Получение фармацевтически значимых гликопротеинов в клетках яичника китайского хомячка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Синегубова Мария Валерьевна

• Синегубова Мария Валерьевна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Синегубова Мария Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Подходы к разработке высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов фармацевтически значимых белков в клетках яичника китайского хомячка

1.1.1 Создание клеточной линии-продуцента рекомбинантного белка

1.1.2 Применение векторов на основе гена фактора элонгации трансляции EEF1A1 китайского хомячка для получения рекомбинантных белков

1.1.3 Использование гетерологичных сигнальных пептидов для повышения выхода рекомбинантных белков

1.1.4 Роль гликанов в составе гликопротеина и контроль профиля гликозилирования в клетках CHO

1.2 Организация промышленного процесса получения биофармацевтических продуктов: процессы upstream и downstream

1.2.1 Разработка и оптимизация культуральных сред

1.2.2 Режимы культивирования

1.2.3 Критические параметры культивирования

1.2.4 Хроматографическое разделение

1.2.5 Примеси в биофармацевтическом производстве

1.2.6 Очистка от вирусов

1.3 Диагностические реагента для детекции COVID-19

1.3.1 Рецептор-связывающий домен шиповидного белка коронавируса SARS-CoV-2 и его применение в иммунодиагностике

1.3.2 Суррогатная вирус-нейтрализация как способ выявления нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в клинической практике

1.4 Рекомбинантные гонадотропные гормоны для медицинского применения

1.4.1 Общая характеристика гонадотропных гормонов

1.4.2 Структура и биологическая роль фолликулостимулирующего гормона человека

1.4.3 Структура и биологическая роль хорионического гонадотропина человека

1.4.4 История получения гонадотропинов

1.4.5 Современные лекарственные препарата гонадотропных гормонов человека для клинического применения

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Методы работы с ДНК

2.1.1 Получение синтетических ДНК-последовательностей

2.1.2 Аденилирование синтетических ДНК (А-tailing)

2.1.3 Полимеразная цепная реакция

2.1.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.1.5 Очистка и переосакдение ДНК-фрагментов перед лигированием

2.1.6 Лигирование ДНК

2.1.7 Выделение плазмидной ДНК

2.1.8 Секвенирование ДНК

2.1.9 Препаративное получение плазмид для трансфекции

2.1.10 Измерение концентрации ДНК

2.1.11 Получение экспрессионных плазмид

2.2 Методы работа с бактериальными культурами E. coli

2.2.1 Химическая трансформация

2.2.2 Ночная культура бактерий

2.2.3 Создание музея бактерий - продуцентов целевых плазмид

2.3 Методы работа с культурами клеток млекопитающих

2.3.1 Культивирование родительских линий СНО

2.3.2 Липосомальная трансфекция и получение транзиентных трансфектантов

2.3.3 Электротрансфекция клеточных линий

2.3.4 Первичная селекция и геномная амплификация клеточных линий

2.3.5 Получение моноклональных линий (клеточное клонирование)

2.3.6 Периодическое культивирование с подпиткой (fed-batch) линий-продуцентов СНО

2.3.7 Серийное длительное культивирование (тест на стабильность)

2.3.8 Замораживание клеточных линий

2.3.9 Разморакивание клеточных линий

2.4 Методы выделения и очистки белков

2.4.1 Методы выделения и очистки ^BD

2.4.2 Методы выделения и очистки АПФ2

2.4.3 Методы выделения и очистки ХГч

2.4.4 Методы выделения и очистки рФСГч

2.5 Аналитические метода

2.5.1 Лизис клеток для оценки содержания внутриклеточного белка

2.5.2 Анализ уровня экспрессии eGFP в клеточных лизатах

2.5.3 Анализ уровня экспрессии eGFP методом проточной цитометрии

2.5 .4 ИФА содержания целевых белков в культуральной среде, клеточном лизате, полупродуктах

хроматографической очистки

2.5.5 Анализ содержания глюкозы и лактата

2.5.6 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия

2.5.7 Вестерн-блоттинг

2.5.8 Анализ вторичной структуры РНК

2.5.9 Определение амидолитической активности АПФ2

2.5.10 Изучание связывания AncD2-RBD методом поверхностного плазмонного резонанса

2.5.11 Конъюгация белков с пероксидазой хрена (HRP)

2.5.12 Сбор образцов и анализ ВНТ

2.5.13 Тест суррогатной вирус-нейтрализацис

2.5.14 Оценка копийности вставки трансега в геноме линий-продуцентов

2.5.15 Масс-спектрометрический анализ RBD

2.5.16 Масс-спектрометрический анализ ХГч методом MALDI-TOF

2.5.17 Дегликозилирование гликопротеинов

2.5.18 Изоэлектрофокусирование ХГч на IPG-полосках

2.5.19 Анализ отщепленных гликанов ХГч (Z-индекс)

2.5.20 Определение биологической активности ХГч in vivo

2.5.21 Определение уровня контаминирующих анти-ФСГ антител методом ИФА

2.5.22 Определение уровня белков штамма-продуцента методом ИФА

2.6 Статистические метода

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Оптимизация экспрессионного вектора p1.1 на основе гена фактора элонгации трансляции EEF1A1 китайского хомячка

3.1.1 Роль фланкирующих областей гена EEF1A1, лежащих выше и ниже по течению от промотора

3.1.2 Роль фрагмента EBVTR и промотора EEF1A1

3.2 Увеличение выхода гликопротеиновых гормонов в стабильно трансфицированных клетках СНО с использованием гетерологичного сигнального пептида человеческого сывороточного альбумина для ß-цепей

3.2.1 Получение генетических конструкций, кодирующих цепи гормонов с вариабельными сигнальными пептидами, и анализ вторичной структуры их мРНК

3.2.2 Определение уровней секреции гетеродимерных гормонов и свободных цепей при помощи ИФА в транзиентно трансфицированных клеточных линиях

3.2.3 Определение уровней секреции гетеродимерных гормонов и свободных цепей при помощи ИФА и вестерн-блоттинга в стабильно трансфицированных клеточных линиях

3.2.4 Определение числа копий интегрированных в геном плазмид методом ПЦР-РВ

3.3 Получение рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка SARS-CoV-2

3.3.1 Получение RBDv1

3.3.2 Получение RBDv2

3.3.3 Анализ очищенных белков RBD

3.4 Разработка теста суррогатной вирус-нейтрализации, основанного на блокировании антителами взаимодействия АПФ2 и RBD SARS-CoV-2

3.4.1 Получение растворимого ангиотензинпревращающего фермента 2 типа (АПФ2)

3.4.2 Взаимодействие АПФ2-RBD в микропланшетах

3.4.3 Анализ кривых ингибирования связывания

3.4.4 Корреляция значений сВНТ и ВНТ

3.4.5 Адаптация дизайна для вариантов SARS-CoV-2

3.5 Получение биоаналогичного хорионического гонадотропина человека (ХГч)

3.5.1 Получение генетических конструкций, кодирующих цепи ХГч

3.5.2 Трансфекция основными плазмидами с расположением генов цепей ХГч в трицистронном формате, получение стабильных поликлональных популяций и амплификация трансгена

3.5.3 Трансфекция вспомогательной плазмидой, кодирующей недостающую цепь ХГч

3.5.4 Получение и характеризация клональных линий-продуцентов ХГч

3.5.5 Поиск оптимальных условий культивирования линии-продуцента ХГч

3.5.6 Непрерывное культивирование моноклональных линий-продуцента ХГч в неселективной среде для оценки стабильности экспрессии трансгена

3.5.7 Характеризация ХГч, полученного в результате иммуноаффинной очистки

3.5.8 Получение высокоочшценного биоаналогичного ХГч и характеризация продукта

3.6 Исследование промышленной пригодности процессов выделения и очистки рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (рФСГч), секретируемого клеточной линией СНО С-P1.3-FSH-G4

3.6.1 Мультимодальная хроматография с использованием сорбента Capto ММС

3.6.2 Иммуноаффинная хроматография с использованием сорбента CS FSH Affinity

3.6.3 Обессоливание при помощи сорбента Sephadex G25

3.6.4 Тандемная ионообменная хроматография с использованием сорбента Capto Q

3.6.5 Финальная эксклюзионная хроматография с использованием сорбента Superdex

3.6.6 Результата контроля качества промышленных партий субстанции рФСГч

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ATF - alternating tangential flow (переменный тангенциальный поток, система фильтрации) BSL-2/3 - biosafety level 2/3 (уровень биобезопасности 2/3)

CHO - Chinese hamster ovary (клетки яичника китайского хомячка Cricetulus griseus) CMV - cytomegalovirus (цитомегаловирус, промотор)

COVID-19 - coronavirus disease 2019 (коронавирусное заболевание 2019 года) CTP - carboxy-terminal peptide (карбокситерминальный пептид ХГч) CV - column volume (колоночный объем)

DBC - dynamic binding capacity (динамическая емкость связывания) DHFR - dihydrofolate reductase (дигидрофолатредуктаза) E. coli - Escherichia coli

EBV(TR) - Epstein-Barr virus (terminal repeat) (терминальный повтор вируса Эпштейна-Барр) EEF1A1 - eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1 (эукариотический фактор элонгации трансляции 1 а1)

EGFP - enhanced green fluorescent protein (усиленный зеленый флуоресцентный белок)

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (ИФА)

FITC - fluorescein isothiocyanate (флуоресцеинизотиоцианат)

HEK293 - human embryonic kidney (клетки почки эмбриона человека)

HRP - horseradish peroxidase (пероксидаза хрена)

ICH - International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals IgG/IgM - immunoglobulin G/M (иммуноглобулин G/M) IRES - internal ribosome entry site (внутренний сайт связывания рибосом) MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетным масс-анализатором) MCB - master cell bank (матричный банк клеток)

MERS-CoV - Middle East respiratory syndrome coronavirus (коронавирус ближневосточного респираторного синдрома) MTX - methotrexate (метотрексат)

MSX - methionine sulfoximine (метионинсульфоксимин)

PBS - phosphate-buffered saline (фосфатно-солевой буфер)

PRNT - plaque reduction neutralization test (тест снижения бляшкообразования)

ppb - parts per billion (частей на миллиард)

ppm - parts per million (частей на миллион)

RBD - receptor-binding domain (рецептор-связывающий домен)

RCB - research cell bank (исследовательский банк клеток) SARS-CoV-2 - severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 SDS - sodium dodecyl sulfate (додецилсульфат натрия)

SDS-PAGE - polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (ДСН-ПААГ, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия)

SEC - size-exclusion chromatography (эксклюзионная хроматография, гель-фильтрация) TBE - Tris-borate-EDTA (Трис-боратный буфер) WCB - working cell bank (рабочий банк клеток)

Z-индекс - индекс гликозилирования, отражающий степень терминального сиалирования

АПФ2 - ангиотензинпревращающий фермент 2 типа

БСА - бычий сывороточный альбумин

БШП - белки штамма-продуцента

ВНА - вируснейтрализующие антитела

ВНТ - тест вирус-нейтрализации

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ГнРГ - гонадотропин-рилизинг-гормон

ГФ - Государственная фармакопея

Да (кДа) - дальтон (килодальтон)

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛГ - лютеинизирующий гормон

МЕ - международная единица

(мк)АТ - антитела (моноклональные)

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ОРС - открытая рамка считывания

ОФС - общая фармакопейная статья

пВ Т - псевдотипированный тест вирус-нейтрализации

ПЦР(-РВ) - полимеразная цепная реакция (в реальном времени)

рФСГч - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека

рХГч - рекомбинантный хорионический гонадотропин человека

РНК - рибонуклеиновая кислота

сВНТ - суррогатный тест вирус-нейтрализации

СП - сигнальный пептид

ТТГ - тиреотропный гормон

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ХГч - хорионический гонадотропин человека

чМГ - человеческий менопаузальный гонадотропин

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение фармацевтически значимых гликопротеинов в клетках яичника китайского хомячка»

Актуальность темы

Разработка высокопродуктивных линий клеток млекопитающих, секретирующих фармацевтически значимые белки, является одной из ключевых задач современной биофармацевтики и требует применения современных научно-технических решений, основанных на методах биохимии, молекулярной биологии и клеточной инженерии. Данная диссертационная работа посвя ена создани линий-продуцентов фармацевтически значим х гликопротеинов на основе культивируемых клеток яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary, CHO). В работе рассмотрены ключевые аспекты получения таких гликопротеинов — от дизайна генетических конструкций, кодирующих целевой белок, и получения стабильных клональн х линий до разработки и валидации методик в деления целевых рекомбинантн х белков, контроля их качества и переноса разработок на пром ленное производство. Созданн е в ходе исследования генетические конструкции легли в основу разработки технологий получения медицинских препаратов рекомбинантных гликопротеиновых гормонов для терапии бесплодия у человека и реагентов для диагностических тест-систем.

Особую актуальность работа приобрела в контексте пандемии COVK)-19. Быстрое распространение нового коронавируса SARS-CoV-2 и тяжесть вызываемого им заболевания создали беспрецедентную потребность в массовом диагностическом тестировании. Ключевым компонентом таких тестов является рецептор-связывающий домен (RBD) шиповидного (S) белка SARS-CoV-2 — иммунодоминантный антиген, использующийся для серологической диагностики. ри стандартном расходе антигена для изготовления микропланетов для одного миллиона тестов требуется около 250 мг очищенного белка RBD. Такое количество белка в виде однородной партии невозможно получить с помощью транзиентной трансфекции клеток СНО или клеток эмбриональной почки человека HEK293. Таким образом, получение высокопродуктивной стабильно трансфицированной клеточной линии СНО, секретирующей белок RBD с постоянными характеристиками от партии к партии, являлось критически важной задачей для обеспечения работы производителей диагностических тестов.

Ва н м прикладн м аспектом использования рекомбинантного RB стала разработка безопасного и высокопроизводительного биохимического теста суррогатной вирус-нейтрализации (сВНТ). Традиционный метод оценки вирус-нейтрализующих антител (ВНА) с использованием живого вируса требует работы в лаборатории повышенного уровня биобезопасности (BSL-3), он трудоемок и не подходит для массового скрининга. Актуальной задачей являлась разработка теста, напряму измеря его функциональну активность антител — их способность блокировать ключевое взаимодействие вируса с клеткой. Такой тест,

основанный на иммуноферментном анализе, позволил бы быстро и безопасно оценивать гуморальный иммунитет у переболевших и вакцинированных в клинической и эпидемиологической практике.

Другой важной областью применения разработанных технологий является производство рекомбинантных гликопротеиновых гормонов человека. Семейство этих гормонов у человека включает в себя три гипофизарных гормона — тиреотропный гормон (ТТГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), а также плацентарный гормон хорионический гонадотропин (ХГ). В медицине ФСГ, ЛГ и ХГ используются во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ) для лечения бесплодия у человека, а ТТГ — преимущественно в диагностике рака щитовидной железы. Все четыре гормона представля т собой нековалентно связанн е гетеродимер , состоя ие из обей для семейства а- и уникальной Р-субъединицы, и проявляют физиологическую активность только как ав-гетеродимер. Гетеродимерная структура и обильное гликозилирование (около 30 % углеводов по массе) делает эти белки крайне сложными для экспрессии в культуре клеток и требует разработки инновационных подходов для повы ения титра биологически активной форм продуктов. ля создания конкурентоспособн х биоаналогичн х лекарственн х препаратов этих гормонов необходимо не только получить стабильно продуцирующую линию с высоким титром, но и обеспечить максимальное сходство биохимических свойств молекул действующего вещества в составе биоаналогичной и оригинальной разработки.

Одним из лимитирующих этапов биосинтеза секретируемых белков является транслокация транслируемого полипептида в эндоплазматический ретикулум, эффективность которой может быть заметно повышена заменой нативного сигнального пептида (СП) на гетерологичн й. ля гликопротеиновых гормонов на момент проведения настоя ей работ подобные исследования не проводились. Оптимизация СП рассматривалась как ключевой шаг для увеличения выхода целевого продукта на ранних стадиях его биосинтеза. Было предположено, что оптимизация СП для в-субъединиц гликопротеиновых гормонов может значительно усилить секреци целевых гетеродимеров в культуре .

ля биофармацевтической разработки так е крайне актуальным является оптимизация дорогостоя их процессов очистки целев х белков. Так, для в деления СГ из кондиционированной культуральной среды линии P1.3-FSH-G4, ранее полученной в лаборатории биоин енерии клеток млекопита их Биотехнологии Р, б л разработан многостадийн й процесс очистки на основе иммуноаффинной хроматографии с в сокоспецифичными однодоменн ми антителами. отя пригодность данного метода в лабораторном масштабе была подтверждена, отсутствовали данные о стабильности сорбентов для использования в промышленном масштабе, практической динамической ёмкости связывания

(dynamic binding capacity, DBC) и динамике утечки лиганда в повторяющихся циклах эксплуатации. Поскольку масштабирование данного технологического процесса требует значительных материальных затрат, оптимизация и валидация процесса на лабораторных уменьшенных моделях являлись крайне необходимыми перед внедрением в серийное промышленное производство.

Цель и задачи

Основной целью настоящей работы было получение фармацевтически значимых гликопротеинов в клетках яичника китайского хомячка. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Установить роль некодирующих участков гена EEF1A1 китайского хомячка и фрагмента конкатемера длинного концевого повтора вируса Эпштейна-Барр в составе плазмиды p1.1.

2. Провести биохимическую и структурную оптимизацию рецептор-связывающего домена (RBD) шиповидного белка коронавируса SARS-CoV-2, получить его эффективный продуцент.

3. Разработать тест суррогатной вирус-нейтрализации (сВНТ), основанный на конкурентном иммуноферментном анализе, для определения уровня нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в сыворотке переболевших COVID-19.

4. Исследовать влияние гетерологичных сигнальных пептидов на секрецию Р-цепей гликопротеинов х гормонов в клетках C .

5. Получить сбалансированный промышленный продуцент хорионического гонадотропина человека с максимальным содержанием биологически активного гетеродимера и оптимальными биохимическими свойствами гормона.

