Разработка рекомбинантного химерного антигена для оценки Т-клеточного иммунитета против коронавирусной инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Копать Владимир Владиславович

• Копать Владимир Владиславович
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Копать Владимир Владиславович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 - ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 - Коронавирусная инфекция COVID-19. Структура вируса SARS-CoV-2

1.2 - Изменчивость вируса SARS-CoV-2

1.3 - Особенности иммунного ответа на SARS-CoV-2

1.4 - Т-клеточные эпитопы

1.5 - Оценка иммунного ответа на коронавирусную инфекцию 26 ГЛАВА 2 - МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 - Предсказание/поиск CD4+ Т-клеточных иммуногенных эпитопов SARS-CoV-2 in silico

2.2 - Поиск предсказанных эпитопов SARS-CoV-2 среди экспериментально определенных эпитопов и предсказание связывания отобранных эпитопов с Т-клеточным рецептором

2.3 - Анализ физико-химических свойств сконструированных рекомбинантных белков

2.4 - Конструирование плазмиды pCorD_PS

2.5 - Создание штамма-продуцента плазмиды pCorD_PS

2.6 - Конструирование штамма-продуцента Escherichia coli CorD_PS

2.7 - Оценка стабильности штамма-продуцента Escherichia coli CorD_PS

2.8 - Культивирование клеток штамма Escherichia coli CorD_PS

2.9 - Выделение нерастворимой формы антигена коронавирусного рекомбинантного из клеточной биомассы штамма Escherichia coli CorD_PS

2.10 - Рефолдинг денатурированного белка

2.11 - Хроматографическая очистка антигена коронавирусного рекомбинантного

34

2.12 - Методы контроля качества субстанции рекомбинантного антигена

2.13 - Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3 - РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 - Разработка кодирующей химерной последовательности антигена

3.2 - Структура плазмиды pCorD_PS

3.3 - Конструирование штамма-продуцента Escherichia coli CorD_PS

3.4 - Стабильность штамма-продуцента Escherichia coli CorD_PS

3.5 - Культивирование клеток штамма Escherichia coli CorD PS

3.6 - Выделение и отмывка тел включения

3.7 - Рефолдинг денатурированного белка

3.8 - Хроматографическая очистка субстанции рекомбинантного антигена

3.9 - Контроль качества субстанции рекомбинантного антигена 53 Резюме к главе 3 57 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 60 ВЫВОДЫ 68 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 69 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 70 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 72 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 - СПЕЦИФИКАЦИЯ НА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКУЮ СУБСТАНЦИЮ 95 ПРИЛОЖЕНИЕ 2 - ПАСПОРТ ШТАММА CORD PS

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 - ПРОТОКОЛЫ АНАЛИЗА ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СЕРИЙ

104

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка рекомбинантного химерного антигена для оценки Т-клеточного иммунитета против коронавирусной инфекции»

Актуальность темы исследования

Несмотря на то, что пик эпидемии COVID-19 был пройден, проблема оценки иммунного ответа на SARS-CoV-2 в настоящее время все еще не решена. Применяемый массово тест на антитела IgM и IgG дает лишь понимание, сталкивался ли человек с вирусом SARS-CoV-2, но не позволяет сделать однозначный вывод о том, сформировался ли иммунитет у человека, достаточный для защиты от повторного заражения и/или от протекания инфекции в тяжелой форме и/или от осложнений на различные системы и органы. Кроме того, ввиду сильной изменчивости новых поколений вируса, наличие иммуноглобулинов не всегда может обеспечивать необходимую защиту от повторного заражения очередным новым штаммом.

В то же время, все известные способы оценки клеточного иммунитета против SARS-CoV-2 являются методами ex vivo, in vitro - методы оценки синтеза цитокинов стимулированными клетками с помощью ELISPOT и цитофлюориметрии. Данные методы не применяются массово из-за высокой стоимости лабораторного оборудования и реагентов, сложности подготовки проб, скорости проведения исследования и анализа полученных данных. Требуется новый, экономически целесообразный подход к оценке Т-клеточного иммунитета против коронавирусной инфекции.

Вариантом такого подхода может стать визуальная оценка кожной реакции (появления воспалительной папулы) в месте введения антигена SARS-CoV-2, проявляющейся вследствие реакции гиперчувствительности замедленного типа, по аналогии с пробой Манту. Данный метод прост и доступен, однако его эффективность и надежность определяются дизайном универсального, консервативного и специфичного антигена, активирующего Т-клеточный иммунный ответ.

Степень разработанности темы исследования

Т-клеточный иммунный ответ играет критическую роль в защите хозяина от многих вирусных инфекций. Внутриклеточная вирусная инфекция стимулирует презентацию вирусных пептидов либо белками НЬА класса I CD8 + Т-клеткам (цитотоксические Т-клетки), либо белками НЬА класса II CD4 + Т-клеткам [60]. Активация CD4+ и CD8+ Т-клеток зависит от связывания между антигеном, присутствующим на главном комплексе гистосовместимости (МНС) антигенпрезентирующих клеток, и Т-клеточным рецептором на Т-клетке [141]. В частности, МНС I распознается CD8+ Т-клетками, а МНС II - CD4+ ^клетками. Оба типа Т-лимфоцитов важны для борьбы с коронавирусами, но в моделях инфицирования SARS-CoV-2 показано, что степень защиты в большей степени зависит от CD4+ Т-клеток. Именно их экспериментальное удаление приводило к блокировке выхода всех типов лимфоцитов в ткань легких, снижению синтеза нейтрализующих антител и цитокинов и значительно снижало вирусный клиренс [31]. Известно, что Т-клеточный иммунный ответ может обеспечить вирусный клиренс и полное выздоровление у пациентов с гуморальным иммунодефицитом [14, 53, 145].

Выявляемый реактивный Т-клеточный ответ у пациентов с СОУГО-19, ответственный за элиминацию вируса, имеет широкую вариабельную специфичность к различным белкам SARS-CoV-2. Наиболее доминирующие реактивные Т-клетки, включая CD4+, CD8+, CD4+CD154+CD137+ и CD154+CD137+, обнаруженные у выздоровевших пациентов с СОУГО-19, были специфичны для структурных белков SARS-CoV-2 [40, 85, 145]. Структура вируса SARS-CoV-2 состоит из четырех белков: Е (оболочка), М (мембрана), N (нуклеокапсид) и S (шип) [50]. Из них наиболее консервативным и стабильным является ^белок: большинство эпитопов, специфичных для Т-клеток, сохраняют функциональность в защите от инфекций, вызываемых мутированными вариантами SARS-CoV-2 [102, 141], что определяет перспективность разработки диагностических систем именно на оценку функциональности Т-клеточного иммунитета.

Цель исследования

Разработать рекомбинантный химерный антиген для оценки Т-клеточного иммунитета против коронавирусной инфекции. Задачи исследования:

1. Разработать структуру химерного рекомбинантного белка-антигена на основе Т-клеточных эпитопов структурных белков SARS-CoV-2.

2. Сконструировать экспрессионный вектор для производства субстанции антигена.

3. Создать штамм-продуцент рекомбинантного антигена коронавирусного; отработать протокол культивирования штамма-продуцента.

4. Разработать технологию очистки субстанции рекомбинантного антигена.

5. Оценить специфическую активность антигена в отношении человеческих антител к SARS-CoV-2 и CD4+ Т-лимфоцитов.

Научная новизна

Впервые сконструирована уникальная молекула, позволяющая наглядно и надежно продемонстрировать наличие сформированного клеточного иммунного ответа на SARS-CoV-2, что может свидетельствовать о защите человека от повторного заражения, либо о текущей зараженности.

Разработана новая технология получения субстанции коронавирусного антигена.

Современный подход к дизайну молекулы исключает кросс-реактивность в отношении собственных белков человека, таким образом исключены возможные аутоиммунные реакции после применения антигена.

Теоретическая и практическая значимость исследования: Практическое применение разрабатываемого антигена можно разделить как минимум на три области:

1. Как универсальный консервативный антиген для исследований in vitro, в частности для проточной цитометрии.

2. В качестве антигена для метода оценки in vivo Т-клеточного иммунитета против коронавирусной инфекции, учитывающего как постинфекционный, так и поствакцинальный иммунитет.

3. Как основа новой вакцины, не зависящей от смены генетических вариантов штаммов SARS-CoV-2.

Теоретическая значимость определяется самим подходом к созданию подобных тест-систем. Применяемые методы анализа данных, конструирования химерных антигенов и их дальнейшее производство позволяют создавать аналогичные тест-системы для определения иммунного ответа на другие вирусные инфекции, для которых ключевую роль играет именно Т-клеточный иммунный ответ.

Методология

В основе разработки рекомбинантного антигена для оценки Т-клеточного иммунитета против коронавирусной инфекции лежит изучение Т-клеточных антигенных детерминант (эпитопов) структурных беков вируса SARS-CoV-2. Далее, с помощью биоинформатических алгоритмов предсказания определяется набор эпитопов, обладающих с одной стороны наибольшим сродством к HLA (метод 7 аллелей), с другой - сродством к рецептору Т-клеток (иммуногенность). Из выбранного набора формируется кодирующая конструкция (несколько вариантов). Для полученных конструкций рассчитываются физико-химические параметры белка, оценивается их пригодность, а также проводится проверка на отсутствие сходства полученной гибридной последовательности с последовательностями белков человека во избежание возникновения аутоиммунных реакций при введении антигена.

На следующем этапе проводится оптимизация нуклеотидной последовательности под экспрессионную систему E.coli. Далее конструкция синтезируется и клонируется в заранее подобранный экспрессионный вектор.

3й этап - создание штамма-продуцента экспрессионной плазмиды, а затем -штамма-продуцента целевого рекомбинантного белка с высоким уровнем экспрессии. Процесс культивирования переносится в лабораторный биореактор,

нарабатывается биомасса, отрабатывается выделение и очистка телец включения. Подбираются условия фолдинга.

На четвертом этапе разрабатывается технологическая схема хроматографической очистки субстанции белка-антигена до уровня соответствия требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации.

Завершающим этапом данного исследования является проведение тестирования специфической активности и оценка продукции цитокинов CD4+ Т-лимфоцитами в ответ на специфическую стимуляцию антигеном ex vivo.

Положения, выносимые на защиту

1. Структура химерного рекомбинантного коронавирусного антигена обеспечивает специфичность и универсальность в отношении иммунного ответа против коронавируса SARS-CoV-2.

2. Разработанная технология производства химерного рекомбинантного коронавирусного антигена позволяет реализовать его серийный выпуск.

3. Химерный рекомбинантный коронавирусный антиген обладает активностью в отношении человеческих антител к SARS-CoV-2 и CD4+ Т-лимфоцитов.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность результатов работы, правомочность основных положений и выводов основаны на полноте и широте литературно-библиографической справки, использовании современных инструментов для прогнозирования и идентификации высокоаффинных эпитопов, а также подтверждена проверкой достоверности первичной документации.

Результаты работы представлены и обсуждены на конференции «Сочинская школа-конференция «Аллергология, иммунология и инфектология» (Сочи, 2024 г.) и XIV школе-конференции по клинической иммунологии «Иммунология для врачей» (Пушкинские горы, 2024 г.).

Личный вклад автора

Личный вклад автора состоит в участии в проведении всех этапов работ: в дизайне структуры антигена, генной инженерии штамма-продуцента, в

организации и проведении биотехнологических этапов работ, включая очистку целевого белки и отработку аналитических методик, в проведении иммунологических исследований, а также в трансфере технологии получения рекомбинантного коронавирусного антигена на производственную площадку ООО «Фирн-М» и в подготовке документации для регистрационного досье на субстанцию.

Соискатель приносит коллегам свою искреннюю благодарность.

Реализация результатов работы

Технология производства универсального консервативного антигена SARS-CoV-2 фармацевтического качества с широким спектром применения (исследования, диагностика, перспективные вакцинные препараты), разработанная в рамках проведенного диссертационного исследования, внедрена на производственной площадке ООО «Фирн-М» для производства «КоронаДерм-PS, аллерген коронавирусный рекомбинантный, субстанция - раствор». Подготовлена технологическая документация для регистрационного досье.

Получено in vivo подтверждение пригодности использования разработанного антигена в составе тест-системы «КоронаДерм-PS» для выявления Т-клеточного ответа в группах как переболевших пациентов, так и не болевших, но вакцинированных различными вакцинными препаратами.

