Представленность генетических маркеров анеуплоидий плода во внеклеточной фракции крови беременных женщин тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Коростин Дмитрий Олегович

• Коростин Дмитрий Олегович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Коростин Дмитрий Олегович

Введение

1.1 Актуальность темы исследования

1.2 Цель исследования

1.3 Задачи исследования

1.4 Научная новизна

1.5 Практическая значимость

1.6 Положения, выносимые на защиту

1.7 Апробация результатов

1.8 Публикации

1.9 Личный вклад автора

1.10 Структура и объем работы

2. Обзор литературы: современные способы определения анеуплоидий плода на

ранних сроках беременности

2.1 Введение

2.2 Современный скрининг и диагностика

2.3 Подходы к оценке генома плода

2.3.1 Фетальные клетки

2.3.2 Фетальная РНК

2.3.3 Внеклеточная фетальная ДНК

2.4 Внеклеточная ДНК

2.4.1 Происхождение внеклеточной фетальной ДНК

2.4.2 Характеристики внфДНК: размеры и концентрация в плазме

2.5 Неинвазивный пренатальный скрининг с помощью NGS

2.5.1 Оценка доли внеклеточной фетальной ДНК

2.5.2 Валидация НИПС

2.5.3 Возможности НИПС: выявление микроделеций, моногенных заболеваний

2.5.4 Ложноположительные и ложноотрицательные результаты НИПС

2.6 Клинические рекомендации по НИПС в мире

2.6.1 Великобритания

2.6.2 Швеция

2.6.3 Франция

2.6.4 США

2.6.5 Россия

2.7 Применение искусственных химерных молекул ДНК

3. Материалы и методы экспериментальных исследований

3.1 Материалы

3.1.1 Формирование критериев отбора для контрольной выборки

3.1.2 Сбор контрольной выборки образцов биоматериала

3.2 Методы

3.2.1 Отделение плазмы крови

3.2.2 Выделение внДНК

3.2.3 Подготовка библиотек химерных ДНК, состоящих из фрагментов внДНК smash

3.2.4 Подготовка библиотек ДНК для определения доли внфДНК amplifet

3.2.5 Секвенирование

3.2.6 Биоинформатическая обработка

3.2.7 Статистическая обработка

4. Результаты

4.1 Характеристики контрольной выборки образцов биоматериала

4.2 Выделение внДНК

4.3 Подготовка и секвенирование библиотек smash

4.4 Подбор ОНП для библиотек amplifet

4.5 Результаты секвенирования образцов amplifet

4.6 Определение минимального количества фрагментов в образце

4.7 Фильтрация образцов контрольной выборки

4.8 Расчет чувствительности и специфичности

4.9 Расчет прогностических значимостей

4.10 Определение пола плода

5. Обсуждение

6. Выводы

7. Практические рекомендации

8. Перспективы дальнейшей разработки темы

Основные обозначения и сокращения

Список литературы

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Благодарности

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Представленность генетических маркеров анеуплоидий плода во внеклеточной фракции крови беременных женщин»

1.1 Актуальность темы исследования

Неинвазивный пренатальный скрининг (НИПС) анеуплоидий плода на основе анализа внеклеточной ДНК беременной женщины - группа подходов, в основном использующих технологии высокопроизводительного секвенирования ДНК, которая появилась в 2012 году. НИПС существенно превосходит классические методы скрининга анеуплоидий по чувствительности и специфичности, используемые в клинической практике. Поэтому количество проводимых неинвазивных тестов с каждым годом растет по всему миру, включая Россию. Применение НИПС снижает долю ложноотрицательных результатов, из-за которых происходит рождение детей с серьезными наследственными нарушениями, которые приводят к тяжелым социальным и экономическим проблемам как в рамках отдельной семьи, так и целого государства. Ложноположительные результаты комбинированного скрининга также имеют негативный эффект: женщин направляют на проведение инвазивной пренатальной диагностики (ИД). Рынок НИПС в значительной степени коммерци-ализован, и услуги, в частности, в России проводятся либо отправкой образцов за рубеж, либо путем трансфера технологий иностранных компаний в отечественных лабораториях.