6. Оценить промышленную пригодность процессов очистки рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, секретируемого клеточной линией C-P1.3-FSH-G4.

Научная новизна

Научная новизна исследования заключается в решении комплекса фундаментальных и прикладных задач, направленных на создание рекомбинантн х терапевтических и диагностических белков.

В части оптимизации векторных систем впервые на примере модельного зеленого флуоресцентного белка (enhanced green fluorescent protein, eGFP) было установлено, что некодирующие участки гена фактора элонгации трансляции китайского хомячка (eukaryotic translation elongation factor la, EEF1A1), фланкирующие целевой ген в экспрессионной плазмиде p1.1, могут быть удалены из плазмиды без существенной потери стабильности уровня экспрессии

целевого белка при длительной культивации в неселективных условиях. На примере стандартной плазмиды pOptiVEC, содержащей промотор цитомегаловируса (CMV), также была установлена роль участка фрагмента конкатемера длинных концевых повторов вируса Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus terminal repeat, EBVTR), заключающаяся в поддержании постоянства уровня экспрессии целевого гена при стабильной трансфекции в клетки млекопитающих. Плазмиды на основе EEF1A1-промотора показали себя более стабильными, чем плазмиды на основе CMV-промотора. Минимальный функциональный вариант p1.1-Tr2 fern успешно применен для создания линий-продуцентов фармацевтически значимых белков, таких как RBD S-белка SARS-CoV-2 и ХГч.

Важным достижением стала разработка рекомбинантного мономерного RBD S-белка SARS-CoV-2, лишенного непарного остатка цистеина. Эта модификация устранила склонность B к формировани ковалентн х гомодимеров и обеспечила высоку иммуноспецифичность. Полученный RBD был использован в тесте суррогатной вирус-нейтрализации (сВНТ) на основе ИФА для оценки титра нейтрализующих антител у переболевших COVID-19 или вакцинированных. ри этом б ло показано, что оптимальная чувствительность теста достигается при использовании нативного B в качестве иммобилизованного антигена и конъюгата растворимого ангиотензинпревращающего фермента 2 (АПФ2) с пероксидазой хрена (horseradish peroxidase, HRP) в качестве детектирующего реагента. Предложенный метод сВНТ является простой и безопасной альтернативой трудоемкой реакции классической Т с использованием живого вируса.

Впервые для всех четырех представителей семейства гликопротеиновых гормонов (ФСГ, ЛГ, ХГ, ТТГ) проведено систематическое исследование влияния гетерологичного СП на секрецию их Р-цепей. Установлено, что СП человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) является наиболее универсальн м, обеспечива им статистически значимое увеличение продуктивности по гетеродимерной форме для ХГ (в 1,5 раза), ЛГ (в 4 раза) и ТТГ (в 13 раз).

При получении высокопроизводительных линий-продуцентов ХГч был разработан оригинальный подход, включающий анализ соотношения экспрессии а- и Р-субъединиц в стабильно трансфицированных популяциях и последующую трансфекцию конструкцией, несущей ген дефицитной цепи и второй метаболический селекционный маркер. Подход позволил сбалансировать уровень экспрессии цепей, увеличить общий выход гетеродимера более чем в 2 раза, и перейти к культивировани клеток без внесения глутамина. лональная линия-продуцент ХГч S-pTr2-hCG-8 достигала титра более 100 мг/л и сохраняла продуктивность в течение 60 генераций, что делает ее пригодной для пром ленного применения. нализ основных физико-химических свойств полученного ХГч показал их соответствие свойствам ХГч, содержащегося в составе оригинального препарата. Профиль гликозилирования (Z-индекс) полученного

биоаналогичного ХГч, отражающий уровень терминального сиалирования N-гликанов и влияющего на биологическую активность ХГч, не отличался от Z-индекса оригинального ХГч.

Вперв е проведена комплексная оценка пром ленной пригодности многостадийного процесса очистки рекомбинантного ФСГ человека (рФСГч), секретируемого линией C-P1.3-FSH-G4, из культуральной жидкости до фармацевтических показателей качества продукта. Доказано сохранение свойств всех используемых в технологическом процессе хроматографических сорбентов в течение 40 хроматографических циклов, включающих процедуры очистки и санитарной обработки сорбента. Впервые подробно зафиксирована динамика сохранения емкости для аффинного хроматографического сорбента ключевой стадии очистки (CaptureSelect™FSH Affinity) и детально изучена динамика смыва однодоменных камелидных мини-антител, способных контаминировать конечн й целевой продукт и продемонстрировано их полное удаление из раствора ФСГ при следующих стадиях очистки.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в расширении фундаментальных знаний о механизмах регуляции экспрессии генов в клетках млекопитающих, роли СП в эффективной секреции сло н х гетеродимерных белков и факторах, обеспечива их стабильность плазмидных векторов и продуктивности клеточных линий при длительном культивировании. Разработанные принципы балансировки экспрессии субъединиц гетеродимеров и использования комбинаций регуляторных элементов (промотор EEF1A1, элемент EBVTR) имеют универсальный характер и применим для конструирования продуцентов других фармацевтически значимых белков. Разработанные платформенные решения на основе бицистронных (для односубъединичных белков) и трицистронных (для двухсубъединичных белков) конструкций с промотором EEF1A1 могут быть использованы для дальнейшей разработки продуцентов других фармацевтически значим х гликопротеинов.

Практическая значимость исследования подтверждена внедрением его результатов. Разработана линия-продуцент RBD S-белка коронавируса SARS-CoV-2 с высокой продуктивность, получаемый продукт обладает в сокой антигенной специфичность и б л использован для производства иммунодиагностических тестов для определения антител к SARS-CoV-2 методом тонкослойной хроматографии, а также в тестах сВНТ.

Разработанная линия-продуцент ХГч является источником фармацевтически значимого белка, применяемого в качестве лекарственного средства для лечения бесплодия у человека в программах ВРТ. Титр Гч, секретируемого полученной линией в оптимизированн х условиях культивирования, является экономически в годн м для внедрения в пром ленное производство, при этом полученный гормон обладает физико-химическими свойствами и

биологической активностью, позволяющими сделать вывод о его биоаналогичности ХГч, входя ему в состав оригинального лекарственного препарата.

Результаты оптимизации и валидации процессов очистки рФСГч были перенесены в промы ленное производство и внесли значительн й вклад в успе ное мас табирование технологического процесса получения гормона от лабораторного до промышленного масштаба. Немаловажным доказательством достоверности и практической полезности исследования является тот факт, что, начиная с 2020 года до настоя его момента, получено более 60 промы ленных партий лекарственного препарата на основе разработанного процесса очистки рФСГч с воспроизводящимися биохимическими свойствами молекулы от партии к партии.

Степень достоверности результатов

Эксперимент проводились независимо друг от друга, с использованием поло ительн х и отрицательных контролей. сследование подтвер дено воспроизводимость значений измерений. Полученные данные проанализированы с использованием современных методов статистической обработки.

Публикации и апробация результатов

По теме диссертации были опубликованы 6 статей в журналах, индексируемых в Scopus/Web of Science, получен 1 патент на изобретение. Результаты работы были представлены на нескольких научных конференциях: XXXI, XXXIII, XXXIV, XXXVI Зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2019, 2021, 2022, 2024 гг.), 23-й и 24-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука ХХ! века» (2019, 2021, 2022 гг.), IV Студенческом биохимическом форуме (2024 г.), втором и третьем Саммите разработчиков лекарственн х препаратов «Сириус. Биотех» (2024, 2025 гг.), XXXIV международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (2024 г.), XVI и XVIII международной конференции мКАРМ «Краеугольные аспекты репродуктивной медицины» (2023, 2024 гг.), международной научной конференции РУДН Science4Health (2025 г.), XVIII Курчатовской молодё ной научной коле (2025 г.).

Личный вклад автора

Экспериментальные данные, представленные в настоящей работе, получены лично автором либо при его непосредственном участии на всех этапах исследований, включая планирование, выполнение экспериментов, обработку данн х, а так е оформление и публикаци результатов. втор лично проводил асептическое культивирование клеток млекопитающих в процессе получения линий-продуцентов и осуществлял аналитические

методики, описанные в данной работе. Автор выражает признательность всем коллегам за совместную работу. Молекулярное клонирование проводилось совместно с к.б.н. Орловой НА. Постановка теста суррогатной вирус-нейтрализации (сВНТ), а также эксперименты по исследованию влияния сигнальных пептидов на титр гликопротеиновых гормонов проводились совместно с Колесовым Д.Э. Исследования стабильности свойств хроматографических сорбентов, используемых в процессе получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГч), и поиск оптимальных условий выделения из культуральной среды рецептор-связывающего домена (RBD) SARS-CoV-2 проводились совместно с д.б.н. Воробьевым И.И. Разработка методов очистки и контроля качества хорионического гонадотропина человека (ХГч) проводилась совместно с сотрудниками ООО «Фармапарк» Клишиным А.А., Зыряновым Д.А. Результаты контроля качества промышленных партий рФСГч получены отделом контроля качества площадкой-производителя ООО «Завод Медсинтез» (г. Новоуральск, Россия), автор совместно с сотрудниками ООО «АйВиФарма» принимал непосредственное участие в разработке, промышленном трансфере процесса культивирования в биореакторе, а также разработке, валидации и трансфере ряда методик контроля качества рФСГч и ХГч.

Методология и методы исследования

В работе использован широкий спектр биохимических, молекулярно-биологических, микробиологических и клеточных методов: методы работы с ДНК (рестрикция, лигирование, препаративное выделение из бактериальных культур и переосаждение, электрофорез в агарозном геле); метода работа с бактериальными культурами (получение компетентных клеток, трансформация, отбор целевых колоний, создание бактериальных музеев); методы работы с культурами клеток млекопитающих (асептическое пассирование, микроскопия, трансфекция, клеточное клонирование); метод очистки белков (колоночная хроматография, фильтрация); аналитические метод (Р в реальном времени, электрофорез белков в полиакриламидном геле, колоночная хроматография, иммуноферментный анализ, вестерн-блоттинг, изоэлектрофокусирование, количественное определение белка по Брэдфорду, флуориметрия, проточная цитометрия, аналитическая хроматография).

Положения, выносимые на защиту

1. Долгосрочная стабильность экспрессии трансгена в векторной системе на основе плазмиды р1.1-Тг2 достигается за счёт синергичного действия только двух элементов: компактной регуляторной области генаEEF1A1, лежащей выше по течению от промотора, и фрагмента EBVTR.

2. Высокий уровень биосинтеза и антигенная специфичность рекомбинантного ЯВО-домена S-белка SARS-CoV-2 обеспечиваются структурной оптимизацией, предотвращающей

образование некорректных межмолекулярных дисульфидных связей, что является необходимым биохимическим условием для высокоаффинного связывания с рецептором АПФ2 и нейтрализующими антителами.

3. ринцип разработанного теста сВ Т основан на количественной оценке способности нейтрализующих антител стерически блокировать высокоаффинное взаимодействие между иммобилизованным RBD и растворимой формой его клеточного рецептора АПФ2, что делает метод прямым биохимическим коррелятом вирус-нейтрализующей активности, пригодным для ирокого скрининга в клиническом применении без использования ивого вируса.

4. Наблюдаемое в работе повышение эффективности секреции гликопротеиновых гормонов при использовании гетерологичного сигнального пептида человеческого сывороточного альбумина обусловлено улуч ением эффективности транслокации и ко-трансляционной укладки их в-субъединиц в эндоплазматическом ретикулуме, что является ключевым лимитирующим этапом в биосинтезе этих сложных белков.

5. Получение сбалансированного продуцента биоаналогичного хорионического гонадотропина человека требует не только эквимолярной экспрессии субъединиц гормона, но и выбора родительской линии клеток, обеспечива ей корректн й биохимический профиль молекулы, соответствующий оригинальному препарату.

6. Промышленная пригодность процесса очистки рФСГч доказывается высокой селективность и стабильность работы всех используем х в технологическом процессе хроматографических сорбентов. птимизированн й процесс обеспечивает воспроизводимое от партии к партии получение фармацевтической субстанции с сохранением биохимических свойств гормона.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения, заключения, практического использования результатов, выводов, списка научных трудов по теме диссертации и списка литературы. Работа изложена на 180 страницах и содержит 366 цитируемых источников, 39 рисунков, 14 таблиц, 1 приложение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Подходы к разработке высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов фармацевтически значимых белков в клетках яичника

китайского хомячка

1.1.1 Создание клеточной линии-продуцента рекомбинантного белка

Значительная доля биотехнологических лекарственных препаратов представляет собой рекомбинантные белки, получаемые в культуре клеток млекопитающих, поскольку они способны продуцировать разнообразные, правильно фолдированные и гликозилированные белки. Профиль гликозилирования во многом определяет биохимические свойства гликопротеина, что сказывается, в первую очередь, на времени полувыведения и стабильности и, таким образом, обеспечивает требуемую биологическую активность биофармацевтических препаратов [1-3].

Процесс разработки рекомбинантной линии-продуцента на основе клеток млекопитающих включает конструирование плазмидных векторов, несущих трансгены (как правило, целевой ген и ген селекционного маркера), трансфекцию, отбор стабильно трансфицированн х клеток, клеточное клонирование, мас табирование клональн х линий, создание банка клеток и оптимизацию процесса культивирования (Рисунок 1). Выбор родительских клеток, экспрессионных векторов, методов трансфекции и селекции определяет способностью экспрессионной платформы обеспечивать высокую продуктивность при стабильном качестве продукта [4].

pCMV <ç-

CiiSçj. Vector I

5- I

J o-

Vector fragment

*

24-48hr

2-3 weeks

рвя V

Random integration

Transfection

Pool selection

(0-1«106oells/ml>

2-3 weeks

I Limiting dilution

▼ (0.2~0-5cells/well>

III

Cell banking

mmm

вав

Н -, ; 1.

Cell clones development

Рисунок 1. Схема получения клеточной линии-продуцента рекомбинантного белка.

Источник: [5].

Экспрессионные системы, основанные на клеточных линиях млекопитающих, включают клеточные линии различного происхождения: хомячка (СНО, ВНК), человека (НЕК293, HT-1080, PER.C6, CAP, HKB-11, Huh-7), мыши (NS0, Sp2/0). Однако около 70% биофармацевтических препаратов, включая практически все моноклональные антитела (мкАТ), производятся в клетках яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary, СНО) [6]. Столь широкое применение CHO объясняется тем, что они обладают высокой продуктивностью (0,1-1 г/л в периодическом процессе и 1-10 г/л в периодическом процессе с подпиткой) и хорошими ростов ми показателями, подходят для крупномас табного промы ленного культивирования, могут быть легко адаптированы к различным средам определенного химического состава, менее восприимчивы к инфицированию человеческими вирусами и способны осуществлять совместимое с человеческим организмом гликозилирование, а так е признаны регуляторн ми органами [2,3,6,7].

Оригинальная клеточная линия CHO впервые была выделена и иммортализована Теодором Паком в 1956 г. [8], затем из нее получили несколько сублиний путем клонирования, мутагенеза и адаптации к различным условиям культивирования [9-11]. Для промышленного производства клетки CHO было разрешено использовать в 1897 г. для производства тканевого активатора плазминогена компанией Genentech. Сублиния CHO S была адаптирована к суспензионному культивированию для увеличения плотности клеток и, как следствие, достижения более высоких объемных титров продукта [12]. Мутантные сублинии СНО различаются по набору метаболических маркеров (дигидрофолатредуктаза, DHFR, и глутаминсинтаза, GS): CHO DXB11 (DHFR+/-), CHO DG44 (DHFR-/-) и CHO K1SV (GS-/-) [13]. Нокаут одного или обоих аллелей соответствующих генов в геноме линии позволяет провести метаболическу селекци с применением метотрексата (T ), конкурентного ингибитора DHFR, или метионинсульфоксимина (MSX), конкурентного ингибитора GS [14,15].

Наиболее распространенной и охарактеризованной в отношении стабильности продуцента является DHFR/MTX-опосредованная система, позволяющая достичь высоких уровней амплификации и экспрессии генов [16,17]. MTX как кластогенный (дозозависимый) селекционн й агент, как правило, используется так е для амплификации генов, что позволяет увеличить продукци целевого белка посредством культивировании при возраста их концентрациях MTX [2,3]. Система DHFR/MTX широко используется благодаря высоким уровням экспрессии целевого белка и стабильности продукции, но требует многоэтапного отбора с пов ением концентрации T для многокопийной амплификации трансгена в геноме, что увеличивает сроки разработки клеточной линии до нескольких месяцев [18-20].

Более быстрый результат может быть достигнут при использовании GS/MSX-опосредованной системы, так как такая система требует только одного раунда селекции, после

которого меньшее количество копий трансгенов приводит к высоким уровням экспрессии белка [21-24]. При этом при использовании GS-нокаутной линии селекция может осуществляться и без применения MSX, только за счет отсутствия глутамина в культуральной среде [25]. Дополнительным преимуществом системы GS^ISX является снижение накопления аммиака в культуральной среде, поскольку сверхэкспрессированная GS катализирует превращение глутамата и аммиака в глутамин [26-28]. Несмотря на все вышеперечисленные преимущества, использование данной системы при получении линии для промы ленного применения ограничено вследствие недостаточных данных о стабильности продуцента [29].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Синегубова Мария Валерьевна, 2026 год

Источник: [5].

Экспрессионные системы, основанные на клеточных линиях млекопитающих, включают клеточные линии различного происхождения: хомячка (СНО, ВНК), человека (НЕК293, HT-1080, PER.C6, CAP, HKB-11, Huh-7), мыши (NS0, Sp2/0). Однако около 70% биофармацевтических препаратов, включая практически все моноклональные антитела (мкАТ), производятся в клетках яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary, СНО) [6]. Столь широкое применение CHO объясняется тем, что они обладают высокой продуктивностью (0,1-1 г/л в периодическом процессе и 1-10 г/л в периодическом процессе с подпиткой) и хорошими ростов ми показателями, подходят для крупномас табного промы ленного культивирования, могут быть легко адаптированы к различным средам определенного химического состава, менее восприимчивы к инфицированию человеческими вирусами и способны осуществлять совместимое с человеческим организмом гликозилирование, а так е признаны регуляторн ми органами [2,3,6,7].