Публикации результатов исследования

По результатам проведенного исследования было опубликовано 5 научных работ в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования основных научных результатов диссертации по специальности 3.2.7. Иммунология, и/или индексируемых в международной библиографической базе данных Scopus, а также получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, заключение. Работа изложена на 112 страницах, содержит 19 рисунков, 5 таблиц и 3 приложения. Список литературы содержит 178 литературных источников.

ГЛАВА 1 - ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 - Коронавирусная инфекция COVID-19. Структура вируса SARS-CoV-2

Коронавирусы (CoVs) — это очень разнообразное семейство вирусов с одноцепочечной (+)РНК, покрытых оболочкой. Коронавирусы входят в семейство Coronaviridae, подотряд Coronavirineae, отряд Nidovirales. Семейство Coronaviridae состоит из четырёх родов: альфа-, бета-, гамма- и дельтакоронавирусы. В то время как альфакоронавирусы и бетакоронавирусы поражают исключительно млекопитающих, гаммакоронавирусы и дельтакоронавирусы имеют более широкий круг хозяев, включая птиц. Инфекции, вызываемые коронавирусами у людей и животных, в основном приводят к респираторным и кишечным заболеваниям [35, 137].

Многие коронавирусы человека, такие как HCoV-229E и HCoV-OC43, циркулируют среди населения и вызывают сезонные легкие инфекции дыхательных путей, сопровождающиеся симптомами «простуды». В отличие от них, относительно недавно появившиеся в человеческой популяции коронавирусы тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV), ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) и SARS-CoV-2 являются высокопатогенными и высококонтагиозными. Инфицируя клетки бронхиального эпителия, пневмоциты и клетки верхних дыхательных путей у людей, SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 могут вызывать тяжелые, опасные для жизни респираторные заболевания и повреждения легких.

Заражение коронавирусом начинается со специфического связывания шиповидного белка (S) коронавируса с так называемыми рецепторами проникновения на клеточной мембране клетки-мишени. К таким рецепторам относятся аминопептидаза N человека (APN; HCoV-229E), ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2; HCoV-NL63, SARS-CoV и SARS-

СоУ-2) и дипептидилпептидаза 4 (DPP4; MERS-CoV) [155]. Уровень экспрессии и тканевое распределение рецепторов проникновения определяет тропизм и патогенность вируса.

Дальнейший жизненный цикл вируса, его репликация, изображен схематично на рисунке 1 [61]. Белок-шип SARS-CoV-2 прикрепляется к клеточному рецептору ACE2, инициируя проникновение вируса в цитоплазму посредством эндоцитоза. После высвобождения и трансляции вирусной геномной РНК к клетке экспрессируются 16 неструктурных, 9 вспомогательных и 4 структурных белков E, M и К). Белок N связывается с геномной РНК дочернего вируса, образуя рибонуклеопротеин, который впоследствии собирается в структуру фазового разделения (PS) и взаимодействует с белками S, Е и М, встроенными в промежуточный компартмент эндоплазматического ретикулума комплекса Гольджи (ERGIC). Происходит сборка зрелого дочернего вируса, за которой следует его высвобождение посредством экзоцитоза [97, 167].

Рисунок 1 - Схематическое изображение процесса репликации SARS-CoV-2

Геном коронавирусов выделяется своим большим размером около 30 тысяч оснований, фланкирован 5'- и З'-нетранслируемыми повторяющимися участками,

которые содержат вторичные структуры РНК, необходимые для синтеза РНК (Рисунок 2). На 5'-конце геномной РНК находятся две большие открытые рамки считывания (ORF; ORFla и ORFlb). ORFla и ORFlb кодируют 15-16 неструктурных белков (nsp), участвующих в формировании комплекса репликации и транскрипции вируса (RTC). Данный комплекс также выполняет функцию проверки РНК, необходимую для поддержания целостности генома [49]. Рамки считывания, кодирующие структурные и вспомогательные белки, транскрибируются с З'-конца одной трети генома, образуя вложенный набор субгеномных мРНК (сг-мРНК/sg-mRNA). Вспомогательные белки коронавируса характеризуются высокой вариабельностью, специфичны для видов вируса [101, 118], из-за чего их молекулярные функции изучены слабо [93].

Рисунок 2 - Структура генома SARS-CoV-2 и других коронавирусов

Сравнение кодирующих участков SARS-CoV-2 с другими коронавирусами показало, что организация генома SARS-CoV-2 схожа с организацией геномов SARS-CoV, SL-CoVZXC21 летучих мышей и CoV GX/P2V панголинов. В ORF1 разных коронавирусов нет заметных различий, но он кодирует NSP разной длины,

а в вспомогательных генах есть различия. Красная пунктирная линия на рисунке 2 показывает заметное различие между SARS-CoV-2 и SARS-CoV [68].

Б-белок

Б-белок (шиповидный белок) — это трансмембранный белок, сильно выступающий из оболочки вируса. Обычно обнаруживается порядка 15-30 свободно вращающихся S-белков на одной вирусной частице [87, 170]. Функциональный S-белок представляет собой тример, состоящий из экзодомена, трансмембранной области и внутриклеточного домена. Было показано, что шиповидный белок может совершать шарнироподобные движения, приводящие к переходам между «верхним» и «нижним» положениями [71, 168, 170]. Внутриклеточный домен имеет короткий внутриклеточный хвост. Область экзодомена состоит из субдоменов S1 и S2, первый из которых выступает в качестве основного поверхностного антигена. Он состоит из двух субъединиц: N концевого домена (NTD) и С-концевого домена (CTD) [71]. S1-CTD действует как рецептор-связывающий домен (RBD) и взаимодействует с 18 аминокислотами ACE-2 [81]. Три RBD образуют тример и поворачиваются вверх, чтобы обеспечить доступ к рецептору [34]. Домен S2 представляет собой субъединицу слияния с мембраной. Он содержит пептид слияния (РР), гептадный повтор 1 (HR1), центральную спираль (СН), соединительный домен (CD), гептадный повтор 2 (HR2) и трансмембранный домен (ТМ). Гептадные повторы образуют тримерную структуру в виде спиральной катушки и сближают вирусную оболочку и билипидный слой клетки-хозяина, способствуя их слиянию [158]. На границе субъединиц S1 и S2 присутствует отличительный для SARS-CoV-2 участок расщепления фурином (RRAR) и остаток пролина в начале этого сайта [12, 163].

Е-белок

Белок Е (белок оболочки) представляет собой небольшой полипептид массой от 8,4 до 12 кДа. Он состоит из двух отдельных доменов: гидрофобного трансмембранного домена (К-конец) и заряженного цитоплазматического хвоста (С-конец) [7]. Е-белок образует виропорины, транспортирующие ионы Са2+ и участвующие в сборке и высвобождении вирусных частиц из клеток-хозяев [41, 89,

119]. Также известно, что белок СоУ Е участвует в увеличении нагрузки на эндоплазматический ретикулум (ЭР) при сворачивании белков, а также в формировании специализированной структуры «промежуточного компартмента ЭР-Гольджи» (ERGIC), способствующей высвобождению зрелого вируса [39].

М-белок

Гликопротеин М (мембранный белок) является основным структурным элементом коронавируса и, взаимодействуя с белками М, 8 и Е, формирует характерную форму оболочки вириона. Последовательность М-белка включает в себя три трансмембранных домена, С-конец которых находится внутри, а К-конец — снаружи вируса. Третий трансмембранный домен содержит высококонсервативную амфипатическую область на конце, в то время как для других участков М-белка характерна большая вариативность [66]. За счет взаимодействия с остальными структурными белками, а также РНК коронавируса М-белок играет центральную роль в регуляции репликации и упаковке РНК в зрелые вирусные частицы [110]. Было доказано, что М-белки могут иметь две структурные формы: компактную и вытянутую. Компактные М-белки часто ассоциируются с низкой плотностью 8-белков по сравнению с вытянутыми [59]. Сообщается, что белок М вируса SARS-CoV взаимодействует с ОТ-кВ в клетках хозяина, снижая экспрессию гена циклооксигеназы 2 (Сох 2). Более того, белок М может способствовать патогенезу, подавляя воспалительную реакцию хозяина, опосредованную ОТ-кВ и Сох-2 [44].

И-белок

Белок N имеет молекулярную массу от 43 до 50 кДа и связывается с геномной РНК. Он состоит из трёх консервативных доменов: К-ветви (NTD), центрального линкера (СЬ) и С-хвоста (CTD). Функция NTD заключается в связывании с РНК, и большую его часть занимают положительно заряженные аминокислоты. Рентгеновская кристаллография NTD показывает, что четыре мономера NTD упакованы в асимметричный орторомбический кристалл. Полную структуру NTD можно разделить на три области: выступающий основный палец, основную ладонь и кислотное запястье. В мономерах можно увидеть правостороннюю

сэндвичеобразную складку из петли, в-листа и петли. в-лист состоит из пяти антипараллельных в-цепей с функционально важной в-шпилькой, выступающей между в2 и в5 цепями. В СоУ наиболее консервативные остатки присутствуют в основных областях ладони по сравнению с пальцами и кислотным запястьем. Хотя NTD у коронавирусов имеет очень похожую структуру, NTD SARS-CoV-2 отличается распределением поверхностных зарядов, что, вероятно, повышает эффективность связывания с РНК [69]. СТБ-область опосредует димеризацию N белка путём самоассоциации и содержит сигнал ядерной локализации. Она играет важную роль в олигомеризации нуклеокапсидного белка и взаимодействии выбелок-белок. Считается, что СЬ-область специфически взаимодействует с М-белком [147]. Аминокислотная последовательность ^белка SARS-CoV-2 высококонсервативна и более чем на 90% идентична ^белку SARS-CoV [69].

После проникновения вируса ^белок способствует высвобождению вирусной РНК в процессе диссоциации капсида [13]. В дальнейшем, функции N белка включают репликацию и транскрипцию вирусной РНК, формирование и поддержание рибонуклеопротеинового (РНП) комплекса [81]. Кроме того, показано, что для взаимодействия РНК-Ы-белок характерно фазовое разделение (ФР/PS англ.). Фазовое разделение белка N инициируется его связыванием с молекулами РНК различной длины и зависит от электростатических сил, таких как рН и концентрация №С1 (Рисунок 3). Такое разделение имеет несколько последствий. Путь «А» на рисунке 3 заключается в образовании гранул стресса (SG) и взаимодействии с ключевыми факторами, участвующими в противовирусной реакции клетки-хозяина, такими как MAVS и ЯЮ-1, что в конечном итоге приводит к подавлению выработки интерферона I типа (Ш№). Путь «В» заключается в сборке и почковании зрелых вирионов. ^белок взаимодействует с геномной РНК вируса и образует конденсаты, которые затем прикрепляются к мембране ERGIC посредством кофазного разделения с белком М SARS-CoV-2. И наконец, кофазное разделение белка N также регулирует пути врождённого иммунитета клеток хозяина, взаимодействуя с активаторами ОТ-кВ, что приводит к усилению выработки цитокинов. Это, в свою очередь, вызывает

воспалительную реакцию и секрецию различных цитокинов, что ещё больше усиливает иммунный ответ организма на инфекцию SARS-CoV-2 [61]

SGs: stress granules i^m ERGIC membrane ^ Spike Protein "J* Envelope Protein * J Membrane Protein

Рисунок 3 - Регуляция и функциональное значение фазового разделения

белка N SARS-CoV-2

1.2 - Изменчивость вируса SARS-CoV-2

После начала эпидемии СОУГО-19 было выявлено и задокументировано множество вариаций SARS-CoV-2. Новые мутации или варианты могут возникать по разным причинам, в том числе в результате естественного отбора, рецидивирующих инфекций у людей с ослабленным иммунитетом, случайных событий, смены хозяев, мутаций, связанных с отсутствием способности к редактированию, образования гибридных вирусов при сочетанной инфекции и мутаций во время трансляции [48]. Для некоторых развивающихся вариантов мутаций, обнаруженных у людей с ослабленным иммунитетом при постоянном выделении вируса и у спонтанных нон-респондеров, мог произойти естественный отбор мутаций, устойчивых к иммунному ответу.

Пандемия SARS-CoV-2 привела к описанию множества вариантов. Они были разделены на две группы. Они известны как варианты, представляющие интерес (У01), и варианты, вызывающие озабоченность (УОС) [108]. ВОЗ классифицировала лишь небольшое количество из них как УОС из-за их

потенциального негативного воздействия на общественное здравоохранение во всем мире, однако вскоре появились новые геноварианты коронавируса. Мутировавшие штаммы характеризуются высокой трансмиссивностью, приводят к более тяжелому прогрессированию заболевания, увеличивают смертность, не поддаются нейтрализации антителами и/или их трудно обнаружить.

