Предгибернационная метаболическая активность длиннохвостого суслика (Urocitellus undulatus) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Теплова Полина Олеговна

• Теплова Полина Олеговна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Теплова Полина Олеговна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Феномен спячки

1.1.1 Торпор (оцепенение)

1.1.2 Гибернация (зимняя спячка)

1.1.3 Особенности спячки суслика игоеивПт ипёиШт

1.2. Биохимические и физиологические аспекты метаболизма гибернаторов

1.2.1 Респираторные маркеры биоэнергетических процессов у млекопитающих

1.2.2 Особенности метаболической активности гибернаторов во время зимней спячки

1.2.3 Перестройка метаболизма гибернаторов в период подготовки к спячке

1.3. Щитовидная железа как регулятор метаболизма

1.3.1 Морфофункциональные характеристики щитовидной железы

1.3.2. Биохимическая характеристика тиреоидного профиля

1.3.3 Особенности функционирования щитовидной железы у гетеротермов

1.3.4 Биохимические и морфофункциональные особенности щитовидной железы гибернаторов осенью

1.4 Бурая жировая ткань как регулятор метаболизма

1.4.1 Строение и функциональные характеристики бурой жировой ткани

1.4.2 Роль липидов в биоэнергетике бурой жировой ткани гетеротермов

1.4.3 Биохимические и функциональные изменения бурой жировой ткани гетеротермов осенью

1.5 Кровеносная система как индикатор метаболических перестроек

1.5.1 Биохимические показатели липидного и энергетического обмена в крови гетеротермов

1.5.2 Гематологический профиль у гетеротермов: физиологические и биохимические аспекты

1.5.3 Изменения показателей крови как отражение осенней подготовки к спячке

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Экспериментальные животные

2.2. Методы

2.2.1 Измерение метаболизма методом непрямой калориметрии

2.2.2 Морфофункциональный анализ щитовидной железы

2.2.3 Количественное определение тиреоидных гормонов в крови

2.2.4 Количественный анализ липидов в буром жире

2.2.5 Биохимический анализ крови

2.2.6 Гематологический анализ

2.2.7 Статистический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Биоэнергетические показатели дыхательного метаболизма

3.2. Морфофункциональные характеристики щитовидной железы

3.3. Уровень тиреоидных гормонов в сыворотке крови

3.4. Биохимический анализ липидов бурой жировой ткани

3.5. Показатели липидного профиля крови

3.6 Показатели гематологического профиля

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Предгибернационная метаболическая активность длиннохвостого суслика (Urocitellus undulatus)»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Изучение биохимических и физиологических механизмов гибернации (зимней спячки) у млекопитающих представляет собой одну из фундаментальных и перспективных задач современной биологии. Спячка является уникальным эволюционным достижением, позволяющим организмам выживать в условиях экстремального дефицита ресурсов и низких температур. Понимание глубинных принципов гибернации имеет значение, выходящее далеко за рамки экологической физиологии. Оно дает ключи к разгадке общих механизмов управления метаболизмом, устойчивости тканей к ишемии и гипотермии, регуляции энергетического гомеостаза и даже замедления процессов старения. Интерес к этим механизмам в последние десятилетия резко возрос в связи с поиском новых подходов в медицине: от разработки методов индукции искусственного гипобиоза для нужд хирургии и реаниматологии до создания стратегий борьбы с метаболическими и нейродегенеративными заболеваниями (Xie et al, 2021; Drew, 2025).

Степень разработанности проблемы. Несмотря на длительную историю исследований, основной объём данных касается состояния глубокого оцепенения (гипотермии) и летней нормотермии (Carey et al., 2003; Cooper et al., 2016b; Mohr et al., 2024). В то же время адаптационный потенциал метаболических процессов в организме гетеротермов в переходные периоды годового цикла, особенно в предгибернационный период (осенью), остается недостаточно изученным. Зачастую он рассматривается упрощенно, в основном как период, связанный с пассивным накоплением жировых запасов за счет гиперфагии и плавного снижения двигательной и метаболической активности (Dark et al., 1990; Russell et al., 2010). Тогда как именно в осенний период происходят ключевые события, определяющие успешность всей сезонной адаптации. Такие, как перестройка центральных нейромедиаторных систем (Zakharova and Tarahovsky, 2025), реорганизация энергетического обмена в тканях (Kulagina et al., 2021) и комплексная подготовка клеточных структур к гипотермии (Калмыков с соавт., 2004; Averin et al., 2017; Gritsyna et al., 2022).

Для выявления недостающего звена и получения репрезентативных данных об адаптационном потенциале в предгибернационный период необходимо использование единой стандартизированной экспериментальной модели. В данной работе в качестве модельного животного выбран длиннохвостый суслик (Urocitellus undulatus) - типичный облигатный гибернатор с четким сезонным циклом и глубокой гипотермией. Содержание животных в контролируемых условиях (при регулируемом фотопериоде, температуре помещения и рационе) позволяет минимизировать внешнюю вариабельность и сосредоточиться на изучении эндогенных механизмов перестройки организма. Важно отметить, что ранее в лаборатории на

сусликах этого же вида, отловленных в одном и том же месте обитания, в предгибернационный период были получены данные, касающиеся особенностей функционирования мышц, сердечнососудистой системы, головного мозга и других органов и систем (Karaduleva et al., 2014; Averin et al., 2017; Gritsyna et al., 2022; Lizorkina et al., 2024; Zakharova and Tarahovsky, 2025). Однако комплексный анализ, позволяющий впервые предложить согласованную, многомерную картину осенней перестройки организма облигатных гибернаторов на системном уровне, до сих пор не проводился, что и определяет актуальность данной работы.

На основании изложенного была сформулирована цель работы: исследовать физиолого-биохимические особенности метаболической активности длиннохвостых сусликов (Urocitellus undulatus) в осенний период подготовки к зимней спячке.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику изменений дыхательного метаболизма у длиннохвостого суслика в активный летний, осенний и зимний торпидный периоды.

2. Изучить сезонные изменения морфофункционального состояния щитовидной железы как одного из основных регуляторов метаболизма и уровень тиреоидных гормонов в крови.

3. Провести количественный анализ липидного состава бурой жировой ткани, ответственной за термогенез сусликов в разных функциональных состояниях.

4. Оценить сезонную динамику биохимических параметров крови длиннохвостого суслика.

5. Исследовать гематологические показатели длиннохвостого суслика в активный летний, осенний и зимний торпидный периоды.

6. На основании полученных и литературных данных разработать схему системного репрограммирования организма облигатных гибернаторов в период подготовки к спячке (на примере Urocitellus undulatus).

Научная новизна. В работе впервые установлено, что осенний период у облигатных гибернаторов (длиннохвостых сусликов) характеризуется не плавным снижением, а предварительной фазой повышения скорости метаболизма: на фоне падения температуры тела на 1-2°C интенсивность дыхательного метаболизма возрастает на 40-70%. Показано, что это состояние отражает не только терморегуляторный ответ и/или гиперфагию, а целенаправленное перераспределение энергетических ресурсов на мультиорганные процессы, необходимые для предстоящей гибернации. Впервые у вида Urocitellus undulatus выявлена стратегическая перестройка тиреоидной системы. Установлено, что осенняя морфофункциональная активация щитовидной железы, происходящая на фоне повышенного общего метаболизма, не сопровождается увеличением уровня тиреоидных гормонов в крови. В свою очередь, в состоянии глубокой гипотермии выявлен иной парадокс: на фоне резкого угнетения метаболизма регистрируются пик активности щитовидной железы и повышенный уровень тиреоидных

гормонов в крови. Впервые для облигатного гибернатора проведён сезонный анализ липидного состава бурой жировой ткани. Показано, что подготовка к спячке связана с ремоделированием липидов бурой жировой ткани, характеризующимся сниженным пулом ди- и триацилглицеридов одновременно с двукратным увеличением запасов фосфолипидов. Также выявлено трёхкратное накопление кардиолипина - маркера биогенеза митохондрий, и избирательное увеличение сфингомиелина со сдвигом соотношения холестерин/сфингомиелин к ~1:1. Впервые показано, что в предгибернационный период, несмотря на стремительный набор жировой массы тела и активное ремоделирование жировых депо, липидный профиль крови (холестерин, триацилглицериды, Р-гидроксибутират, свободные жирные кислоты) остаётся стабильным, соответствуя летним значениям. Впервые у и. ипёиШш установлена связь между осенним гиперметаболизмом и специфическими изменениями гематологических показателей. Показано, что в осенний период у сусликов наблюдается комплекс изменений: лейкоцитоз с гранулоцитозом и лимфопенией, тромбоцитоз, рост числа эритроцитов, гемоглобина и гематокрита. Впервые на одном виде (облигатном гибернаторе и. ипёиШш) получен согласованный комплекс данных и предложена целостная схема осеннего системного репрограммирования организма, выходящая за рамки идеи пассивного энергосбережения.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в существенном вкладе в сравнительную биохимию и биохимию адаптационных процессов. Исследование конкретизирует биохимические перестройки метаболизма, доказывая, что осенний период является стадией активного системного репрограммирования, а не пассивного накопления энергетических ресурсов. В частности, впервые было показано, что для бурой жировой ткани сусликов в осенний период характерно переключение метаболических путей с депонирования триацилглицеридов на биосинтез фосфолипидов, а также накопление кардиолипина и увеличение содержания сфингомиелина с оптимизацией соотношения холестерин/сфингомиелин. Кроме того, охарактеризована адаптивная перестройка клеточного состава крови в предгибернационный период, связанная со скоординированными изменениями эритроцитарных, лейкоцитарных и тромбоцитарных параметров, лежащих в основе подготовки клеток крови к условиям гипометаболизма и гипотермии. Практическая значимость полученных результатов имеет важное медико-биологическое значение, поскольку они раскрывают механизмы заблаговременной адаптации к отставленной гипотермии и гипометаболизму -явления, когда организм суслика осенью, при незначительном снижении температуры тела, инициирует перестройку липидного состава мембран, метаболических путей и эндокринной регуляции, создавая структурную и функциональную основу для последующего устойчивого состояния глубокой гипотермии. Увеличенное накопление фосфолипидов при снижении температуры тела, делает мембраны клеток более устойчивыми к холоду, и эти данные могут

быть применены, в частности, для оптимизации сред при криоконсервации клеток и тканей. Выявленные закономерности - от гиперметаболизма на фоне сниженной на 1-2 °С температуры до ремоделирования липидного и гематологического профиля - открывают перспективы для разработки способов метаболической коррекции при ожирении, сахарном диабете, ишемических состояниях и других патологиях у человека. Материалы диссертации могут быть также использованы в образовательном процессе при чтении курсов по биохимии адаптаций, сравнительной биохимии, эндокринологии на биологических, медицинских и ветеринарных факультетах.

Методология и методы диссертационного исследования. Методологической основой работы является системный подход, интегрирующий анализ функций целого организма с исследованием тканевых, клеточных и молекулярных механизмов для всестороннего изучения метаболического репрограммирования. В соответствии со специальностью 1.5.4 «Биохимия» и поставленными задачами сформирован комплекс взаимодополняющих методов, выбор которых обоснован их адекватностью, валидированностью и соответствием современным стандартам доказательности, что обеспечивает необходимую точность, воспроизводимость и объективность полученных данных. Экспериментальная работа выполнена на длиннохвостом суслике (Urocitellus ипёиШш) - облигатном гибернаторе, который является признанной и валидной биологической моделью для изучения гипометаболизма. Это позволило в рамках сравнительного анализа исследовать три четко определенных функциональных состояния: летнюю активность (контроль нормотермии), осеннюю подготовку к спячке и зимний торпор (гипотермия). Для оценки энергетического обмена целого организма применяли непрямую калориметрию (респирометрию) на сертифицированной установке - общепризнанный стандарт неинвазивного измерения интенсивности метаболизма. Чтобы изучить сезонные морфофункциональные изменения щитовидной железы, выполняли её гистологическое исследование с последующей компьютерной морфометрией. Срезы окрашивали стандартно гематоксилин-эозином. Морфометрические параметры оценивали в некоммерческой программе ImageJ. Оценивали следующие показатели функциональной активности железы: количество фолликулов (шт.), площадь коллоида (мкм2), площадь резорбционных вакуолей (мкм2), долю вакуолей в коллоиде (%), а также форму тироцитов. Гормональный (тиреоидный) статус определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. В работе использовали коммерческие наборы, специфичность которых к целевым антигенам была подтверждена производителями. Биохимический анализ состава липидов бурой жировой ткани проводили по стандартной схеме. Липиды экстрагировали по эталонной методике Фолча, затем фракционировали их методом тонкослойной хроматографии. Количественное определение выполняли

спектрофотометрически. Такой подход обеспечил приемлемую разрешающую способность для

разделения основных классов липидов и хорошую воспроизводимость. Для оценки интегральных метаболических и клеточных показателей крови использованы автоматизированные ферментативные и гематологические методы на сертифицированных анализаторах с регулярным контролем качества, исключающим субъективную ошибку. Обработка всех полученных данных проведена с применением адекватных статистических критериев (параметрический дисперсионный анализ ANOVA с апостериорными тестами или его непараметрические аналоги) в лицензионных программных пакетах GraphPad Prism 10.1.1 и Statistica 12.5. Графическое представление в виде диаграмм размаха соответствует требованиям наглядности и статистической достоверности. Все процедуры с животными выполнены в строгом соответствии с принципами биоэтики: протоколы экспериментов одобрены Биоэтической комиссией Института биофизики клетки РАН, а манипуляции проводились в рамках Приказа Минздрава РФ № 755 и Директивы ЕС 2010/63/EU, что гарантирует правомерность и воспроизводимость экспериментальной базы исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предгибернационный (осенний) период у длиннохвостого суслика характеризуется уникальной фазой гиперметаболизма.