Оригинальная клеточная линия CHO впервые была выделена и иммортализована Теодором Паком в 1956 г. [8], затем из нее получили несколько сублиний путем клонирования, мутагенеза и адаптации к различным условиям культивирования [9-11]. Для промышленного производства клетки CHO было разрешено использовать в 1897 г. для производства тканевого активатора плазминогена компанией Genentech. Сублиния CHO S была адаптирована к суспензионному культивированию для увеличения плотности клеток и, как следствие, достижения более высоких объемных титров продукта [12]. Мутантные сублинии СНО различаются по набору метаболических маркеров (дигидрофолатредуктаза, DHFR, и глутаминсинтаза, GS): CHO DXB11 (DHFR+/-), CHO DG44 (DHFR-/-) и CHO K1SV (GS-/-) [13]. Нокаут одного или обоих аллелей соответствующих генов в геноме линии позволяет провести метаболическу селекци с применением метотрексата (T ), конкурентного ингибитора DHFR, или метионинсульфоксимина (MSX), конкурентного ингибитора GS [14,15].

Наиболее распространенной и охарактеризованной в отношении стабильности продуцента является DHFR/MTX-опосредованная система, позволяющая достичь высоких уровней амплификации и экспрессии генов [16,17]. MTX как кластогенный (дозозависимый) селекционн й агент, как правило, используется так е для амплификации генов, что позволяет увеличить продукци целевого белка посредством культивировании при возраста их концентрациях MTX [2,3]. Система DHFR/MTX широко используется благодаря высоким уровням экспрессии целевого белка и стабильности продукции, но требует многоэтапного отбора с пов ением концентрации T для многокопийной амплификации трансгена в геноме, что увеличивает сроки разработки клеточной линии до нескольких месяцев [18-20].

Более быстрый результат может быть достигнут при использовании GS/MSX-опосредованной системы, так как такая система требует только одного раунда селекции, после

которого меньшее количество копий трансгенов приводит к высоким уровням экспрессии белка [21-24]. При этом при использовании GS-нокаутной линии селекция может осуществляться и без применения MSX, только за счет отсутствия глутамина в культуральной среде [25]. Дополнительным преимуществом системы GS^ISX является снижение накопления аммиака в культуральной среде, поскольку сверхэкспрессированная GS катализирует превращение глутамата и аммиака в глутамин [26-28]. Несмотря на все вышеперечисленные преимущества, использование данной системы при получении линии для промы ленного применения ограничено вследствие недостаточных данных о стабильности продуцента [29].

После трансфекции клеток критериями отбора клеточных линий являются высокая продуктивность, должное качество продукта, ростовые характеристики, способность к росту в бессывороточных суспензионных средах, адаптивное поведение [30]. Для обеспечения желаемого качества продукта используется ряд методов оптимизации клеточных линий: РНК-интерференции, делеции генов, оптимизация кодонов, различные подходы к геномной амплификации трансгена [31-34].

В результате трансфекции и селекции трансген интегрирует в хромосому клетки-хозяина случайным образом, за исключением тех случаев, когда для направленной интеграции трансгена используют транспозазы, такие как Sleeping Beauty, PiggyBac [35]. Вследствие гетерогенности родительских клеток и случайной интеграции трансгена стабильно трансфицированная популяция содержит клетки, вариабельные по продуктивности, метаболическому профилю, стабильности и качеству продукта [36]. Согласно регуляторным нормам, биофармацевтические препараты, предназначенные для лечения человеческих заболеваний, должны производиться на основе моноклональной линии клеток [37]. Чтобы отобрать стабильные и высокопродуктивные клетки, пригодн е для промы ленного производства, проводится изолирование одиночн х клеток клеточное клонирование, а затем их мас табирование, сопрово да ееся многоэтапным скринингом в течение всего процесса, начиная с 96-луночных планшетов [38] и заканчивая перемешиваемыми колбами или микробиореакторами [39]. Параллельно с этим необходима оценка клонов на предмет долгосрочной стабильности продукции при культивировании в переме иваемых колбах. В бор наиболее подходя его клеточного клона является одним из наиболее важных этапов, поскольку изменения в производственной клеточной линии во время клинической разработки представляют собой существенное изменение процесса, требующее дополнительного подтверждения сопоставимости продукта. Критериями отбора клона являются: скорость роста и отсутствие склонности к образованию аггрегатов, волюметрическая продуктивность (титр), специфическая удельная продуктивность, воспроизводимость профиля гликозилирования, стабильность секреции продукта, метаболические характеристики (низкое образование лактата или аммония) [40]. Профиль

гликанов зависит от состава культуральной среды и условий культивирования, а также может различаться между индивидуальными клонами [41]. Выбор индивидуального клона — длительн й и трудоемкий процесс, осло ненн й тем фактом, что продуктивность клеток и качество продукта сильно зависят от условий культивирования [42]. Целевой ген должен поддерживать экспрессию в течение как минимум 40-60 удвоений, чтобы гарантировать воспроизводимый продукт в конце производственного процесса. По результатам оценки продуктивности, стабильности продукции и параметров качества продукта для будущего промы ленного применения в бира т основной производственн й клон и резервн й клон.

Из отобранного клона клеток формируется исследовательский банк клеток (Research cell bank, RCB), который явялется конечной стадией фармацевтической разработки клеточной линии.

CB переносится на предприятие, работа ее в соответствии с требованиями надле а ей производственной практики (Good manufacturing practice, GMP), где изготавливается главный банк клеток (Master cell bank, MCB). MCB проходит тщательное испытание безопасности и качества [43] и служит основой для получения рабочего банка клеток (Working cell bank, WCB), который является основой производственного процесса получения продукта для клинических исследований и пром ленн х серий.

1.1.2 Применение векторов на основе гена фактора элонгации трансляции EEF1A1 китайского хомячка для получения рекомбинантных белков

Критическим условием использования клеточной линии-продуцента в промы ленном производстве является высокий и стабильный уровень экспрессии гетерологичного белка. На скорость транскрипции трансгенов влияют как цис-регуляторные элементы (промотор, энхансер в составе экспрессионного вектора или другие регуляторные элемента, присутствующие в месте интеграции в геном хозяина), так и транс-регуляторные элемент , специфичные для клетки-хозяина (например, транскрипционные факторы) [44-48]. Многие коммерческие векторы используют вирусные промоторы, такие как промотор цитомегаловируса (CMV), что позволяет достичь высоких выходов белка [49]. Однако использование промотора немедленного раннего со временем мо ет привести к низкому уровн экспрессии из-за подавления транскрипции за счет метилирования ДНК [50-52], поэтому CMV-промотор обычно является промотором выбора в случае транзиентной экспрессии целевого белка [49,53]. Высокий уровень продукции и стабильность экспрессии в культурах клеток млекопита их могут б ть достигнут при ипользовании других сильн х промоторов, таких как промотор эукариотического фактора элонгации трансляции 1а (EF-1a, символ гена EEF1A1) [54-56].

Обоснование выбора регуляторных элементов китайского хомячка основано на том, что а) EEFlAl-промотор принадлежит высокоэкспрессируемому EEFlAl-гену и его фланкирующие

последовательности могут включать элементы, позитивно регулирующие транскрипцию; б) при трансфекции в клетки СНО такая плазмида и родительская клетка будут составлять гомологичную экспрессионную систему. Литературные данные показывают, что векторы, основанные на регуляторных элементах из гена EEF1A1-китайского хомячка, в стабильных линиях СНО и других клеточных линиях млекопитающих позволяют добиться уровня экспрессии в 6-35 раз выше по сравнению с CMV-промотором или EF-1a-промотором человека [54]. Однако ожидается, что векторы на основе ЕР-1а будут иметь более низкую эффективность трансфекции, чем векторы на основе CMV, из-за их большего размера [57].

1.1.3 Использование гетерологичных сигнальных пептидов для повышения выхода рекомбинантных белков

Для всех секретируемых белков характерно наличие сигнального пептида (СП) -короткой ^концевой аминокислотной последовательности, облегчающей ко-трансляционную транслокацию транслируемого полипептида в ЭПР [58]. Показано, что применение различных СП способно повышать скорость преодоления лимитирующей стадии классического пути секреции, что, как следствие, усиливает общую секрецию белка [59]. При этом не существует универсально эффективного СП, подходящего для всех классов белков [60]. Более того, для клеток СНО установлено, что нативная сигнальная последовательность не всегда обеспечивает максимальную эффективность [59,61,62]. В качестве примера, работа КоЬег и соавт. показала увеличение секреции модельных белков (антитела и Fc-слитого белка) в клетках СНО при использовании гетерологичных СП — препро-формы человеческого сывороточного альбумина и препро-азуроцидина [63]. Параллельно ведутся изыскания в области синтетических (неприродных) СП для повышения экспрессии рекомбинантных белков [64,65]. Замена нативных на гетерологичн е у е доказала сво результативность в увеличении титра рекомбинантн х антител [66], однако в отношении гликопротеиновых гормонов эта проблема до сих пор оставалась совершенно не изученной.

Существующие в настоящее время биоинформатические сервисы (например, SignаlP 6.0) позволяют предсказать, может ли комбинация СП-белок быть правильно расщеплена [67]. Однако данные алгоритмы не предсказывают скорость трансляции соответствующих мРНК и не могут отличить эффективные СП от неэффективных. Разработка регрессионной модели для предсказания эффективности секреции на основе последовательности С и первых 50 аминокислот целевого белка описана в [68]. Для одноцепочечного фрагмента слитного Fc-белка авторам удалось в брать два С из выборки из 40000 аминокислотных последовательностей, что привело к двукратному увеличению титра. При этом авторы сообщают, что умеренная предсказательная эффективность модели (Я2 = 0,65) была достигнута только для

одноцепочечных белков, но не для моноклональных антител вследствие необходимости балансирования синтеза легких и тяжелых цепей [68].

1.1.4 Роль гликанов в составе гликопротеина и контроль профиля

гликозилирования в клетках СНО

Типичные структуры М- и О-гликанов и их моносахаридный состав приведены на Рисунке 2. В промышленном биопроцессе при получении рекомбинантных гликопротеинов в клетках млекопитающих этот набор гликанов может быть представлен не полностью из-за ограничений путей биосинтеза. Три класса ^гликанов (высокоманнозные, гибридные, комплексные) имеют общую пентасахаридную коровую структуру (Рисунок 2).

High Marinóse

Hybrid

Complex

В

i

Lrfjp-í

Фи.*]!™! - - I

О Man

I№lSÍÍ

Д Fue O Gal □ GalNAc

llí1'6,L _' r¿1'i_I

GIcNAc O NANA O NGNA

Рисунок 2. Типичная структура N-связанных гликанов и О-связанных гликанов.

А. N-гликаны представлены тремя классами (высокоманнозные, гибридные, комплексные) и имеют общую пентасахаридную коровую структуру.

Б. О-гликаны имеют до восьми различных коровых структур. Man - манноза; Fuc - фукоза; Gal -галактоза; GalNAc - N-ацетилгалактозамин; GlcNAc - N-ацетилглюкозамин; NANA - N-ацетилнейраминовая (сиаловая) кислота; NGNA - N-гликолилнейраминовая кислота. Источник: [69].

Гликозилирование белка представляет собой сложный метаболический процесс, включающий перенос олисахаридов единым блоком (en block), а также поэтапное добавление и удаление отдельных моносахаридов. N- и О-связанные гликаны влияют на иммуногенность, эффективность, растворимость и период полувыведения биофармацевтических препаратов [70-72]. Протекание конкретных реакций в определенном порядке зависит от доступности реакционного сайта, специфичности и пространственной локализации ферментов и нуклеотидно-сахарных субстратов [69]. N-связанное гликозилирование происходит в ЭПР ко-трансляционно

по остаткам Asn в консесусной последовательности Asn-X-Ser/Thr, где «X» — любая аминокислота, кроме Pro [73]. Синтез N-гликанов у эукариот начинается на молекуле долихолфосфата, после чего собранный олигосахарид, содержащий до 14 моносахаров, переносится на белок (Рисунок 3).

Endoplasmic Reticulum

Golgi

Oligosaccharyl» •• transferase fitV

Jq-glucQsidase a-glucosldase

J T ^

9 V

:e llER a-MAN i

P N

NANA:NGNA ratio can vary:

Terminal sialylation and antennarlty levels can vary:

\rflAN II

Л Glc О Man ■ Glc Ac A Fuc О NANA О NGNA О Gal

%P

^ UDP-Я4

::

Galactosyl 1вГ

CMP -O • transferase 1 fucosyllransferase

и

GDP-A

Ш Siff ssaTT vv^V

CMP -O Y 4--Fucosyltransferase Y uop__ ¥

Л II UDP-O II "«-— 'I 1

II CMP -ф GOP-A w T

' All ^Hl IIV N

"T N N N \_UDP-И

N

Г \GriT V

f UDP-И V

A

Рисунок 3. Пути гликозилирования в клетках СНО. В ЭПР прекурсор Glc3Man9GlcNAc2 переносится от донора долихолфосфата к остатку асапарагина. Конечный углеводный состав и структура гликопротеина (степень разветвленности и сиалирования) могут варьироваться в зависимости от условий культивирования клеток и уровней экспрессии какдого фермента. Источник: [69].

Cодержание терминальной сиаловой, или !М-ацетилнейраминовой кислоты (МАМА), в гликопротеине зачастую связано с периодом полувыведения из кровотока и, как следствие, является контролируемым показателем качества биофармацевтического продукта. Так, например, для эритропоэтина было показано влияние степени сиалирования на фармакокинетические параметры [74,75]. Исключением являются моноклональные антитела IgG1, для которых не наблюдали существенной разницы в скорости клиренса молекул с различным количеством сиаловой кислоты [76]. №гликолилнейраминовая кислота (NGNA) представляет собой производное , которое является онкофетальным антигеном и не

обнаруживается в организме взрослого человека [77], но присутствует в клетках ^^О и NS0 [78,79]. Белки с низким содержанием NGNA (например, в ЭПО около 1% от общего количества сиаловых кислот составляет NGNA) вызывают незначительный иммунный ответ, однако белки с более высоким содержанием ^ОМА (например, фетуин содержит 7% МОМА) иммуногенны [78]. Содержание галактозы (Gal) зачастую влияет на уровень терминального сиалирования.

Р(1,4)-связанная Gal, экспонируемая на конце N-гликана, распознается асиалогликопротеиновыми рецепторами печени [80]. Как манноза (Man), так и N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) также могут модулировать эффективность и фармакокинетику терапевтиеского гликопротеина. Гликопротеины с терминальными Man и GlcNAc связываются через маннозный рецептор циркулирующих естественных киллеров и макрофагов либо удаляются через ретикуло-эндотелиальную систему печени [81]. Высокоманнозные или гибридные гликаны могут вызывать иммунный ответ, что в некоторых случаях, например, для таргетной доставки лекарств, является желательным. Так, церезим, рекомбинантный фермент для лечения болезни Гоше, содержит терминальные структуры высокоманнозного типа, что облегчает распознавание макрофагами и захват через маннозные рецепторы на поверхности клеток [74]. N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) играет основную роль в определении разветвленности N-гликанов и результирующего уровня терминального гликозилирования. Для ЭПО было установлено, что тетрасиалированные тетраантеннные N-гликаны повышают биологическую активность in vivo [82]. Для антагониста фактора некроза опухоли а ленерцепта фармакокинетическая вариабельность коррелировала исключительно с уровнем терминальной GlcNAc, но не Gal, NANA или NGNA [82]. Наличие a(1,6)-Fuc, присоединенной к N-гликанам, необходимо для функционирования антител, включая связывание Fc-рецепторов и антителозависимую клеточную цитотоксичность [83].

-связанные гликан име т до восьми различных коровых структур (Рисунок 2). -связанное гликозилирование происходит в ЭПР или в аппарате Гольджи по остаткам Ser или Thr, но его труднее предсказать из-за отсутствия консенсусных последовательностей гликозилирования. O-гликаны менее разветвлены, чем большинство N-гликанов, и обычно представля т собой биантенн е структур . становлено, что -гликан игра т ва ну роль в межклеточных взаимодействиях иммунных реакциях. Авторами [83] было обнаружено, что у пациентов, получавших рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный

колониестимулирующий фактор, не вырабатывались антитела, если гликопротеин содержал как -, так и -связанн е гликан . нтитела образовывались только после отепления -гликанов, что связывали с узнаванием пептидного кора молекулы, замаскированного О-гликанами. В другом исследовании было показано, что аналоги ФСГ длительного действия с большим количеством О-связанных сайтов гликозилирования обладают сниженной биологической активностью по сравнению с аналогами с N-связанными сайтами [83].

ля получения терапевтических гликопротеинов предпочтительно использовать экспрессионные систем , основанные на культурах клеток млекопита их, потому что их встроенный механизм процессинга белков, в том числе гликозилирования, сходен с человеческим (Рисунок 3). Контроль гликозилирования можно осуществлять на уровне

подбора/инжиниринга клеточной линии, инжиниринга белка и изменения состава культуральной среды и параметров биопроцесса.

Для моноклональных антител, продуцируемых клетками СНО, NSO или Sp2/0, было показано, что профиль гликозилирования может различаться как между видами, так и внутри видов, а также существенно зависит от условий культивирования [83].