Варианты SARS-CoV-2 характеризуются мутациями в вирусном геноме, в частности в шиповидном белке который играет ключевую роль в способности вируса заражать клетки хозяина. Шиповидный белок является основной мишенью для нейтрализующих антител и вакцин, что делает мутации в этом регионе особенно значимыми. Такие варианты, как «Альфа» (В.1.1.7), «Бета» (В.1.351), «Гамма» (Р1), «Дельта» (В.1.617.2) и «Омикрон» (В.1.1.529), были идентифицированы и классифицированы как УОС из-за повышенной заразности, вирулентности или устойчивости к нейтрализующим антителам (Таблица 1) [27, 162].

Таблица 1 - Основные геноварианты вируса 8АЯ8-СоУ-2

Вариант Ярлык ВОЗ Происхо ждение Панго Дата появления Ключевые мутации (Спайковый белок) Способность к передаче

Альфа В.1.1.7 Великобр итания Сентябрь 2020 года Ш01У, Б6140, 69-70ёе1, Р681Н ~ На 50% более трансмиссивный, чем исходный штамм

Бета В.1.351 Южная Африка Май 2020 года К417К, Е484К, Ш01У, Б6140 ~ На 50% более трансмиссивный, чем исходный штамм

Гамма П.1 . Бразилия Ноябрь 2020 К417Т, Е484К, Ш01У, года Б6140 Повышенная пропускаемость (данные неточны)

Дельта Б.1.617. 2 Индия Октябрь 2020 года Ь452Я, Т478К, Б6140, Р681Я Сильно увеличенный (в 2 раза больше, чем Альфа)

Омикрон Б.1.1.52 9 Южная Африка Ноябрь 2021 года Б371Ь, Б373Р, 8375Б, Т376А, 0496Б, 0498Я, №79К, Р681Н, Б796У Чрезвычайно высокая пропускаемость; превосходит дельта-

Примечание: ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

Альфа-вариант (В.1.1.7) SARS-CoV-2

Вариант «Альфа» (В.1.1.7) был впервые выявлен в Соединённом Королевстве в сентябре 2020 года. О нём сообщили в ВОЗ в декабре 2020 года, и он быстро стал вызывать обеспокоенность из-за своего быстрого распространения и значительных мутаций [114]. Вариант «Альфа» продемонстрировал значительное повышение заразности по сравнению с предыдущими штаммами. Он быстро распространился по Великобритании и другим странам и к началу 2021 года стал доминирующим штаммом во многих регионах. Исследования показали, что вариант «Альфа» на 50100% более заразен, чем предыдущие варианты [114].

Вариант «Альфа» характеризуется 23 мутациями, в том числе 17 несинонимичными мутациями, 6 синонимичными мутациями и 3 делециями [160]. Ключевые мутации в шиповидном белке включают N50^, которая повышает сродство к рецептору ACE2, и делецию аминокислот 69-70 (Д69-70), которая связана с уклонением от иммунного ответа и повышенной заразностью [57, 160].

Бета-вариант (В.1.351) SARS-CoV-2

Вариант «Бета», также известный как В.1.351, был впервые выявлен в Южной Африке в мае 2020 года и доложен ВОЗ в декабре 2020 года. Он стал вызывать обеспокоенность из-за мутаций, которые повлияли на его трансмиссивность и способность уклоняться от иммунитета [99]. Вариант «Бета» продемонстрировал повышенную трансмиссивность по сравнению с более ранними штаммами, что привело к росту числа случаев заболевания в регионах [42]. Он также продемонстрировал значительную способность уклоняться от иммунитета, снижая эффективность вакцин и повышая риск повторного заражения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Копать Владимир Владиславович, 2026 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОФС. 1.7.1.0007.15. Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII изд. 2016. С. 521-41.

2. Савин, Т.В. Оценка безопасности и специфической активности рекомбинантного аллергена коронавируса SARS-CoV-2 («КоронаДерм-PS») по результатам I—II фазы клинического исследования / Т.В. Савин, А.М. Миличкина, А.А. Краснов [и др.] / Инфекция и иммунитет. — 2024. — Т. 14, №. 5. — C. 900-916. doi: 10.15789/2220-7619-SAS-17790.

3. Савин, Т.В. Экспериментальное исследование специфической иммунологической активности и безопасности препарата «КоронаДерм-PS» для оценки клеточного иммунитета против коронавируса SARS-CoV-2 / Т.В. Савин, В.В. Копать, А.А. Рябченкова [и др.] // Инфекция и иммунитет. — 2024. — Т. 14, №. 2. — C. 238-250. doi: 10.15789/2220-7619-ESO-17661.

4. Abudunaibi, B. A comparative study on the three calculation methods for reproduction numbers of COVID-19 / B. Abudunaibi, W. Liu, Z. Guo [et al.] // Front. Med. — 2023. — V. 9. — P. 1079842. doi: 10.3389/fmed.2022.1079842.

5. Agerer, B. SARS-CoV-2 mutations in MHC-I-restricted epitopes evade CD8+ T cell responses / B. Agerer, M. Koblischke, V. Gudipati [et al.] // Sci. Immunol. — 2021. — V. 6. — P. eabg6461. doi: 10.1126/sciimmunol.abg6461.

6. Ahmadi, E. SARS-CoV-2 spike protein displays sequence similarities with paramyxovirus surface proteins: a bioinformatics study / E. Ahmadi, M.R. Zabihi, R. Hosseinzadeh [et al.] // PLOS ONE. — 2021. — V. 16. — P. e0260360. doi: 10.1371/journal.pone.0260360.

7. Alam, I. Functional pangenome analysis suggests inhibition of the protein E as a readily available therapy for COVID-2019 / I. Alam, A.A. Kamau, M. Kulmanov [et al.] // Front Cell Infect Microbiol. - 2020. - V. 10. - P. 405. DOI: 10.1101/2020.02.17.952895.

8. Arunachalam, P.S. Systems biological assessment of immunity to mild versus severe COVID-19 infection in humans / P.S. Arunachalam, F. Wimmers, C.K.P. Mok [et al.] // Science. - 2020. - V. 369. - P. 1210-1220. doi: 10.1126/science.abc6261.

9. Bacher, P. Antigen-reactive T cell enrichment for direct, high-resolution analysis of the human naive and memory Th cell repertoire / P. Bacher, C. Schink, J. Teutschbein [et al.] // J Immunol. - 2013. - V. 190, №. 8. - P. 396776. doi: 10.4049/jimmunol.1202221.

10.Bacher, P. Flow-cytometric analysis of rare antigen-specific T cells / P. Bacher, A. Scheffold // Cytometry A. - 2013. - V. 83, №. 8. - P. 692-701. doi: 10.1002/cyto.a.22317.

11.Bacher, P. Low-avidity CD4+ T cell responses to SARS-CoV-2 in unexposed individuals and humans with severe COVID-19 / P. Bacher, E. Rosati, D. Esser [et al.] // Immunity. - 2020. - V. 53. - P. 1258-71.e5. doi: 10.1016/j.immuni.2020.11.016.

12.Bagdonaite, I. Global aspects of viral glycosylation / I. Bagdonaite, H.H. Wandall // Glycobiology. - 2018. - V. 28. - P. 443-67. doi: 10.1093/glycob/cwy021.

13.Baggen, J. Cellular host factors for sars-cov-2 infection / J. Baggen, E. Vanstreels, S. Jansen, D. Daelemans // Nat. Microbiol. - 2021. - V. 6. - P. 1219-1232. doi: 10.1038/s41564-021-00958-0.

14.Bange, E.M. CD8+ T cells contribute to survival in patients with COVID-19 and hematologic cancer / E.M. Bange, N.A. Han, P. Wileyto [et al.] // Nature medicine. - 2021. - V. 27, №. 7. - P. 1280-1289. doi: 10.1038/s41591-021-01386-7.

15.Banho, C.A. Impact of SARS-CoV-2 Gamma lineage introduction and COVID-19 vaccination on the epidemiological landscape of a Brazilian city / C.A. Banho, L. Sacchetto, G.R.F. Campos [et al.] // Commun. Med. - 2022. - V. 2. - P. 1-11. doi: 10.1038/s43856-022-00108-5.

16.Bastard, P. Autoantibodies against type I IFNs in patients with life-threatening COVID-19 / P. Bastard, L.B. Rosen, Q. Zhang [et al.] // Science. - 2020. - V. 370. - P. eabd4585. doi: 10.1126/science.abd4585.

17.Bian, L. Impact of the Delta variant on vaccine efficacy and response strategies / L. Bian, Q. Gao, F. Gao [et al.] // Expert Rev. Vaccines. - 2021. -V. 20. - P. 1201-1209. doi: 10.1080/14760584.2021.1976153.

18.Blanco-Melo, D. Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of COVID-19 / D. Blanco-Melo, B.E. Nilsson-Payant, W.-C. Liu [et al.] // Cell. - 2020. - V. 181. - p. 1036-1045.e9. doi: 10.1016/j.cell.2020.04.026.

19.Boratyn, G.M. Magic-BLAST, an accurate RNA-seq aligner for long and short reads / G.M. Boratyn, J. Thierry-Mieg, D. Thierry-Mieg [et al.] // BMC bioinformatics. - 2019. - V. 20, №. 1. - P. 1-19. doi: 10.1186/s12859-019-2996-x.

20.Braun, J. SARS-CoV-2-reactiveTcells in healthy donors and patients with COVID-19 / J. Braun, L. Loyal, M. Frentsch [et al.] // Nature. - 2020. - V. 587. - P. 270-74. doi: 10.1038/s41586-020-2598-9.

21.Breton, G. Persistent cellular immunity to SARS-CoV-2 infection / G. Breton, P. Mendoza, T. Hägglöf [et al.] // J. Exp.Med. - 2021. - V. 218. - P. e20202515. doi: 10.1084/jem.20202515.

22.Burgess, R.R. Refolding solubilized inclusion body proteins / R.R. Burgess // Methods in enzymology. - 2009. - V. 463. - P. 259-282. doi: 10.1016/S0076-6879(09)63017-2.

23.Cao, Y. BA.2.12.1, BA.4 and BA.5 escape antibodies elicited by Omicron infection / Y. Cao, A. Yisimayi, F. Jian [et al.] Nature New Biol. - 2022. - V. 608. - P. 593-602. doi: 10.1038/s41586-022-04980-y.

24.Cao, Y. Omicron Escapes the Majority of Existing SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies / Y. Cao, J. Wang, F. Jian [et al.] // Nature. - 2022. - V. 602. - P. 657-663. doi: 10.1038/s41586-021-04385-3.

25.Carreno, J.M. Activity of Convalescent and Vaccine Serum against SARS-CoV-2 Omicron / J.M. Carreno, H. Alshammary, J. Tcheou [et al.] // Nature. - 2022. - V. 602. - P. 682-688. doi: 10.1038/s41586-022-04399-5.

26.Carter, L.J. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis / L.J. Carter, L.V. Garner, J.W. Smoot [et al.] // ACS Cent Sci. - 2020. - V. 6. - P. 591-605. doi: 10.1021/acscentsci.0c00501.

27.CDC, SARS-CoV-2 Variant Classifications and Definitions [Electronic resource] / CDC. - 2021. - Access mode: https://www.cdc.gov/coronavirus/

28.Cejka, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea / J. Cejka, Z. Vodrazka, J. Salak // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure. - 1968. - V. 154, №. 3. - P. 589591. doi: 10.1016/0005-2795(68)90021-4.

29.Cerutti, G. Cryo-EM structure of the SARS-CoV-2 Omicron spike / G. Cerutti, Y. Guo, L. Liu [et al.] // Cell Rep. - 2022. - V. 38. - P. 110428. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110428.

30.Chang, C. The SARS coronavirus nucleocapsid protein-forms and functions / C. Chang, M.-H. Hou, C.-F. Chang [et al.] // Antiviral research. - 2014. - V. 103. - P. 39-50. doi: 10.1016/j.antiviral.2013.12.009.

31.Chen, J. Cellular immune responses to severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) infection in senescent BALB/c mice: CD4+ T cells are important in control of SARS-CoV infection / J. Chen, Y.F. Lau, E.W. Lamirande [et al.] // Journal of virology. - 2010. - V. 84, №. 3. - P. 12891301. doi: 10.1128/jvi.01281-09.

32.Clark, E.D.B. Protein refolding for industrial processes / E.D.B. Clark // Current opinion in biotechnology. - 2001. - V. 12, №. 2. - P. 202-207. doi: 10.1016/s0958-1669(00)00200-7.