2. Морфофункциональная активация щитовидной железы у сусликов в осенний период не приводит к увеличению уровня тиреоидных гормонов в крови.

3. Осеннее ремоделирование бурой жировой ткани связано с увеличенной концентрацией фосфолипидов и сниженным уровнем нейтральных липидов;

4. В осенний период у сусликов не наблюдается изменений липидного профиля крови;

5. Осенний период у сусликов характеризуется изменениями гематологического профиля;

6. Предложена схема репрограммирования организма облигатных гибернаторов сусликов Urocitellus undulatus в осенний период.

Степень достоверности научных положений и результатов диссертационной работы подтверждается согласованностью результатов теоретических и экспериментальных исследований, а также применением комплекса современных взаимодополняющих методов, адекватных поставленным задачам. Достоверность и объективность выводов обеспечены репрезентативным объемом выборки, воспроизводимостью результатов в сериях экспериментов и корректной статистической обработкой данных. Диссертационная работа выполнена лично автором и не содержит некорректных заимствований.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены и обсуждены 28 января 2026 г. на научном семинаре ИБК РАН, а также на VII Съезде биофизиков России (Краснодар, Россия, 17-23 апреля 2023 г.); II Всероссийской конференции с международным участием «Теоретические и практические аспекты действия естественной и искусственной

гипотермии на организм» (Махачкала, Россия, 28-30 сентября 2023 г.); XII Международной конференции по радиации, естественным наукам, медицине, инженерии, технологиям и экологии (Херцег-Нови, Черногория, 17-21 июня 2024 г.); XXXI Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы биомедицины-2025» (Санкт-Петербург, Россия, 20-21 марта 2025 г.); XXVIII Пущинской школе-конференции молодых ученых с международным участием «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 21-24 апреля 2025 г.); Международной научной конференции молодых учёных «Наука и инновации 2025» (Ташкент, Узбекистан, 10 октября 2025 г.). Представленные на вышеуказанных мероприятиях результаты исследования были отмечены научным сообществом: Диплом I степени на XXXI Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы биомедицины-2025» (Санкт-Петербург, Россия, 20-21 марта 2025 г.).

Личный вклад автора включает планирование и непосредственное проведение экспериментальных исследований, статистическую обработку и интерпретацию полученных данных, подготовку публикаций и представление результатов на научных конференциях, а также анализ литературных источников.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 3 82 литературных источника, из них 20 опубликовано в отечественных изданиях и 362 - в зарубежных. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 15 рисунками и содержит 8 таблиц.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Феномен спячки

Поддержание жизнедеятельности в условиях сезонного дефицита пищевых ресурсов и низких температур окружающей среды требует существенных энергозатрат (Ibraimov, 2025). В ответ на это у организмов эволюционно выработались разнообразные стратегии. Так у одних видов происходят поведенческие изменения: сезонные миграции, групповое скучивание, запасание пищевых резервов для поддержания активного метаболизма (Кузнецова, 2019). Другие виды демонстрируют эндогенные физиологические перестройки, например, регуляторное подавление метаболической активности (гипометаболизм) с последующим снижением температуры тела (гипотермия) (Morales et al., 2021; Drew et al., 2023). Современная наука выделяет три основные стратегии поддержания температуры тела (Tt) в ответ на изменения температуры окружающей среды (Тс): пойкилотермию, гомойотермию и гетеротермию (Boyles et al, 2013; Nowack et al, 2025).

Пойкилотермия (греч. poikilos - переменчивый; therme - тепло) / эктотермия / холоднокровность характеризуется тем, что Tt пассивно следует за изменениями Тс. У пойкилотермных животных обычно низкий уровень базального метаболизма (BMR), так как они не способны продуцировать достаточное количество эндогенного тепла для поддержания стабильной температуры тела. Соответственно, их активность напрямую коррелирует с температурой окружающей среды. К представителям группы хладнокровных относятся беспозвоночные, рыбы, амфибии и рептилии. Чтобы пережить неблагоприятные температурные условия, эти животные либо прибегают к поведенческой терморегуляции (поиску укрытий, нагреву на солнце - т.н. баскинг) либо впадают в состояние оцепенения (торпора) или диапаузы. Именно энергетическая экономичность пойкилотермии и является её основным адаптивным преимуществом (Angilletta Jr., 2009; Tattersall et al., 2012; Giacometti and Tattersall, 2025; Ibraimov, 2025).

Гомойотермия (греч. homoios - одинаковый; therme - тепло) / эндотермия / теплокровность - способность организмов поддерживать относительно постоянную высокую Tt преимущественно за счет внутренней теплопродукции (высокий уровень BMR). Эта стратегия обеспечивает высокую и постоянную активность независимо от Тс, но требует значительных энергозатрат. К гомойотермным животным относятся подавляющее большинство млекопитающих (за исключением некоторых специализированных видов, таких как голые землекопы, Heterocephalus glaber) и птиц. Поддержание стабильной Тт обеспечивается сложными механизмами, включающими высокий уровень метаболической теплопродукции (термогенез), развитую систему терморецепторов, центральную интеграцию в гипоталамусе, а также наличие эффективных теплоизолирующих структур (шерсть, перья, подкожный жир) для

минимизации теплопотерь (Cannon and Nedergaard, 2004; Geiser, 2021; Grigg et al., 2022; Ibraimov, 2025).

Гетеротермия (греч. heteros - другой, therme - тепло) представляет собой гибкую стратегию, сочетающую черты гомойотермии и пойкилотермии в зависимости от физиологического состояния и условий среды. Гетеротермные животные (например, многие виды сусликов, сурков, ежей, летучих мышей, хомяков, некоторые сумчатые, а также медведи) способны поддерживать высокую и постоянную Tt в периоды активности, используя механизмы, схожие с гомойотермами. Однако при наступлении неблагоприятных условий (низкая/высокая Тс, дефицит пищи и воды) они впадают в контролируемое глубокое, но обратимое состояние гипометаболизма (до 1-5% от BMR у некоторых видов).

Таблица 1. Виды гипотермии, их основные характеристики и примеры гетеротермных млекопитающих (T0ien et al., 2011; Boyles et al., 2013; Ruf and Geiser, 2015; Geiser, 2021; Evans et al., 2023; Giroud et al., _2024; Nowack et al, 2025)_

Вид/ подвид ГТ Торпор (оцепенение) Гибернация (зимняя спячка)

Суточный Пролонгированный Факультативная Облигатная

Краткое описание Кратковременная ГТ в рамках суточного цикла Многодневная ГТ для преодоления кратковременных стрессов Гибкая стратегия: сезонная спячка при влиянии внешних факторов (Тс, дефицит пищи и т.д.) Обязательная сезонная спячка, влияют эндогенные факторы (циркадные ритмы)

абс Тт +5 до +25 °C +4 до +10 °С +20 до +35 °С -2,9* до +10 °C

А Тт -10 до -25 °C -15 до -30 °С -5 до -15 °С до -40 °C

Lrr 2-24 ч 24-65 ч 1-4 мес (с пробуждениями > 24 ч с питанием) 3-8 мес (с пробуждениями на 2-24 ч без питания)

СМ 10-90 % 70-95 % 20-90 % 90-99 %

Примеры видов Mus musculus (домовая мышь), Eptesicus fuscus (большой бурый кожан), Sminthopsis macroura (полосатая сумчатая мышь) Nyctophilus gouldi (длинноухая летучая мышь), Elephantulus myurus (капская слоновая землеройка), Elephantulus edwardii (слоновая землеройка) Ursus* arctos (бурый медведь), Mesocricetus auratus (сирийский хомяк), Myotis lucifugus (малая бурая ночница) Urocitellus undulatus (длиннохвостый суслик), Marmota marmota (альпийский сурок), Erinaceus europaeus (обыкновенный ёж)

Условные обозначения: ГТ - гипотермия, Тт - абсолютная температура тела во время эпизодов гипотермии, А Тт -отклонение температуры тела от видовой нормы, ключевой параметр для оценки глубины гипотермии, LrT -продолжительность эпизода гипотермии, СМ - снижение метаболизма (от базального уровня), ч - час, д - день, мес - месяц.

*Арктический суслик (Urocitellus parryii): Тт = -2,9 °C (самая низкая температура, зафиксированная у млекопитающих), СМ 98-99% (Barnes, 1989; Geiser, 2021).

**Медведи (Ursidae) являются исключением: Тт снижается до 30-35 °C, СМ до 20-50%, пробуждение быстрое, возможно деторождение во время спячки (T0ien et al., 2011; Mohr et al., 2020).

В этом состоянии так же переходит переключение терморегуляторных реакций в ответ на понижение Тс и, как следствие, значительное снижение Tt (иногда до значений, близких к Тс). Ключевым аспектом гетеротермии является способность к спонтанным эндогенным пробуждениям и быстрому восстановлению нормотермии (Geiser, 2021; Giroud et al., 2021b; Sone and Yamaguchi, 2024). Регуляция перехода в состояние спячки и выхода из него представляет собой сложный каскад молекулярных событий, включая изменения экспрессии генов, метаболических путей (особенно углеводно-липидного обмена), активности факторов транскрипции (например, PPARs), уровня гормонов (лептин, адипонектин, тиреоидные гормоны) и сигнальных молекул (NO, H2S, аденозин), которые в совокупности переключают организм на гипометаболический режим (Jastroch et al., 2016; Andrews, 2019; Mohr et al., 2020; Nowack et al., 2020; Singhal et al, 2020).

Современные исследователи выделяют у гетеротермных животных две основные стратегии, различающиеся по экологическому контексту, глубине и продолжительности торпидного состояния (Geiser, 2021): торпор/оцепенение (дневной и пролонгированный) и гибернацию/ зимнюю спячку (факультативную и облигатную). Более подробная классификация видов гипотермии млекопитающих (на основе анализа ~250 видов) представлена в таблице 1. Дополнительно отмечают эстивацию - эволюционный аналог гибернации для засушливых регионов (при высокой Тс и засухе)(Storey, 2002; Wang et al., 2015). В литературе также имеются единичные сообщения не только о гипо-, но и о гипертермии (Gerson et al., 2019; Levesque et al., 2023). Открытым остается вопрос о распространенности этого явления и потенциальной связи со способностью организмов впадать в гипометаболическое состояние (Kontopoulos et al., 2025).

1.1.1 Торпор (оцепенение)

Дневной или суточный торпор (daily torpor) как самостоятельное физиологическое явление, был обнаружен около семидесяти лет назад (Bartholomew et al., 1957). Это состояние, характеризующееся кратковременным снижением скорости метаболизма на 10-90% (в среднем 10-30%), позволяет экономить энергию в течение периодов от 2 до 24 часов без строгой привязки к сезону. На данный момент описано более 150 видов млекопитающих и 30 видов птиц, способных впадать в дневной торпор (Nowack et al., 2017; Geiser, 2021).

Теоретически эта стратегия доступна организмам круглый год. Но на практике частота её закономерно возрастает на 40-70 % именно в зимний период (Mohr et al., 2020). Важнейшее значение в инициации суточного торпора имеет фотопериод (особенно сокращение светового дня), температура окружающей среды и доступность пищевых ресурсов (Geiser, 2021). Еще одна важная характеристика дневного торпора - это факультативность. То есть торпор запускается только при остром дефиците ресурсов и обратимо прекращается, как только ресурсы снова

становятся доступны (Clarke, 2017; Sone and Yamaguchi, 2024). Благодаря такой пластичности торпирующие виды выживают в экстремальных климатических условиях (например, при засухе) на 30 % лучше, чем типичные гомойотермы (Nowack et al., 2017, 2020). Это подчёркивает эволюционную роль суточного торпора как механизма экстренного реагирования.

Пролонгированный торпор (prolonged torpor) - промежуточная форма между суточным торпором (< 24 ч) и сезонной гибернацией (> 7 сут) (Heldmaier et al., 2004; Nowack et al., 2020; Geiser, 2021). Особенность пролонгированного торпора состоит в том, что животное может поддерживать гипометаболическое состояние ~ 24-65 ч без перехода в полноценную спячку (Dausmann, 2014; Geiser, 2021). Что при этом происходит на физиологическом уровне (табл.1)? Температура тела снижается до 4-12 °C. Это близко к нижнему терморегуляторному порогу, однако всегда выше критической точки замерзания тканей. Метаболизм замедляется до 5-15 % от BMR, что сопоставимо с темпами при гибернации. Но при этом у организмов не отмечается характерного для спячки урежения дыхания и сердцебиения (Swoap et al., 2017; Blanco et al., 2018; Geiser, 2021; Geiser and Cooper, 2023; Nowack et al., 2020, 2023). К пролонгированному торпору способны, например, слоновые землеройки (Elephantulus edwardii, E. myurus), у них длительность баутов достигает 44-53 часов, а Тт снижается до 6-10°C (Geiser, 2021; Nowack et al., 2023). С экологической точки зрения пролонгированный торпор выгоден в ареалах обитания, где ресурсы появляются непредсказуемо. Данная стратегия позволяет пережить многодневные погодные аномалии (например, холода или засуху), не впадая в фазу глубокой гибернации (ведь выход из неё требует значительных энергозатрат) (Geiser, 2021; Nowack et al., 2025).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Теплова Полина Олеговна, 2026 год

Г— -

нейроны

т Г.1ЮК01НЫЙ

ТЕЖК/БСЖК/КД36 СЖК

Рисунок 4. Термогенез в бурой жировой ткани (McNeill et al, 2021; Ghesmati et al., 2024) с изм. Слева изображена схема активации бурого адипоцита; справа (в рамке) механизм разобщительного фосфорилирования, запускаемый белком термогенином (UCP1) во внутренней мембране митохондрии. Условные обозначения и сокращения: АЦ - аденилатциклаза; цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ПК А - протеинкиназа А; СЖК - свободные жирные кислоты; ЖК - жирные кислоты; ТБЖК - транспортные белки жирных кислот; БСЖК - белки, связывающего жирные кислоты; КД36 - кластер дифференцировки 36; К1-4 - комплекс 1-4; ^Q - коэнзим Q; цит C - цитохром C; е- -электрон; H+ - ион водорода.