Известно, что режим культивирования (простое периодическое культивирование, периодическое с подпиткой и полунепрерывная перфузия) может оказывать заметное влияние на получаемый профиль гликоформ [84]. Профили гликозилирования щелочной фосфатазы сравнивали для линий-продуцентов на основе CHO DG44 с неамплифицированным и амплифицированных под действием MTX трансгеном, культивируемых в различных режимах [85]. Для амплифицированной линии было характерно меньшее количество маннозилированных гликанов, а также меньшее общее сиалирование. Общее сиалирование было повышено для образцов, полученных в перфузионном режиме по сравнению с периодическим режимом с подпиткой — по-видимому, более медленный рост клеток в перфузионном режиме способствовал более полному гликозилировани белка по сравнени с периодическим ре имом с подпиткой, в котором клетки росли быстрее.

Культуральная среда для клеток представляет собой смесь 50-100 химически определенных компонентов, но также может содержать и химически неопределённые компоненты — пептоны, дрожжевые экстракты, растительные гидролизаты и сыворотку, все они могут влиять на профиль изоформ [86]. В настоящее время в биофармацевтической отрасли не используют сыворотки и другие компонентов животного происхождения [87]. Показано влияние глюкозы, глутамина и галактозы на профиль гликозилирования. В непрерывной культуре CHO с ограниченным содержанием глюкозы fern получен IFN-y с низким содержанием гликоформ [88]. Культивация с подпиткой при содержании глутамина ниже 0,1 мМ и глюкозы 0,7 мМ приводила к снижению сиалирования и увеличению доли гибридных и высокоманнозных гликанов для IFN-y [89]. Предполагается, что более низкие уровни гликозилирования (меньшая доля сайтов, занятых гликанами) могут быть связаны со сниженной концентрацией UDP-GlcNAc в культурах, для которых поступление глюкозы и глутамина ограничено [90]. В то же время для другого гликопротеина (слитый белок IgG-IL2 человека), полученного в культуре ВНК-21, не наблюдали различия в профиле олигосахаридов при низких концентрациях глюкозы и глутамина [91]. Добавление галактозы в культуральную среду в сочетании с марганцем может способствовать более полному профилю галактозилирования N-гликанов [92,93]. Использование аминокислотн х добавок оказ вает поло ительное влияние на роста и продуктивность клеток, но может вызывать изменения в профиле гликозилирования. Добавление дополнительных аминокислот (цистеин, изолейцин, лейцин, триптофан, валин, аспарагин, аспарагиновая кислота

и глутамат), деплетированных в ранней культуре, в случае ЭПО вызывало увеличение низкосиалилированной фракции [93]. Липидные добавки (долихол) улучшают занятость сайтов N-гликозилирования для IFN-y [94]. Предшественники нуклеотидов-сахаров также могут модулировать уровни сиалирования и разветвленности. ЭПО-секретирующая культура СНО-К1 при добавлении глюкозамина в концентрации 10 мМ и выше снижала сиалирование тетрасиалированных гликанов на 41% и долю тетраантеннарных гликанов на 37 %, при этом внутриклеточный пул UDP-GlcNAc был как минимум в 2 раза выше при добавлении аммиака или глюкозамина [95]. К клеткам-продуцентам тканевого ингибитора металлопротеиназ 1 на основе GS-CHO и GS-NS0 добавляли 10 мМ глюкозамина и 2 мМ уридина, а также 20 мМ N-ацетилманнозамина с целью увеличения внутриклеточного пула УДФ-Ы-ацетилгексозамина [96]. Культуры при добавлении глюкозамина и уридина повышали уровни N-ацетилгексозамина, что в сво очередь пов ало разветвленность -гликанов в клетках С , но не в клетках S0. Однако следует отметить, что данное явление сопровождалось снижением сиалирования.

1.2 Организация промышленного процесса получения биофармацевтических продуктов: процессы upstream и downstream

Производственный процесс биотехнологического лекарственного препарата подразделяется на процессы upstream (культивирование линий, продуцирующих целевой белок) и downstream (выделение, очистка и концентрирование целевого белка). Рисунок 4 отражает основные этап биофармацевтического технологического процесса.

Production bioneactor Inoculum ■—j

Plate or SlocK Flask ртерапайоп ^J Centrifugation or titration Precipitation and/or liquid liquid

Culture al -Й0°С * I harvesting) extraction

Low rasol Jtior purification slaps

Croitiatographiy

Viral Polishing Viral 01аЫ№Лкзп D ^uiatlorj:

inadrafcn cra™a,ography nitration Dialll"a,l0ft (Protein + Buffer

1

Л

Salt + Projetants) ШИнвоп

Quality control and packaging

Final biopnam&cauticaJ

*

A

» s

Higft resolution purification sleps

Рисунок 4. Схема технологического процесса получения биофармацевтического продукта.

Источник: [97].

Основной целью культивирования является трансформация субстрата в интересующий продукт с максимальн м выходом [98]. а данном этапе происходит формулирование ростовой среды, подготовка посевного материала из рабочего клеточного банка, наращиваение инокулята в колбах, инокуляция биоректора, культивирование в биореакторе.

Выходы продукта со стадии культивирования в основном зависят от биологических пределов (например, от свойств клеточной линии или состава среды) и могут быть повышены без увеличения затрат, поскольку процессы, генерирующие более высокие титры, происходят в тех же обемах культивации. Урожай поступает на очистку, разработанную для гораздо меньших количеств продукта, однако ввиду ограниченной производительности оборудования для обработки больших количеств нужно увеличивать время операции и/или расход материалов. Пропускная способность процессов очистки всегда масштабируется, причем по крайней мере линейно. ри низких титрах продукта наработка продукта доро е, чем его очистка, но более высокие титры смещают основные производственные затраты на очистку и приводят к нелинейному увеличению общих затрат на производственный процесс [99]. Эта проблема усугубляется изменением типа и концентрации примесей, возника их в результате изменений условий процесса [100,101].

По окончании процесса культивирования фракция, содержащая целевой продукт (кондиционированная культуральная среда в случае клеток СНО), поступает на этап выделения и очистки, котор й нацелен на удаление не елательных примесей при сохранении целевого продукта. лассификация основн х способов очистки приведена в Таблице 1. ри разработке процессов очистки основное внимание уделяется выходу, а также чистоте и производительности процесса.

В процессах с низким выходом на культивации часто требуется этап концентрирования для уменьшения объёмов обработки для дальнейшей очистки. Первый этап процесса очистки — удаление клеток и дебриса (осветление) — обычно выполняется путем центрифугирования и/или глубинной фильтрации. Далее следует, как правило, этап захвата целевой молекулы. Последующие этапы удаляют остаточные контаминанты, а на финальном этапе удаляются следовые контаминанты и нецелевые формы молекулы. Существует альтернативная обратная стратегия, при которой в начале процесса улавлива тся основные загрязнители, а продукт очищается на последующих этапах, что может быть более экономичным, особенно если продукт не в деляется из клеток. В случае если продукт секретируется в среду, он, как правило, будет составлять не более 1-5 % от общего клеточного белка, и специфическое связывание клеточных белков на этапе захвата окажет большое влияние на эффективность этого этапа. После очистки выполняют перевод целевого продукта в буферный раствор, в котором он хранится в течение регламентированного времени до выполнения дальнейших технологических этапов. Перед

хранением готовой субстанции необходимо удалить потенциальные остаточные количества посторонних примесей, например, бактерий и грибов, обычно с помощью фильтров с размером пор 0,2 мкм.

Таблица 1. Классификация способов очистки целевого продукта в биофармацевтическом производстве.

Метод разделения Принцип разделения Физико-химическое свойство в основе разделения

Фильтрация Микрофильтрация Размер

Ультрафильтрация Размер

Нанофильтрация Размер

Диализ Размер

Заряженные мембраны Заряд

Глубинная фильтрация Размер

Центрифугирование Изопикническое фракционирование Плотность

Неравновесное осаждение Плотность

Экстракция Флюидная экстракция Растворимость

Жидкостно-жидкостная экстракция Распределение, изменение растворимости

Осаждение Фракционное осакдение Изменение растворимости

Хроматография Ионообменная Заряд

Эксклюзионная (гель-фильтрация) Размер

Аффинная Специфическое лиганд-субстратное взаимодействие

Гидрофобная Гидрофобность

Адсорбционная Ковалентное/нековалентное связывание

1.2.1 Разработка и оптимизация культуральных сред

Ранние среды для культивирования клеток, такие как Ham F10 или модифицированная среда Eagle от Dulbecco, были основаны на добавках сыворотки крови. В 1970-х и 1980-х годах было разработано множество сред без сыворотки, а в дальнейшем и вовсе отказались от всех компонентов животного происхождения, чтобы избежать перенесения животных патогенов. Сегодня используют так называемые среды с определенным химическим составом [102,103].

Состав среды является ключевым фактором повышения продуктивности и роста клеток и влияет на качество продукта [104]. Оптимальная смесь компонентов среды сегодня решается в индивидуальном порядке из-за большого разнообразия клеточных линий, процессов, компонентов среды и метаболических путей. Наиболее распространенные стратегии оптимизации состава сред основаны на титровании компонентов, сме ивании сред, анализе отработанных сред и автоматическом скрининге [105]. Традиционно среда разрабатывались путем изменения одного фактора за раз, однако сегодня в процессах промышленной разработки применяются высокопроизводительные методы [106]. При разработке питательных сред

варьируют концентрации компонентов основной среды и оценивают скорости потребления питательных веществ и накопления примесей, баланс роста клеток и объемной продуктивности [105,107,108].

1.2.2 Режимы культивирования

В биофармацевтической индустрии сегодня используют следующие типы культивирования клеток млекопитающих: простой периодический (batch), периодический с подпиткой (fed-batch), перфузионный (perfusion) — частный случай непрерывного процесса (continuous).

При простом периодическом культивирование клеточную культуру инокулируют в фиксированн й рабочий объем сред в биореакторе, введение дополнительных добавок по ходу процесса не предусматривается. В течение процесса (около 7 дней) в закр той системе истощаются питательные вещества и накапливаются токсичные побочные продукты, поэтому продуктивная фаза культивации составляет несколько дней, а плотность клеток и титры продукта сравнительно низкие (1-5 млн клеток на мл и до 200 мг/л соответственно [109]). Периодическое культивирование наиболее простое в исполнении и несет минимальн е риски контаминации, поэтому этот способ часто применяют на ранних стадиях разработки процесса до оптимизаций условий культивирования.

ериодическое культивирование с подпиткой начинается как периодическое, то есть основные компоненты сред и инокулят вносятся в начале культивирования, однако предусматривает добавление высококонцентрированных свежих питательных компонентов в процессе культивации. Питательные вещества добавляются непрерывно или периодически (болюсное введение). При этом достигаются высокие концентрации субстрата и, как следствие, в сокие клеточн е плотности и титр продукта, однако токсичные метаболит по-пре нему остаются в среде. Как правило, кормление начинают при истощении глюкозы или при накоплении вредных побочных продуктов (например, аммиака > 3 ммоль/л). Периодическое культивирование с подпиткой, как правило, длится 10-14 дней, однако может быть эффективно продлено до 3-4 недель при понижении температуры культивации (temperature shift). Пиковая плотность клеток СНО обычно составляет 10-30 млн клеток/мл, а типичные концентрации продукта на примере моноклональных антител находятся в диапазоне 3-5 г/л, также имеются сообщения о концентрациях более 10 г/л [42,110-112]. Большинство зарегистрированных на момент написания данной работы биотерапевтических препаратов производятся с помощью периодического культивирования с подпиткой в силу дости ения в соких титров при минимальном расходе культуральной среды, а также надежности и простоты масштабирования [109,113].

Непрерывное культивирование (continuous) происходит при постоянном объеме с непрерывной подачей свежей культуральной среды в биореактор и одновременным удалением такой же порции отработанной среды. Процесс можно осуществить в реакторе при постоянной скорости подачи питательн х компонентов (хемостате) или при поддер ании постоянной клеточной плотности (турбидостате). Частным вариантом непрерывного процесса является перфузионное культивирование (perfusion), при котором часть отработанной среды удаляется из реактора в обмен на свежую, однако биомасса удерживается в системе. Этот процесс является наболее сложным с точки зрения технологии и соблюдения стерильности, расход культуральной среды и объем урожая значительно выше, чем для периодических процессов [114]. Данный режим может применяться как для прикрепленных, так и для суспензионных культур при условии наличия устройства удержания биомассы [115]. Масштабируемые устройства сепарации основаны на фильтрации, самой распространенной из котор х является система тангенциальной фильтрации ATF (alternating tangential flow, переменный тангенциальный поток), гравитационном отстаивании и центрифугировании [116]. С точки зрения физиологии перфузионный процесс наиболее похо на естественн е условия обитания клеток млекопита их, поскольку культура бесперебойно получает питательные ве ества, а токсичные побочные продукты удаляются из системы. Эти факторы позволяют увеличить время культивирования до нескольких месяцев [117]. Основным преимуществом перфузионного режима является достижение особенно высоких клеточных плотностей (30-80 млн клеток/мл, иногда до 200 млн клеток/мл [118]) и высокой производительности (титр рекомбинантного антитела до 25 г/л) в биореакторе небольшого размера. Вместе с этим, короткое время хранения продукта позволяет использовать перфузи для получения нестабильных белков (фактора свёртывания крови VIII [119]) и ферментов [117]. Тем не менее, перфузионное культивирование применяется в менее 10% промышленных процессов культивирования клеток млекопитающих из-за высоких требований к автоматизации, а также проектирования большинства производственных установок под периодическое культивирование с подпиткой [120,121].

1.2.3 Критические параметры культивирования

ля получения продукта дол ного качества так е необходима оптимизация рабочих параметров культивации: физической природы (температуры, расхода газа и скорости перемешивания), химической природы (растворенного кислорода и углекислого газа, pH, осмоляльности, окислительно-восстановительного потенциала и уровней метаболитов) и биологической природа (концентрации клеток, жизнеспособности, уровней НАДН, Л1Г митохондриальной активности и анализа клеточного цикла). Даже малейшие изменения параметров микросреды могут оказать существенное влияние на титр и качество продукта, что

критично в особенности в тех случаях, когда для белка характерна микрогетерогенность гликанов [42]. Типичный биореактор с перемешиванием оснащен контроллерами температуры, давления, перемешивания, pH и растворенного кислорода.

При инокуляции важно соблюдение определенной посевной плотности (как правило, не менее 100 тыс кл/мл) и перенесение определенной доли кондиционированной среды, в которой присутствуют синтезированные клетками факторы роста. Для клеток млекопитающих, не име их клеточной стенки, критичн м становится осмотическое давление. В отсутствие осмопротекторов приемлемый диапазон осмоляльности составляет 250-400 мОсм/кг, большинство сред для культивирования клеток имеют осмоляльность в диапазоне 270-330 мОсм/кг [42]. Однако имеются сведения о повышении продуктивности некоторых клеточных линий при гиперосмоляльности. Так, повышение осмоляльности до 470 мОсм/кг в сочетании с гипотермией позволило снизить агрегацию интерферона-Р и увеличить специфическую продуктивность клеток CHO [122].

Уровень рН для CHO должен поддерживаться в диапазоне 6,7-7,4 и является важным параметром, влияющим на титр и качество продукта [123]. Синтезируемые клетками продукты метаболизма — лактат, аммоний и С02 — могут смещать рН. Для поддержания pH культуральные среды обычно содержат бикарбонат натрия в качестве компонента буферной системы, снижают рН инжекцией CO2, повышают — титрованием щелочью.

Содержание кислорода в среде для разных культур может варьироваться и обеспечивается поступлением воздуха или дополнительной подачей кислорода. Растворенный кислород обычно поддерживают между 20-50 % насыщения воздуха. Пониженное содержание растворенного кислорода может привести к ухудшению пролиферации и чрезмерному накоплению лактата, повышенное — к цитотоксичности и окислительным повреждениям [124]. В диапазоне 20-100 % насыщения воздухом клетки относительно нечувствителены к содержанию кислорода с точки зрения скорости роста [125], однако варьирование насыщения кислородом может сказаться на качестве продукта (известно о снижении N-гликозилирования для антител при понижении содержания растворенного кислорода [84]).

В некоторых случаях спустя некоторое время после инокуляции (через несколько суток) применяют температурный сдвиг, понижая температуру с 37 °С до 30-35 °С, что помогает дольше удерживать клетки в фазе G1 и приводить к большему накоплению продукта [126-128].

казанные параметр дол ны подвергаться мониторингу татным оборудованием биореактора (on-line), что позволяет снизить риск контаминации, или при помощи внешнего оборудования после отбора пробы оператором (off-line). Контроль температуры, рН и рО2 осуществляется обычно on-line. В настоящее время для измерения рН и рО2 применяются оптические сенсоры, изменяющие интенсивность флюоресценции в зависимости от величины

измеряемого параметра [129]. Особенного внимания требует мониторинг клеточных параметров — плотности, выживаемости, что контролируется на сегодня off-line микроскопически или при помощи автоматического анализатора клеток. В разработке находится возможность применения in situ микроскопии [130].

1.2.4 Хроматографическое разделение

В основе очистки ле ат, как правило, несколько хроматографических стадий, наиболее часто применяют ионообменную, аффинную, гидрофобную, эксклюзионную хроматографию [131]. Отдельного внимания заслуживает способ очистки при помощи аффинной хроматографии, поскольку такая хроматография на основании в сокой селективности позволяет отделить целевой белок от примесей как неродственной, так и, зачастую, родственной природы.

Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография основана на обратимом ионном обмене между заряженными частицами поступающего на колонку раствора и противоположно заряженными функциональными группами сорбента. Тип необходимой колонки определяется свойствами очищаемых белков: изоэлектрической точкой и плотностью заряда. Анионообменники связывают отрицательно заряженные молекулы, а катионообменники — положительно заря енные. онообменная хроматография мо ет использоваться в отрицательном ре име, то есть продукт наносится на колонку в условиях, благоприятствующих связыванию примесей, в то время как целевой белок оказывается в несорбируемой фракции [132]. В ионообменной хроматографии с градиентом солей концентрация соли в элюирующем буфере увеличивается непрерывно или ступенчато. Чем прочнее связывание белка с ионообменником, тем поте он появится в элюирующем буфере. Аналогично, если при хроматографировании применяется градиент pH, то значение pH изменяется непрерывно или ступенчато. Вследствие гетерогенности гликозилирования (например, различного количества остатков сиаловой кислоты), гликозилированные белки могут элюироваться в относительно широком диапазоне pH (до двух единиц pH).