33.Cohen, K.W. Longitudinal analysis shows durable and broad immune memory after SARS-CoV-2 infection with persisting antibody responses and memory B and T cells / K.W. Cohen, S.L. Linderman, Z. Moodie [et al.] // Cell Rep.Med. - 2021. - V. 2. - P. 100354. doi: 10.1101/2021.04.19.21255739.

34.Coutard, B. The spike glycoprotein of the new Coronavirus 2019-nCoV contains a furin-like cleavage site absent in CoV of the same clade / B. Coutard, C. Valle, X. de Lamballerie [et al.] // Antiviral Res. - 2020. - V. 176. - P. 104742. doi: 10.1016/j.antiviral.2020.104742.

35.Cui, J. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses /J. Cui, F. Li, Z.L. Shi // Nat Rev Microbiol. - 2019. - V. 17. - P. 181-92. doi: 10.1038/s41579-018-0118-9.

36.Cui, Z. Structural and functional characterizations of infectivity and immune evasion of SARS-CoV-2 Omicron / Z. Cui, P. Liu, N. Wang [et al.] // Cell. -2022. - V. 185. - p. 860-871. doi: 10.1016/j.cell.2022.01.019.

37.Dan, J.M. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection / J.M. Dan, J. Mateus, Y. Kato [et al.] // Science. -2021. - V. 371. - P. eabf4063. doi: 10.1126/science.abf4063.

38.Datar, R.V. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator / R.V. Datar, T. Cartwright, C.G. Rosen // Bio/technology. - 1993. - V. 11, №. 3. - P. 349357. doi: 10.1038/nbt0393-349.

39.DeDiego, M.L. Severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein regulates cell stress response and apoptosis / M.L. DeDiego, J.L. Nieto-Torres, J.M. Jimenez-Guardeno [et al.] // PLOS Pathog. - 2011. - V. 7, №. 10. - P. e1002315. doi: 10.1371/journal.ppat.1002315.

40.DiPiazza, A.T. T cell immunity to SARS-CoV-2 following natural infection and vaccination / A.T. DiPiazza, B.S. Graham, T.J. Ruckwardt // Biochemical and biophysical research communications. - 2021. - V. 538. - P. 211-217. doi: 10.1016/j.bbrc.2020.10.060.

41.Duart, G. SARS-CoV-2 envelope protein topology in eukaryotic membranes / G. Duart, M.J. García-Murria, B. Grau [et al.] // Open Biol. -2020. - V. 10.

- P. 200209. doi: 10.1098/rsob.200209.

42.Duong, B.V. Is the SARS CoV-2 Omicron Variant Deadlier and More Transmissible Than Delta Variant? / B.V. Duong, P. Larpruenrudee, T. Fang [et al.] // Int. J. Environ. Res. Public Health. - 2022. - V. 19. - P. 4586. doi: 10.3390/ijerph19084586.

43.Fahnert, B. Inclusion bodies: formation and utilization / B. Fahnert, H. Lilie, P. Neubauer // Adv Biochem Eng Biotechnol. - 2004. - V. 89. - P. 93-142. doi:10.1007/b93995.

44.Fang, X. The membrane protein of SARS-CoV suppresses NF-kB activation / X. Fang, J. Gao, H. Zheng [et al.] // Antivir Ther. - 2007. - V. 79. - P. 14319. doi: 10.1002/jmv.20953.

45.Fernández-González, M. Clinical performance of a standardized severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) interferon-g release assay for simple detection of T-cell responses after infection or vaccination / M. Fernández-González, V. Agulló, S. Padilla [et al.] // Clin. Infect. Dis. - 2022.

- V. 75, №. 1. - P. e338-46. doi: 10.1093/cid/ciab1021.

46.Ferretti, A.P. Unbiased screens show CD8+ T cells of COVID-19 patients recognize shared epitopes in SARS-CoV-2 that largely reside outside the spike protein / A.P. Ferretti, T. Kula, Y. Wang [et al.] // Immunity. - 2020. -V. 53. - P. 1095-107.e3. doi: 10.1016/j.immuni.2020.10.006.

47.Gobeil, S.M.-C. Structural diversity of the SARS-CoV-2 Omicron spike / S.M.-C. Gobeil, R. Henderson, V. Stalls [et al.] // Mol Cell. - 2022. - V. 82.

- P. 2050-2068. doi: 10.1016/j.molcel.2022.03.028.

48.Gómez, C.E. Emerging SARS-CoV-2 Variants and Impact in Global Vaccination Programs Against SARS-CoV-2/COVID-19 / C.E. Gómez, B. Perdiguero, M. Esteban // Vaccines. - 2021. - V. 9, №. 3. - P. 243. doi: 10.3390/vaccines9030243.

49.Gorbalenya, A.E. Nidovirales: evolving the largest RNA virus genome / A.E. Gorbalenya, L. Enjuanes, J. Ziebuhr, E.J. Snijder // Virus Res. - 2006. - V. 117. - P. 17-37. doi: 10.1016/j.virusres.2006.01.017.

50.Gordon, D.E. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing / D.E. Gordon, G.M. Jang, M. Bouhaddou [et al.] // Nature. -2020. - V. 583, №. 7816. - P. 459-468. doi: 10.1038/s41586-020-2286-9.

51.Grifoni, A. SARS-CoV-2 human T cell epitopes: Adaptive immune response against COVID-19 / A. Grifoni, J. Sidney, R. Vita [et al.] // Cell Host Microbe. - 2021. - V. 29, №. 7. - P. 1076-1092. doi: 10.1016/j.chom.2021.05.010. Epub 2021 May 21. Erratum in: Cell Host Microbe. 2022 Dec 14;30(12):1788. doi: 10.1016/j.chom.2022.10.017.

52.Grifoni, A. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals / A. Grifoni, D. Weiskopf, S.I. Ramirez [et al.] // Cell. - 2020. - V. 181. - P. 1489-1501.e15. doi: 10.1016/j.cell.2020.05.015.

53.Gupta, S. SARS-CoV-2-associated T-cell responses in the presence of humoral immunodeficiency / S. Gupta, H. Su, T. Narsai, S. Agrawal // International archives of allergy and immunology. - 2021. - V. 182, №. 3. -P. 195-209. doi: 10.1159/000514193.

54.Hagel, P. Cyanate formation in solutions of urea: I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH / P. Hagel, J.J. Gerding, W. Fieggen, H. Bloemendal // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure. - 1971. - V. 243, №. 3. - P. 366-373. doi: 10.1016/0005-2795(71)90003-1.

55.Hamelin, D.J. Themutational landscape of SARS-CoV-2 variants diversifies T cell targets in an HLA-supertype-dependent manner / D.J. Hamelin, D. Fournelle, J.C. Grenier [et al.] // Cell Syst. - 2022. - V. 13. - P. 143-57.e3. doi: 10.1016/j.cels.2021.09.013.

56.Hartley, D.L. Properties of inclusion bodies from recombinant Escherichia coli / D.L. Hartley, J.F. Kane // Biochem Soc Trans. - 1988. - V. 16, №. 2. -P. 101-102. doi:10.1042/bst0160101.

57.Harvey, W.T. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape / W.T. Harvey, A.M. Carabelli, B. Jackson [et al.] // Nat. Rev. Microbiol. -2021. - V. 19. - P. 409-424. doi: 10.1038/s41579-021-00573-0.

58.Hoffmann, M. The Omicron Variant Is Highly Resistant against Antibody-Mediated Neutralization: Implications for Control of the COVID-19 Pandemic / M. Hoffmann, N. Krüger, S. Schulz [et al.] // Cell. - 2022. - V. 185. - P. 447-456.e11. doi: 10.1016/j.cell.2021.12.032.

59.Hu, Y. The M protein of SARS-CoV: basic structural and immunological properties / Y. Hu, J. Wen, L. Tang [et al.] // Genomics Proteomics Bioinformatics. - 2003. - V. 1. - P. 118-30. doi: 10.1016/s1672-0229(03)01016-7.

60.Huang, S. T cell responses in respiratory viral infections and chronic obstructive pulmonary disease / S. Huang, Q. He, L. Zhou //Chinese Medical Journal. - 2021. - V. 134, №. 13. - P. 1522-1534. doi: 10.1097/CM9.0000000000001388.

61.Huang, Y. Molecular characterization of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein / Y. Huang, J. Chen, S. Chen [et al.] //. Front Cell Infect Microbiol. - 2024. -V. 23, №. 14. - P. 1415885. doi: 10.3389/fcimb.2024.1415885.

62.Huzly, D. Accuracy and real life performance of a novel interferon-y release assay for the detection of SARS-CoV2 specific T cell response / D. Huzly, M. Panning, F. Smely [et al.] // J. Clin. Virol. - 2022. - V. 148. - P. 105098. doi: 10.1016/j.jcv.2022.105098.

63.Ikai, A. Thermostability and aliphatic index of globular proteins / A. Ikai // The Journal of Biochemistry. - 1980. - V. 88, №. 6. - P. 1895-1898. doi: 10.1093/oxfordiournals.ibchem.a133168.

64.Ito, K. Estimating relative generation times and relative reproduction numbers of Omicron BA.1 and BA.2 with respect to Delta in Denmark / K. Ito, C. Piantham, H. Nishiura // Math Biosci Eng. - 2022. - V. 19, №. 9. - P. 90059017. doi: 10.3934/mbe.2022418.

65.Jiang, H. Global profiling of SARS-CoV-2 specific IgG/ IgM responses of convalescents using a proteome microarray / H. Jiang, Y. Li, H. Zhang [et al.] // MedRxiv. - 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.20.20039495.

66.Jiang, S. Neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 and other human coronaviruses / S. Jiang, C. Hillyer, L. Du // Trends Immunol. - 2020. - V. 41. - P. 355-9. doi: 10.1016/j.it.2020.03.007.

67.Johansson, A.M. Cross-reactive and mono-reactive SARS-CoV-2 CD4+ T cells in prepandemic and COVID-19 convalescent individuals / A.M. Johansson, U. Malhotra, Y.G. Kim [et al.] // PLOS Pathog. - 2021. - V. 17. -P. e1010203. doi: 10.1371/journal.ppat.1010203.

68.Kadam, S.B. SARS-CoV-2, the pandemic coronavirus: Molecular and structural insights / S.B. Kadam, G.S. Sukhramani, P. Bishnoi [et al.] // J Basic Microbiol. - 2021. - V. 61, №. 3. - P. 180-202. doi: 10.1002/jobm.202000537.

69.Kang, S. Crystal structure of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein RNA binding domain reveals potential unique drug targeting sites / S. Kang, M. Yang, Z. Hong [et al.] // Acta Pharm Sin B. - 2020. - V. 10. - P. 1228-38. doi: 10.1016/j.apsb.2020.04.009.

70.Karimizadeh, Z. The reproduction rate of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 different variants recently circulated in human: A narrative review / Z. Karimizadeh, R. Dowran, T. Mokhtari-Azad, N.-Z. Shafiei-

Jandaghi // Eur. J. Med Res. - 2023. - V. 28. P. 1-10. doi: 10.1186/s40001-023-01047-0.

71.Ke, Z. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions / Z. Ke, J. Oton, K. Qu [et al.] // Nature. - 2020. - V. 588. - P. 1-7. doi: 10.1038/s41586-020-2665-2.

72.Kedl, R.M. Down but far from out: the durability of SARS-CoV-2 immunity after asymptomatic infection / R.M. Kedl // J. Exp. Med. - 2021. - V. 218. -P. e20210359. doi: 10.1084/jem.20210359.

73.Keller, M.D. SARS-CoV-2-specific T cells are rapidly expanded for therapeutic use and target conserved regions of the membrane protein / M.D. Keller, K.M. Harris, M.A. Jensen-Wachspress [et al.] // Blood. - 2020. - V. 136. - P. 2905-17. doi: 10.1182/blood.2020008488.

74.Khetran, S.R. Mutations of SARS-CoV-2 Structural Proteins in the Alpha, Beta, Gamma, and Delta Variants: Bioinformatics Analysis / S.R. Khetran, R. Mustafa // JMIR Bioinform. Biotechnol. - 2023. - V. 4. - P. e43906. doi: 10.2196/43906.

75.Kozlowski, L.P. IPC-isoelectric point calculator / L.P. Kozlowski // Biology direct. - 2016. - V. 11, №. 1. - P. 1-16. doi: 10.1186/s13062-016-0159-9.

76.Kruse, M. Performance of the T-SPOT(®).COVID test for detecting SARS-CoV-2-responsive T cells / M. Kruse, C. Dark, M. Aspden [et al.] // Int. J. Infect. Dis. - 2021. - V. 113. - P. 155-61. doi:10.1016/j.ijid.2021.09.073.