Метаболическая активность бурой жировой ткани находится под строгим контролем симпатической нервной системы. Норадреналин, высвобождаемый из нервных окончаний, стимулирует липолиз (гидролиз триацилглицеридов) и повышает экспрессию и активность UCP-1. Холод является мощным стимулом, увеличивающим активность ткани (через каналы транзиторного рецепторного потенциала TRPM8 и TRPA1), что подтверждается клиническими наблюдениями: с помощью позитронно-эмиссионной томографии выявлено, что количество

активной БЖТ увеличивается в холодное время года даже у взрослых людей (особенно у лиц с нормальной массой тела) (Seale et al., 2007; Bienboire-Frosini et al., 2023).

Высокая термогенная способность бурой жировой ткани, обеспечиваемая разобщающим белком UCP-1, фундаментально зависит от эффективного субстратного обеспечения её митохондрий. Ключевыми источниками энергии и структурными компонентами для этого процесса выступают липиды.

1.4.2 Роль липидов в биоэнергетике бурой жировой ткани гетеротермов

Липиды бурой жировой ткани по функциональному признаку можно разделить на две основные группы: энергетические/регуляторные и структурные. К первой группе относятся липиды, непосредственно участвующие в термогенезе и его регуляции: запасные триацилглицериды, их промежуточные продукты гидролиза (ди- и моноацилглицериды), конечные субстраты окисления - свободные жирные кислоты, а также холестерин, выступающий важным регулятором. Вторую группу составляют структурные фосфолипиды, формирующие специализированные клеточные мембраны.

Хотя общее содержание триацилглицеридов (ТАГ) - доминирующего класса запасных липидов - в бурых адипоцитах ниже, чем в белых, они хранятся в виде множества мелких липидных капель, что обеспечивает большую площадь поверхности для быстрого доступа к энергии для термогенеза (Richard et al., 2000; Schweizer et al., 2019). Высокая липолитическая активность (каскадный гидролиз) в термогенных адипоцитах продуцирует диацилглицериды (ДАГ) и моноацилглицериды (МАГ) - промежуточные продукты, которые также находятся в состоянии быстрого «биохимического оборота», то есть стремительно включаются в дальнейшие метаболические реакции, например путь Кеннеди синтеза фосфолипидов (Gibellini and Smith, 2010; Lass et al., 2011; Eenige et al., 2018; Schweizer et al., 2019; Leiria and Tseng, 2020; Tavasoli et al., 2020). Но основным субстратом для ß-окисления в митохондриях и прямым активатором UCP1 в БЖТ являются свободные жирные кислоты (СЖК) (Cannon and Nedergaard, 2004; Fedorenko et al., 2012; Li and Fromme, 2022). У облигатных гетеротермов наблюдается значительное увеличение уровня кетонового тела ß-гидроксибутирата в плазме во время оцепенения, что дополнительно свидетельствует об интенсивном ß-окислении СЖК (Andrews et al., 2009; Calderon-Dominguez et al., 2016; Wade et al., 2021). Активность всего «липолитического аппарата» сусликов даже в состоянии глубокой гипометаботермии находится в частично активированном состоянии, что говорит о готовности к незамедлительной мобилизации СЖК для термогенеза при пробуждении (Herinckx et al., 2017). Помимо своей фундаментальной роли в построении клеточных мембран, холестерин в БЖТ гибернаторов выступает регуляторным элементом, необходимым для функционирования митохондрий (в особенности UCP1), синтеза

гормональных сигнальных молекул (кортизол) и поддержания латеральной организации мембран (Elustondo et al., 2017; Frobert et al., 2022).

Бурые адипоциты также характеризуются уникальным профилем фосфолипидов, обогащенных длинноцепочечными полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК). Фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭА) и фосфатидилсерин (ФС) содержат высокие пропорции ПНЖК: C18:0-20:4, C18:0-22:5, C18:0-22:6. Это значительно повышает текучесть мембран, облегчает митохондриальное окисление и является критически важным фактором для работы мембранных ферментов. Фосфатидилинозитол (ФИ) в БЖТ, в свою очередь, богат арахидоновой кислотой (C20:4). Это позволяет предположить его усиленную роль в сигнальных каскадах, которые регулируют термогенез при холодовом стрессе (Schweizer et al., 2019; Leiria and Tseng, 2020). Кардиолипин (КЛ) - уникальный димерный фосфолипид. Он расположен во внутренней мембране митохондрий и выполняет не только структурную функцию. В БЖТ кардиолипин стабилизирует белок UCP1 и напрямую усиливает его способность транспортировать протоны (Sustarsic et al., 2018; Jiang et al., 2022). Сфингомиелин (СМ) является основным компонентом липидных рафтов плазматической мембраны. Он также участвует в регуляции несократительного термогенеза. Кроме того, СМ и его метаболит церамид действуют как «метаболический переключатель», регулируя клеточную сигнализацию (Lingwood and Simons, 2010; Alomari et al., 2019; Hu et al., 2024). Тенденция увеличения фосфолипидов в БЖТ в торпоре по сравнению с летним активным состоянием показана для золотистого (Citellus lateralis) и 13-полосного (Ictidomys tridecemlineatus) сусликов, а также малой бурой ночницы (Myotis lucifugus) (Wells et al., 1965; Burlington et al., 1969; Aloia, 1981).

Совокупность этих особенностей - обогащение мембран длинноцепочечными ПНЖК, оптимизация содержания холестерина и сфингомиелина, а также накопление специфического кардиолипина - соответствует общей стратегии гомеовязкой адаптации, направленной на поддержание оптимальной текучести (микровязкости, флюидности) биологических мембран гетеротермов (Hazel, 1995; Munro and Thomas, 2004; Kolomiytseva, 2011). Подобная перестройка позволяет сохранять высокую метаболическую и термогенную активность БЖТ в условиях сезонных температурных колебаний, а целенаправленная подготовка данной системы, обеспечивающая успешное вхождение в гибернацию, начинается уже осенью.

1.4.3 Биохимические и функциональные изменения бурой жировой ткани гетеротермов

осенью

Важнейшая роль бурой жировой ткани в реализации сезонной стратегии гибернаторов была отмечена еще ранними исследователями, которые называли ее «железа спячки» (Rasmussen, 1923; Sheldon, 1924; Smith, 1964). При этом данных, касающихся липидного состава БЖТ

гетеротермных животных в осенний период в литературе критически мало (Chaffee et al, 1966; MacCannell and Staples, 2021). А между тем осенью уже происходят глубокие сезонные изменения, направленные на подготовку к длительному периоду голодания и гипотермии.

Ключевым компонентом подготовки является значительное повышение термогенной емкости БЖТ в результате гиперфагии: например, у сусликов разных видов во время подготовки к спячке показано увеличение массы БЖТ в 2-3 раза (Ballinger et al., 2016; Boyer et al., 2019; Jankovic et al., 2024). Морфологической основой этого роста является активная пролиферация и дифференцировка предшественников бурых адипоцитов, приводящая к гиперплазии ткани, а не только гипертрофия уже существующих клеток. Одновременно с этим в цитоплазме происходит интенсивное накопление множественных мелких липидных капель, состоящих преимущественно из триацилглицеридов. При этом ТАГ не являются инертным запасом; они целенаправленно аккумулируются в качестве основного энергетического субстрата для последующего несократительного термогенеза в течение зимних месяцев (Ballinger and Andrews, 2018). Вышеописанные процессы у облигатных гибернаторов стимулируются фотопериодом и эндогенными ритмами, независимо от изменений температуры окружающей среды (MacCannell et al, 2017; Frare et al, 2021; MacCannell and Staples, 2021).

На молекулярном уровне под воздействием симпатической нервной системы к началу зимней спячки митохондриальный аппарат бурых адипоцитов 13-полосных сусликов (Ictidomys tridecemlineatus) уже сформирован, насыщен UCP-1 и готов к моментальной теплопродукции в ответ на снижение температуры тела. Эти изменения обеспечиваются усилением синтеза белков, ответственных за транспорт и окисление жирных кислот, что переключает биоэнергетику БЖТ на использование липидов в качестве основного топлива для термогенеза во время зимних пробуждений (Ballinger et al., 2016). Осенью в БЖТ также начинается подготовка к защите от окислительного стресса: активность глутатионпероксидазы и уровень аскорбиновой кислоты, как показано у европейского суслика (Spermophilus citellus) значительно повышаются по сравнению с весенними уровнями, в том числе в ответ на низкие температуры окружающей среды (Jankovic et al., 2024).

Таким образом, комплексный анализ биохимических механизмов, лежащих в основе функционирования метаболизма гетеротермов, в том числе через работу щитовидной железы и бурой жировой ткани, создает основу для перехода к изучению их системных проявлений. Таковыми являются биохимические и гематологические показатели крови, служащие общепринятыми объективными маркерами сезонных перестроек.

1.5 Кровеносная система как индикатор метаболических перестроек

Современная наука рассматривает организм как сложную, саморегулирующуюся систему, в которой все процессы тесно взаимосвязаны. Метаболизм, являясь основой жизнедеятельности, не является статичным и постоянно подвергается перестройкам в ответ на изменение условий внешней и внутренней среды (физическая нагрузка, голодание, стресс, патологические процессы). Для мониторинга этих перестроек необходим надежный, интегративный и доступный для оценки индикатор. Такому требованию в полной мере отвечает кровеносная система, выполняющая ключевую транспортную, регуляторную и гомеостатическую функции (Baron, 1995; Khonsary, 2017). Именно кровь, обеспечивая доставку субстратов, эвакуацию метаболитов, транспорт регуляторов и поддержание гомеостаза, представляет собой уникальное «зеркало», объективно отражающее малейшие сдвиги в метаболическом статусе организма. Ключевые параметры кровеносной системы, выступающие маркерами метаболических изменений, можно разделить на две группы:

• Биохимические показатели (метаболиты, субстраты, ферменты, гормоны) непосредственно отражают интенсивность и направленность катаболических и анаболических путей;

• Гематологические показатели (количество и состав форменных элементов, реологические свойства крови) характеризуют не только кислородтранспортную функцию, но и состояние иммунной системы и гемостаза.

Наиболее ярко эти взаимосвязи проявляются у гетеротермных млекопитающих, у которых переход от нормотермии к гипометаболическому состоянию (спячке) сопряжен с глубокими перестройками белкового, углеводного и липидного обмена (Carey et al., 2003), что находит непосредственное отражение в биохимическом и гематологическом профиле крови.

1.5.1 Биохимические показатели липидного и энергетического обмена в крови

гетеротермов

У гетеротермных млекопитающих глубокая перестройка метаболизма в период гибернации, прежде всего смена доминирующего энергетического субстрата с глюкозы на липиды, находит прямое и комплексное отражение в биохимическом профиле плазмы крови (Carey et al., 2003). Мониторинг ключевых показателей позволяет объективно оценить эту перестройку, направленную на обеспечение жизнедеятельности в условиях гипометаболизма, голодания и периодических пробуждений.

Неэтерифицированные/свободные жирные кислоты (СЖК) и триацилглицериды (ТАГ) являются маркерами мобилизации и транспорта липидов. Активация липолиза в белой жировой ткани - первый этап подготовки к голоданию. Прямым следствием этого служит значительное

повышение уровня СЖК в плазме во время торпора. У различных гибернаторов, включая сусликов, сурков, медведей и барсуков, концентрация СЖК в период спячки возрастает в 1,6-2 раза по сравнению с активным состоянием (Yeh et al, 1996; LeBlanc et al, 2001; Nelson et al, 2010; Giroud et al., 2021a). Это указывает на интенсивный выход жирных кислот в кровоток для последующего ß-окисления. Динамика триацилглицеридов более вариабельна и отражает особенности их утилизации. У бурых медведей уровень ТАГ в спячке значительно повышается (Harlow et al., 2002), в то время как у некоторых сусликов в глубоком торпоре он может оставаться стабильным (Yeh et al., 1996; Otis et al., 2011), что, вероятно, свидетельствует о высокой скорости поглощения их тканями, например, бурой жировой.

Концентрация общего холестерина в торпоре демонстрирует наиболее консервативное и выраженное увеличение (в 1,5-2 раза) у самых разных гибернаторов, включая длиннохвостых, 13-полосных сусликов, сурков и медведей (Wenberg and Holland, 1973; Kolomiytseva et al, 2018; Giroud et al., 2021a). Этот рост связывают с активным транспортом липидов и повышенными структурными потребностями в холестерине для обновления мембран. Принципиально важно, что столь выраженная гиперхолестеринемия, в отличие от человека, не приводит к развитию атеросклероза у гибернаторов (Arinell et al., 2012). Механизмы защиты включают усиление антиоксидантного потенциала плазмы (значительный рост уровня аскорбата) (T0ien et al., 2001; Hermes-Lima et al., 2015;) и качественную перестройку липопротеинового профиля (Hurt-Camejo and Pedrelli, 2022).

На фоне физиологической гипогликемии, характеризующей состояние торпора облигатных гибернаторов (Al-Badry and Taha, 1983; Ануфриев, 2008; Khu et al., 2014), ß-гидроксибутират (БГБ) становится ключевым метаболитом активированного печеночного кетогенеза и основным альтернативным энергетическим субстратом. Концентрация БГБ в плазме крови у животных в состоянии оцепенения ожидаемо значительно возрастает. Например, у тринадцатиполосных сусликов в глубокой спячке уровень БГБ может достигать ~2,3 мМ, что примерно в 9 раз превышает его концентрацию в активный летний период (~0,26 мМ) (Otis et al., 2011). Аналогичное направленное увеличение (до 17 раз) уровня БГБ в торпоре фиксируется и у других видов, например, у бурых и черных медведей (LeBlanc et al., 2001; Giroud et al., 2021a). Такое выраженное увеличение концентрации БГБ служит не только основным альтернативным энергетическим субстратом для мозга и других тканей в условиях дефицита глюкозы (Andrews et al., 2009), но и опосредует важные сигнальные функции, обладая нейропротективным и противовоспалительным действием, что особенно значимо на фоне иммуносупрессии в состоянии оцепенения (Newman and Verdin, 2017).