С другой стороны, развитие технологий высокопроизводительного секвениро-вания имеет тенденцию к увеличению длины единичных прочтений (ридов), особенно среди приборов мономолекулярного секвенирования. Однако, использование этого преимущества в случае НИПС ограничено, так как внеклеточная ДНК представляет собой фрагментированные молекулы длиной 140-160 п.о.

Для однозначного картирования рида на референсном геноме достаточно 3040 п.о., поэтому в первом приближении секвенирование внДНК от начала до конца

не имеет практического смысла. Значит, если случайно разрезать внДНК до соответствующего диапазона длин, а затем соединить фрагменты случайным образом в длинные химерные молекулы, можно будет использовать последние достижения платформ высокопроизводительного секвенирования наиболее полно в случае НИПС.

Таким образом, разработка нового варианта НИПС с использованием соответствующей пробоподготовки и биоинформатического алгоритма позволит эффективно осуществлять скрининг с учетом актуальных технологических достижений в области секвенирования ДНК.

1.2 Цель исследования

Разработать методику высокоэффективного скрининга анеуплоидий плода беременных по анализу циркулирующей в кровотоке матери внеклеточной ДНК с помощью высокопроизводительного секвенирования длинных химерных ридов.

1.3 Задачи исследования

1. Собрать коллекцию образцов венозной крови беременных, относящихся к группе высокого риска анеуплоидии по результатам скрининга I триместра и направленных на инвазивную диагностику (контрольная выборка).

2. Разработать методику конструирования библиотек ДНК, состоящих из длинных химерных ридов фрагментов внеклеточной ДНК (smash).

3. Разработать панель однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) для определения доли внеклеточной фетальной ДНК во фракции внеклеточной ДНК беременной.

4. Разработать методику конструирования библиотек ДНК для определения доли фетальной ДНК во фракции внеклеточной ДНК беременной (amplifet).

5. Разработать методику биоинформатической и статистической обработки результатов высокопроизводительного секвенирования для определения кариотипа плода по 13, 18 и 21 хромосомам, пола плода и доли фетальной ДНК во фракции внеклеточной ДНК беременной.

6. Провести высокопроизводительное секвенирование smash и amplifet библиотек ДНК, сконструированных из образцов контрольной выборки.

7. Провести определение значений чувствительности, специфичности и прогностических значимостей методики.

1.4 Научная новизна

Впервые разработана методика скрининга анеуплоидий плода беременных по анализу циркулирующей" в кровотоке матери внеклеточной" ДНК с помощью высокопроизводительного секвенирования длинных химерных ридов, включающая в себя лабораторный протокол пробоподготовки образцов биоматериала, в рамках которого также проводится подготовка библиотеки для оценки доли внеклеточной фетальной ДНК, а также биоинформатический и статистический протоколы для анализа данных.

1.5 Практическая значимость

Разработана и внедрена в лабораторную практику методика скрининга ане-уплоидий плода беременных по анализу циркулирующей" в кровотоке матери

внеклеточной" ДНК с помощью высокопроизводительного секвенирования длинных химерных ридов, включающая в себя лабораторный протокол пробоподго-товки образцов биоматериала, в рамках которого также проводится подготовка библиотеки для оценки доли внеклеточной фетальной ДНК, а также биоинформа-тический и статистический протоколы для анализа данных. Благодаря этому подходу значительно повышается экономическая целесообразность использования увеличивающейся в последнее время длины единичных прочтений (ридов) высокопроизводительных секвенаторов последних поколений. Методика запатентована и, при получении регистрационного удостоверения на медицинское изделие Рос-здравнадзора, может быть использована в рутинной практике клинико-диагностических лабораторий.