Иммуноаффинная хроматография

Иммуноаффинная хроматография основана на специфическом связывании антител с их эпитопами [133]. Преимуществами иммуноаффинной хроматографии являются её высокая специфичность и сочетание концентрирования и очистки в один этап. едостатком иммуноаффинн х методов порой является весьма сильное связ вание антитела с антигеном, что требует жёстких условий элюирования. В таких условиях чувствительные лиганды могут повреждаться вследствие денатурации очищаемого белка. Эту проблему можно решить, подобрав такие антитела и условия хроматографирования, котор е сочета т высоку

специфичностью и достаточную аффинность с возможностью высвобождения лиганда в мягких условиях. Другой проблемой является разрушение ковалентной связи, соединяющей антитело с матрицей, что ведет к отрыву антител от матрикса и загрязнению ими целевого продукта. Поэтому на практике после аффинной хроматографии почти всегда необходим дополнительный этап очистки, а также соответствующий анализ на определение уровней утекающих примесей (например, ИФА). Масштабирование иммуноаффинной хроматографии часто затрудняется относительно большим количеством необходимого специфического антитела и отсутствием коммерчески доступных, готовых к использованию сорбентов. Более того, введение в технологический процесс иммуноаффинной хроматографии может существенно влиять на конечную стоимость продукции.

Гидрофобная хроматография

Гидрофобная хроматография основана на нековалентных и неэлектростатических взаимодействиях между белками и неподвижной фазой. В физиологических условиях большинство гидрофобных аминокислотных остатков расположено внутри ядра белка, и лишь небольшая их часть экспонирована на поверхности белка. Их экспонирование подавляется присутствием гидрофильных аминокислот, которые притягивают большие кластеры молекул воды и образуют экран. Высокие концентрации солей снижают гидратацию белка, и гидрофобные аминокислотные остатки, экспонированные на поверхности, становятся более доступными. Гидрофобная хроматография — это мягкий метод, обычно обеспечивающий в соку степень извлечения неповре денных белков с правильной структурой и отделением от структурно родственных примесей, он идеально подходит для процессов после ионообменной хроматографии, где белок обычно высвобождается в элюирующих растворах с высокой ионной силой [134].

Эксклюзионная хроматография

Гель-проникающая, или эксклюзионная хроматография, также известная как гель-фильтрация, разделяет молекулы в зависимости от их формы и размера. Чем меньше размер белка, тем больший объём доступен для его диспергирования внутри сорбента с узким распределением размеров пор в диапазоне размеров белков. При непрерывном потоке буфера через колонку более крупные белки элюируются первыми, а мелкие — последними. Гель-фильтрация является хорошей альтернативой мембранной диафильтрации для замены буфера практически на любой стадии очистки. Однако в промышленных масштабах использование этого метода об чно ограничено, главн м образом из-за медленной скорости процесса и возмо ности нанесения относительно небольших объёмов образца (до одной трети объёма колонки). Поэтому данный способ зачастую используется на поздних этапах очистки, когда белок оказывается в высококонцентрированной форме, например, на заключительном этапе формуляции.

1.2.5 Примеси в биофармацевтическом производстве

В биотехнологических продуктах могут присутствовать примеси, связанные с продуктом и процессом, а также с родительской линией [129]. Классификация биотехнологических примесей приведена в Таблице 2. Примеси представляют потенциальную опасность для здоровья, поскольку могут быть распознан пациентом как антиген , и при повторном введении препарата у пациента может проявиться иммунная реакция. Некоторые примеси также могут влиять на эффективность препарата, например, связываясь с эпитопом, важным для выполнения молекулой своих функций.

Таблица 2. Классификация примесей в биофармацевтическом производстве.

Связанные с родительской линией Связанные с продуктом Связанные с процессом

• Вирусы • Вариации • ирусы

• Бактерии (микоплазмы) гликозилирования • Бактерии

• Хозяйские белки и ДНК • Замена и делеция • омпоненты сред для

• Эндотоксины (из аминокислот культивирования

грамотрицательных бактерий) • Денатурация белка клеток

(потеря вторичной, • Реагента для очистки

третичной, четвертичной • еталл

структуры) • мываемые

• Окисленние вещества с сорбентов

• Конформационные • Вымываемые

изомер вещества из

• имеризация и агрегация одноразовых систем

• Варианта парных

дисульфидных групп

• бразование сукцинимида

• (Дез)амидирование

• рагментация белка

Остаточная ДНК продуцента

спользование перевиваем х линий клеток млекопита их для получения рекомбинантных белков может привести к появлению в конечном продукте фрагментов ДНК, содержащих онкогены [135]. Существует ряд подходов для подтверждения того, что процесс очистки удаляет клеточную ДНК и РНК до безопасного уровня. Один из таких подходов заключается в инкубации клеточной линии с радиоактивно меченными нуклеотидами и определении радиоактивности в очищенном продукте, полученном в результате очистки.

ругими методами явля тся анализ , основанные на Р. Вопрос о безопасном уровне нуклеиновых кислот в биотехнологических продуктах остается дискуссионным. Тем не менее, по требованиям ВОЗ, контаминация конечного продукта нуклеиновыми кислотами не должна

превышать 100 пг или 10 нг на дозу в зависимости от типа клеток, используемых для производства фармацевтического препарата [136].

Остаточные белки продуцента

Белки клетки-хозяина, или белки штамма-продуцента (БШП), являются основным типом биотехнологических примесей. БШП одного процесса могут существенно отличаются друг от друга по своей молекулярной массе, изоэлектрической точке, гидрофобности и структуре. Состав БШП сильно зависит от зависит от нескольких факторов: организма-хозяина, клеточного клона, целевого белка, изнеспособности, стадии культивирования клеток, условий процесса культивации и сбора урожая [137-139]. Было продемонстрировано влияние возраста и жизнеспособности клеточной культуры на состав БШП. В конце биопроцесса клетки производят другие белки, не ели чем в начале, и их количество значительно увеличивается на стадии снижения жизнеспособности [140]. Данные результата указывают на то, что время сбора урожая имеет решающее значение для итогового спектра примесей, которые поступают в переработку. Условия процесса также влияют на профиль БШП. Так, уровень БШП может изменяться в 0,5-7 раз вслед за изменениями температуры, аэрации, стратегии внесения добавок, состава среды, продолжительности культивирования клеток и условий сбора урожая [139].

Нецелевые варианты продукта

Компоненты, связанные с продуктом, представляют собой молекулярные варианты желаемой молекулы-мишени, предшественники, продукты деградации, агрегаты или варианты продукта с различной посттрансляционной модификацией [141]. Такие молекулы считаются вариантами продукта. Они возникают в процессе производства или во время хранения и обладают другими свойствами по сравнению с целевым продуктом в отношении активности, эффективности и безопасности.

Ва но отметить, что рекомбинантн е белки, продуцируем е в клетках, априори обладают вариабельной структурой на уровне гликозилирования, поскольку гликозилирование белка не определяется последовательностью ДНК, а зависит от путей клеточного метаболизма [142]. Гетерогенность углеводов может быть обусловлена размером цепи, типом олигосахарида и последовательность углеводов. аличие и природа олигосахаридн х боков х цепей в белках влияют на ряд важных характеристик, таких как период полувыведения из крови, растворимость и стабильность белка, а иногда даже на его фармакологическую функцию [143]. Это было продемонстрировано для ряда рекомбинантных продуктов, включая моноклональные антитела, интерлейкин-4, хорионический гонадотропин, эритропоэтин и тканевой активатор плазминогена. Так, дарбэпоэтин, генетически модифицированный эритропоэтин второго поколения, содержит 50% углеводов по сравнению с 40% для нативной молекулы, что увеличивает период полувыведения in vivo с 8 ч для эритропоэтина до 25 ч для дарбэпоэтина [144]. Для мкАТ

повышение степени фукозилирования антитела усиливает антителозависимую клеточную цитотоксичность [145].

1.2.6 Очистка от вирусов

Неотъемлемым этапом очистки также является удаление вирусов, что регулируется как международными (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH) [146], так и российскими регуляторными требованиями (ГФ РФ). ОФС.1.7.1.0007.15 «Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК» сообщает о том, что должны быть предусмотрены стадии, позволяющие удалять и/или инактивировать оболочечные и безоболочечные вирусы [147]. Хотя риск занесения инфекционных агентов при производстве препаратов генно-инженерным путем существенно ниже, чем при получении их из донорской крови, сохраняется некоторая возможность вирусной контаминации, потенциальными источниками которой могут служить как исходная клеточная линия, так и манипуляции в процессе производства. Клетки главного клеточного банка могут обладать персистентной или латентной вирусной инфекцией или е иметь эндогенну встроенную в геном ретровирусную конструкцию, которая передается вертикально и может экспрессироваться конститутивно или внезапно активироваться с экспрессией инфекционных частиц. Вирусные агенты могут попадать в клетки или в промежуточный либо финальный продукт различными путями: при использовании в качестве источника первичной культуры зараженных животных, при применении вируса в процессе создания клеточной линии, при применении контаминированных реагентов для культивации (сыворотки), при очистке или в случае контаминации вспомогательных веществ.

Согласно требованиям нормативн х актов, очистка от вирусов дол на происходить по меньшей мере в 2 этапа, в основе которых лежат различные механизмы, причем каждый из них обеспечивает снижение тира вирусов (лог вирусов) как минимум на два порядка [148]. Методы вирусной деконтаминации мо но разделить на две группы: инактивация вирусов и очистка от вирусов [149] (Таблица 3).

Таблица 3. Методы вирусной деконтаминации, используемые в процессе очистки биофармацевтического продукта.

Категория Метод Пример

Вирусная инактивации Температурная инактивация Пастеризация

рН-инактивация Низкий рН

нактивация действием жесткого облучения УФ УФ-облучение

Дегидратация Лиофилизация

Сшивающие, денатурирующие или разрушающие агенты Р-пропиолактон, формальдегид, №ОН, органические растворители (хлороформ), моющие средства (холат натрия)

Нейтрализация Специфические нейтрализующие антитела

Удаление вирусов Хроматография Ионообменная, иммуноаффинная хроматография

Фильтрация Нанофильтрация, (^-мембраны

Преципитация Криопреципитация, преципитация этанолом

1.3 Диагностические реагенты для детекции COVID-19

1.3.1 Рецептор-связывающий домен шиповидного белка коронавируса SARS-CoV-2 и его применение в иммунодиагностике

В 2019 году человечество столкнулось с беспрецедентной проблемой — пандемией COVID-19, вызванной появлением нового коронавируса SARS-CoV-2. Быстрое распространение и тя есть заболевания вызвали потребность в массовом диагностическом тестировании. н необходим для проникновения в клетку, но не для сборки вируса [157]. В первые месяцы пандемии основным инструментом диагностики стали методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), поскольку разработка соответствующих тест-систем возможна в сжатые сроки после появления нового патогена. Серологическая диагностика, в свою очередь, позволяет достоверно выявлять факт инфицирования SARS-CoV-2, в том числе при бессимптомном течении или через длительное время после исчезновения клинических проявлений. Серологические тесты также критически важны для отбора донорской реконвалесцентной плазмы с терапевтическими целями и для оценки иммуногенности разрабатываемых вакцин. качестве мишени для серодиагностики иммунодоминантным и наиболее специфичным антигеном SARS-CoV-2 выступает рецептор-связывающий домен (RBD) шиповидного белка [152]. Другой широко используемый антиген — нуклеокапсидный белок (НП) — демонстрирует высокую аналитическую чувствительность, но уступает в специфичности [152]. S-белок и его фрагменты применя т не только для рутинного в явления антител, но и для картирования эпитопов нейтрализующих антител (по аналогии с исследованиями для SARS-CoV [153]), а также в суррогатных тестах нейтрализации, основанных на ингибировании взаимодействия S-белка с клеточным рецептором — ангиотензин-превращающим ферментом 2 (^1Ф2) [154]. S-белок выполняет ключевую функцию в распознавании рецептора, слиянии мембран, интернализации вируса и его выходе из эндосом [155]. Таким образом, он абсолютно необходим для проникновения вируса в клетку-хозяина, однако не участвует в процессах сборки новых вирусных частиц [156]. Взаимодействуя с белками мембраны (М) и оболочки (Е), гомотример белка S транспортируется к месту сборке вируса. Для проникновения в клетку необходимо, чтобы гомотример S-белка связался с димером АПФ2 [157]. В инфицированных клетках S-белки многих коронавирусов, в т.ч. SARS-CoV-2 и MERS-CoV, но не SARS-CoV, распознаются фуриновой протеазой клетки-хозяина и подверга тся частичной протеолитической деградации с образованием двух субъединиц — S1 и S2 [158].

S-белок гликозилирован ^связанными гликанами, образующими так называемый гликанов й ит, который, вероятно, позволяет вирусу уйти от иммунного ответа. В сравнительном исследовании данн х полногеномного секвенирования природн х изолятов SARS-CoV-2 для 228 вариантов S-белка все 22 потенциальных сайта !М-гликозилирования эктодомена S-белка были полностью консервативны [159], что подтверждает ключевую роль этих сайтов в сохранении целостности гликанового щита. Однако не все из этих 22 потенциальных сайтов !М-гликозилирования были занята для субъединиц S1 и S2, получены раздельно рекомбинантным путем в культуре транзиентно трансфицированных клеток НЕК293 [160]. Фактически наличие №гликозилирования экспериментально было подтверждено только для 17 из 22 сайтов. Также в области RBD-домена S1-субъединицы был экспериментально обнару ен по крайней мере один сайт -гликозилирования с муциноподобными олигосахаридн ми структурами. Культуры дро евых клеток так е б ли использованы для получения S-белка или его фрагментов, однако в этом случае №гликаны присутствовали в основном в виде объемных структур с высоким содержанием маннозы или маломаннозы, блокирующих взаимодействие антител с S-белком [161]. Компьютерное моделирование гликанового щита для белка S, полученного в культуре клеток НЕК293, показало, что покрыто около 40% поверхности белка и таким образом эффективно защищено от антител IgG [162].

Использование полноразмерного S-белка для рутинного серологического тестирования практически невозможно из-за того, что он нерастворим (это свойство обусловленно его трансмембранным доменом). Для серологического тестирования использовали его искусственно тримеризованный эктодомена [163]; однако такой сложный белок затруднительно получить в больших количествах в клетках млекопитающих. Считается, что RBD S-белка SARS-CoV-2 представляет собой минимальный антиген, весьма близкий полноразмерному S-белку по своим иммуногенным свойствам. КВБ содержит только два занятых сайта !М-гликозилирования [160] и 1-2 занятых сайта О-гликозилирования, не подвергается тримеризации, и его поверхность в основном неэкранирована. RBD S-белков Р-коронавирусов были получены рекомбинантным способом в различных экспрессионных системах. При попытках экспрессии ^ВБ МЕКБ-СоУ в бактериях растворимый белок не образовывался, а попытки рефолдинга были безуспешны [164]. Дрожжевая система экспрессии, основанная на РюЫа рastoris, позволила получить RBD MERS-CoV с по крайней мере двумя из трех сайтами №гликозилированиями. Для SARS-CoV удаление всех сайтов -гликозилирования приводили к резкому падени уровня секреции белка дрожжами Р. рastoris; в случае полного домена RBD (остатки 318-536) секреция негликозилированного белка б ла полность остановлена [165].

Исходя из этих данных, можно предположить, что №гликозилирование необходимо для правильного фолдинга КВБ. RBD SARS-CoV-2 также был полностью нерастворим при

получении в прокариотических системах экспрессии (в клетках Escherichia coli); солюбилизированные тельца включения не были видны даже методом вестерн-блоттинга [166]. Гипергликозилированный SARS-CoV-2 RBD fern получен с довольно высоким титром (50 мг/л) в культуре дрожжей и успешно применялся для иммунизации мышей [167], однако гликозилированные белки дрожжевого происхождения не подходят для серологического исследования, так как содержат иммуногенные гликаны. Аналогичным образом, RBD SARS-CoV-2, полученный в растении Nicotiana benthamiana, содержит N-гликаны, характерные для беспозвоночных, которые потенциально реактивны с человеческими антителами [168].

На ранних этапах получения S-белка SARS-CoV-2 и его RBD работали с транзиентной трансфекцией клеток НЕК293 [160,169], очищая при этом небольшие порции белка. Например, сообщалось о титре более 20 мг/л в транзиентно трансфицированных клетках НЕК-293 [169]. Тем не менее, масштабируемость подобного процесса культивирования остается под вопросом — граммовые количества RBD для нужд массового серологического тестирования могут быть получены только в стабильно трансфицированных клеточных линиях.

1.3.2 Суррогатная вирус-нейтрализация как способ выявления нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в клинической практике

Важность серологического тестирования гуморального иммунного ответа против SARS-CoV-2 для общественного здравоохранения подтверждается огромным разнообразием тест-систем, одобренн х в настоя ее время в мире. Тем не менее, фундаментальным ограничением большинства доступных коммерческих тестов является их ориентация исключительно на количественное или качественное определение IgG/IgM, без оценки функциональной активности в являемых антител, в перву очередь их способности нейтрализовать вирус.

Эффективность многих из применяемых сегодня вакцин против SARS-CoV-2, согласно данным клинических исследований, составляет более 90 % в профилактике симптоматического COVID-19 [170]. Было обнаружено, что достигнутый протективный иммунитет тесно коррелирует с уровнем вируснейтрализующих антител (ВНА) [171]. Поскольку титры антител, в том числе ВНА, к SARS-CoV-2 снижаются со временем после вакцинации [172] или естественного инфицирования [173], для достижения желаемого коллективного иммунитета может потребоваться дополнительная вакцинация в последующие годы. Несмотря на принятие международных стандартов ВОЗ для анти-SARS-CoV-2 иммуноглобулинов, в настоящее время отсутствуют четкие корреляты защиты, то есть неизвестно, какой именно уровень ВНА или анти-B антител является достаточным для предотвра ения первичного или повторного зара ения SARS-CoV-2. Ответ на этот вопрос может быть найден путем массового количественного тестирования уровня В среди населения в целом.