Глубина метаболической перестройки раскрывается в изменениях активности ключевых ферментов. Снижение активности панкреатической липазы, по-видимому, является общей

реакцией млекопитающих к отсутствию пищи и переходу на внутренние жировые запасы. В отличие от медведей, у которых уровень сывороточной липазы падает глобально (~ в 10 раз) на весь период зимы (LeBlanc et al, 2001), у мелких млекопитающих (например, сусликов) наблюдается более сложная динамика: так, у них происходит перераспределение экспрессии гена панкреатической липазы в пользу энергопотребляющих тканей (сердце, жировая ткань); сам фермент сохраняет высокую каталитическую активность при гипотермии (около 0°C), обеспечивая локальный липолиз; при этом его секреторная активность в желудочно-кишечный тракт резко подавляется в связи с анорексией (Balslev-Clausen et al., 2003; Squire et al, 2003; Squire and Andrews, 2003). Исследования также показывают, что низкотемпературный липолиз является общим свойством панкреатических липаз и не требует модификаций белка, уникальных для клеток млекопитающих и/или спячки (Squire et al., 2003). Важную роль в условиях гибернации играют липопротеинлипаза и гормон-чувствительная липаза. Активность первой, отвечающей за утилизацию липидов из кровотока, перераспределяется, обеспечивая снабжение энергией сердца и скелетных мышц (Giroud et al., 2021a). Гормон-чувствительная липаза является ключевым ферментом липолиза в белой жировой ткани, активируемым катехоламинами. Ее сохраненная функциональная активность в условиях гипотермии напрямую обеспечивает высокую скорость мобилизации жировых запасов и поддерживает наблюдаемый повышенный уровень СЖК в плазме гибернаторов (Lehninger et al., 2009). Современные исследования указывают на то, что такие согласованные изменения активности липаз являются частью метаболического репрограммирования печени и плазмы для выживания организмов при гипотермии (Huang et al., 2025).

Помимо количественных изменений, в липидном составе крови происходят и качественные преобразования. Например, у длиннохвостого суслика в торпоре наблюдается реорганизация фосфолипидного пула: общее содержание фосфолипидов возрастает в ~2 раза, а уровни фосфатидилинозитола и фосфатидилэтаноламина увеличиваются в 6-8 раз. Одновременное резкое снижение уровня диацилглицеридов (в 2,2-2,5 раза) указывает на активную утилизацию этих промежуточных метаболитов (Kolomiytseva et al., 2018). Эта глубокая перестройка липидного обмена является частью комплексных изменений всей системы крови, которые затрагивают не только плазму, но и её форменные элементы.

1.5.2 Гематологический профиль у гетеротермов: физиологические и биохимические

аспекты

Гематологическая картина у гетеротермных млекопитающих демонстрирует выраженную пластичность, направленную на оптимизацию работы системы крови в условиях гипометаболизма и гипотермии.

Лейкоцитарный профиль гибернирующих животных характеризуется значительной изменчивостью, которая зависит как от видовой принадлежности, так и от физиологического состояния особи (Ануфриев, 2008). Наиболее выраженным проявлением данной пластичности является феномен угнетения врожденного иммунитета за счет экстремальной лейкопении во время оцепенения (снижение количества циркулирующих лейкоцитов до 90-95% по сравнению с активным летним состоянием). Этот феномен показан для множества гетеротермов, включая бурого медведя (Ursus arctos), европейского хомяка (Cricetus cricetus), монгольского хомяка (Allocricetulus curtatus), обыкновенного ежа (Erinaceus europeausL.), европейского (Spermophilus citellus), арктического (Urocitellus parryii) и 13-полосного суслика (Ictidomys tridecemlineatus) (Suomalainen and Rosokivi, 1973; Reznik et al., 1975; Frerichs et al, 1994; Drew et al., 1999; T0ien et al, 2001; Bouma et al., 2010a, 2010b; Kuznetsova et al., 2016). При этом лейкопения затрагивает все основные субпопуляции лейкоцитов облигатных гибернаторов: гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), лимфоциты и моноциты. Оставшийся в циркуляции пул лейкоцитов преимущественно состоит из нейтрофилов (~90%) и лимфоцитов (~9%) (Bouma et al., 2010a).

Наблюдаемое снижение количества гранулоцитов и моноцитов в состоянии торпора является закономерным, учитывая их короткую продолжительность жизни, которая значительно уступает длительности одного баута спячки (Кузнецова, 2019). Данный феномен объясняется комбинацией трех основных факторов: 1) низкой продукцией новых клеток в условиях гипотермии (Klug and Brigham, 2015); 2) короткой продолжительностью жизни миелоидных клеток (Hidalgo et al., 2019); 3) активной секвестрацией (маргинализацией) клеток в периферических органах, таких как легкие, печень и селезенка и др. Так, в легких в основном аккумулируются нейтрофилы, а в кишечнике - лимфоциты (Inkovaara and Suomalainen, 1973; Colditz, 1985; Iadocicco et al, 2002; Kurtz and Carey, 2007; Bouma et al, 2010a; Franco et al, 2013). Нейтропения в период торпора имеет специфический характер: она в первую очередь затрагивает зрелые формы клеток. Например, у ежа количество сегментоядерных (зрелых) нейтрофилов снижается приблизительно в 6 раз, в то время как палочкоядерных (незрелых) - лишь в 1,5 раза (Suomalainen and Rosokivi, 1973; Кузнецова, 2019). Важным элементом описанной выше стратегии является метаболическая пластичность иммунных клеток, в частности, способность нейтрофилов переключаться на Р-окисление жирных кислот, что обеспечивает функциональный потенциал в условиях длительного голодания и гипотермии (Kumar and Dikshit, 2019).

Лимфопения в торпоре, в свою очередь, развивается вследствие глубокого угнетения лимфопоэза. Пролиферация Т-лимфоцитов резко снижается из-за ежегодной реверсивной инволюции тимуса, лимфоидная ткань которого в сезон гибернации практически полностью утрачивает лимфоциты (Novoselova et al., 2004; Bouma et al., 2010b). Подавление синтеза клеток также затрагивает и костный мозг, что в совокупности с короткой продолжительностью жизни

многих зрелых лимфоцитов не позволяет поддерживать их пул в циркуляции. Важно подчеркнуть, что несмотря на лимфопению, ключевые субпопуляции лимфоцитов (CD4+, CD8+ Т-клетки и CD45RA+ В-клетки) физически присутствуют в организме, не подвергаясь массивному апоптозу, а перераспределяясь в периферические лимфоидные органы. Более того, перераспределение клеток между органами неоднородно: в селезенке гибернирующих животных наблюдается снижение относительного количества В-лимфоцитов при увеличении доли CD8+ Т-лимфоцитов (Bouma et al., 2013; Klug and Brigham, 2015).

Во время кратковременных пробуждений количество лейкоцитов в крови облигатных гибернаторов стремительно возрастает. Быстрое восстановление пула нейтрофилов и моноцитов до летнего уровня уже во время пробуждения вероятно, обусловлено как высвобождением зрелых клеток из органов-депо, так и усиленным выходом подготовленных клеточных резервов из костного мозга, где в период гибернации накапливаются поздние стадии нейтрофилов -нейтрофильные метамиелоциты (Szilagyi and Senturia, 1972; Bouma et al., 2010a). Данный адаптивный механизм приобретает ключевое значение, поскольку синтез новых лейкоцитов de novo в период кратковременных пробуждений невозможен. Это подтверждается, во-первых, общим снижением клеточной плотности костного мозга в торпоре, а, во-вторых, многодневной продолжительностью нейтропоэза млекопитающих, несовместимой с кратковременностью межбаутных пробуждений (2-24 ч, Табл.1) (Szilagyi and Senturia, 1972; Hidalgo et al., 2019; Aksyonova et al., 2023; Lizorkina et al., 2024).

В отличие от миелоидных клеток, динамика лимфоцитов при пробуждении облигатных гибернаторов характеризуется более медленным и неполным восстановлением - лишь до ~50% от летних значений. Это связывают не только с секвестрацией, но и с сохраняющимся на момент пробуждения угнетением пролиферации лимфоцитов в тимусе и костном мозге. Функциональным следствием данных изменений является избирательное подавление иммунного ответа: тогда как Т-зависимый иммунный ответ у гибернирующих животных сохраняется, гуморальный ответ на Т-независимые антигены 2 типа (TI-2) оказывается существенно угнетенным (Bouma et al., 2010b, 2013).

Таким образом, совокупность описанных изменений представляет собой скоординированную перестройку иммунной системы, направленную на поддержание минимального, но функционально достаточного иммунного надзора в условиях гипометаботермии.

Тромбоцитарный профиль у облигатных гибернаторов в период торпора претерпевает значительные изменения, направленные на предотвращение тромбообразования в условиях гипотермии, брадикардии и стаза крови (de Vrij et al., 2023). У многих видов в период гибернации количество тромбоцитов резко снижается. Экстремальная тромбоцитопения зафиксирована у

длиннохвостого (Urocitellus undulatus), европейского (Spermophilus citellus) и 13-полосного сусликов (Ictidomys tridecemlineatus), а также у сирийского хомяка (Mesocricetus auratus) и обыкновенного ежа (Erinaceus europaeus) (Ануфриев, 2008; Bouma et al, 2010b; Sahdo et al., 2013; de Vrij et al., 2023). Например, у 13-полосного суслика уровень тромбоцитов снижается до 47,9 ± 22,3*109/л, у европейского - до 44 ± 30,9*109/л. В активный летний период у этих видов количественный показательь тромбоцттов находится в диапазоне 300-450* 109/л (Lechler and Penick, 1963; Bouma et al., 2010b). У факультативных гибернаторов, например, у бурого медведя (Ursus arctos), снижение количественного показателя тромбоцитов менее выражено (до 146174* 109/л) (Arinell et al., 2012; Welinder et al., 2016). Это указывает на связь между глубиной гипотермии и степенью тромбоцитопении. В крови гетеротермов при этом не повышена доля молодых (ретикулированных) тромбоцитов. Следовательно, тромбоциты не разрушаются, а временно депонируются в зрелом виде в синусоидах печени (локализация доказана в работе de Vrij et al., 2021). Это подтверждают и другие данные: удаление селезёнки (спленэктомия) не влияет на динамику тромбоцитов во время спячки (Cooper et al., 2012, 2016a; de Vrij et al., 2021).

В условиях гипотермии у тромбоцитов гибернаторов выявлено несколько защитных механизмов. Так резко снижается уровень высокомолекулярных мультимеров фактора свертывания Виллебранд - с 24,9% до 2,4% (Cooper et al., 2016b). Уменьшается экспрессия и/или активность рецепторов GPIba непосредственно на мембранах тромбоцитов (de Vrij et al., 2023). Микротубулярный цитоскелет зимоспящих также необычайно устойчив к холодовой деградации: при охлаждении микротрубочки образуют стержни, а при согревании клетки возвращают дискоидную форму (Cooper et al., 2017). Поверхностные гликопротеины тромбоцитов подвергаются процессу десиалилирования (Splinter et al., 2023). Все это препятствует адгезии клеток, а также блокирует клиренс зрелых тромбоцитов клетками Купфера.

В состоянии торпора у гибернаторов сильно снижается функциональная активность тромбоцитов. Например, они хуже агрегируют в ответ на стандартные агонисты -аденозиндифосфат и коллаген. Это установлено в экспериментах как на факультативных бурых медведях, так и на облигатных13-полосных сусликах (Arinell et al., 2012; de Vrij et al., 2023). Подавление активации тромбоцитов также минимизирует их взаимодействие с лейкоцитами через путь P-селектина, что снижает риск образования тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов и сопутствующего воспалительного ответа в эндотелии (de Vrij et al., 2023). Это представляет собой многоуровневый механизм регуляции с одновременным противотромботическим и противовоспалительным эффектом. Интересно отметить и межвидовые различия в молекулярных механизмах: у бурого медведя во время гибернации наблюдается 55-кратное снижение белка теплового шока 47 в тромбоцитах, что коррелирует со снижением риска тромбозов при длительной неподвижности во время гибернации (Thienel et al., 2023). В отличие

от медведей, у 13 -полосного суслика уровень этого белка в тромбоцитах не меняется (de Vrij et al, 2023), что может отражать немного различные антитромботические стратегии у облигатных и факультативных гибернаторов.

При межбаутных пробуждениях происходит быстрое высвобождение тромбоцитов из печеночных депо. Количество тромбоцитов восстанавливается практически до исходного уровня в течение нескольких часов: у суслика франклина (Spermophilus franklinii) - до 232,4 ± 19,7*109/л за 2 часа, у 13-полосного суслика - до 410,9 ± 59,2*109/л, а у европейского- до 194 ± 5*109/л (Pivorun and Sinnamon, 1981; Bouma et al., 2010b; Cooper et al., 2012). Такой механизм восстанавливает гемостатический потенциал для предотвращения кровотечений в активные эутермные периоды, но не снижает антитромботическую защиту в период гипотермии (de Vrij et al., 2014), что делает всю тромбоцитарную систему гибернаторов крайне пластичной.

В отличие от изменчивых показателей лейкоцитов и тромбоцитов, эритроцитарный профиль крови гибернаторов отличается высокой стабильностью (Corrons et al., 2021). Это связано с жизненно важной необходимостью поддерживать кислородтранспортную функцию зверьков в любом физиологическом состоянии. Такая стабильность обеспечивается длительным сроком жизни эритроцитов (до 160 суток у гибернирующих хомяков против ~ 60 -120 суток у негибернирующих гомойотермов) (Brock, 1960; Reznik et al., 1975; Ануфриев, 2008).