77.Kumar, S. Omicron and Delta variant of SARS-CoV-2: A comparative computational study of spike protein / S. Kumar, T.S. Thambiraja, K. Karuppanan, G. Subramaniam // J. Med Virol. - 2021. - V. 94. - P. 16411649. doi: 10.1002/jmv.27526.

78.Kyte, J. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein / J. Kyte, R.F. Doolittle // Journal of molecular biology. - 1982. - V. 157, №. 1. - P. 105-132. doi: 10.1016/0022-2836(82)90515-0.

79.Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // nature. - 1970. - V. 227, №. 5259. - P. 680-685. doi: 10.1038/227680a0.

80.Laing, A.G. A dynamic COVID-19 immune signature includes associations with poor prognosis / A.G. Laing, A. Lorenc, I. Del Molino Del Barrio [et al.] // Nat. Med. - 2020. - V. 26. - P. 1623-1635. doi: 10.1038/s41591-020-1038-6.

81.Lan, J. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor / J. Lan, J. Ge, J. Yu [et al.] // Nature. - 2020. - V. 581. - P. 215-20. doi: 10.1038/s41586-020-2180-5.

82.Lan, L. Positive RT-PCR test results in patients recovered from COVID-19 / L. Lan, D. Xu, G. Ye [et al.] // Jama. - 2020. - V. 323, №. 15. - P. 1502-1503. doi: 10.1001/jama.2020.2783.

83.Laslo, A.C. Refolding of hexameric porcine leucine aminopeptidase using a cationic detergent and dextrin-10 as artificial chaperones / A.C. Laslo, E. Ganea, C. Obinger // Journal of biotechnology. - 2009. - V. 140, №. 3-4. - P. 162-168. doi: 10.1016/j.jbiotec.2009.01.023.

84.Le Bert, N. Highly functional virus-specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV-2 infection / N. Le Bert, H.E. Clapham, A.T. Tan [et al.] // J. Exp. Med. - 2021. - V. 218. - P. e20202617. doi: 10.1084/jem.20202617.

85.Le Bert, N. SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls / N. Le Bert, A.T. Tan, K. Kunasegaran [et al.] // Nature. - 2020. - V. 584, №. 7821. - P. 457-462. doi: 10.1038/s41586-020-2550-z.

86.Li, C.K. Tcell responses to whole SARS coronavirus in humans / C.K. Li, H. Wu, H. Yan [et al.] // J. Immunol. - 2008. - V. 181. - P. 5490-500. doi: 10.4049/jimmunol.181.8.5490.

87.Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins / F. Li // Annu Rev Virol. - 2016. - V. 3. - P. 237-61. doi: 10.1146/annurev-virology-110615-042301.

88.Liao, M. Single-cell landscape of bronchoalveolar immune cells in patients with COVID-19 / M. Liao, Y. Liu, J. Yuan [et al.] // Nat. Med. - 2020. - V. 26. - P. 842-844. doi: 10.1038/s41591-020-0901-9.

89.Liao, Y. Viroporin activity of SARS-CoV E protein / Y. Liao, J.P. Tam, D.X. Liu // Adv Exp Med Biol. - 2006. - V. 581. - P. 199-202. doi: 10.1007/978-0-387-33012-9_34.

90.Lin, M.F. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing / M.F. Lin, C. Williams, M.V. Murray [et al.] // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2004. - V. 803, №. 2. - P. 353-362. doi: 10.1016/j.jchromb.2004.01.017.

91.Lino, A. Omicron - The new SARS-CoV-2 challenge? / A. Lino, M.A. Cardoso, P. Martins-Lopes, H.M.R. Gon?alves // Rev. Med Virol. - 2022. -V. 32. - P. e2358. doi: 10.1002/rmv.2358.

92.Lippincott, J. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea / J. Lippincott, I. Apostol // Analytical biochemistry. - 1999. - V. 267, №. 1. - P. 57-64. doi: 10.1006/abio.1998.2970.

93.Liu, D.X. Accessory proteins of SARS-CoV and other coronaviruses / D.X. Liu, T.S. Fung, K.K.L. Chong [et al.] // Antivir. Res. - 2014. - V. 109. - P. 97-109. doi: 10.1016/j.antiviral.2014.06.013.

94.Lorenzo-Redondo, R. COVID-19: Is omicron less lethal than delta? / R. Lorenzo-Redondo, E. A Ozer, J.F. Hultquist // BMJ. - 2022. - V. 378. - P. o1806. doi: 10.1136/bmj.o1806.

95.Mak, W.A. SARS-CoV-2 antibody and T cell responses one year after COVID-19 and the booster effect of vaccination: a prospective cohort study /

W.A. Mak, J.G.M. Koeleman, M. van der Vliet [et al.] // J. Infect. - 2022. -V. 84. - P. 171-78. doi: 10.1016/j.jinf.2021.12.003.

96.Mallajosyula, V. CD8+ T cells specific for conserved Coronavirus epitopes correlate with milder disease in COVID-19 patients / V. Mallajosyula, C. Ganjavi, S. Chakraborty [et al.] // Sci. Immunol. - 2021. - V. 6. - P. eabg5669. doi: 10.1126/sciimmunol.abg5669.

97.Malone, B. Structures and functions of coronavirus replication-transcription complexes and their relevance for sars-cov-2 drug design / B. Malone, N. Urakova, E.J. Snijder, E.A. Campbell // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2022. -V. 23. - P. 21-39. doi: 10.1038/s41580-021-00432-z.

98.Mangsbo, S.M. An evaluation of a FluoroSpot assay as a diagnostic tool to determine SARS-CoV-2 specific T cell responses / S.M. Mangsbo, S. Havervall, I. Laurén [et al.] // PLOS ONE. - 2021. - V. 16. - P. e0258041. doi: 10.1371/journal.pone.0258041.

99.Manirambona, E. Evolution and implications of SARS-CoV-2 variants in the post-pandemic era / E. Manirambona, O.J. Okesanya, N.O. Olaleke [et al.] // Discov. Public Health. - 2024. - V. 21. - P. 1-12. doi: 10.1186/s12982-024-00140-x.

100. Mannar, D. SARS-CoV-2 Omicron variant: antibody evasion and cryo-EM structure of spike protein-ACE2 complex / D. Mannar, J.W. Saville, X. Zhu [et al.] // Science. - 2022. - V. 375. - P. 760-764. doi: 10.1126/science.abn7760.

101. Masters, P.S. The molecular biology of coronaviruses / P.S. Masters // Adv. Virus Res. - 2006. - V. 65. - P. 193-292. doi: 10.1016/S0065-3527(06)66005-3.

102. Matchett, W.E. Nucleocapsid vaccine elicits spike-independent SARS-CoV-2 protective immunity / W.E. Matchett, V. Joag, J.M. Stolley [et al.] // The Journal of Immunology. - 2021. - V. 207, №. 2. - P. 376-379. doi: 10.4049/jimmunol.2100421

103. Mateus, J. Low-dose mRNA-1273 COVID-19 vaccine generates durable memory enhanced by cross-reactive T cells / J. Mateus, J.M. Dan, Z. Zhang [et al.] // Science. - 2021. - V. 374. - P. eabj9853. doi: 10.1126/science.abj9853.

104. Mateus, J. Selective and cross-reactive SARS-CoV-2 T cell epitopes in unexposed humans / J. Mateus, A. Grifoni, A. Tarke [et al.] // Science. - 2020.

- V. 370. - P. 89-94. doi: 10.1126/science.abd3871.

105. Matyushenko, V. Detection of IFNy-secreting CD4+ and CD8+ memory T cells in COVID-19 convalescents after stimulation of peripheral blood mononuclear cells with live SARS-CoV-2 / V. Matyushenko, I. Isakova-Sivak, I. Kudryavtsev [et al.] // Viruses. - 2021. - V. 13, №. 8. - P. 1490. doi: 10.3390/v13081490.

106. Meckiff, B.J. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4+ T cells in COVID-19 / B.J. Meckiff, C. Ramirez-Suastegui, V. Fajardo [et al.] // Cell. - 2020. - V. 183. - P. 1340-53.e16. doi: 10.1016/j.cell.2020.10.001.

107. Mitraki, A. Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation / A. Mitraki, B. Fane, C. Haase-Pettingell [et al.] // Science.

- 1991. - V. 253, №. 5015. - P. 54-58. doi: 10.1126/science.1648264.

108. Mohapatra, R.K. Twin Combination of Omicron and Delta Variant Triggering a Tsunami Wave of Ever High Surges in COVID-19 Cases: A Challenging Global Threat With a Special Focus on Indian Sub-Continent / R.K. Mohapatra, R. Tiwari, A.K. Sarangi [et al.] // Journal of Medical Virology. - 2022. - V. 94. - P. 1761. doi: 10.1002/jmv.27585.

109. Moss, P. The T cell immune response against SARS-CoV-2 / P. Moss // Nature immunology. - 2022. - V. 23, №. 2. - P. 186-193. doi: 10.1038/s41590-021-01122-w.

110. Narayanan, K. Nucleocapsid-independent specific viral RNA packaging via viral envelope protein and viral RNA signal / K. Narayanan,

C.J. Chen, J. Maeda, S. Makino // J Virol. - 2003. - V. 77. - P. 2922-7. doi: 10.1128/jvi.77.5.2922-2927.2003.

111. Nelde, A. SARS-CoV-2-derived peptides define heterologous and COVID-19-induced T cell recognition / A. Nelde, T. Bilich, J.S. Heitmann [et al.] // Nat. Immunol. -2021. - V. 22. - p. 74-85. doi: 10.1038/s41590-020-00808-x.

112. Ng, O.W. Memory T cell responses targeting the SARS coronavirus persist up to 11 years post-infection / O.W. Ng, A. Chia, A.T. Tan [et al.] // Vaccine. - 2016. - V. 34. - P. 2008-14. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.02.063.

113. Oran, D.P. Prevalence of Asymptomatic SARS-CoV-2 Infection : A Narrative Review / D.P. Oran, E.J. Topol // Ann. Intern. Med. - 2020. - V. 173. - P. 362-367. doi: 10.7326/M20-3012.

114. Pascall, D.J. The SARS-CoV-2 Alpha variant was associated with increased clinical severity of COVID-19 in Scotland: A genomics-based retrospective cohort analysis / D.J. Pascall, E. Vink, R. Blacow [et al.] // PLoS ONE. - 2023. - V. 18. - P. e0284187. doi: 10.1371/journal.pone.0284187.

115. Patra, A.K. Optimization of inclusion body solubilization and renaturation of recombinant human growth hormone from Escherichia coli / A.K. Patra, R. Mukhopadhyay, R. Mukhija [et al.] // Protein expression and purification. - 2000. - V. 18, №. 2. - P. 182-192. doi: 10.1006/prep.1999.1179.

116. Paul, S. TepiTool: a pipeline for computational prediction of T cell epitope candidates / S. Paul, J. Sidney, A. Sette, B. Peters // Current protocols in immunology. - 2016. - V. 114, №. 1. - P. 18.19.1-18.19.24. doi: 10.1002/cpim.12.

117. Peng, Y. ISARIC4C Investigators Broad and strong memory CD4+ and CD8+ T cells induced by SARS-CoV-2 in UK convalescent individuals following COVID-19 / Y. Peng, A.J. Mentzer, G. Liu [et al.] // Nat. Immunol. - 2020. V. 21. - P. 1336-1345. doi: 10.1038/s41590-020-0782-6.

118. Perlman, S. Coronaviruses post-SARS: update on replication and pathogenesis / S. Perlman, J. Netland // Nat. Rev. Microbiol. - 2009. - V. 7.

- P. 439-450. doi: 10.1038/nrmicro2147.

119. Pham, T. The rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel / T. Pham, J.L. Perry, T.L. Dosey [et al.] // Sci Rep. -2017. - V. 7. - P. 43487. doi: 10.1038/srep43487.

120. Planas, D. Considerable Escape of SARS-CoV-2 Omicron to Antibody Neutralization / D. Planas, N. Saunders, P. Maes [et al.] // Nature. - 2022. -V. 602. - P. 671-675. doi: 10.1038/s41586-021-04389-z.

121. Prakash, S. Genome-wide B cell, CD4+, and CD8+ T cell epitopes that are highly conserved between human and animal coronaviruses, identified from SARS-CoV-2 as targets for preemptive pan-coronavirus vaccines / S. Prakash, R. Srivastava, P.G. Coulon [et al.] // J. Immunol. - 2021. - V. 206.