Следует отметить, что, хотя ВНА являются подгруппой общих антигенсвязывающих антител (в случае SARS-CoV-2 они представляют собой антитела к S-белку), уровень ВНА слабо коррелирует с общим титром АТ и не может быть выведен из общего титра АТ [174]. Например, в исследовании реконвалесцентов COVID-19 (n = 149) коэффициент корреляции между уровнями ВНА и уровнями антител к RBD составил 0,64, при этом была выявлена большая подгруппа ВНА-отрицательных образцов со средними или высокими титрами антител к RBD [175]. Такая ограниченная корреляция основана на вариабельности подъема и снижения гуморального иммунного ответа у разных людей [176], несмотря на генерацию естественных клонов ВНА, главным образом, в виде антител к RBD [177].

аиболее точн м методом оценки В считается тест сни ения бля кообразования (plaque reduction neutralization test, PRNT), в котором адаптированный лабораторный штамм живого вируса добавляют к культуре чувствительных клеток с последующим подсчетом вирус-индуцированных бляшек. Титром ВНА принято считать максимальное разведение сыворотки, вызывающее снижение числа бляшек более чем на 50%, что делает результат полуколичественным. Для SARS-CoV-2 тест обычно проводят на клетках НЕК293, сверхэкспрессирующих рецептор АПФ2 [178], иногда в комбинации с протеазой TMPRSS2 [179], которая активирует S-белок, облегчая слияние вируса с мембраной. Хотя PRNT является эталонным методом, его применение ограничено необходимостью лаборатории уровня BSL-3, высокой трудоемкостью и длительностью (более двух суток), что исключает возможность массового скрининга [178]. Альтернативой служит тест нейтрализации псевдотипированного вируса (пВНТ), где живой вирус заменен менее опасным вирусным вектором (например, вирусом везикулярного стоматита), несущим S-белок SARS-CoV-2 и репортерный ген [180]. Этот метод может выполняться в условиях BSL-2, но по-прежнему требует работа ^ишми клетками, сло ного оборудования и нескольких дней, оставаясь непрактичным для рутинного скрининга.

В отличие от них, тест суррогатной вирус-нейтрализации (сВНТ) измеряет не инфекционность вируса, а способность сыворотки блокировать взаимодействие вирусного белка (RBD или S1) с растворимым рецептором АПФ2 в формате стандартного ИФА. Это делает сВНТ идеально подходящим для клинической практики, позволяя быстро и безопасно тестировать большое количество образцов в обычных лабораториях. В большинстве опубликованных протоколов сВНТ для SARS-CoV-2 используется схема с иммобилизованным АПФ2 и детектирующим коньюгатом ^BD-HRP, впервые описанная в [181] и доступная в виде коммерческих наборов. днако ряд исследований указывает на недостаточну корреляци результатов этого формата с данными классической вируснейтрализации, что ставит под сомнение его надежность как замены ВНТ [182,183].

Для оценки нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 методом сВНТ применяются две основные схемы анализа: 1) АПФ2:КВВ-НКР: иммобилизация интактного растворимого АПФ2 на планшете и детекция с помощью конъюгата ^ВВ-НКР; 2) ^ВВ:^1Ф2-НКР: иммобилизация рекомбинантного КВБ и детекция с помощью конъюгата АПФ2-НКР. Вторая схема, описанная в литературе (например, в виде трехслойного сэндвич-ИФА с биотинилированным АПФ2 и стрептавидин-НКР [184]), встречается реже.

есмотря на то что оба подхода оценива т блокирование одного и того е молекулярного взаимодействия (КВВ-^1Ф2), их результатах могут не быть полностью эквивалентными. Это связано с рядом технических факторов, таких как:

• различная стерическая доступность иммобилизованного лиганда (АПФ2 или RBD);

• возможность образования в растворе иммунных комплексов между антителами из сыворотки и детектируемым коньюгатом, что может приводить к неспецифическому усилению или подавлению сигнала.

1.4 Рекомбинантные гонадотропные гормоны для медицинского

применения

1.4.1 Общая характеристика гонадотропных гормонов

К гонадотпропным гормонам человека относят три гомона, отвечающим за репродуктивную функцию, из них два гормона — фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ) — секретируются передней долей гипофиза, а хорионический гонадотропин человека (ХГч) синтезируется по большей части плацентой при наступлении беременности. ЛГ, ФСГ, ХГч совместно с тиреотропным гормоном (ТТГ) образуют семейство гликопротеиновых гормонов и представля т собой гетеродимерные белки, состоя ие из обильно гликозилированных (около 30 % гормона по массе занимают углеводные остатки [185]), нековалентно связанных а- и Р-субъединиц (цепей). A-субъединицa является общей для всех представителей семейства гликопротеиновых гормонов (ХГч, ЛГ, ФСГ, ТТГ), состоит из 92 аминокислот, имеет два сайта -гликозилирования и 5 внутримолекулярн х дисульфидн х связей. В-субъединицы гликопротеиновых гормонов различаются по аминокислотному и углеводному составу, отвечают за специфичность связи с рецептором и, соответственно, опосредуют физиологический эффект и биологическую активность [186,187]. Структурное различие ме ду Гч, Г и СГ демонстрирует Рисунок 5.

А

u-Su buril H-N ' (92 aa)

LHtS HzN (121 aa)

♦ ♦ ♦ ♦

Y Y

so4 so.

Y

52

JL—-COOH 78

■ N-Aceiyl-glucosamine о Marinóse Galactose # Sialic acid

N-Ace tyl-ga lactosa mine

N

30

♦ ♦ * t

_гч

ceP HoN---Í3

(146 aa)

COOH

Б

у к

Y ■К

Y

N N

N

N

N N

а

ос

а

>0 N-0

FSH

N —< LH

v

Рисунок 5. Схематическое изображение гонадотропных горюнов.

А. A-субъединица идентична для всех представителей семейства гликопротеиновых гормонов, ß-субъединицы различаются по длине и гликозилированию.

Б. FSH - фолликулостимулирующий гормон, LH - лютеинизирующий гормон, hCG -хорионический гонадотропин человека. Источник: А [188], Б [189].

Профиль гликозилирования гонадотропина определяет заряд молекулы, биологическую активность и период полувыведения гормона [190]. Гликопротеины имеют два основных типа гликозилирования: N-связанное гликозилирование — N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), присоединенный к амидной группе аспарагина (Asn) в последовательности Asn-X-Ser/Thr (X -любая аминокислота, кроме Pro), и О-связанное гликозилирование — N-ацетилгалактозамин (GalNAc), присоединенный к гидроксильной группе серина (Ser) или треонина (Thr) [191-193]. Для гликанов зачастую характерно терминальное сиалирование или сульфатирование по остаткам GalNAc (SO3-4GalNAc) [194,195]. Молекулы с большим количеством сульфатированных групп элиминируются из кровотока быстрее, чем менее сульфатированные изоформы, вследствие сродства к рецепторам SO3-4GalNAc печени [196-198]. Напротив, в сокосиалированн е форм име т более длинн й период полув ведения из-за сродства к асиалогликопротеиновым рецепторам печени [197,198]. Гетерогенность олигосахаридов в гликопротеиновых гормонах бывает двух видов: макрогетерогенность, возникающая ввиду отсутствия одного или более остатка олигосахарида, и микрогетерогенность, возникающая ввиду переменного набора моносахаров и различных связей между ними [199].

Обе субъединицы транслируются как пре-белки, сопряженные с соответствующим СП [58]. Превращение пре-а и пре^-субъединиц, содержащих СП, в их зрелые формы осуществляется в результате двух ключевых процессов: котрансляционного отщепления

сигнального пептида [200]) и гликозилирования, протекающего как ко-, так и пост-трансляционно [201]). В случае ЛГ было непосредственно показано, что для корректного сворачивания Р-субъединицы необходимо присутствие в ЭР а-субъединицы, выполняющей роль шаперона [202]. Можно предположить, что in vivo фолдинг Р-цепей всех гликопротеиновых гормонов протекает в комплексе с а-цепью, однако строго подтвердить это для других гормонов затруднительно, так как in vitro Р-субъединицы способны сворачиваться и секретироваться клетками и в отсутствие а-цепи [203].

1.4.2 Структура и биологическая роль фолликулостимулирующего гормона

человека

Г секретируется гонадотропными клетками передней доли гипофиза, стимулирует рост и рекрутирование фолликулов яичников у женщин и инициирует сперматогенез у мужчин [204-206]. ФСГ представляет собой сильно гликозилированную молекулу, N-связанные гликаны составляют 30% белка по массе и присутствуют в основном в виде сильно разветвленных три- и тетраантенных структур комплексного типа (complex-type) с высоким уровнем терминального сиалирования [207]. А-субъединица ФСГ идентична а-субъединице гликопротеиновых гормонов. B-субъединица ФСГ состоит из 111 аминокислот и имеет два сайта N-гликозилирования (Asn7 и Asn24) [208]. Таким образом, гетеродимер ФСГ человека имеет 4 потенциальных сайта N-гликозилирования (oN52, oN78, PN7 и PN24) [199], часть из которых могут б ть не занят . Гетерогенность гликанов приводит к наличи различных изоформ гормона, что отражается на времени полувыведения (от 3 до 4 часов) и биологической активности [209]. Природный человеческий ФСГ в кровотоке содержит молекулы с тремя (гипогликозилированн й СГ) или четырьмя -связанными гликанами, рекомбинантный СГ полностью по всем четырем сайтам [210]. Олигосахара включают в себя остатки маннозы, галактозы, фукозы, GlcNAc, GalNAc, а также терминальные остатки сиаловой кислоты и в небольшой степени сульфатированный GlcNAc, придающие молекуле отрацательный заряд [211].

При этом для ФСГ более характерно сиалирование, чем сульфатирование [212]. Более кислые (в сокосиалированн е) гликоформы Г име т более длительн й период полувыведния из кровотока из-за сниженного клиренса асиалогликопротеиновыми рецепторами печени [197,213] и более низкого сродства к рецептору ФСГ [214]. Препарат ФСГ с высокой специфической биологической активность дол ен содер ать смесь нейтральных и кисл х изоформ [214].

ФСГ связывается со своим рецептором (FSHR), экспрессируемым в женском организме клетками гранулезы яичников, и опосредует передачу сигналов через путь

Gs/цАМФ/протеинкинaзa А [215,216]. Интерфейс рецептор-лиганд образован в основном аминокислотными остатками Р-цепи ФСГ, но свободная Р-цепь ФСГ не способна связывать рецептор с достаточной аффинностью [217], и биологически активен только а/р-гетеродимер СГ. СГ выполняет две основн е функции в яичниках: оказывает митогенное действие, стимулируя пролиферацию и рост клеток гранулезы [218], и индуцирует синтез эстрогенов. Последний эффект осуществляется посредством активации фермента цитохрома Р450 ароматазы, катализирующего необратимое превращение андрогенов в эстрогены [219]. Стимуляция клеток гранулезы ФСГ приводит также к увеличению количества рецепторов ФСГ на их поверхности. Экспрессия этих рецепторов регулируется сложным многоуровневым механизмом. Он включает не только прямое цАМФ-опосредованное действие ФСГ на ген рецептора, но и модуляцию со стороны эстрогена и ряда факторов роста (эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов и ГнРГ-подобного белка).

В медицине ФСГ используется для лечения женского бесплодия для стимуляции овуляции в случае обратимой ановуляции или для гиперстимуляции яичников в рамках ЭКО [220]. Лечение му ского бесплодия так е требует в некоторых случаях назначения Г [221].

1.4.3 Структура и биологическая роль хорионического гонадотропина

человека

ХГч является первым гормональным сообщением, поступающим от плаценты при наступлении беременности: он обнару ивается в материнской крови у е через два дня после имплантации (через недел после оплодотворения), поэтому анализ крови на Гч является наде н м методом ранней диагностики беременности. Гч играет ва ну роль для развития и поддержания беременности: он отвечает за имплантацию, формирование плаценты, дифференцировку трофобласта, ангиогенез и васкулогенез в матке [222]. При наступлении беременности он действует как суперагонист Г, стимулируя клетки елтого тела через рецептор Г/Г, и способствует поддер ани функционирования елтого тела (трансформации циклического лютеинового тела яичника в гравидное) [223]. Желтое тело функционирует до момента полного созревания плаценты, пока плацента не сможет производить прогестерон и эстроген самостоятельно, примерно на 16 неделе беременности.

А-субъединица является общей для всех гормонов семейства гонадотропинов. В-субъединица ХГч состоит из 145 аминокислот, при этом 121 аминокислоты (85% первичной последовательности) идентичны Р-цепи ЛГ, а уникальным для ХГч является карбокситерминальный пептид (СТР, 122-145), состоящий из 24 аминокислот [199]. В-субъединица Гч содер ит два сайта -связанного гликозилирования по сравнени с одним сайтом ЛГ. №гликаны ХГч представляют собой структуры комплексные гликаны, состоящие

преимущественно из двухантенных структур с различными уровнями терминального сиалилирования и с коровым фукозилированием или без него [224-226]. CTP содержит четыре О-связанных олигосахаридных сайта — остатка Ser (PS121, PS127, PS132, PS138) [199]. Также сообщалось о пятом сайте гликозилирования (PS130 или PT140) [224,227]. О-гликаны ХГч соответствуют низкомолекулярным структурам [226]; сиалирование О-связанных гликанов не столь важно для биоактивности ХГч [228]. Из-за большего числа как сайтов гликозилирования, так и остатков сиаловой кислот (приблизительно 20) по сравнени с Г, Гч имеет заметно более длительн й конечный период полув ведения, составля ий 24 часа, по сравнени с приблизительно 30 минутами для ЛГ [229].

Секреция, период полувыведения и функции ХГч существенно зависят от гликозилирования. В частности, содержание сиаловых кислот играет важную роль в сродстве к рецептору, функционировании и выведении из кровотока [230]. В результате разнообразия посттрансляционных модификаций в организме человека могут существовать три изоформы гетеродимера ХГч («классический» планцентарный ХГч, сульфатированный ХГч и гипергликозилированный ХГч), а также свободная Р-цепь и ее гипергликозилированная форма [231-233]. Каждый вариант молекулы вырабатывется различными клетками и имеет свою биологическую функцию. Молекулы, секретируемые клетками синцитиотрофобласта плаценты и гонадотропными клетками гипофиза, являеются гормонами и действуют на рецептор ЛГ/ХГч [234]. Молекулы, секретируемые клетками цитотрофобласта плацента и злокачественными новообразованиями, действуют как как аутокринные и паракринные факторы, связываясь с рецептором трансформирующего фактора роста-Р [229,234]. При наступлении беременности «классический» ХГч, секретируемый дифференцированным синцитиотрофобластом плаценты, поддерживает существование желтого тела и выработку им прогестерона [235,236], а также регулирует многие другие процессы, включая имплантацию, плацентацию, дифференцировку трофобласта, маточный ангиогенез и васкулогенез [222]. Гипергликозилированный ХГч представляет собой гликоформу гормона, вырабатываемую клетками цитотрофобласта цитотрофобласта по мере прогрессирования беременности [237,238]. Гипергликозилированный ХГч оказывает аутокринное действие, стимулируя клеточный рост и инвазию в процессе имплантации при наступлении беременности или в случае развития хориокарциномы [238]. При этом гипергликозилированный вариант, обнаруживаемый на ранних сроках беременности и при онкологических заболеваниях, содер ит более сло ные сиалированн е гликан , чем продуцируемый на более поздних сроках беременности ХГч [239,240]. Свободная Р-субъединица и ее гипергликозилированная форма также являются аутокринными факторами, продуцируемыми наиболее распространенными злокачественными новообразованиями нетрофобластического происхождения, способствуют росту опухоли и ее малигнизации

[241,242]. Сульфатированный ХГч секретируется на низком уровне гипофизом и, по-видимому, имитирует действие лютеинизирующего гормона во время менструального цикла: индуцирует продукцию тека-клетками андростендиона, продукцию прогестерона лютеиновым телом и способствует процессу овуляции [222]. Физико-химичские свойства различных вариантов ХГч представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Свойства пяти независимых вариантов ХГч.

Составлено по [233].

Параметр ХГч Сульфатированный ХГч Гипергликозилированный ХГч ХГч-Р Гипергликозилированная ХГч-р

Физиологическое действие Гормон Аутокринный фактор

Общий молекулярный вес, кДа 37,18 36,15 42,80 23,30 27,60

Аминокислот в а-субъединице 92 92 92 - -

Аминокислот в Р-субъединице 145 145 145 145 145

Молекулярный вес пептидной части, кДа 26,2 26,2 26,2 16,0 16,0

Число О-связанных олигосахаридов 4 4 4 4 4

Число К[-связанных олигосахаридов 4 4 4 2 2

Молекулярный вес олигосахаридов, кДа 10,98 9,95 16,60 7,30 11,60

Доля олигосахаридов, % 30 28 39 31 42

Изоэлектрическая точка (р1), преобладающая форма 3,5 Не известно 3,2 Не известно 3,5

Скорость клиренса,ч 36 20 Не известно 0,72 Не известно

В терапевтических целях ХГч используется для лечения ановуляторного бесплодия, мужского бесплодия, связанного с гипогонадизмом, вызванным снижением секреции гонадотропина, задержкой полового созревания у мужчин и неопущением яичек. При проведении ЭКО ХГч вводят для стимуляции финального созревания фолликулов и продвижения незрелых ооцитов на профазе I (стадии зародышевых пузырьков) через мейотическое созревание к метафазе II [209]. Для завершения мейотического процесса требуется примерно 36 часов; через несколько часов происходит овуляция. Таким образом, при ЭКО фолликулярная аспирация при извлечении ооцитов синхронизируется с введением ХГч.