У облигатных европейского, 13-полосного и колумбийского (Urocitellus columbianus) сусликов количество эритроцитов, гематокрит и уровень гемоглобина почти не отличаются между летней активностью и состоянием оцепенения (Nansel and Knoche, 1972; Bouma et al., 2010b; Cooper et al., 2016a). Вместе с тем, у других видов (например, у садовой сони, Sicista betulina, и рыжей вечерницы, Nyctalus noctula) в торпоре отмечается увеличение количества эритроцитов. В то время как у третьих (например, у мексиканского суслика, Ictidomys mexicanus, и некоторых видов летучих мышей) - его снижение (Кузнецова, 2019). Эта видовая специфичность, вероятно, отражает различные стратегии физиологического ответа на гипотермию.

Важнейшим адаптивным механизмом является и значительное повышение вязкости крови и гематокрита, достигающее у некоторых видов гетеротермов 60-70% (Lyman et al., 1957). Хотя такая гемоконцентрация могла бы создавать чрезмерную нагрузку на сердце в активном состоянии, в условиях брадикардии и сниженного сердечного выброса во время спячки она способствует поддержанию адекватного артериального давления.

Несмотря на количественную стабильность у многих видов, эритроциты гибернаторов обладают уникальной морфофункциональной пластичностью. У длиннохвостых сусликов в состоянии торпора наблюдается частичная замена дискоцитов на атипичные формы эритроцитов - овальные, макроциты и мишеневидные. Количество этих форм значительно снижается в

периоды зимних пробуждений. Вероятно, это связано со способностью эритроцитов обратимо менять форму («складываться») для облегчения прохождения по суженным в условиях гипотермии сосудам, как было ранее показано у тринадцатиполосного суслика (Lizorkina et al., 2024; Spurrier and Dawe, 1973; Ануфриев, 2008). Данная способность имеет критическое значение для поддержания микроциркуляции в условиях значительного снижения артериального давления и сердечного выброса. Исследования на малом суслике (Spermophilus pygmaeus) также выявили выраженную сезонную динамику деформируемости эритроцитов: максимальная деформируемость, гидратация и осмотическая стабильность отмечаются весной после пробуждения, снижаются в летний период и вновь возрастают осенью перед гибернацией, что коррелирует с изменениями содержания холестерина в мембране (Katiukhin et al., 2023).

Поддержание стабильного пула эритроцитов обеспечивается перестройкой работы костного мозга. Гистологический анализ выявил, что в состоянии торпора у длиннохвостых сусликов в костном мозге бедренной кости значительно увеличивается количество эритроидных островков, несмотря на общее снижение количества ядерных клеток и частичное замещение миелоидной ткани на жировую. При этом в костном мозге плечевой кости аналогичного увеличения не наблюдалось. Это указывает на то, что именно костный мозг бедренной кости берет на себя основную роль в поддержании эритропоэза во время гибернации, что компенсирует общее подавление пролиферативной активности (Aksyonova et al., 2023; Lizorkina et al., 2024). Последующие исследования показали, что в период пробуждения именно в костном мозге бедренной кости наблюдается наиболее значительное увеличение доли клеток в фазе G2+M митотического цикла, что подтверждает его ключевую роль в формировании пролиферативного пула эритроцитов во время выхода из оцепенения (Lizorkina et al., 2025).

Фундаментальное исследование метаболома эритроцитов арктического суслика выявило глубокие и обратимые перестройки в ходе баута спячки (Gehrke et al., 2019). В условиях торпора в эритроцитах активируется гликолиз, что способствует кислородной разгрузке гемоглобина (эффект Бора) (Low et al, 1993; Chu and Low, 2006; Campanella et al, 2008; Chu et al, 2008, 2016). При пробуждении, когда резко возрастает риск окислительного стресса, метаболизм переключается на пентозофосфатный путь для генерации антиоксидантов (Carey et al., 2003; Castagnola et al., 2010). Среди важнейших результатов также следует выделить (Gehrke et al., 2019):

1) Подавление маркеров реперфузионного повреждения. Уровни сукцината -провоспалительного дикарбоксилата, концентрация которого резко возрастает при ишемии-реперфузии у негибернирующих млекопитающих, - в эритроцитах сусликов оставались экстремально низкими (до 100 раз ниже, чем у крыс с геморрагическим шоком) и быстро

нормализовались при пробуждении (Klain and Whitten, 1968; Carey et al., 2003; D'Alessandro et al, 2017; Reisz et al, 2017, 2018).

2) Перераспределение путей распада триптофана. В торпоре отмечалось накопление нейротоксичных катаболитов триптофана - кинуренина, хинолината и пиколината, уровень которых нормализовался при пробуждении. Это указывает на потенциальную связь метаболизма эритроцитов с нейромодуляцией в гибернации (Grant et al., 2009; Pierozan et al., 2016; Baumgartner et al, 2019).

3) Открытие тиорфана: в эритроцитах был идентифицирован тиорфан - мощный ингибитор металлопротеиназ, чья концентрация резко возрастает на пике пробуждения (Benchetrit et al., 1987; Oneda and Inouye, 2001; Carey et al., 2003). Предполагается, что он является одним из эндогенных факторов, защищающих гибернаторов от реперфузионного повреждения (Hachisu et al, 1985; Tannahill et al, 2013; D'Alessandro et al, 2014).

Таким образом, важной частью адатационной стратегии гибернаторов является согласованная перестройка всей системы крови. Иммунное и тромбоцитарное звено в спячке подавляются, а эритроциты проявляют метаболическую пластичность. Такая реорганизация позволяет зимоспящим животным энергоэффективно поддерживать жизненно важные функции и одновременно снижать риски тромбозов, воспаления и реперфузионного повреждения.

1.5.3 Изменения показателей крови как отражение осенней подготовки к спячке

Осенью, в отличие от периода глубокой спячки, процессы в организме ещё не угнетены, происходит подготовка к зимовке. Кровь как транспортная среда чутко реагирует на эти изменения: её биохимический и клеточный профиль сдвигается ещё до наступления первых эпизодов оцепенения.

Общеизвестно, что во время осенней гиперфагии создаются тканевые жировые депо. Важную роль в этот период играет фермент липопротеинлипаза, который находится на эндотелии капилляров. Функция липопротеинлипазы заключается в быстром гидролизе триацилглицеридов из хиломикронов и липопротеинов очень низкой плотности прямо в кровотоке, обеспечивая поступление жирных кислот в адипоциты для хранения. Максимальная активность данного фермента в период активного потребления пищи обеспечивает эффективное депонирование энергии и предотвращает развитие выраженной хилезии (помутнения плазмы) (Boyer and Barnes, 1999). Таким образом, высокая активность липопротеинлипазы является одним из первых биохимических маркеров переключения метаболизма в сторону накопления резервов.

Непосредственным следствием и отражением этой и других метаболических перестроек являются изменения в липидном профиле крови, демонстрирующие, однако, значительные

межвидовые различия. Например, у южноамериканского сумчатого соневидного опоссума Dromicops gliroides концентрация холестерина возрастает более чем на 60% с лета на осень (с ~4,00 до ~6,57 ммоль/л), что согласуется с активной подготовкой мембран к гипотермии (Franco etal., 2013). При этом у данного вида осенью достоверно возрастают также показатели белкового обмена: общий белок, альбумин и глобулины, что свидетельствует об активных анаболических процессах. Вместе с тем уровни триацилглицеридов и Р-гидроксибутирата осенью значимо не меняются, указывая на то, что переключение на липидный катаболизм происходит непосредственно во время торпора, а не на подготовительном этапе (Franco et al., 2013). У длинноухого ежа (Hemiechinus auritus aegyptius) в осенний период наблюдается увеличение содержания холестерина на 33% (Badry and Taha, 1983). В отличие от этих видов, у 13-полосных сусликов и бурых медведей осенний уровень холестерина остается стабильным, а его резкий скачок происходит после захода в спячку (до ~375 мг/дл у сусликов), что авторы исследований связывают с активацией синтеза холестерина для обновления мембран на фоне длительного голодания и гипотермии (Otis et al., 2011; Giroud et al., 2021a). У альпийских сурков повышение уровня холестерина происходит в активный летний сезон, достигая пика к июлю (~4,3-5,4 ммоль/л) и сохраняясь на высоком уровне вплоть до сентября (~3,3-5,1 ммоль/л) (Sartorelli et al., 2004), что предполагает более раннее, летнее формирование липидного «буфера». Уровень триацилглицеридов в крови у японского черного медведя (Ursus thibetanus japonicus) снижается (с 3,4 ммоль/л в июне до 2,2 ммоль/л в ноябре), что может свидетельствовать об активной тканевой утилизации в преддверии гибернации (Shimozuru et al., 2016). В то же время, в экспериментах на сурках было установлено, что многие биохимические показатели крови (концентрация мочевины, общего белка, кальция и неорганического фосфата) практически не меняются от лета к осени (Sartorelli et al., 2004). Однако данные об осенней динамике биохимических показателей у гибернаторов крайне скудны, а поэтому делать общие выводы пока сложно.

В осенний период наряду с биохимическими показателями изменяется и клеточный состав крови. Подготовка иммунной системы у разных видов сильно варьирует. Различия, вероятно, связаны с тем, насколько глубокой и долгой будет предстоящая гипотермия. У некоторых облигатных гибернаторов, например, у прудовой ночницы (Myotis dasycneme), тарбагана (Marmota sibirica) и краснощёкого суслика (Spermophilus erythrogenys) осенью число лейкоцитов повышается (Лешкович, 1950; Юнкер с соавт., 1974; Mishchenko et al., 2018). Обнаруженный лейкоцитоз может рассматриваться как возможная стратегия элиминации латентных инфекций перед длительным периодом глубокой иммуносупрессии. Это снижает риск реактивации патогенов во время спячки. У факультативных гибернаторов и видов с неглубоким торпором наблюдается иная картина. Так, у монгольского хомячка (Allocricetulus curtatus) и соневидного

опоссума (Dromiciops gliroides) уровень лейкоцитов и их субпопуляций с лета на осень не меняется. Выраженная лейкопения развивается только непосредственно во время оцепенения (Franco et al., 2013; Кузнецова с соавт., 2016). Ещё более консервативна стратегия у большой ночницы (Myotis myotis). Анализ главных компонент не показал чёткого разделения биохимических и гематологических показателей между летом (лактация) и осенью (роение) (Bandouchova et al., 2020). Это говорит о сильных гомеостатических механизмах. По-видимому, выраженной предгибернационной перестройки системы крови у этого вида нет. Причина, скорее всего, в том, что эпизоды оцепенения у данных летучих мышей частые и неглубокие.

Другая задача осенней подготовки - оптимизировать систему гемостаза для корректной работы как в состоянии гипотермии животных, так и во время межбаутных пробуждений. У прудовой ночницы, например, число тромбоцитов и тромбокрит осенью увеличиваются примерно в два раза (Mishchenko et al, 2018). Это, вероятно, создаёт запас для быстрого восстановления свёртываемости после пробуждений, когда выше риск кровотечений от травм.

Осенью меняется и кислородтранспортная функция крови. У малого (Spermophilus pygmaeus) и крапчатого сусликов (Spermophilus suslicus) количество эритроцитов с лета на осень увеличивается (Передрий, 1973). У 13-полосного суслика возрастает не только число эритроцитов, но и гематокрит (Spurrier and Dawe, 1973). На малом суслике провели исследование, которое показало, что перед спячкой повышаются интегральная деформируемость и гидратация эритроцитов. Кроме того, расширяется диапазон их осмотической стабильности. Зафиксированные сдвиги происходят на фоне роста содержания холестерина в мембранах и небольшого выброса ретикулоцитов в кровь (Katiukhin et al., 2023). Повышенная деформируемость эритроцитов является важным реологическим свойством в условиях гипотермии, когда кровоток замедляется, сосуды сужаются, но красным кровяным тельцам нужно проходить через капилляры. Именно благодаря высокой деформируемости это становится возможным.

Таким образом, осенние изменения в показателях крови у гетеротермных млекопитающих представляют собой не пассивное следствие накопления жира, а активный и многокомпонентный этап физиологического репрограммирования. Конкретный спектр приспособительных изменений и их выраженность варьируют в широких пределах, отражая эволюционное разнообразие стратегий выживания: от глубокой многомесячной спячки сурков и сусликов до нерегулярных коротких торпидных эпизодов хомячков и летучих мышей. Кровь, будучи основной транспортной и коммуникационной средой организма, интегрирует эти процессы, а её изменяющийся биохимический и клеточный профиль служит прямым отражением и необходимым условием успешной адаптации к гибернации.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Экспериментальные животные

В качестве объекта исследования использовали длиннохвостых сусликов Urocitellus undulatus (рис 5). Исследования проводили на половозрелых особях обоих полов (всего 75 особей, из них 45 самцов $ и 30 самок Материал для данной работы был собран в период с 2020 по 2024 гг.

Рисунок 5. Длиннохвостый суслик Urocitellus undulatus

Зверьки были доставлены в лабораторию из природных мест обитания (долина реки Лена, Якутия, Россия). В летний и осенний период (до конца октября-начала ноября) сусликов содержали в индивидуальных клетках (60*40*40 см) в одинаковых условиях в помещении с естественным фотопериодом (г. Пущино, Московская область, Россия), при постоянной температуре 19±1 °C. Гнездовой материал и пищу (зерно, семена подсолнечника, свежие овощи) предоставляли ad libitum. В ноябре клетки переносили в темное помещение с температурой 0-2°С до окончания зимней спячки (апрель). Для мониторинга торпора с декабря по февраль включительно сусликов индивидуально размещали в деревянные ящики (20*20*25 см), в дно которых был вмонтирован термистор (чувствительность 0,2 °C). Во время спячки температура

подстила составляла 0-4 °С, а при кратковременной эутермии (периодические пробуждения между торпидными эпизодами) поднималась до 14 °С. Температуру в области миокарда точечно измеряли датчиком RET-3 (Physitemp, США, ± 0,1°С) сразу после вскрытия грудной клетки.