- P. 2566-82. doi: 10.4049/jimmunol.2001438.

122. Qiu, C. CD8+ T-cell epitope variations suggest a potential antigen HLA-A2 binding deficiency for spike protein of SARS-CoV-2 / C. Qiu, C. Xiao, Z. Wang [et al.] // Frontiers in Immunology. - 2022. - V. 12. - P. 764949. doi: 10.3389/fimmu.2021.764949.

123. Quadeer, A.A. Landscape of epitopes targeted by T cells in 852 individuals recovered from COVID-19: meta-analysis, immunoprevalence, and web platform / A.A. Quadeer, S.F. Ahmed, M.R. McKay // Cell Rep. Med. - 2021. - V. 2. - P. 100312. doi: 10.1016/j.xcrm.2021.100312.

124. Ramachandran, Gn. Stereochemistry of polypeptide chain configurations / Gn. Ramachandran, C. Ramakrishnan, V. Sasisekharan // J. mol. Biol. - 1963. - V. 7. - P. 95-99. doi: 10.1016/s0022-2836(63)80023-6.

125. Redd, A.D. Minimal crossover between mutations associated with Omicron variant of SARS-CoV-2 and CD8+ T-cell epitopes identified in COVID-19 convalescent individuals / A.D. Redd, A. Nardin, H. Kared [et al.] // mBio. - 2022. - V. 13. - P. e0361721. doi: 10.1128/mbio.03617-21.

126. Reynisson, B. Improved prediction of MHC II antigen presentation through integration and motif deconvolution of mass spectrometry MHC eluted ligand data / B. Reynisson, C. Barra, S. Kaabinejadian [et al.] // Journal of proteome research. - 2020. - V. 19, №. 6. - P. 2304-2315. doi: 10.1021/acs.jproteome.9b00874.

127. Rodda, L.B. Functional SARS-CoV-2-specific immune memory persists after mild COVID-19 / L.B. Rodda, J. Netland, L. Shehata [et al.] // Cell. - 2021. - V. 184. - p. 169-83.e17. doi: 10.1016/j.cell.2020.11.029.

128. Rudolph, R. In vitro folding of inclusion body proteins / R. Rudolph, H. Lilie // The FASEB journal. - 1996. - V. 10, №. 1. - P. 49-56.

129. Rydyznski Moderbacher, C. Antigen-specific adaptive immunity to SARS-CoV-2 in acute COVID-19 and associations with age and disease severity / C. Rydyznski Moderbacher, S.I. Ramirez, J.M. Dan [et al.] // Cell. - 2020. - V. 183. - P. 996-1012.e19. doi: 10.1016/j.cell.2020.09.038.

130. Schulien, I. Characterization of pre-existing and induced SARS-CoV-2-specific CD8+ T cells / I. Schulien, J. Kemming, V. Oberhardt [et al.] // Nat.Med. - 2021. - V. 27. - p. 78-85. doi: 10.1038/s41591-020-01143-2.

131. Schwarz, M. Rapid, scalable assessment of SARS-CoV-2 cellular immunity by whole-blood PCR / M. Schwarz, D. Torre, D. Lozano-Ojalvo [et al.] // Nat. Biotechnol. - 2022. - V. 40. - P. 1680-89. doi: 10.1038/s41587-022-01347-6.

132. Scurr, M.J. Whole blood-based measurement of SARS-CoV-2-specific T cells reveals asymptomatic infection and vaccine immunogenicity in healthy subjects and patients with solid-organ cancers / M.J. Scurr, W.M. Zelek, G. Lippiatt [et al.] // Immunology. - 2022. - V. 165. - P. 250-59. doi: 10.1111/imm.13433.

133. Sekine, T. Karolinska COVID-19 Study Group Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19 / T.

Sekine, A. Perez-Potti, O. Rivera-Ballesteros [et al.] // Cell. - 2020. - V. 183.

- P. 158-168.e14. doi: 10.1016/j.cell.2020.08.017.

134. Sette, A. Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and-B polymorphism / A. Sette, J. Sidney // Immunogenetics. - 1999. - V. 50, №. 3-4. - P. 201-212. doi: 10.1007/s002510050594.

135. Sette, A. T Cell Responses to SARS-CoV-2 / A. Sette, J. Sidney, S. Crotty // Annu Rev Immunol. - 2023. - V. 41. - P. 343-373. doi: 10.1146/annurev-immunol-101721-061120.

136. Shah, M. Omicron: A Heavily Mutated SARS-CoV-2 Variant Exhibits Stronger Binding to ACE2 and Potently Escapes Approved COVID-19 Therapeutic Antibodies / M. Shah, H.G. Woo // Front. Immunol. - 2021. - V. 12. - P. 830527. doi: 10.3389/fimmu.2021.830527.

137. Shereen, M.A. COVID-19 infection: origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses / M.A. Shereen, S. Khan, A. Kazmi [et al.] // J Adv Res. - 2020. - V. 24. - P. 91-98. doi: 10.1016/j.jare.2020.03.005.

138. Shiehzadegan, S. Analysis of the Delta Variant B.1.617.2 COVID-19 / S. Shiehzadegan, N. Alaghemand, M. Fox, V. Venketaraman // Clin. Pr. -2021. - V. 11. - P. 778-784. doi: 10.3390/clinpract11040093.

139. Shomuradova, A.S. SARS-CoV-2 epitopes are recognized by a public and diverse repertoire of human T cell receptors / A.S. Shomuradova, M.S. Vagida, S.A. Sheetikov [et al.] // Immunity. - 2020. - V. 53. - P. 1245-57.e5. doi: 10.1016/j.immuni.2020.11.004.

140. Singh, S.M. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins / S.M. Singh, A.K. Panda // Journal of bioscience and bioengineering.

- 2005. - V. 99, №. 4. - P. 303-310. doi: 10.1263/jbb.99.303.

141. Smith-Garvin, J. E. T cell activation / J.E. Smith-Garvin, G.A. Koretzky, M.S. Jordan //Annual review of immunology. - 2009. - V. 27. - P. 591-619. doi: 10.1146/annurev.immunol.021908.132706.

142. Springer, I. Prediction of specific TCR-peptide binding from large dictionaries of TCR-peptide pairs / I. Springer, H. Besser, N. Tickotsky-Moskovitz [et al.] // Frontiers in immunology. - 2020. - V. 11. - P. 1803. doi: 10.3389/fimmu.2020.01803.

143. Stalls, V. Cryo-EM structures of SARS-CoV-2 Omicron BA.2 spike / V. Stalls, J. Lindenberger, S.M.-C. Gobeil [et al.] // Cell Rep. - 2022. - V. 39. - P. 111009. doi: 10.1016/j.celrep.2022.111009.

144. Stark, G.R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. III. Reactions with amino and carboxyl groups / G.R. Stark // Biochemistry. -1965. - V. 4, №. 6. - P. 1030-1036. doi: 10.1021/bi00882a008.

145. Steiner, S. Reactive T cells in convalescent COVID-19 patients with negative SARS-CoV-2 antibody serology / S. Steiner, T. Schwarz, M.V. Corman [et al.] // Frontiers in immunology. - 2021. - V. 12. - P. 2557. doi: 10.3389/fimmu.2021.687449.

146. Sun, S. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers / S. Sun, J.Y. Zhou, W. Yang, H. Zhang // Analytical biochemistry. - 2014. - V. 446. - P. 76-81. doi: 10.1016/j.ab.2013.10.024.

147. Surjit, M. The SARS-CoV nucleocapsid protein: a protein with multifarious activities / M. Surjit, S.K. Lal // Infect Genet Evol. - 2008. - V. 8. - P. 397-405. doi: 10.1016/j.meegid.2007.07.004.

148. Tarke, A. Impact of SARS-CoV-2 variants on the total CD4+ and CD8+ T cell reactivity in infected or vaccinated individuals / A. Tarke, J. Sidney, N. Methot [et al.] // Cell Rep.Med. - 2021. - V. 2. - P. 100355. doi: 10.1016/j.xcrm.2021.100355.

149. Tarke, A. SARS-CoV-2 vaccination induces immunological T cell memory able to cross-recognize variants from Alpha to Omicron / A. Tarke, C.H. Coelho, Z. Zhang [et al.] // Cell. - 2022. - V. 185. - P. 847-59.e11. doi: 10.1016/j.cell.2022.01.015.

150. Teng, I.T. Molecular probes of spike ectodomain and its subdomains for SARS-CoV-2 variants, Alpha through Omicron / I.T. Teng, A.F. Nazzari, M. Choe [et al.] // PloS one. - 2022. - V. 17, №. 5. - P. e0268767. doi: 10.1371/journal.pone.0268767.

151. The proteomics protocols handbook 1st ed. / ed. J.M. Walker. - Totowa, NJ: Humana press, 2005. - 988 p.

152. Tian, D. The Global Epidemic of the SARS-CoV-2 Delta Variant, Key Spike Mutations and Immune Escape / D. Tian, Y. Sun, J. Zhou, Q. Ye // Front. Immunol. - 2021. - V. 12. - P. 751778. doi: 10.3389/fimmu.2021.751778.

153. To, K.K. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study / K.K. To, O.T. Tsang, W.S. Leung [et al.] // Lancet Infect Dis. - 2020. - V. 20, №. 5. - P. 565-574. doi: 10.1016/S1473-3099(20)30196-1.

154. Vita, R. The Immune Epitope Database (IEDB): 2018 update / R. Vita, S. Mahajan, J.A. Overton [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2019. - V. 47. - P. D339-43. doi: 10.1093/nar/gky1006.

155. V'kovski, P. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2 / P. V'kovski, A. Kratzel, S. Steiner [et al.] // Nat Rev Microbiol. - 2021. - V. 19, №. 3. - P. 155-170. doi: 10.1038/s41579-020-00468-6.

156. Volkin, D.B. Degradative covalent reactions important to protein stability / D.B. Volkin, H. Mach, C.R. Middaugh // Molecular biotechnology. - 1997. - V. 8. - P. 105-122. doi: 10.1007/BF02752255.

157. Volz, E. Fitness, growth and transmissibility of SARS-CoV-2 genetic variants / E. Volz // Nat. Rev. Genet. - 2023. - V. 24. - P. 724-734. doi: 10.1038/s41576-023-00610-z.

158. Walls, A.C. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein / A.C. Walls, Y.J. Park, M.A. Tortorici [et al.] // Cell. -2020. - V. 181. - P. 281-92. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.058.

159. Weiskopf, D. Phenotype and kinetics of SARS-CoV-2-specific T cells in COVID-19 patients with acute respiratory distress syndrome / D. Weiskopf, K.S. Schmitz, M.P. Raadsen [et al.] // Sci. Immunol. - 2020. - V. 5. - P. eabd2071. doi: 10.1126/sciimmunol.abd2071.

160. Wilkinson, S.A.J. Recurrent SARS-CoV-2 mutations in immunodeficient patients / S.A.J. Wilkinson, A. Richter, A. Casey [et al.] // Virus Evol. - 2022. - V. 8. - P. veac050. doi: 10.1093/ve/veac050.

161. Woldemeskel, B .A. SARS-CoV-2 mRNA vaccines induce broad CD4+ T cell responses that recognize SARS-CoV-2 variants and HCoV-NL63 / B.A. Woldemeskel, C.C. Garliss, J.N. Blankson // J. Clin. Investig. - 2021. - V. 131. - P. e149335. doi: 10.1172/JCI149335.

162. World Health Organization, Tracking SARS-CoV-2 Variants [Electronic resource] / WHO. - 2022. - Access mode: https://www.who.int/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants

163. Wrapp, D. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation / D. Wrapp, N. Wang, K.S. Corbett [et al.] // Science. - 2020. -V. 367. - P. 1260-3. doi: 10.1126/science.abb2507.

164. Wu, Y. Prolonged presence of SARS-CoV-2 viral RNA in faecal samples / Y. Wu, C. Guo, L. Tang [et al.] // The lancet Gastroenterology & hepatology. - 2020. - V. 5, №. 5. - P. 434-435. doi: 10.1016/S2468-1253(20)30083-2.

165. Xue, S. Mutations in the SARS-CoV-2 spike receptor binding domain and their delicate balance between ACE2 affinity and antibody evasion / S.

Xue, Y. Han, F. Wu, Q. Wang // Protein Cell. - 2024. - V. 15. - P. 403-418. doi: 10.1093/procel/pwae007.

166. Yajima, H. Molecular and structural insights into SARS-CoV-2 evolution: from BA.2 to XBB subvariants / H. Yajima, T. Nomai, K. Okumura [et al.] // mBio. - 2024. - V. 15, №. 10. - P. e0322023. doi: 10.1128/mbio.03220-23.