1.4.4 История получения гонадотропинов

В 1927 г. было обнаружено, что кровь и моча беременных женщин содержат некое вещество, которое при введении неполовозрелым мышам индуцировало созревание фолликулов и лютеинизацию стромы яичников. Было показано, что это вещество представляет собой ХГч, который вырабатывается плацентой [209,243]. Производство ХГч in vitro стало возможным с

помощью культуры плацентарной ткани, в 1931 г. впервые стал доступен коммерческий ХГч

[244].

Было установлено, что ХГч, вводимый отдельно в фолликулярную фазу, не способствовал развитию фолликулов и овуляции, что говорит о неэффективности ХГч в отсутствие ФСГ [244]. Напротив, экстрагированные гонадотропины, например, из сыворотки жеребых кобыл и гипофизов человеческих трупов, вызывали ответ яичников, однако не удавалось добиться воспроизводимой индукции овуляции [244]. Кроме того, в ответ на введение таких экстрактов происходила выработка нейтрализующих антител, что делало яичники невосприимчивыми к повторной стимуляции [244]. К середине 1980-х годов были выявлены случаи ятрогенной болезни Крейтцфельдта-Якоба, связанные с использованием человеческого гипофизарного гонадотропина, после чего гонадотропины трупного происхо дения б ли отозван с р нка

[245]. В 1940-х годах начали выделять гонадотропины из мочи: ХГч в 1940 г., человеческий менопаузальный гонадотропин (чМГ) в 1949 г., высокоочищенный мочевой ФСГ в 1993 г. [245].

С начала 1970-х годов врачи стали предполагать, что различным пациентам необходимы индивидуальные протоколы лечения с подбираемыми дозировками ФСГ и ЛГ. Такие скорректированные режимы выдвигают соответствующие требования к лекарственным препаратам, которые содержат высокоочищенный гормон в точной концентрации. Для решения этой задачи необходимо было разделить ФСГ и ЛГ в экстрактах, для чего белки, выделенные из гипофиза или из мочи, подвергались расщеплению ферментами поджелудочной железы [246] или мочевиной [247]. Butt и соавторы дополнили процесс расщепления удалением инертных белков при помощи электрофореза в крахмальном геле [248]. Другие авторы предложили очистить ФСГ от примесей ЛГ с помощью зонного электрофореза или хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе [249]. Донини и соавт. объединили электрофорез и хроматографию с лиофилизацией элюента и его последующей фильтрацией на колонке с сефадексом [250]. Этот метод позволил получить препарат гонадотропинов, содержащий 384,4 МЕ ФСГ и 5,6 МЕ ЛГ на мг белка. Тем не менее, ни один из описанных методов не предложил простого и экономически оправданного решения. Очистка была усовершенствована в 1960-х годах, когда в ее основу лег метод аффинной хроматографии с использованием поликлональных антител против ЛГ [251]. При нанесении экстракта на такую колонку белки, включая ФСГ, оказываются в несорбируемой фракции, а ЛГ остается на колонке, связавшись со специфическими антителами. Затем элюированный ФСГ очищают до биологически чистого препарата ФСГ с минимальными примесями ЛГ и лиофилизируют. Конечный продукт (Метродин) содержит 150 МЕ ФСГ и 1 МЕ Г на мг белка. Таким образом, наличие иммуносорбентов позволило фармацевтической промышленности получать очищенные препараты ФСГ, практически свободные от загрязнения ЛГ.

И наконец, достижения в области генной инженерии позволили получить рекомбинантный человеческий ФСГ (рФСГч), который стал коммерчески доступным в 1995 г. [252]. В 2000 г. стал доступен рекомбинантный человеческий ЛГ (рЛГч), а с запуском рекомбинантного ХГч в 2001 г. fern на рынке стал представлен полный набор рекомбинантных гонадотропинов. Последние достижения в области производства препаратов гонадотропинов включают: формуляцию рФСГч, наполняемую по массе (filled-by-mass), что позволило улучшить постоянство от партии к партии по сравнению с продуктами, которые стандартизуют тестом на биологическую активность in vivo на крысах (filled-by-bioassay) [253]; фиксированную комбинацию рФСГч и рЛГч [254]; гонадотропины пролонгированного действия [255]; инновационные лекарственные формы гонадотропинов (предзаполненные шприц-ручки) для наиболее точного дозирования [256].

1.4.5 Современные лекарственные препараты гонадотропных гормонов

человека для клинического применения

Для проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО, IVF, in vitro fertilisation) необходимо провести оплодотворение in vitro с отдельно полученными яйцеклетками и сперматозоидами, вырастить эмбрион in vitro до стадии гаструлы и ввести его в полость матки женщины. Поскольку в норме у женщины в течение одного менструального цикла созревает одна яйцеклетка, то для получения нескольких яйцеклеток в рамках ЭК проводят так называемую процедуру контролируемой овариальной стимуляции (КОС). Существуют различные протоколы введения препаратов, которые подбираются в зависимости от индивидуальных особенностей пациентки [257-259]. Обычно КОС включает три основных этапа:

1) Применение агонистов или антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) для подавления функции гипофиза и угнетения секреции эндогенных гонадотропинов.

2) Стимуляция мультифолликулярного развития (как правило, препарат ФСГ).

3) Запуск финального созревания ооцитов за 36-38 часов до извлечения ооцитов (препарат ЛГ или ХГч).

На сегодня введение ХГч для стимуляции финального созревания ооцитов более предпочтительно, чем введение ЛГ [260]. При поступлении в организм эквивалентных доз ХГч и ЛГ выраженность и продолжительность биологического действия ХГч выше, что приводит к оптимальному результату: наилуч ему качеству ооцитов и природно необходимой трансформации эндометрия [261]. Однако использование ЛГ может быть обосновано в случаях, когда необходим точный контроль над временем и характером созревания фолликулов. апример, у пациенток с низким овариальн м резервом или у пациенток со специфическими

мутациями рецептора введение Г мо ет обеспечить более физиологически синхронизированную овуляцию [262].

Наиболее распространенные препараты гонадотропных гормонов, используемые в настоящее время для клинического применения, приведены в Таблица 5.

Таблица 5. Лекарственные препараты гонадотропных гормонов для клинического применения.

МНН - международное непатентованное наименование; МЕ - международные единицы.

Гормон (МНН) Происхождение Чистота Активность (МЕ/мг) Торговое наименование

чМГ Мочевой <5% 100 Меногон®

Высокоочищенный чМГ Мочевой < 70% 2 000 - 2 500 Менопур®

ФСГч (фоллитропин а) Рекомбинантный > 99% 13 645 Гонал-Ф®

ФСГч (фоллитропин в) Рекомбинантный > 99% 7 000 - 10 000 Пурегон®, Фоллистим®

Пролонгированный ФСГч (кориофоллитропин) Рекомбинантный > 99% Нет данных Элонва®

ЛГч (лютропин а) Рекомбинантный > 99% 22 000 Луверис®

ФСГч + ЛГч (фоллитропин а + лютропин а 2:1) Рекомбинантный > 99% 13 636 + 25 000 Перговерис®

ХГч Рекомбинантный > 99% 26 000 Овитрель®®

Г для терапевтических ну д получа т, как правило, рекомбанантным путем в культуре клеток СНО, однако в последние годы для производства ФСГ стали использовать и другие линии клеток млекопитающих (в частности, человеческие ретинальные клетки РЕЯС.6) [263]. ФСГ, экстрагируемый из мочи, по-прежнему производится в больших количествах, но рФСГ предпочтителен из-за постоянства от партии к партии, отсутствия инфекционных агентов человеческого происхождения и более высокой экономической эффективности [264,265].

Для клинического применения на сегодня доступны два варианта рФСГч — фоллитропин а и фоллитропин р. При получении фоллитропина а (оригинальный препарат Гонал-Ф ) использовали два вектора, кодирующие отдельные субъединицы [266], для фоллитропина Р (оригинальный препарат Пурегон®) использовали один вектор, содержащий кодирующие последовательности для обеих субъединиц [267]. Последующие этапы производства схожи для обоих препаратов. В технологический процесс очистки включены стадии ионообменной, гидрофобной и эксклюзионной хроматографии. Основное отличие при производстве фоллитропина а заключается в наличии стадии иммуноаффинной хроматографии со специфическими моноклональными антителами [266]. Из-за небольших различий в способах получения и очистки препараты не являются абсолютно идентичными, имеются различия в гликозилировании белка (в частности, различается число остатков сиаловой кислот ), что выражается в различных изоэлектрических точках [268]. Оба фоллитропина похожи на нативные изоформы ФСГ в кровотоке примерно в середине цикла (более основные изоформы), однако наблюдается некоторая гетерогенность заряда: фоллитропин а имеет более кислые гликоформы,

чем фоллитропин в [268,269]. Оба варианта также имеют эквивалентную иммуноактивность, биоактивность in vitro и степень разветвленности гликанов [270]. В клинических исследованиях оба фоллитропина позволили получить сравнимое количество ооцитов, однако частота наступления клинической беременности оказалась выше для фоллитропина a (P<0,7) [270]. Начальный и конечный периоды полувыведения после введения 150 МЕ рФСГч составляют 2 и 17 ч соответственно. Из-за относительно короткого периода полувыведения ФСГ назначают ежедневные инъекции ФСГ для поддержания его концентрации в крови вше порогового значения [271]. После каждой инъекции пиковый уровень ФСГ в сыворотке достигаются в течение 10-12 ч, затем снижается до следующей инъекции. Устойчивый уровень достигается только после введения ФСГ в течение 3-5 дней.

едавно с использованием методов сайт-направленного мутагенеза и переноса генов б ла разработана новая молекула гонадотропина пролонгированного действия — кориофоллитропин a, в которой ФСГ слит с CTP ХГч [272]. Более длительный период полувыведения молекулы обусловлен CTP ХГч, содержащим четыре дополнительные O-связанных углеводных остатка. Кориофоллитропина был получен с использованием плазмиды, содержащей химерный ген — слитые кодирующие последовательностей в-субъединицы ФСГ и CTP ХГч [273]. Химерная плазмида была трансфицирована в клетки СНО совместно с плазмидой, кодирующей a-субъединицу ФСГ. Присутствие фрагмента CTP не оказывает существенного влияния на сборку гетеродимера ФСГ или на секрецию его клетками [273]. Кориофоллитропин a демонстрирует такое же связывание с рецептором ФСГ in vitro и стероидогенную активность, что и ФСГ дикого типа, но проявляет повышенную биологическую активность in vivo и более длительный период полувыведения из плазмы (65 ч) [255,272,273]. Клинические исследования показали, что однократная инъекция корифоллитропина a мо ет заменить первые семь е едневн х стандартных инъекций СГ и что стимуляци мо но продол ать е едневными инъекциями ФСГ до тех пор, пока не будет достигнуто финальное созревание ооцитов [274].

ЛГ применяется во время КОС яичников при женском гипогонадотропном гипогонадизме для поддержки развития фолликулов [275,276]. ЛГ необходим для выбора доминантного фолликула, стимуляции овуляции и обеспечения лютеинизации фолликула [262]. Препарата с активностью ЛГ можно поделить на три группы: мочевой чМГ, в котором активность ЛГ выполняет ХГч; очищенный ЛГ, полученный рекомбинантным путем (лютропин а); комбинация очищенных ФСГ и ЛГ в фиксированном соотношении 2:1. чМГ использовался для стимуляции яичников с 60-х годов, в 2000 году при гонадотропиновой недостаточности у женщин стал применяться рекомбинантный ЛГ. Препарат вводят ежедневно путем подкожных инъекций с использованием инновационного устройства — предзаполненной шприц-ручки [277]. Использование рЛГ в сравнении с чМГ предпочтительно вследствие более высокой чистоты и

удельной активности, а также большей точности дозирования благодаря методу заполнения флакона. Активность рЛГ обеспечивается непосредственно чистым гликопротеином ЛГ; в чМГ активность ЛГ обеспечивается ХГч, который концентрируется при очистке или добавляется до достижения желаемого уровня биологической активности, оказываемой ЛГ [245]. Основное различие между ЛГ и ХГч заключается в спектре их гликоформ, что напрямую определяет разницу в биологической активности и фармакокинетике, в частности, в скорости элиминации.

Гч обладает значительно более высокой аффинность к рецептору Г, чем сам Г, что объясняет его примерно 30-кратно более высокую активность in vivo при сравнении эквивалентных массовых количеств. Кинетика элиминации также существенно различается: рекомбинантный ЛГ характеризуется коротким конечным периодом полувыведения, составляющим 10-12 часов. В то же время препарата, основанные на ХГч-опосредованной активности (например, чМГ), имеют значительно более длительный период полувыведения — от 24 до 31 часа [278]. Препарат, содержащий комбинацию рФСГч и рЛГч (фоллитропин а + лютропин а) в соотношении 2:1, был выпущен в 2007 году. Такой препарат предпочтителен для пациенток, которым требуется сопутствующее введение ЛГ, поскольку используется одна инъекция для введения двух активных веществ. Фоллитропин а в сочетании с лютропином а, вводимые отдельно или совместно, биоэквиваленты [279].

Введение ХГч на сегодня является золотым стандартом для стимуляции финального созревания ооцитов [260]. Из-за структурного и биологического сходства ХГч и ЛГ связываются с одним и тем же рецептором и активируют его [280,281]. Однако лютеотропная активность ХГч заметно выше, чем у ЛГ из-за его более длительного периода полувыведения и большей аффинности к рецептору [282,283]. Препараты ХГч мочевого происхождения представляют собой лиофилизат по 5 000 или 10 000 МЕ для внутримышечного применения. Фармацевтические препарата ХГч, полученные из мочи, содержат большое количество примесных белков и значительно различаются между партиями [284]. В 2001 г. стал доступен рекомбинантный ХГч (хориогонадотропин а) в форме раствора в предварительно заполненных шприцах, содержащих 250 мкг чистого ХГч, что эквивалентно 6500 МЕ мочевого ХГч [285]. Благодаря более высокой чистоте рХГч лучше переносится и используется подкожно, что позволяет пациенту вводить препарат самостоятельно [286,287]. Клиническая эффективность мочевых и рекомбинантных препаратов ХГч не отличается [288].

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Методы работы с ДНК

2.1.1 Получение синтетических ДНК-последовательностей

Синтетические ДНК-последовательности заказывали в ООО «Клонинг-Фасилити» (Москва, Россия).

2.1.2 Аденилирование синтетических ДНК (A-tailing)

Синтетические ДНК-последовательности, перед встраиванием в линеаризованный вектор с выступающими фосфорилированными 3'-концевыми тимидинами аденилировали по концам (А-tailing). Реакционную смесь для одного образца составляли: синтетическая ДНК в количестве 200 нг и реактивы 10-кратный Overnight ligation buffer (разбавленный до однократного), 50-кратный раствор dNTPs в качестве источники аденинов в количестве 0,2 мМ и Taq ДНК-полимераза термостабильной бактерии Thermus aquaticus YT1 (Евроген, Россия). Режим аденилирования концов последовательностей: 95 °С - 2 мин, 72 °С - 30 мин. После охлаждения до комнатной температур реакционная смесь использовалась для постановки реакции ночного лигирования с цель подстановки аденилированн х синтетических в линеаризованный

вектор с выступающими фосфорилированными З'-концевыми тимидинами pAL2-T (Евроген). Реакция ночного лигирования поставлена с участием 10-кратного Overnight ligation buffer (разбавленный до однократного), линеаризованного вектора pAL2-T в количестве не менее 50 нг/реакцию и Т4-лигазы (Евроген) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя.

2.1.3 Полимеразная цепная реакция

ПЦР осуществляли, используя наборы для выскоточного синтеза Tersus Plus PCR kit, Encyclo Plus PCR kit, а также олигонуклеотиды dNTPs 0,2 мкМ (Евроген) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя. Для анализа бактериальных колоний E. coli на предмет присутствия целевых плазмид использовали полимеразную смесь ScreenMix (Евроген) в соответствии с рекомендациями фирм производителя, поме ая часть бактериальн х колоний в пробирки с готовой смеси для ПЦР, объём которой составлял 10 мкл.

2.1.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Для анализа ПЦР-продуктов и рестрикционных смесей плазмид и ПЦР-продуктов проводили электрофорез в 1 %-ном агарозном геле, приготовленном на однократном трис-боратном буфере (ТВЕ) с бромистым этидием в концентрации 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводили на приборе для горизонтального электрофореза (Хеликон, Россия) при напряжении

5 В/см. После разделения ДНК анализировали на трансиллюминаторе (Ultra Violet Products, США) в УФ-свете (254 нм).

2.1.5 Очистка и переосаждение ДНК-фрагментов перед лигированием

Выделение и очистка рестрицированных фрагментов ДНК и продуктов ПЦР из агарозного геля проводились при помощи набора Cleanup Standard (Евроген) согласно рекомендациям фирмы производителя. Для получения рестрицированных фрагментов ДНК и плазмид высокой чистоты и в оптимальных количествах в некоторых случаях их подвергали переосаждению при помощи соосадителя нуклеиновых кислот Satellite Red (Евроген) согласно рекомендациям фирм производителя.

2.1.6 Лигирование ДНК

Ночное лигирование рестрицированных фрагментов ДНК тяжёлых и лёгких цепей и рестрицированных векторов проводили в течение 16 часов при 14 °С с участием 10-кратного Overnight ligation buffer (разбавлен до однократного) и Т4-ДНК-лигазы (Евроген) в соответствии с рекомендациями фирм производителя.