Изучали следующие состояния особей:

1. «лето» (активные животные, контроль нормотермии, температура в области сердца 38-39 °С, июнь-июль, т = 607 ± 19 г, п = 25, 15$ и 10$);

2. «осень» (предгибернационный период, подготовка к спячке, температура в области сердца 36-37 °С, сентябрь - первая декада ноября, т = 682 ± 15 г, п = 25, 16$ и 9$);

3. «торпор» (оцепенение, гипотермия, температура в области сердца (0,5-5 °С, декабрь-февраль, т = 551 ± 17 г, п = 25, 14$ и 11$);

Формирование экспериментальных групп было случайным. В работе использован комплексный подход, при котором одни и те же животные последовательно или одновременно участвовали в разных типах экспериментов. Это позволило минимизировать общее количество особей, одновременно получив согласованные данные по разным системам организма от одной и той же особи в определенный сезонный период. Общее количество физически использованных животных составило п = 75. Из этого числа: для многократных респирометрических измерений в течение годового цикла было отобрано п = 7 особей; для гистологического анализа щитовидной железы на разных сезонных стадиях было использовано п = 9 особей; для исследования бурой жировой ткани отобрано п =12 особей; гематологический и биохимические анализы крови проводились на материале от всех животных, составляющих общую выборку (п = 75). Размеры выборок определены в соответствии с международными принципами 3R, закреплёнными в Директиве ЕС 2010/63/Еи, и рекомендациями для исследования диких видов NC3Rs (2етапоуа, 2020, 2021).

Все манипуляции с сусликами осуществляли в соответствии с руководящими принципами, установленными Директивой Европейского Совета 2010/63/Еи и Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 12 августа 1977 г. N 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Протоколы экспериментов были одобрены комиссией по биоэтике Института биофизики клетки РАН (Идентификатор: №3/062019 от 13.06.2019 г., № 3/092022 от 08.09.2022 г., №1/082023 от 17.08.2023 г.). Активных животных (летних и осенних) перед декапитацией предварительно подвергали легкому наркозу (4 мг/кг, внутримышечно; 2о1еШ, У1гЬае, Франция). Летом и осенью сусликов доставляли в экспериментальную комнату не менее, чем за час до начала исследования, торпидных животных забирали сразу после извлечения из холода.

2.2. Методы

2.2.1 Измерение метаболизма методом непрямой калориметрии

Показатели метаболизма (потребление кислорода, выделение углекислого газа) регистрировали в первой половине дня при комнатной температуре с помощью установки ММ-100 (Рис.6) с дополнением MMX-8 (CWE Inc., США) (Teplova et al., 2026). Перед проведением цикла исследований выполняли полную калибровку датчиков системы при помощи баллона с калибровочным газом в соответствии с рекомендациями производителя (смесь 0,25% CO2 + N2).

В основе работы установки лежит общеизвестный «открытый метод» для измерения потребленного кислорода (VO2) и выделившегося углекислого газа (VCO2). Этот метод требует использования шести переменных: V1 = приток свежего воздуха в камеру, л/мин; V0 = поток воздуха выходящего из камеры, л/мин; X1 = концентрация кислорода на входе в камеру, %; X0 = концентрация кислорода на выходе из камеры, %; Y1 = концентрация диоксида углерода на входе в камеру, %; Y0 = концентрация диоксида углерода на выходе из камеры, %. Все эти переменные, за исключением V0 (расчетное значение), получаются путем прямых измерений.

Измерение концентрации кислорода осуществляли парамагнитным датчиком высокого разрешения, углекислого газа - ИК-анализатором низкого диапазона с температурным контролем на входе и выходе из камеры при условии, что скорость потока воздуха известна (измеритель потока thermal mass flowmeter). Сусликов размещали в камере объемом 7,5 литров и скоростью потока воздуха ~ 1700 мл/мин (Рис.6). Измерения проводили на одних и тех же особях в течение всего календарного года (n = 7). Летних и осенних активных животных в постабсорбтивном периоде (натощак для исключения термического эффекта пищи) перед началом измерений на один час помещали в экспериментальную комнату для адаптации к условиям проведения опыта.

Рисунок 6. Измерение интенсивности метаболизма у длиннохвостых сусликов (и. ипёиШш) в состоянии осенней активности методом непрямой калориметрии. Экспериментальная установка с многоканальным дополнением ММХ-8 позволяет проводить параллельные измерения у группы животных.

Мониторинг проводили через заданные промежутки времени в течение четырех минут для каждого измерения после калибровки прибора относительно воздуха. Данные были обработаны программным обеспечением MMCom, записаны в формате ASCII и импортированы в пакеты статистического анализа (MS Excel и GraphPad Prism) для дальнейшей обработки. Значение V0 рассчитывалось установкой автоматически по уравнению Хальдана (Haugen et al., 2007).: V0 = V1 (N1/N0), где N1 и N0 - это концентрации азота на входе и выходе соответственно, N1 - это концентрация азота в помещении, которая, как правило составляет 78,084%. N1 рассчитывалось по формуле из-за возможных колебаний в составе окружающего воздуха: N1 = 100 - (X1-Y1); N0 рассчитывалось по формуле: N0 = 100 - (X0-Y0). После получения всех переменных использовали следующие уравнения:

• VO2 = (V1 X1) - (V0 X0) - потребленный кислород (л/мин);

• VCO2 = (V0 Y0) - (V1 Y1) - выделяемый углекислый газ (л/мин).

Далее количественные показатели метаболизма стандартизировали по весу животных. Расчет интенсивности теплопродукции/общего количества энергии, также проводился автоматически при помощи MMCom по модифицированному уравнению Вейра (Weir, 1949), исключающему коррекцию по азоту мочи, что является общепринятым стандартом для кратковременных измерений у мелких млекопитающих.

2.2.2 Морфофункциональный анализ щитовидной железы

Аутопсию проводили в утренние часы (10:00-11:00). Криосекционирование извлеченных органов проводили по следующей методике:

1) Незамедлительно после декапитации образцы щитовидной железы фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина по Лилли (в соотношении 1:20) 24 часа при комнатной температуре, отмывали от фиксатора физиологическим раствором без кальция и магния (pH = 7,4) не менее 24 часов.

2) В камере криотома (Shandon Cryotome 620E, Thermo Fisher Sci., США) охлаждали предметные стекла, покрытые желатиновым адгезивом и кисти для переноса криосрезов.

3) Отмытые от фиксатора образцы помещали в формы для заморозки Cryomold (Sakura, Япония) и заливали (полное покрытие) криосредой O.C.T. Compound Tissue Tek (Sakura, Япония).

4) Заливочную форму с фрагментом образца помещали в камеру охлажденного криотома и на столике быстрой заморозки (Cryobar Boost, на основе элемента Пельтье) с помощью теплоотвода (Thermo Scientific™ Heat Extractor) проводили мгновенную заморозку залитых в заливочную среду образцов (при -60°С).

5) С помощью тонкого слоя заливочной среды замороженный блок с образцом крепили на предметном столике и помещали в зажимный патрон подвижной головки криостата. Получали криосрезы толщиной 6-7 мкм, которые переносили на предметные стекла с помощью кисточки (№1-2).

6) Предметные стекла с прикрепленными криосрезами расправляли на нагревательной плате OTS 40 (Medite, Германия) при температуре 40°С в течение 1 минуты.

7) Секционирование срезов проводилось при температуре рабочей камеры от -18°С до -25°С (в зависимости от внешних условий).

Далее проводили стандартную окраску гематоксилином Майера и эозином (Labiko, Россия) (Lillie, 1976). Данная окраска позволяет четко дифференцировать структуру щитовидной железы, выделяя ядра клеток (базофильные структуры) сине-фиолетовым цветом, а цитоплазму, коллоид и соединительную ткань (эозинофильные структуры) - розовым. Цифровые изображения окрашенных препаратов щитовидной железы получали на широкопольном прямом микроскопе Leica DM 6000 B (Leica, Германия) на базе сектора оптической микроскопии и спектрофотометрии ЦКП ПНЦБИ РАН. Для гистологического анализа щитовидной железы на разных сезонных стадиях было использовано n = 9 особей (по 3 особи на каждый сезон). Площади коллоида и резорбционных вакуолей, а также количество фолликулов для каждого отдельного органа определяли в 5 произвольно выбранных полях зрения (400*400 мкм) с помощью некоммерческого программного обеспечения ImageJ (дата обращения: 1 апреля 2024 г).

2.2.3 Количественное определение тиреоидных гормонов в крови

Незамедлительно после декапитации животных осуществляли подготовку образцов, которая включала: отбор крови (~5 мл) в пластиковые пробирки (SPL Lifesciences, Корея), инкубацию 30 мин при комнатной температуре, центрифугирование (1500 g, 10 мин), отбор сыворотки и хранение аликвот сыворотки при -20 °C. Перед анализом образцы размораживали и центрифугировали (10000 g, 5 мин) для осаждения криопреципитатов. Часть сыворотки также использовали для биохимического анализа метаболитов (см. главу 2.2.5). Концентрации общего трийодтиронина (общТЗ) и общего тироксина (общТ4) в сыворотке крови сусликов определяли методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерческих наборов ИФА-ТТ3-1 и ИФА-ТТ4-1 (ЗАО «НВО Иммунотех», Россия), а свободных фракций (свТ3 и свТ4) - с помощью наборов K213CFI и K214CFI (ООО «ХЕМА», Россия). Согласно технической документации производителей, антитела, входящие в состав наборов, обладают высокой специфичностью: для наборов на общие фракции перекрестная реактивность с другими тиреоидными гормонами не превышает 1,0% (0,6% для Т3 с Т4 и 0,9% для Т4 с Т3, инструкции ИФА-ТТ3-1, ИФА-ТТ4-1); для наборов на свободные фракции заявлена

100% реактивность с целевыми L- и D-изомерами (инструкция K213CFI, стр. 15). Первоначальное назначение наборов - диагностика у человека (ИФА-ТТ3-1, ИФА-ТТ4-1) и домашних животных (K213CFI, K214CFI). Применение данных наборов в работе с сывороткой сусликов обосновано эволюционной консервативностью молекулярной структуры и иммунореактивных эпитопов тиреоидных гормонов у млекопитающих, а также их широким использованием в исследовательской практике на модельных грызунах. Корректность и воспроизводимость измерений в наших условиях дополнительно контролировалась построением калибровочных кривых в каждой аналитической серии и использованием предусмотренных производителем контрольных проб.

Принцип метода основан на конкуренции между определяемым гормоном в образце и конъюгатом гормона с пероксидазой хрена (ПХ) за сайты связывания специфичных поликлональных антител, иммобилизованных на поверхности лунок плоскодонных полистироловых 96-луночных планшетов высокой степени связывания (Nunc MaxiSorp, Thermo Fisher Scientific, США). Все процедуры выполняли в строгом соответствии с инструкциями производителей. Для наборов свободных фракций использовали планшеты с иммобилизованными кроличьими поликлональными антителами (к Т3 для K213CFI, к Т4 для K214CFI); калибровочные пробы на основе сыворотки крупного рогатого скота; а также специальные буферы, блокирующими связывание гормонов с транспортными белками сыворотки. Количество связавшегося конъюгата во всех анализах выявляли с помощью хромогенного субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ), а ферментативную реакцию останавливали добавлением 100 мкл стоп-реагента (5,0% H2SO4). Абсорбцию измеряли при длине волны 450 нм (референс 620 нм) с помощью планшетного спектрофотометра Multiskan FC microplate reader (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Протоколы анализа различались объёмами реагентов: для общТ3/общТ4 вносили 20 мкл образца и 100 мкл конъюгата (Т3-ПХ/Т4-ПХ); для свТ3/свТ4 - 50 мкл образца и 50 мкл конъюгата (Т3-ПХ/Т4-ПХ). Инкубацию с конъюгатом проводили 60 мин при +37 °C, промывку - 3-5 раз фосфатно-солевым буфером (pH 7,0 ± 0,5) или отмывочным буфером (для наборов «ХЕМА»). Инкубация с ТМБ составляла: 10-15 мин при +37 °C (общие фракции) или 10-20 мин при комнатной температуре в темноте (свободные фракции).

Концентрации гормонов рассчитывали в программах MS Excel и GraphPad Prism 10.1.1 методом кусочно-линейной аппроксимации по калибровочной кривой в координатах процент связывания от максимального - логарифм концентрации. Процент связывания для образцов вычисляли относительно оптической плотности нулевого стандарта (калибровочная проба без гормона) с учётом контроля неспецифического связывания. Минимальная концентрация общего трийодтиронина, определяемая с помощью набора, составляла не более 0,15 нмоль/л, минимальная концентрация свободного трийодтиронина - не более 0,5 пмоль/л, общего

тироксина - не более 6 нмоль/л, свободного тироксина - не более 1 пмоль/л. Количество особей в эксперименте: n = 7 лето, n = 19 осень, n = 11 торпор.