Методика может стать основой для разработки новых модификаций подходов кариотипирования высокого разрешения, осуществляемого с помощью высокопроизводительных секвенаторов, замещающих ставший уже классическим хромосомный микроматричный анализ: преимплантационное генетическое тестирование хромосомных аномалий, преимплантационное генетическое тестирование моногенных заболеваний, пренатальный скрининг хромосомных аномалий.

Получен патент «Способ определения кариотипа плода беременной женщины на основании секвенирования гибридных прочтений, состоящих из коротких фрагментов внеклеточной ДНК» ^Ш717023С1).

Разработанные подходы могут быть использованы в учебном процессе при подготовке специалистов медицинского и биологического профиля.

Экономическая целесообразность использования разработанной методики превышает показатели уже существующих на рынке технологий НИПС. Благодаря этому внедрение методики НИПС в качестве более эффективной альтернативы комбинированному скринингу значительно облегчается.

1.6 Положения, выносимые на защиту

Методика конструирования длинных химерных ридов из фрагментов внеклеточной ДНК позволяет выявлять анеуплоидии плода по 13, 18 и 21 хромосомам у беременных с высоким риском анеуплоидии по результатам комбинированного скрининга на сроках гестации 11-25 недель.

Методика подготовки библиотек ДНК с использованием мультиплексной ПЦР на ОНП, отобранные по ряду критериев, позволяет проводить оценку доли внеклеточной фетальной ДНК в образце внеклеточной ДНК, выделенной из плазмы крови беременной.

Разработанные биоинформатический и статистический алгоритмы позволяют проводить совместный анализ результатов высокопроизводительного секвенирова-ния библиотек ДНК для получения надежной информации о наличии анеуплоидий у плода по хромосомам интереса.

1.7 Апробация результатов

Результаты работы были представлены и обсуждены на 2 российских конференциях: VII Всероссийской' научно-практической" конференции по геномному се-квенированию и редактированию (Москва, 20-21 мая 2020); Всероссийской онлайн конференции с международным участием «Геномная медицина в пренатальной диагностике, генетическом паспорте и в генной терапии» (Санкт-Петербург, 12-13 ноября 2020).

Диссертация апробирована на заседании апробационной комиссии НИИ Трансляционной медицины ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России 6 октября 2020 года, протокол №2 10 и рекомендована к защите на соискание

ученой степени кандидата биологических наук по специальности «03.02.07 - генетика».

1.8 Публикации

Материалы диссертации изложены в 8 работах, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК для опубликования научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук, а также 2 тезиса докладов в сборниках трудов конференций, получен 1 патент.

1.9 Личный вклад автора

Автором проведена систематизация литературных данных по теме диссертации, самостоятельно разработаны дизайн и программа исследования.

Автору принадлежит решающая роль в сборе контрольной выборки образцов, разработке стратегии экспериментов, отработке методик и обобщении полученных результатов. Анализ, статистическая обработка полученных данных проведены автором самостоятельно в соответствии с правилами и обеспечивают достоверность результатов и сформулированных выводов. Описание и публикация результатов исследований выполнены автором лично.

1.10 Структура и объем работы

Работа изложена на 126 страницах печатного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов экспериментальных исследований, результатов, обсуждения, выводов, списка использованной литературы, а также 4 приложений с развернутыми таблицами по полученным результатам. Работа включает 17 рисунков и 11 таблиц. Указатель литературы содержит 164 библиографических источника, в том числе 6 отечественных и 158 иностранных публикаций.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: СОВРЕМЕННЫЕ СПОСОБЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНЕУПЛОИДИЙ ПЛОДА НА РАННИХ СРОКАХ

БЕРЕМЕННОСТИ

2.1 Введение

Пренатальный скрининг применяется для выявления беременных женщин с высоким риском различных нарушений развития плода, например, анеуплоидий, дефектов формирования нервной трубки, врожденных пороков сердца и ауто-сомно-рецессивных заболеваний. В клинической практике он используется более 30 лет. Точность результатов исследования на ранних сроках важна по нескольким причинам: во-первых, информация о повышенном риске наличия патологии у плода позволяет направлять беременных на целенаправленную диагностику патологии; во-вторых, информация о патологии позволяет выработать подходящий курс лечения сразу после рождения ребенка.