167. Yang, H. Structural biology of sars-cov-2 and implications for therapeutic development / H. Yang, Z. Rao // Nat. Rev. Microbiol. - 2021. -V. 19. - P. 685-700. doi: 10.1038/s41579-021-00630-8.

168. Yao, H. Molecular architecture of the SARS-CoV-2 virus / H. Yao, Y. Song, Y. Chen [et al.] // Cell. - 2020. - V. 183. - P. 730-8. doi: 10.1016/j.cell.2020.09.018.

169. Ye, G. Cryo-EM structure of a SARS-CoV-2 omicron spike protein ectodomain / G. Ye, B. Liu, F. Li // Nat Commun. - 2022. - V. 13. - P. 1214. doi: 10.1038/s41467-022-28882-9.

170. Yuan, M. A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV / M. Yuan, N.C. Wu, X. Zhu [et al.] // Science. - 2020. - V. 368. - P. 630-3. doi: 10.1126/science.abb7269.

171. Zhang, J. Structural and Functional Impact by SARS-CoV-2 Omicron Spike Mutations / J. Zhang, Y. Cai, C.L. Lavine [et al.] Cell Rep. - 2022. -V. 39. - P. 110729. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110729.

172. Zhang, Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction / Y. Zhang // BMC bioinformatics. - 2008. - V. 9. - P. 1-8. doi: 10.1186/14712105-9-40.

173. Zhao, J. Airway Memory CD4(+) T Cells Mediate Protective Immunity against Emerging Respiratory Coronaviruses / J. Zhao, J. Zhao, A.K. Mangalam [et al.] // Immunity. - 2016. - V. 44. - P. 1379-1391. doi: 10.1016/j.immuni.2016.05.006.

174. Zhao, J. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019 / J. Zhao, Q. Yuan, H. Wang [et al.] // Clin Infect Dis. - 2020. - V. 71, №. 16. - P. 2027-2034. doi:10.1093/cid/ciaa344.

175. Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin / P. Zhou, X.L. Yang, X.G. Wang [et al.] //nature. - 2020.

- V. 579, №. 7798. - P. 270-273. doi: 10.1038/s41586-020-2012-7.

176. Zhou, R. Acute SARS-CoV-2 infection impairs dendritic cell and T cell responses / R. Zhou, K.K.-W. To, Y.-C. Wong [et al.] // Immunity. - 2020. -V. 53. - P. 864-877.e5. doi: 10.1016/j.immuni.2020.07.026.

177. Zhou, Y. The Outbreak of SARS-CoV-2 Omicron Lineages, Immune Escape, and Vaccine Effectivity / Y. Zhou, H. Zhi, Y. Teng // J. Med. Virol.

- 2023. - V. 95. - P. e28138. doi: 10.1002/jmv.28138.

178. Zuo, J. Robust SARS-CoV-2-specific T cell immunity is maintained at 6 months following primary infection / J. Zuo, A.C. Dowell, H. Pearce [et al.] // Nat. Immunol. - 2021. - V. 22. - P. 620-26. doi: 10.1038/s41590-021-00902-8.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 - СПЕЦИФИКАЦИЯ НА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКУЮ

СУБСТАНЦИЮ

СПЕЦИФИКАЦИЯ

КоронаДерм-PS, аллерген коронавирусный рекомбинантный,

субстанция - раствор ООО «Фирн М», Россия

Показатель Метод Норма

Описание Визуальный Субстанция представляет собой бесцветную, прозрачную жидкость.

Подлинность 1. Электрофорез в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях Положение основной полосы на электрофореграмме испытуемого раствора должно соответствовать положению основной полосы на электрофореграмме раствора стандартного образца субстанции КоронаДерм-PS.

2. Обращенно-фазовая ВЭЖХ Основной пик на хроматограмме испытуемого раствора по времени удерживания должен соответствовать основному пику на хроматограмме раствора стандартного образца субстанции КоронаДерм-PS.

Прозрачность Визуальный, ГФ РФ Раствор должен быть прозрачным.

Цветность Визуальный, ГФ РФ Раствор должен быть бесцветным.

рН Потенциометрический, ГФ РФ От 7,3 до 7,5

Белок Метод Лоури, ГФ РФ (Метод 2, А) Не менее 1,0 мг/мл.*

Стерильность Метод прямого посева, ГФ РФ Субстанция должна быть стерильной.

Бактериальные эндотоксины ЛАЛ-тест, ГФ РФ Не более 800 ЕЭ на 1 мг белка.

Специфическая активность Иммуноферментный анализ Связывание с международным стандартом ВОЗ №1 в концентрации 1,25 BAU / мл

Показатель Метод Норма

Белковые примеси Электрофорез в полиакриламидном геле: А) в восстанавливающих условиях На электрофореграмме, полученной для испытуемого раствора (а) в восстанавливающих условиях, могут присутствовать в дополнение к основной полосе менее интенсивные полосы. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (с) (5,0%), и должно быть не более пяти дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (1,0%).

Б) в невосстанавливающих условиях. На электрофореграмме, полученной для испытуемого раствора (а) в невосстанавливающих условиях, могут присутствовать в дополнение к основной полосе менее интенсивные полосы с более высокой молекулярной массой, чем основная полоса. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (с) (5,0%), и должно быть не более пяти дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (1,0%).

Родственные примеси Обращенно-фазовая ВЭЖХ На хроматограмме испытуемого раствора площадь основного пика должна составлять не менее 90% от общей площади всех пиков. Площадь любого дополнительного пика должна составлять не более 5% от общей площади всех пиков. Сумма площадей дополнительных пиков должна составлять не более 10% от общей площади всех пиков.

Остаточные белки клеток штамма-продуцента ИФА Не более 10 мкг/мг белка (Не более 1% от содержания белка)

Остаточная ДНК клеток штамма-продуцента Флуоресцентное окрашивание ДНК Не более 200,0 нг/мг белка

Производственный штамм-продуцент Штамм-продуцент Escherichia coli CorD PS, генетически модифицированный, должен быть непатогенным, нетоксичным, устойчивым к канамицину (50 мкг/мл); соответствовать требованиям

Показатель Метод Норма

по физико-химическим, культуральным и морфологическим свойствам.

Упаковка По 200 мл субстанции-раствора во флаконах из нейтрального стекла 1 -ого гидролитического класса вместимостью 250 мл (Eur.PL, иЗР). Флаконы герметично укупоривают пробками резиновыми (Ешг.Р^ и обжимают колпачками алюминиевыми. На флакон наклеивают этикетку из бумаги этикеточной (ГОСТ 762586) или писчей по ГОСТ 18510-87, или самоклеящуюся этикетку. Допускается упаковка одной серии субстанции-раствора во флаконы разной вместимости. По 1, 2 или 4 флакона помещают в контейнер из картона (ГОСТ 793389) или из пенопласта соответствующего размера. На каждый контейнер наклеивают этикетку из бумаги этикеточной (ГОСТ 7625-86) или писчей по ГОСТ 18510-87, или самоклеящуюся этикетку.

Маркировка В соответствии с НД.

Транспортировани е При температуре от 2 до 8°С.

Хранение В защищенном от света месте, при температуре от 2 до 8°С. Замораживание не допускается

Срок годности 2 года.

*Испытание проводят на этапе перед добавлением фенола.

КоронаДерм-PS, аллерген коронавирусный рекомбинантный,

субстанция - раствор

ООО «Фирн М», Россия

Химическое название: Номенклатурного названия 1иРАС не существует

МНН: Аллерген коронавирусный рекомбинантный Структурная формула (аминокислотная последовательность):

м8вкарОкоктркптааР8Б8Ш8кокаЕК8аАК8коккроаьркетА81№ЕТАьто накЕБькЕРкаоауршшззрввоюууккАтккжаавакмкБьзрк^УБУУьата

РЕАОЬРУОАЫКБО1ШУАТЕОАЬКТРКБНЮТККРАККАА1УЬ0ЬР0ОТТЬРКОЕУАЕО

8каа80А88Я88 8К8кк88кк8ТРа88каТ8РАамАакааБААЬАььььБкькоьЕ8км

8ака0000а0ТУТкк8ААЕА8ккрк0ккТАТкАУКУТ0АраккаРЕ0Т0акБаБ0Еь

IRQGTDYKHWРQIAQFAР8A8AFFGM8RIGMEVTР8GTWLTYTGAIKLDDKDРNFKDQV

ILLNKHIDAУKTFРРTEРKKDKKKKADETQALРQRQKKQQTУTLLРAADLDGF8KQLQQ

8M88AD8TQA8EETGTLIVN8VLLFLTRРLLE8ELVIGAVTRFA8VYAWNRKRI8NTNGV

GYQРYRVVVL8FELLHA

Эмпирическая формула: (С2звН3б80^98О72з87) состоит из 486 аминокислот Молекулярная масса: 53 059Да

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 - ПАСПОРТ ШТАММА CorD PS

ПАСПОРТ ШТАММА

генно-инженерно-модифицированного микроорганизма

1. Родовое и видовое название штамма- хозяина (реципиента) Escherichia coli_

2. Номер или наименование штамма ГИММ__CorDPS_

3.Родословная штамма ГИММ, указать номер реципиента в другой коллекции (если он существует*) с указанием названия коллекции_Rosetta(DE3)__

4.Способ получения штамма ГИММ (получен трансформацией и.т.д.) получен трансформацией

5. Культурально-морфологические особенности штамма с указанием среды__

6. Область применения штамма _фармацевтическое

производство _

7. Продукт, синтезируемый штаммом _Рекомбинантный белок CorDPS

8.Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели 1 мг рекомбинантного белка на 1 грамм биомассы

9.Способ определения активности штамма с указанием метода Обратно-фазовая ВЭЖХ_

10.Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма Глицерольный сток (20%)

11.Способ, условия и состав сред для размножения штамма _LB-среда;

+37°С_

12.Оптимальные условия и состав среды для ферментации LB-среда; +37°С, индукция 1мМ

ИПТГ _

13. Генетические особенности штамма:

I. Генотип штамма хозяина (мутации, делеции, инверсии, наличие плазмид или профагов, устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д., прочие

генетические особенности) _ F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE

(CamR)_

II. Описание рекомбинантной плазмиды

1. Название плазмиды___pCorD PS__

2. Размер, генетическая и физическая карта плазмиды _см. приложение

А_

3. Сведения о векторе, на основе которого сконструирована плазмида см. приложение Б_

- название вектора___ pET-24a(+)_

- размер, генетическая и физическая карта вектора (с указанием литературных ссылок)

- происхождение вектора и его основных генетических элементов

- наличие транспозонов, генов, контролирующих устойчивость к антибиотикам

- наличие элементов, определяющих трансмиссивность плазмид

- круг хозяев аннотация выявленных рамок считывания (если вектор имеет происхождение из патогенных микроорганизмов)

4. Сведения о клонированной ДНК_см._приложение

А_

1. Видовая принадлежность донорного организма

2. Общие сведения о клонированном фрагменте, размер и включенные в его состав гены

3. Аннотация выявленных рамок считывания (если ДНК имеет происхождение их патогенных микроорганизмов)

14. Литературные ссылки

1) Woodcock, DM., Crowther, D.M., Doherty, J., Jefferson,S., DeCruz, E., Noyer-Weidner, M., Smith, S.S., Michael, M.Z., and Graham, M.W., Nucl. Acids Res. (1989) 17, 3469-3478

2) Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M., Wang W, Hu Y, Song Z-G., Tao Z-W., Tian J-H., Pei Y-Y., Yuan ML, Zhang Y-L., Dai F-H., Liu Y, Wang Q-M., Zheng J-J., Xu L, Holmes EC, Zhang Y-Z.

Direct Submission. Submitted (05-JAN-2020) Shanghai Public Health Clinical Center & School of Public Health, Fudan University, Shanghai, China.