2.2.4 Количественный анализ липидов в буром жире

Бурую жировую ткань (БЖТ) выделяли из области подмышечных впадин при аутопсии сусликов (n = 4 для каждого сезона). Липиды экстрагировали, очищали, разделяли методом тонкослойной хроматографии и определяли количество холестерина, свободных жирных кислот, моно-, ди-, триациглицеридов и фосфолипидов. Общую фракцию липидов экстрагировали и промывали по Фолчу (Folch et al., 1957), для этого:

1) образцы заливали двадцатикратным объемом смеси хлороформ/метанол в соотношении 2:1 по объему, затем оставляли в колбах с притертыми пробками на 12 часов при температуре 4 °C;

2) полученные экстракты фильтровали через складчатый фильтр, измеряли объем, далее вносили 0,2 объема 0,73% NaCl, тщательно перемешивали и оставляли на холоде (4 °C) до чёткого разделения фаз;

3) удаляли верхнюю фазу (метанол+вода), затем вносили 0,5 объема метанола, повторяли цикл промывки еще раз;

4) нижнюю фазу (экстракт липидов) выпаривали на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C;

5) полученную общую фракцию липидов перерастворяли в небольшом объеме смеси хлороформ/метанол и использовали для анализа методом тонкослойной хроматографии. Нейтральные липиды, холестерин и СЖК разделяли на силикагеле L (5/40 мкм). На

стеклянные пластины (13*18 см) наносили растертую в агатовой ступке смесь силикагель/гипс/вода (6 г: 0,6 г: 18 мл). Пластины сушили при комнатной температуре, а непосредственно перед экспериментом активировали 1 ч при 105 °C. Хроматографию проводили в стеклянной камере с плотно пришлифованной крышкой в системе гексан/диэтиловый эфир/уксусная кислота (73: 25: 2 по объему) (Hirsch and Ahrens, 1958). Камеры с растворителями выдерживали не менее 12 часов. Идентификацию компонентов (холестерина, свободных жирных кислот, моно-, ди- и триациглицеридов) проводили с использованием стандартных маркеров, хроматограммы визуализировали в парах йода. Для количественного определения нейтральных липидов соответствующие пятна с хроматограмм элюировали и анализировали универсальным методом озоления по Маршу (Marsh and Weinstein, 1966). Аликвоту исследуемого липида (растворенную в хлороформе) переносили в кварцевые пробирки, растворитель выпаривали досуха. Далее пробирки охлаждали, добавляли в них по 2 мл концентрированной H2SO4 и через 30 сек переносили в блок (200 °C) со сплавом Вуда на 15 минут. Затем пробирки охлаждали

сначала в воде комнатной температуры (15 секунд), а за тем на льду (5 минут). После этого в каждую пробу добавляли по 3 мл дистиллированной воды, быстро перемешивали и вновь помещали на лед до исчезновения пузырьков воздуха, после чего измеряли поглощение при 375 нм. Концентрацию холестерина рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для чистого стандарта холестерина, а свободных жирных кислот, моно-, ди- и триацилглицеридов -по калибровочной кривой для арахидоновой кислоты.

Фосфолипиды разделяли на готовых пластинах с кизельгелем 60 F254 (60*0,2 мм, Merck, Германия). Тонкослойную хроматографию проводили в стеклянной камере с плотно пришлифованной крышкой в системе метилацетат/н-пропанол/хлороформ/метанол/0,25% KCl (25 : 25 : 25 : 10 : 9 по объему) (Vitello and Zanetta, 1978). Камеры с растворителями выдерживали не менее 12 часов. Для визуализации и идентификации отдельных классов фосфолипидов использовали специфические цветные реакции: общую фракцию фосфолипидов выявляли по пятнам на пластине после разделения; фосфатидилхолин и сфингомиелин идентифицировали реактивом Драгендорфа по методу Шталя (оранжево-коричневые пятна); фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин - обработкой нингидрином (фиолетовые пятна); кардиолипин и фосфатидилинозитол идентифицировали по характерному положению (коэффициент Rf) на хроматограмме относительно стандартов. Количественное содержание каждого класса фосфолипидов определяли по липидному фосфору. Для этого соответствующие зоны экстрагировали с пластины, подвергали кислотной минерализации и определяли содержание неорганического фосфата спектрофотометрически (Kolomiytseva et al., 2010). Количество всех определённых липидов выражали в микрограммах липида на миллиграмм ткани (мкг/мг). Для пересчёта использовали усреднённый молекулярный вес фосфолипидов или коэффициент 25 (при пересчёте из микрограммов фосфора).

2.2.5 Биохимический анализ крови

Биохимический анализ сыворотки крови проводили с использованием автоматического биохимического анализатора iMagic-S7 (Incubio, Китай). В качестве реагентов применяли коммерческие наборы «ДиаВетТест» (АО «ДИАКОН-ДС», Россия) и наборы компании DiaSys (Diagnostic Systems GmbH, Германия), следуя инструкциям производителей. Получение сыворотки выполняли стандартным методом, описанным ранее (см. 2.2.3). В ходе исследования определяли концентрацию следующих показателей: общего холестерина, триацилглицеридов (ТАГ), липазы, ß-гидроксибутирата (БГБ) и неэтерифицированных (свободных) жирных кислот (СЖК). Количество животных, использованных для данных исследований: n = 8 лето, n = 11 осень, n = 13 торпор.

Концентрацию общего холестерина (набор «Холестерин ДиаВетТест», кат. № DV 792 005/006) определяли ферментативным колориметрическим методом. В основе метода лежит гидролиз эфиров холестерина холестеролэстеразой с последующим окислением свободного холестерина холестеролоксидазой. Образующаяся в эквимолярном количестве перекись водорода в присутствии пероксидазы участвует в реакции с хромогенными субстратами (фенол и 4-аминоантипирин) с образованием окрашенного хинониминового продукта. Интенсивность окрашивания, измеряемая фотометрически при длине волны 500 нм (480-520 нм), прямо пропорциональна концентрации холестерина в пробе. Линейный диапазон измерения составлял от 1,0 до 19,4 ммоль/л.

Уровень триацилглицеридов (набора «Триглицериды ДиаВетТест», кат. № DV 790 005/006) оценивали ферментативным методом. ТАГ гидролизуются под действием липопротеинлипазы до глицерина и свободных жирных кислот. Далее глицерин в серии ферментативных реакций с участием АТФ, глицерокиназы и глицерофосфатоксидазы окисляется с образованием перекиси водорода. Вторичная реакция Триндера, катализируемая пероксидазой, приводит к образованию окрашенного комплекса, интенсивность которого измеряли при 500 нм. Концентрацию ТАГ рассчитывали на основе полученной оптической плотности.

Активность панкреатической триацилглицерол-липазы (набор «Липаза ДиаВетТест», кат. № DV 784 011) определяли ферментативным кинетическим колориметрическим методом с использованием специфического субстрата - 1,2-о-дилаурил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты-(6-метилрезоруфина). Панкреатическая липаза в присутствии колипазы и желчных кислот гидролизует субстрат с образованием 6-метилрезоруфина. Скорость нарастания окраски (абсорбции) продукта реакции, регистрируемая при 580 нм, прямо пропорциональна ферментативной активности в образце. Измерения проводили при 37 °C. Линейный диапазон метода составлял от 10 до 300 Ед/л.

Концентрацию Р-гидроксибутирата (набор «Р-Hydroxybutyrate Standard FS», кат. № 1 3700 99 10 030, DiaSys) измеряли на основе ферментативного метода с Р-гидроксибутиратдегидрогеназой. В ходе реакции Р-гидроксибутират окисляется до ацетоацетата с одновременным восстановлением НАД+ до НАДН. Кинетику накопления НАДН, пропорциональную концентрации БГБ, регистрировали по увеличению абсорбции при 340 нм.

Концентрацию неэтерифицированных жирных кислот (набор «NEFA FS», кат. № 1 5781 99 10921, DiaSys) определяли ферментативным колориметрическим методом. СЖК в присутствии ацил-КоА-синтетазы, коэнзима А и АТФ преобразуются в ацил-КоА, который затем окисляется ацил-КоА-оксидазой с образованием перекиси водорода. Последняя в реакции, катализируемой пероксидазой, окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного

продукта, измеряемого при 546 нм. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации СЖК в образце.

Контроль качества измерений осуществляли в каждой серии анализов. Для калибровки биохимического анализатора использовали коммерческий мультикалибратор TruCal U (DiaSys, Германия). Внутренний контроль правильности и воспроизводимости проводили с помощью контрольных сывороток TruLab N и TruLab P (DiaSys, Германия), что соответствовало рекомендациям производителей как реагентов «ДиаВетТест» (АО «ДИАКОН-ДС», Россия), так и реагентов DiaSys Diagnostic Systems GmbH (Германия). Все процедуры выполняли в соответствии с прилагаемыми инструкциями и стандартными лабораторными протоколами.

2.2.6 Гематологический анализ

Взятие (смешанной, содержащей артериальную и венозную) крови проводили с 10: 00 до 11:00 ч незамедлительно после декапитации животных (n = 25 для каждого сезона). Активных животных предварительно подвергали легкому наркозу (Zoletil, Virbac, Франция, 4мг/кг, внутримышечно). Биоматериал собирали в пластиковую капиллярную микропробирку (0,2 мл) с антикоагулянтом ^2-EDTA) для подсчета форменных элементов крови (Greiner Bio-One, Австрия). Гематологический анализ проводили непосредственно из этой пробирки: образец помещали в анализатор, и автоматический зонд отбирал аликвоту (13 мкл) для измерения. Для каждого образца выполняли три последовательных измерения, результаты которых усреднялись.

Подсчет осуществляли на ветеринарном гематологическом анализаторе ВC-2800Vet (Mindray, Китай) с помощью реагентов ДиаВетТест (Диакон ДС, Россия), согласно протоколу изготовителя. Принцип работы анализатора основан на кондуктометрическом методе (импедансный метод, принцип Культера) для подсчета и определения объема клеток (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) при прохождении их через апертуру в электрическом поле. Концентрацию гемоглобина измеряли фотометрическим методом с использованием лизирующего реагента, который разрушает эритроциты; оптическую плотность измеряли при длине волны 525 нм. Калибровку прибора осуществляли при помощи заводского набора BC-3D (Mindray, Китай).

Непосредственно измеряемыми показателями были: общее количество лейкоцитов (*109/л), лимфоциты (*109/л), моноциты (*109/л), гранулоциты (*109/л), общее количество эритроцитов (RBC, *1012/л), концентрация гемоглобина (HGB, г/л), общее количество тромбоцитов (PLT, *109/л), а также лейкоцитарная формула (в процентах и абсолютных числах) и гистограммы распределения клеток по объему. На основании прямых измерений количества клеток и концентрации гемоглобина расчетным путем получали следующие параметры:

• эритроцитарные: гематокрит (HCT, %, расчет по формуле: HCT = (RBC * MCV) / 10)), средний объем эритроцита (MCV, фл, на основе гистограммы RBC), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH, пг, MCH = HGB / RBC), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC, г/л, MCHC = (HGB / HCT) * 100), ширина распределения эритроцитов (RDW, % , коэффициент вариации по гистограмме RBC);

• тромбоцитарные: средний объем тромбоцитов (MPV, фл, на основе гистограммы), ширина распределения тромбоцитов по объему (PDW, %, геометрическое стандартное отклонение), тромбокрит (PCT, %, PCT = (PLT * MPV) / 10000).

2.2.7 Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программ Statistica 12.5.192.7 (StatSoft Inc., США) и GraphPad Prism 10.1.1 (GraphPad Software Inc., США). Проверку нормальности осуществляли с использованием теста Шапиро-Уилка. Для серии респирометрических тестов применяли однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями (one-way repeated measures ANOVA). Для дальнейшего попарного сравнения различных групп использовали апостериорный тест Тьюки (Tukey's post-hoc test). Во всех остальных экспериментах для оценки достоверности межгрупповых различий использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA). Для множественных сравнений всех групп применяли апостериорный тест Тьюки (при равенстве объемов выборок) или Тьюки-Крамера (при неравных объемах). Результаты тестов во всех случаях считали достоверными, если уровень значимости был строго меньше 0,05 (p <0,05).

Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (Хср ± SEM). Для наглядности результаты визуализированы в виде диаграмм размаха («ящики с усами»). При анализе гематологических данных использовали модификацию диаграммы Тьюки, где границы, определяющие диапазон невыбивающихся значений, соответствуют 1,5 межквартильным размахам, а выбросы показаны отдельными точками. Цифровую обработку микрофотографий гистологических срезов (не менее 5 полей зрения на срез) осуществляли с использованием некоммерческого программного обеспечения ImageJ (https://imagej.net; дата обращения: 1 апреля 2024 г.).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Биоэнергетические показатели дыхательного метаболизма

У животных, показатели которых были измерены летом в качестве контрольных, средние значения потребляемого кислорода составили 549,1 ± 41,96 мл/кг/ч, выдыхаемого углекислого газа 323,0 ± 28,82 мл/кг/ч, а выделение энергии (теплопродукция) 2,6 ± 0,15 ккал/кг/ч (рис. 7). По результатам респирометрии установлено, что осенью относительно лета у одних и тех же особей U. undulatus происходило увеличение потребления кислорода в 1,4 раза, выдыхаемого углекислого газа в 1,7 раз и выделения энергии организмом в 1,4 раза (рис. 7). Далее в торпоре (середина баута) все представленные метаболические параметры резко снизились: О2 в 5 раз, СО2 в 15 раз и теплопродукция в 11 раз.

(А)

зг

поглощение O2

(Б)

750 -I

500-

250-

вьдепение СО

2

#

пето

осень торпор

—I-1-

пето осень торпор

(В)

зг

теплопродукция

П-г

пето осень торпор

Рисунок 7. Динамика изменения метаболических параметров сусликов U. undulatus в различных

функциональных состояниях (Teplova et al, 2026)

(A) - скорость потребления кислорода (O2); (Б) - скорость продукции углекислого газа (CO2) (мл/кг/ч); и

(B) - теплопродукции (ккал/кг/ч). Данные представлены в виде диаграмм размаха. * - p <0,05 между остальными группами по сравнению с группой «лето», # - p <0,05 между группой «торпор» и группой «осень». Измерения проводили на одних и тех же особях в течение календарного года (n = 7). Однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями (one-way repeated measures ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки.

0

3.2. Морфофункциональные характеристики щитовидной железы

Результаты гистологического анализа щитовидной железы длиннохвостых сусликов и. ипёиШш представлены на рис. 8 и табл. 5. По итогам дисперсионного анализа морфофункциональные показатели железы достоверно изменялись в зависимости от

физиологического состояния особей.