2.1.7 Выделение плазмидной ДНК

Образцы плазмидных ДНК получали с помощью набора Plasmid Miniprep (Евроген) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

2.1.8 Секвенирование ДНК

Определение нуклеотидной последовательности ДНК выполняли в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН Секвенирование проводили методом Сэнгера с использованием набора BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) и капиллярного секвенатора ABI PRISM 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

2.1.9 Препаративное получение плазмид для трансфекции

Плазмидные ДНК для трансфекции нарабатывали в клетках E. coli штамма TOP10, трансформированных экспрессионными конструкциями. Бактериальные колонии, включающие в себя целевые плазмид , засевались в селективну питательну среду 2T с ампициллином (50мкг/мл) и культивировались в течение ночи при 37 оС. На следующий день из бактериальных биомасс получали плазмидные ДНК с помощью набора Plasmid Midiprep (Евроген, Россия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Полученные плазмиды подвергались переосаждению по следующему протоколу: к раствору плазмид добавляли 1/16,6 объёма 5 М NaCl и 3 объёма 96 %-ного С2Н5ОН. После аккуратного перемешивания и центрифугирования

при 13 000 об/мин в течение 10 мин убирали надосадочную жидкость и приливали 1 объём 70 %-ного С2Н5ОН. После короткого центрифугирования на максимальной скорости все операции с плазмидами проводили стерильно в условиях ламинарного бокса: образцы плазмид освобождались от 70 %-ного С2Н5ОН, подсушивались до испарения остатков спирта в течение нескольких часов. К подсушенному образцу плазмиды стерильно приливали буфер SBB и оставляли растворяться в нём в течение ночи.

2.1.10 Измерение концентрации ДНК

Количественное определение концентраций К в полняли с использованием настольного флюориметра Qubit (Life Technologies, США). Измерения проводили в строгом соответствии с инструкцией производителя, применяя наборы: Qubit DNA Broad Range Assay Kit — для плазмидной ДНК; Qubit DNA High Sensitivity Assay Kit — для геномной ДНК.

2.1.11 Получение экспрессионных плазмид p1.1-eGFP: Контрольная плазмида p1.1, подробно описанная в [289], была депонирована в Addgene в виде векторной плазмиды (#162737) и с клонированными флуоресцентными репортерными белками: p1.1-eGFP (#162738), p1.1-mCherry (#162772).

p1.1-D (А3644 DFR): Плазмида с самой короткой длиной нижележащей фланкирующей области (DFR) была создана с использованием плазмиды pAL-3CHEF-F1 [289], расщепленной ферментами NheI и XbaI. Фрагмент DFR был лигирован в pBL-ID-EBV-5CH, расщеплен ферментом XbaI, необходимая ориентация была выбрана с помощью ПЦР. В полученную плазмиду p1.1-D была вставлена ОРС eGFP с использованием ферментов AbsI и NheI, в результате чего была получена плазмида p1.1-D-eGFP.

Три фрагмента вышележащей фланкирующей области (UFR) EEF1A, фланкированные сайтами рестрикции адаптеров EcoRI и FseI, были получены с помощью ПЦР с использованием p1.1 в качестве матрицы. Продукта ПЦР были субклонированы в вектор pAL2T и секвенированы. Плазмида p1.1-D-eGFP размером 8995 п.н. была разрезана ферментами EcoRI и FseI, а полученные в результате Р укороченные вариант были вставлены на место фрагмента UFR EcoRI-FseI размером 2845 п.н.

p1.1-Tr1-eGFP (А3644 DFR, А1608 UFR): При помощи праймеров AD-5CHD2083-EcoRIf и AD-5CHD-FseIr (Таблица 6) был получен ПЦР-продукт размером 2083 п.н., клонированный в вектор pAL2T, секвенированный с помощью праймеров M13 и SQ-DEL2083-R (Таблица 6). Затем фрагмент EcoRI-FseI размером 2076 п.н. был вырезан и перенесен в плазмиду p1.1-D-eGFP, расщепленную теми же ферментами. Общий размер сохраненного UFR (EcoRI-AbsI) составил 3309 п.н.

p1.1-Tr2-eGFP (Л3644 DFR, Л2400 UFR): При помощи праймеров AD-5CHD1291-EcoRIf и AD-5CHD-FseIr (Таблица 6) был получен ПЦР-продукт размером 1291 п.н., клонирован в вектор pAL2T и секвенирован с помощью праймеров M13 и SQ-DEL1291-R (Таблица 6). Затем был вырезан фрагмент EcoRI-FseI размером 1284 п.н. и перенесен в плазмиду p1.1-D-eGFP, расщепленную теми же ферментами. Общий размер сохраненного UFR (EcoRI-AbsI) составил 2517 п.н. Полученная плазмида p1.1-Tr2-eGFP доступна в Addgene (#162782).

p1.1-Tr3-eGFP (Л3644 DFR, Л3264 UFR): При помощи праймеров AD-5CHD427-EcoRIf и AD-5CHD-FseIr (Таблица 6) был получен ПЦР-продукт размером 427 п.н., клонированный в вектор pAL2T, секвенированный с помощью праймеров M13 и SQ-DEL427-R (Таблица 6), и фрагмент EcoRI-FseI размером 420 п.н. был вырезан и перенесен в плазмиду p1.1-D-eGFP, расщепленную теми же ферментами. Общий размер сохраненного UFR (EcoRI - AbsI) составил 1653 п.н.

p1.1-Tr2(-)EBVTR-eGFP: Плазмида была получена путем рестрикции p1.1-Tr2-eGFP ферментами EcoRI и PvuI. 959-нуклеотидный фрагмент, содержащий EBVTR и часть гена устойчивости к ампициллину, fern удален и заменен на 551-нуклеотидный EcoRI-PvuI фрагмент плазмиды p1.1(EBVTR-) [290], не содержащий EBVTR.

pOptiVEC-eGFP: Плазмида была получена на основе плазмиды pOptivec-circ (самолигированная pOptivec-TOPO, Thermo Fisher Scientific, США), которая была расщеплена ферментами BamHI-NotI и лигирована с фрагментом BamHI-NotI плазмиды pEGFP-N2 (Clontech, США), содержащим ОРС eGFP.

pOptiVEC(+)EBVTR-eGFP: Плазмида была получена путем рестрикции pOptivec-circ ферментами SpeI и PvuI и лигирования с фрагментом NheI-PvuI плазмиды pBL2-ID-EBV, содержащим EBVTR [289]. Ген eGFP был клонирован ферментами BamHI-NotI.

p1.1-Tr2-RBDv1: Кодирующая последовательность RBD в границах а.о. 319-541 была синтезирована согласно [163], синтетический ген SARS_CoV_2 RBD_his [GenBank: MT380724.1]. Фрагмент ДНК, кодирующий ОРС RBDv1 с консенсусной последовательностью Козака и С-концевыми метками c-myc и 6^His, был получен методом ПЦР с использованием праймеров AD-COV-AbsF и AD-RBD-myc6HNheR (Таблица 6) и полимеразной смеси Tersus (Evrogen, Россия). Продукт ПЦР был расщеплен ферментами AbsI (Sibenzyme, Новосибирск, Россия) и NheI (Fermentas, Вильнюс, Литва) и вставлен в вектор p1.1-Tr2. Полученная плазмида p1.1-Tr2-RBDv1 была секвенирована с использованием праймеров SQ-5CH6-F и IRESA rev (Таблица 6).

pT : олилинкер б л сконструирован из синтетических олигонуклеотидов, перечисленных в Таблица 6. Олигонуклеотиды, предоставленные производителем с 5'-фосфорилированн ми концами, использовали для получения двух двухцепочечн х фрагментов

путем отжига пар праймеров AS-Myc6H-AbsF/AbsR и AS-Myc6H-SpeF/SpeR. Отжиг проводили в термоциклере в эквимолярных концентрациях праймеров по следующей программе: денатурация при 95 °С в течение 3 мин с последующим медленным охлаждением (-2 °С за цикл в течение 36 циклов). Полученные фрагмента лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в вектор p1.1-Tr2-eGFP, предварительно обработанный эндонуклеазами рестрикции AbsI и №е1 для удаления вставки eGFP. Полилинкер имел липкие выступающие концы, образованные ферментами AbsI-SpeI, поэтому сайт 1МЬе1 в векторе был разрушен, что дало возможность использовать уникальный сайт !МЪе1 внутри нового полилинкера. Полученный вектор рТМ доступен в Addgene (#162783).

pTM-RBDv2: ОРС RBD была амплифицирована с использованием адаптерных праймеров AD-SFR2-NheF и AD-SFR2-XmaR, расщепленных ферментами №е1 и Хта1 ^Ье^уте, Россия), и клонирован в вектор рТМ, расщепленный ферментами NheI и AsiGI (Sibenzyme). Полученная конструкция была секвенирована с использованием праймеров SQ-5CH6-F и SQ-MycH-R. Плазмида pTM-RБDv2 доступна в Addgene (#162785).

pTF-ACE2: кДНК, соответствующая ОРС человеческого АПФ2, была любезно предоставлена профессором Петром Сергиевым, МГУ, Москва, Россия. ОРС внеклеточного домена рецептора АПФ2 была амплифицирован методом ПЦР с использованием высокоточной полимеразной смеси Тегеш и специфичных праймеров AD-ACЕ-AbsF и AD-ACЕ-NheR (Таблица 6). Продукт амплификации обработали эндонуклеазами рестрикции AbsI и Ази№Л и встроили в вектор pTF, предварительно линеаризованный теми же ферментами. Вектор pTF был предварительно получен путем лигирования синтетического полилинкера в подходящий вектор-носитель. Полилинкер представлял собой двухцепочечную ДНК, сформированную отжигом пары комплементарных 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов AS-Flag-AbsF и AS-Flag-AbsR (Таблица 6). Корректность сборки итоговой конструкции pTF-ACЕ2 подтвердили секвенированием по Сэнгеру с использованием набора праймеров SQ-5CH6-F, SQ-ACЕ875-R, SQ-ACЕ592-F, SQ-ACЕ1170-F, SQ-ACЕ1512-F (Таблица 6). Вектор pTF и плазмида pTF-ACЕ2 доступны в Addgene (#162784 и #162786 соответственно).

pTM-RBDv2_NKY (в В.1.351): N-концевaя часть открытой рамки считывания RBD была удалена из экспрессионной плазмиды pTM-RBDv2, кодирующей RБD S-белкa Wuhan-Hu-1, путем обработки ферментами AbsI и SphI. Данный регион был заменен синтетическим фрагментом ДНК AbsI-SphI, кодирующим тот же полипептид, с одной заменой в сигнальном пептиде S[-1]->R[-1] и тремя мутациями в зрелом полипептиде RBD: К417^ Е484К, N501Y. Таким образом, экспрессируемый белок соответствовал в-варианту SARS-CoV-2 (В.1.351).

р1.1-Тг2-Соп-ВЬ\.: Экспрессионные плазмиды для изучения эффектов гетерологичных сигнальных пептидов (СП) создавали на основе вектора р1.1-Тг2. Исходные последовательности

Р-цепей с нативными СП для ФСГ и ЛГ взята из ранее проведенных работ [291,292]. Кодирующие последовательности для Р-цепей ХГч и ТТГ получены путем обратной трансляции последовательностей NP_000728 и NP_000540.2 соответственно. Синтетические кассеты <ф-цепь-IRES-а-цепь» клонировали в вектор p1.1-Tr2 по сайтам AbsI-NheI. Синтетические последовательности «P-цепь-IRES-a-цепь» клонировали в экспрессионные векторы по сайтам рестрикции AbsI-NheI. Для замены сигнальных пептидов Р-цепей проводили step-out ПЦР, используя пары длинных адапторных праймеров (Таблица 6), в которых закодирован сигнальный пептид и синтетическая последовательность Козак, и общий для каждой Р-цепи обратный праймер. Продукты ПЦР субклонировали в Т-вектор, секвенировали и переносили в экспрессионные плазмиды по сайтам AbsI-SpeI/NheI, заменяя нативную Р-цепь.

p1.1-Tr2-HCG-AIB, p1.1-Tr2-HCG-BIA: Кодирующие последовательности а- и Р-субъединиц ХГч, предваренные консенсусной последовательностью Козака и разделенные ffiES вируса EMCV, были синтезированы de novo компанией «Клонинг Фасилити» (Россия). Синтетические фрагменты, фланкированные сайтами рестрикции AbsI и AsuNHI, клонировали в вектор pUC57-Kan, линеаризованный эндонуклеазой EcoRV. В результате &ли получены промежуточные плазмиды pUC57-Kan-HCG-AIB и pUC57-Kan-HCG-BIA. Из этих плазмид фрагменты, содержащие ОРС обеих субъединиц, IRES и последовательность Козака, вырезали ферментами AbsI и AsuNI (СибЭнзим) и лигировали в вектор p1.1-Tr2, обработанный теми же рестриктазами. Это привело к получению целевых экспрессионных плазмид p1.1-Tr2-HCG-AIB и p1.1-Tr2-HCG-BIA. Плазмиды различаются порядком расположения генов в экспрессионной кассете: а-IRES-P-IRESatt-DHFR, обозначаемой далее как AIB, и p-IRES-a-IRESatt-DHFR, обозначаемой далее как BIA. Полноразмерное секвенирование кодирующих областей обеих цепей ХГч в полученных плазмидах (с использованием праймеров SQ-5CH6-F, SQ-FA-R, SQ-FA-F, AD-HCGb-SpeR и AD-IHCGb-NheF) подтвердило отсутствие мутаций.

p1.2-GS-ahCG, p1.2-GS-bhCG: Получение вектора p1.2-GS, содержащего глутаминсинтазу крысы, описано в [293]. Для создания целевых экспрессионных конструкций фрагменты, содержащие ОРС а- или Р-субъединицы ХГч с последовательностью Козака, вырезали из плазмид pUC57-Kan-HCG-AIB и pUC57-Kan-HCG-BIA ферментами AbsI и SpeI. Эти фрагменты лигировали в вектор p1.2-GS, предварительно обработанный рестриктазами AbsI и AsuNHI (СибЭнзим), получив итоговые плазмиды p1.2-GS-ahCG (кодирует а-субъединицу) и p1.2-GS-bhCG (кодирует Р-субъединицу) соответственно.

Специфические праймеры, использованные для клонирования, перечислен в Таблица 6 процессе клонирования использовались эндонуклеаз рестрикции от компании «Сибэнзим» (Новосибирск, Россия), а также олигонуклеотиды, ПЦР-реагенты и наборы для очистки

нуклеиновых кислот от компании «Евроген». Клонирование проводилось в штамме Escherichia coli TOPIO (Invitrogen, США), компетентные клетки были подготовлены собственными силами. Секвенирование ДНК проводилось в Межинституциональном центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН.

Таблица 6. Праймеры, использованные для клонирования и секвенирования.

№ п/п Название праймера Последовательность (5 ' ^ 3')

1 AD-5CHD1291-EcoRIf AGAATTCCCACATGTGGACACC

2 AD-5CHD2083-EcoRIf CGAATTCTGGATTCTTTGGTTACA

3 AD-5CHD2083-EcoRIf CGAATTCTGGATTCTTTGGTTACA

4 AD-5CHD2083-EcoRIf CGAATTCTGGATTCTTTGGTTACA

5 AD-5CHD427-EcoRIf CGAATTCTGAACGGAACTCCC

6 AD-5CHD-FseIr GGAGGCCGGCCAGAATTT

7 AD-ACE-AbsF CCTCGAGGCCGCCACCATGTCAAGCTCTTCCTGGCTC

8 AD-ACE-NheR GCTAGCGGAAACAGGGGGCTGGTT

9 AD-COV-AbsF AACCTCGAGGCCGCCACCATGTTCATGCCTTCTT

10 AD-DHFR-F AAGATCTGCCACCATGGTTC

11 AD-DHFR-R ATCTAGATTAGTCTTTCTTCTCGTAGAC

12 AD-GS-BglNcoF AGATCTGCCACCATGGCCACCTCAGCAAGT

13 AD-GS-XbaR TCTAGATTAGTTCTTGTATTGGAAGG

14 AD-HCGb-SpeR TACTAGTCTATTATTGTGGGAG

15 AD-IHCGb-NheF TTGCTAGCCTATTATTGTGG

16 AD-RBD-myc6HNheR GCTAGCCTAATGGTGATGGTGATGATGACCGGTATGCATATTCAGATCCTCTT CTGAGATGAGTTTTTGTTCGAAGTTCACGCATTTGTT

17 AD-SFR2-NheF GCTAGCGTGCAGCCCACCGAATCC

18 AD-SFR2-XmaR CCCGGGTTTGTTCTTCACGAGATTGGT

19 AS-Flag-AbsF TCGAGGCTGCAGCTAGCGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGGATCCCA TCACCATCACCATCACCATCATCACCACTAA

20 AS-Flag-AbsR ACTAGTTAGTGGTGATGATGGTGATGGTGATGGTGATGGGATCCTCCCTTATC GTCGTCATCCTTGTAATCGCTAGCTGCAGCC

21 AS-Myc6H-AbsF TCGAGGCCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTG CTGTGTGGAGCAGTCTTCGTCTCGGCTA

22 AS-Myc6H-AbsR GCGCTAGCCGAGACGAAGACTGCTCCACACAGCAGCAGCACACAGCAGAGCC CTCTCTTCATTGCATCCATGGTGGCGGCC

23 AS-Myc6H-SpeF GCGCTACCGGTGAACAAAAACTGATCAGCGAAGAGGATCTGTCTGCAGGCGG TCATCACCATCACCATCACCATCACCATCA

24 AS-Myc6H-SpeR CTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGACCGCCTGCAGACAGATCCT CTTCGCTGATCAGTTTTTGTTCACCGGTA

25 aSP-FSH-InF TGGTCACATTGTCGGTGTTTCTGCATGTTCTCCATTCCAATAGCTGTGAGCTGA CCAACAT

26 aSP-Hb-AbsF ACCTCGAGGCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTATCTTTCTG GTCACATTGTCGGTGTTT

27 aSP-Hb-InF TGGTCACATTGTCGGTGTTTCTGCATGTTCTCCATTCCTCCAAGGAGCCGCTTC GGC

28 aSP-LH-InF TGGTCACATTGTCGGTGTTTCTGCATGTTCTCCATTCCTCCAGGGAGCCGCTTC GGC