15. Является ли штамм: зоопатогенным нет (да, нет); фитопатогенным нет (да, нет); представляет ли опасность по каким либо другим причинам нет (да, нет): если «да», пояснить

16. Указать уровень риска ГИММ по заключению комиссии по работе с рекомбинантной ДНК 1

Приложение А Страница 1 из 1

Сведения о плазмиде и клонированной ДНК

Карта плазмиды: -6695 п.н.-

Плазмида pCorD_PS имеет 6695 пар оснований (п.о.), и характеризуется наличием следующих фрагментов:

- фрагмент ДНК размером 89 п.о., включающий Т7-лактозный промотор E. coli и последовательность Шайна-Дальгарно, ответственную за инициацию трансляции;

- синтетический фрагмент ДНК размером 1461 п.о., включающий «оптимизированную» кодирующую часть гена аллергена коронавирусного рекомбинантного:

atgagcgacaatggtccgcagaatcagcgtaatgcgccgcgtattacctttggtggtccgagcgatagcaccggcagcaatcagaa cggtgaacgtagcggtgcgcgtagcaagcagcgtcgtccgcaaggtctgccgaacaacaccgcgagctggttcaccgcgctgacccagc acggcaaggaagacctgaaatttccgcgtggtcaaggcgtgccgatcaacaccaacagcagcccggacgatcagattggttactatcgtcgt gcgacccgtcgtatccgtggtggcgacggcaagatgaaagatctgagcccgcgttggtacttctactatctgggtaccggtccggaggcggg tctgccgtatggcgcgaacaaggacggtatcatttgggtggcgaccgaaggtgcgctgaacaccccgaaagatcacattggtacccgtaacc cggcgaacaacgcggcgatcgttctgcaactgccgcaaggtaccaccctgccgaaaggtttttatgcggagggcagccgtggtggcagcc aggcgagcagccgtagcagcagccgtagccgtaacagcagccgtaacagcaccccgggtagcagccgtggcaccagcccggcgcgtat ggcgggtaacggtggcgacgcggcgctggcgctgctgctgctggatcgtctgaaccagctggagagcaagatgagcggtaaaggccagc

aacagcaaggtcaaaccgtgaccaagaaaagcgcggcggaagcgagcaagaaaccgcgtcagaagcgtaccgcgaccaaagcgtaca

acgttacccaggcgtttggtcgtcgtggtccggagcagacccagggtaactttggcgaccaggaactgattcgtcaaggtaccgattataagc

actggccgcaaattgcgcagtttgcgccgagcgcgagcgcgttctttggtatgagccgtattggcatggaagtgaccccgagcggtacctgg

ctgacctacaccggcgcgatcaagctggacgataaagacccgaacttcaaagatcaggttatcctgctgaacaagcacattgacgcgtataa

aacctttccgccgaccgagccgaagaaagacaagaaaaagaaagcggatgaaacccaggcgctgccgcagcgtcaaaagaaacagcaa

accgtgaccctgctgccggcggcggacctggatggtttcagcaagcagctgcagcaaagcatgagcagcgcggatagcacccaagcgag

cgaggaaaccggcaccctgattgtgaacagcgttctgctgtttctgacccgtccgctgctggagagcgaactggtgattggtgcggttacccg

ttttgcgagcgtttatgcgtggaaccgtaaacgtatcagcaacaccaacggcgtgggctatcaaccgtatcgtgtggtggtgctgagctttgaa

ctgctgcatgcgtaa

при оптимизации гена из последовательности были удалены внутренние TATA-boxes, chi-sites, RBS последовательности, AT-богатые и GC-богатые последовательности, повторяющиеся последовательности и потенциальные вторичные структуры мРНК; codon usage был адаптирован для E. coli;

- фрагмент ДНК размером 48 п.о., являющийся терминатором транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7;

- синтетический фрагмент ДНК размером 816 п.о., включающий синтетический ген kanR, обеспечивающий устойчивость к канамицину;

- фрагмент ДНК размером 1161 п.о., включающий в себя ген белка LacI и его промотор. Репрессорный белок LacI ингибирует лактозные промоторы в отсутствии в среде лактозы или ИПТГ, таким образом ингибируя случайное «протекание» этих промоторов и обеспечивая максимальный контроль точки начала индукции.

- фрагмент ДНК размером 589 п.о. плазмид ColE1/pMB1/pBR322/pUC, ответственный за репликацию плазмиды (ori).

Рекомбинантный штамм бактерий E.coli CorD_PS получен трансформацией клеток штамма E.coli Rosetta (DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pCorD_PS.

Рекомбинантная стабильно наследуемая мультикопийная плазмида pCorD_PS содержит, под контролем индуцибельного Т7-лактозного промотора и терминатора транскрипции Т7, синтетический ген аллергена коронавирусного рекомбинантного с оптимизированными для клеток бактерий E.coli кодонами, кодирующими соответствующие аминокислоты и детерминирующими высокий уровень экспрессии аллергена коронавирусного рекомбинантного.

Приложение Б 1 из 1

(158) Х1по1 Т7 1:ад (депе 10 1еас1ег)

Чс1е1 (23В)

Плазмида рЕТ24 имеет 5310 пар оснований (п.о.), и характеризуется наличием следующих фрагментов:

- фрагмент ДНК размером 89 п.о., включающий Т7-лактозный промотор Е.еоМ и последовательность Шайна-Дальгарно, ответственную за инициацию трансляции;

- фрагмент ДНК размером 48 п.о., являющийся терминатором транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7;

- синтетический фрагмент ДНК размером 816 п.о., включающий синтетический ген kanR, обеспечивающий устойчивость к канамицину;

- фрагмент ДНК размером 1161 п.о., включающий в себя ген белка LacI и его промотор. Репрессорный белок LacI ингибирует лактозные промоторы в отсутствии в среде лактозы или ИПТГ, таким образом ингибируя случайное «протекание» этих промоторов и обеспечивая максимальный контроль точки начала индукции.

- фрагмент ДНК размером 589 п.о. плазмид ColE1/pMB1/pBR322/pUC, ответственный за репликацию плазмиды (оп).

Торговое наименование «КоронаДерм-PS», аллерген

продукции

Номер серии Дата изготовления Срок годности Годен до

Количество, ед.изм. Анализ выполнен

коронавирусный рекомбинанатный, субстанция-раствор 01

12.2021г 2 года 12.2023г

25 бутылей по 200 мл (всего 5900 мг белка) по проекту НД

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 - ПРОТОКОЛЫ АНАЛИЗА ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ

СЕРИЙ

Протоколы анализа трех производственных серий субстанции

«КоронаДерм-Р8»

Показатели Требования НД Результаты анализа

Описание Субстанция представляет собой бесцветную, прозрачную жидкость. Соответствует

Подлинность Положение основной полосы на электрофореграмме испытуемого раствора должно соответствовать положению основной полосы на электрофореграмме раствора стандартного образца субстанции КоронаДерм-РБ. Соответствует

Основной пик на хроматограмме испытуемого раствора по времени удерживания должен соответствовать основному пику на хроматограмме раствора стандартного образца субстанции КоронаДерм-РБ. Соответствует

Прозрачность Раствор должен быть прозрачным. Прозрачный

Цветность Раствор должен быть бесцветным. Бесцветный

рН От 7,3 до 7,5 7,37

Белок Не менее 1,0 мг/мл 1,18

Стерильность Субстанция должна быть стерильной. Стерильна

Бактериальные эндотоксины Не более 800 ЕЭ на 1 мг белка. Менее 800 ЕЭ/мг

Специфическая активность Связывание с международным стандартом ВОЗ №1 Связывается

Белковые примеси

На электрофореграмме, полученной для испытуемого раствора (а) в восстанавливающих условиях, могут присутствовать в дополнение к основной полосе менее интенсивные полосы. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (с) (5,0%), и должно быть не более пяти дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (1,0%).

На электрофореграмме, полученной для испытуемого раствора (а) в

невосстанавливающих условиях, могут присутствовать в дополнение к основной полосе менее интенсивные полосы с более высокой молекулярной массой, чем основная полоса. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (с) (5,0%), и должно быть не более пяти дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (1.

Соответствует

Соответствует

Родственные примеси

На хроматограмме испытуемого раствора площадь основного пика должна составлять не менее 90% от общей площади всех пиков. Площадь любого дополнительного пика должна составлять не более 5% от общей площади всех пиков. Сумма площадей дополнительных пиков должна составлять не более 10% от общей площади всех пиков.

Площадь основного составляет 96,71%

пика

Показатели Требования НД Результаты анализа

Остаточная ДНК клеток штамма-продуцента Не более 200,0 нг/мг белка Менее 4 нг

Заключение: «КоронаДерм-PS», аллерген коронавирусный рекомбинанатный, субстанция-раствор, серия 01 от 12.2021г соответствует требованиям проекта НД.

Торговое наименование продукции Номер серии Дата изготовления Срок годности Годен до

Количество, ед.изм. Анализ выполнен

«КоронаДерм-PS», аллерген коронавирусный рекомбинанатный, субстанция-раствор 02

12.2021г 2 года 12.2023г

25 бутылей по 200 мл (всего 5350 мг белка) по проекту НД

Показатели Требования НД Результаты анализа

Описание Субстанция представляет собой бесцветную, прозрачную жидкость. Соответствует

Подлинность Положение основной полосы на электрофореграмме испытуемого раствора должно соответствовать положению основной полосы на электрофореграмме раствора стандартного образца субстанции КоронаДерм-РБ. Соответствует

Основной пик на хроматограмме испытуемого раствора по времени удерживания должен соответствовать основному пику на хроматограмме раствора стандартного образца субстанции КоронаДерм-РБ. Соответствует

Прозрачность Раствор должен быть прозрачным. Прозрачный

Цветность Раствор должен быть бесцветным. Бесцветный

рН От 7,3 до 7,5 7,42

Белок Не менее 1,0 мг/мл 1,07

Стерильность Субстанция должна быть стерильной. Стерильна

Бактериальные эндотоксины Не более 800 ЕЭ на 1 мг белка. Менее 800 ЕЭ/мг

Специфическая активность Связывание с международным стандартом ВОЗ №1 Связывается

Белковые примеси

На электрофореграмме, полученной для испытуемого раствора (а) в восстанавливающих условиях, могут присутствовать в дополнение к основной полосе менее интенсивные полосы. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (с) (5,0%), и должно быть не более пяти дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (1,0%).

На электрофореграмме, полученной для испытуемого раствора (а) в

невосстанавливающих условиях, могут присутствовать в дополнение к основной полосе менее интенсивные полосы с более высокой молекулярной массой, чем основная полоса. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (с) (5,0%), и должно быть не более пяти дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (1.

Соответствует

Соответствует

Родственные примеси

На хроматограмме испытуемого раствора площадь основного пика должна составлять не менее 90% от общей площади всех пиков. Площадь любого дополнительного пика должна составлять не более 5% от общей площади всех пиков. Сумма площадей дополнительных пиков должна составлять не более 10% от общей площади всех пиков.

Площадь основного составляет 96,34%

пика

Показатели Требования НД Результаты анализа

Остаточная ДНК клеток штамма-продуцента Не более 200,0 нг/мг белка Менее 4 нг

Заключение: «КоронаДерм-PS», аллерген коронавирусный рекомбинанатный, субстанция-раствор, серия 02 от 12.2021г соответствует требованиям проекта НД.

Торговое наименование продукции Номер серии Дата изготовления Срок годности Годен до

Количество, ед.изм. Анализ выполнен

«КоронаДерм-PS», аллерген коронавирусный рекомбинанатный, субстанция-раствор 03

12.2021г 2 года 12.2023г

25 бутылей по 200 мл (всего 6200 мг белка) по проекту НД

Показатели Требования НД Результаты анализа

Описание Субстанция представляет собой бесцветную, прозрачную жидкость. Соответствует

Подлинность Положение основной полосы на электрофореграмме испытуемого раствора должно соответствовать положению основной полосы на электрофореграмме раствора стандартного образца субстанции КоронаДерм-PS. Соответствует

Основной пик на хроматограмме испытуемого раствора по времени удерживания должен соответствовать основному пику на хроматограмме раствора стандартного образца субстанции КоронаДерм-PS. Соответствует

Прозрачность Раствор должен быть прозрачным. Прозрачный

Цветность Раствор должен быть бесцветным. Бесцветный

рН От 7,3 до 7,5 7,32

Белок Не менее 1,0 мг/мл 1,24

Стерильность Субстанция должна быть стерильной. Стерильна

Бактериальные эндотоксины Не более 800 ЕЭ на 1 мг белка. Менее 800 ЕЭ/мг

Специфическая активность Связывание с международным стандартом ВОЗ №1 в концентрации 1,25 BAU / мл Связывается

Белковые примеси

На электрофореграмме, полученной для испытуемого раствора (а) в восстанавливающих условиях, могут присутствовать в дополнение к основной полосе менее интенсивные полосы. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (с) (5,0%), и должно быть не более пяти дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (1,0%).

На электрофореграмме, полученной для испытуемого раствора (а) в

невосстанавливающих условиях, могут присутствовать в дополнение к основной полосе менее интенсивные полосы с более высокой молекулярной массой, чем основная полоса. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (с) (5,0%), и должно быть не более пяти дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для раствора стандартного образца (1.