Рисунок 8. Сезонные морфофункциональные изменения щитовидной железы сусликов и. ипёиШш

(Тер1оуа et а/., 2026)

(А, Б) - лето; (В, Г) - осень (Д, Е) - топор. Световая микроскопия, окрашивание гематоксилин-эозин (ядра окрашены в фиолетовый цвет; цитоплазма и коллоид - в розовый или розово-красный; эритроциты в ярко-красный). Увеличение х40 (А, В, Д) и х20 (Б, Г, Е). Черными стрелками на микропрепаратах обозначены резорбционные вакуоли, звездочками - коллоид. п = 3 для каждой группы.

Летом (рис. 8 А, Б) в структуре органа наблюдался практически гомогенный коллоид, содержащий запасы тиреоглобулина. Коллоид был окружен фолликулярными эндокриноцитами (тироцитами, рис. 8 Б) плоской формы. В осенний период (рис. 8 В, Г) в структуре коллоида происходило увеличение общей площади резорбционных вакуолей (более, чем в 3 раза по сравнению с летом). При этом количество самих фолликулов оставалось неизменным (табл. 5). Осенью стенка фолликула была представлена не только плоскими, но и цилиндрическими тироцитами. В торпидном состоянии (рис. 8 Д, Е) превалировала резорбция тиреоглобулина. Как видно из рис. 5 Е, содержимое фолликулов во время спячки было сильно израсходовано, а тироциты приобрели цилиндрическую форму. Общая площадь коллоида в торпоре уменьшилась почти в 4 раза по сравнению с осенью. Количество фолликулов также уменьшилось примерно в 3 раза по сравнению с летним и осенним периодами (табл. 5).

Таблица 5. Гистологическая морфометрия щитовидной железы сусликов U. ппёпШш в различных

функциональных состояниях (Тер1оуа et al, 2026)

Группа Количество фолликулов, шт Площадь коллоида, мкм2 Площадь вакуолей, мкм2 Содержание вакуолей в коллоиде, % Форма тироцитов

Лето 25 ± 3 59660 ± 7399 7105 ±2514 11 ± 3 плоская

Осень 24 ± 4 71019±3480 23250± 1465* 25 ± 1* плоская и цилиндрическая

Торпор 8 ± 2*# 19716±4192*# 14770 ± 2819# 44 ± 4*# цилиндрическая

Подсчет осуществляли в поле зрения (400*400 мкм, n =15 для каждой группы) с помощью некоммерческого программного обеспечения ImageJ. Значения представлены как Хср ± SEM. * -p <0,05 между остальными группами по сравнению с группой «лето», # - p <0,05 между группой «торпор» и группой «осень». Статистическая обработка: однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с попарными сравнениями по Тьюки.

3.3. Уровень тиреоидных гормонов в сыворотке крови

На рис. 9 представлены результаты количественного анализа связанных и свободных форм тиреоидных гормонов в сыворотке крови сусликов U. undulatus. Дисперсионный анализ показал, что уровни всех исследованных гормонов достоверно коррелируют с физиологическим состоянием особей. Однако при дальнейшем попарном сравнении групп изменений содержания общего Т4 (рис. 9 А) в сыворотке крови животных с лета (31,1 ± 2,4 нмоль/л) на осень (37,4 ± 2, 6 нмоль/л) установлено не было. У торпидных же сусликов (61,5 ± 8,3 нмоль/л) общий Т4 увеличивался примерно в 2 раза по сравнению с летними и осенними особями. У сусликов в торпоре (21,0 ± 3,3 пмоль/л) уровень свободного Т4 (рис. 9 Б) увеличивался в 2,3 раза по сравнению с летом (9,3 ± 0,9 пмоль/л).

100

50

(А)

общий Т4

#

—I— лето

осень

-1-

торпор

(Б)

50 -,

403020100

свободный Т4

W о

J t

15

10

(В)

общий Т3

#

15

10

-1-1-1-

лето осень торпор

(Г) свободный Т3

—I— лето

осень

—I— торпор

—I—

лето

т

т

осень торпор

Рисунок 9. Количественный анализ содержания тиреоидных гормонов в сыворотке крови сусликов U. ппёпШш в различных функциональных состояниях (Тер1оуа et al, 2026) (А) - общий Т4 (нмоль/л); (Б) - свободный Т4 (пмоль/л); (В) - общий Т3 (нмоль/л); (Г) - свободный Т3 (пмоль/л). Концентрацию гормонов определяли методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа. Данные представлены в виде в виде диаграмм размаха. * - p <0,05 между остальными группами по сравнению с группой «лето», # - <0,05 между группами «торпор» и «осень», п = 7 лето, п = 19 осень, п = 11 торпор. Статистическая обработка: однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки-Крамера.

Концентрация общего Т3 (рис. 9 В) в крови торпидных животных (8,0 ± 0,9 нмоль/л) примерно вдвое превышала уровень (в среднем 3,8 ± 0,5 нмоль/л), характерный для остальных функциональных состояний. Что касается свободного Т3 (рис. 9 Г), минимальные средние значения регистрировались у активных осенних сусликов (6,1 ± 0,4 пмоль/л), а максимальные -в торпидный период (9,1 ± 0,7 пмоль/л). При попарном сравнении достоверные различия были выявлены только между данными группами животных (уровень гормона в оцепенении превышал осенние показатели в 1,5 раза).

3.4. Биохимический анализ липидов бурой жировой ткани

Результаты дисперсионного анализа свидетельствовали о том, что концентрации холестерина и моноацилглицеридов в бурой жировой ткани сусликов U. uпdulatus, находящихся в разных функциональных состояниях, достоверно не изменялись (рис. 10). Усредненные

0

#

5

5

0

0

значения по всем сезонам составили 2,3 ± 0,2 мкг холестерина/мг бурой жировой ткани и 5,2 ± 0,6 мкг моноацилглицеридов/мг БЖТ.

4 -I

5 X

* 3-

с

:: и

(А)

холестерин

га

5 X

п

с

I

лето

осень

-1-

торпор

1086420

моноацилглицериды

(Б) га

лето

осень

-1-

торпор

Рисунок 10. Содержание холестерина и моноацилглицеридов в бурой жировой ткани сусликов U. undulatus в разных функциональных состояниях (Тер1оуа et al, 2026) (А) - концентрация холестерина (мкг липида/мг ткани); (Б) - концентрация моноацилглицеридов (мкг липида/мг ткани). Данные представлены в виде диаграмм размаха; п = 4 для каждой группы; т - по результатам статистической проверки достоверных различий не обнаружено (р > 0,05). Статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки.

Концентрации жирных кислот, ди- и триацилглицеридов в бурой жировой ткани коррелировали с физиологическим состоянием экспериментальных животных, что отражено на рис. 11. Среднее значение концентрации диацилглицеридов (рис. 11 А) снижалось в 2 раза в период осенней подготовки к гибернации (с 8,2 ± 0,5 летом до 4 ± 0,1 мкг/мг осенью ) и оставалось примерно на этом же уровне во время оцепенения. Уровень триацилглицеридов (рис. 11 Б) в буром жире сусликов снижался в осенний период в 1,7 раз (с 172,6 ± 19,8 до 102,8 ± 9,4 мкг/мг), а в торпоре почти возвращался к летним значениям. Среднее содержание жирных кислот на миллиграмм ткани (рис.11 В) возрастало в торпоре более чем в 1,5 раза по сравнению с летом и осенью (с ~ 5,3 ± 0,2 до 8,6 ± 0,3 мкг/мг).

По результатам однофакторного дисперсионного анализа было установлено, что концентрация всех измеренных фосфолипидов (ФЛ) в бурой жировой ткани U. ипёиШш достоверно изменялась в зависимости от физиологического состояния особей (рис. 12).

Концентрация общей фракции фосфолипидов в период подготовки к осенней спячке увеличивалась более чем в 2 раза (35,33 ± 1,4 мкг/мг) по сравнению с летними (16,0 ± 1,7 мкг/мг) показателями; в состоянии торпора данный показатель возрастал еще в 1,6 раза до 55,9 ± 1,6 мкг/мг ткани (рис.12 А).

0

15

га а

Г- 10

(А)

диацилглицериды

с;

а

5

800 п

2 600 ч

н |_

400-

200 н

2

(Б)

триацилглицериды

—I-1-1—

лето осень торпор

0

40

2 304

н

Ц 20

10

(В)

лето

свободные Ж К

#

*

—I— лето

*

—I— осень

—I— торпор

осень

—I— торпор

Рисунок 11. Содержание диацилглицеридов, триацилглицеридов и свободных жирных кислот в бурой жировой ткани и. ипёиШш в разных функциональных состояниях (Тер1оуа et а/., 2026). Методом тонкослойной хроматографии были получены концентрации (мкг липида/мг ткани): (А) -диглицеридов; (Б) - триглицеридов; (В) -свободных жирных кислот. Данные представлены в виде диаграмм размаха; п = 4 для каждой группы; * - р <0,05 между остальными группами по сравнению с группой «лето», # - р <0,05 между группой «торпор» и группой «осень». Статистическая обработка: однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным тестом Тьюки.

По результатам однофакторного дисперсионного анализа было установлено, что концентрация всех измеренных фосфолипидов (ФЛ) в бурой жировой ткани и. ипёиШш достоверно изменялась в зависимости от физиологического состояния особей (рис. 12).

Концентрация общей фракции фосфолипидов в период подготовки к осенней спячке увеличивалась более чем в 2 раза (35,33 ± 1,4 мкг/мг) по сравнению с летними (16,0 ± 1,7 мкг/мг) показателями; в состоянии торпора данный показатель возрастал еще в 1,6 раза до 55,9 ± 1,6 мкг/мг ткани (рис.12 А).

#

0

0

iS»

60-

40-

^ 20-

A)

общая фракция ФЛ

—в—

фосфатидилхолин

2015 105-

(Б)

лето

—I-1-

осень торпор

10

щ 8

з

¡Й ¡Й

м 6_

^ л & 4

2

Г)

кардиолипин

# *

—I-1-1—

лето осень торпор

—I-1-

осень торпор

фосфатидилэтаноламин

3-1

2-

1-

(Д)

1-Г

лето осень торпор

фосфатидилсерин

*

—I-1-1—

лето осень торпор

3 -1

2-

1-

(Е)

фосфатидилинозитол

—I-1-1—

лето осень торпор

3-1

(Ж)

сфингомиелин

х

га

2-

1-

F=8=l

0-1-1-1-Г

лето осень торпор

Рисунок 12. Содержание фосфолипидов в бурой жировой ткани сусликов U. undulatus в разных функциональных состояниях (Teplova et al., 2026) Методом тонкослойной хроматографии были получены концентрации (мкг липида/мг ткани): (A) - общей фракции фосфолипидов; (Б) - фосфатидилхолина; (В) - фосфатидилэтаноламина; (Г) - кардиолипина; (Д) - фосфатидилсерина; (Е) - фосфатидилинозитола; (Ж) - сфингомиелина. Данные представлены в виде диаграмм размаха; n = 4 для каждой группы; * - p <0,05 между остальными группами по сравнению с группой «лето», # - p <0,05 между группой «торпор» и группой «осень». Статистическая обработка: однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным тестом Тьюки.

0

0

0

0

0

Схожая тенденция была отмечена для фосфатидилхолина (ФХ) и кардиолипина (КЛ): их уровни увеличивались с лета к осени в 2,5 и 3 раза соответственно (рис.12 Б, Г). В торпоре концентрация данных фосфолипидов достигала максимума (увеличение еще в 1,3-1,5 раза). Содержание фосфатидилэтаноламина (ФЕ) и фосфатидилинозитола (ФИ) в БЖТ увеличивалось при подготовке к зимней спячке (в 2 и 2,2 раза соответственно) и оставалось повышенным в торпоре (рис.12 В, Е). Количество фосфатидилсерина (ФС) возрастало линейно от летней активности к торпидному состоянию (рис.12 Д): минимальное содержание было зафиксировано летом, а максимальное - в состоянии торпора (разница составила 2,5 раза). Содержание сфингомиелина (СФМ) в бурой жировой ткани сусликов достоверно изменялось только осенью: отмечено увеличение примерно в 2 раза по сравнению с летним периодом (рис.12 Ж).

3.5. Показатели липидного профиля крови

Для оценки липидного обмена у сусликов и. ппёпШш были измерены уровни холестерина, липазы, триацилглицеридов, жирных кислот и гидроксибутирата в сыворотке крови (рис.13). Дисперсионный анализ выявил достоверную зависимость от физиологического состояния для большинства исследуемых параметров.

Было показано, что осенью в крови изменялась только концентрация панкреатической липазы (увеличение в 2,1 раза, с 68,2 ± 7,9 до 141,3 ± 20,7 ед/л; рис.13 В). В торпоре ее содержание снижалось до летних значений. Содержание триацилглицеридов в крови достоверно не изменялось и находилось в диапазоне 1,0-1,3 ± 0,2 ммоль/л для всех исследуемых сезонов (рис.13 Б). Уровни холестерина (рис.13 А) и неэтерифицированных жирных кислот (рис. 13 Г) возрастали в торпоре в 1,4 и 2,5 раза соответственно. Наиболее значительное изменение в крови сусликов было отмечено для Р-гидроксибутирата (рис.13 Д): в состоянии торпора его содержание увеличивалось в 15 раз (с 0,3 ± 0,05 до 4,3 ± 1,0 ммоль/л).

14-|

12-

10-

С

_й 8-

ь

2 6-

2

4-

2-

0-1

(А)

холестерин

—I— лето

#

*

X

триацилглицериды

(Б) ш

35 2-

осень

-1-

торпор

"Г

в

-8-

1 лето 1 осень

-1-

торпор

4