Несмотря на редкость каждого отдельного заболевания, имеющего генетические причины, совокупная частота встречаемости наследственных болезней среди новорожденных составляет 1%, а 20-30% неонатальных смертей являются следствием генетических нарушений [7].

Ведение и терапия пациентов с генетическими заболеваниями занимает от 20% [8] до 60% ресурсов педиатрических отделений госпиталей [9].

В связи с этим существует потребность в эффективной и точной диагностике генетических нарушений на самых ранних стадиях развития ребенка - в начале беременности.

Анеуплоидия - вариант кариотипа, при котором общее число хромосом не кратно их гаплоидному набору. В норме диплоидный кариотип человека состоит из 46 хромосом или их 23 пар. При анеуплоидии кариотип может быть представлен

45, 47 и другими вариантами количества хромосом. Анеуплоидии хромосом генома плода являются одной из основных (35%) причин спонтанных выкидышей [10] и встречаются с частотой до 0,3% среди всех родившихся детей [11; 12]. Наиболее часто среди новорожденных встречаются анеуплоидии +13, +18, +21, XXX и XXY. Это не говорит о невозможности анеуплоидии по другим хромосомам, но карио-типы выше приводят к вынашиванию ребенка и его рождению. Лишь дети с +21 (синдром Дауна - СД) жизнеспособны и доживают до старости, дети с +13 (синдром Патау) или +18 (синдром Эдвардса) кариотипами характеризуются существенными нарушениями физического и умственного развития и ранней смертностью [13]. В целом анеуплоидии половых хромосом выглядят менее тяжелыми по сравнению с аутосомными, в первую очередь по причине хорошо сохранного интеллекта.

Синдром Дауна является наиболее распространенным типом анеуплоидий плода и встречается с частотой 1:800 рождений [14]. Известно, что риск анеуплои-дии коррелирует с возрастом матери, причем с 34 лет кривая риска приобретает экспоненциальный характер, приближаясь к частоте 1/35 у женщин старше 40 лет [15].

2.2 Современный скрининг и диагностика

До 80-х гг. XX в. возраст матери был единственным надежным критерием оценки риска наличия анеуплоидии, поэтому всем беременным старше 35 лет рекомендовалось пройти инвазивные диагностические тесты, определяющие карио-тип плода прямым способом. Показанием для инвазивной диагностики у более молодых беременных была лишь семейная история [16].

Последовательное внедрение анализа концентраций биохимических маркеров плодового и плацентарного происхождения (альфа-фетопротеин (АФП),

неконъюгированный эстриол (uE3), хорионический гонадотропин (ß-ХГЧ) и инги-бин А) и ультразвуковых исследований с начала 80-х гг. XX в увеличило показатель чувствительности скринингового подхода до 75-80% [14; 17].

В настоящее время наиболее совершенным скринингом I триместра является так называемый комбинированный тест, представленный в 1997 году [18]. В метрики комбинированного теста входят возраст матери, измерение толщины воротникового пространства, визуализация носовых костей плода, нервной трубки и концентрации биохимических маркеров в сыворотке крови - свободного хориониче-ского гонадотропина человека (ß-ХГЧ) и ассоциированного с беременностью про-теина-А плазмы (РАРР-А). Было показано, что чувствительность такого скрининга достигает 90% для СД с 5% ложноположительных результатов [19].

Пациенты, отнесенные по результатам комбинированного скрининга к группе высокого риска, направляются на процедуру биопсии ворсин хориона. Пациенты с низким и средним риском направляются на скрининг II триместра (измерение концентраций АФП, uE3 и ß-ХГЧ). Если риск по результатам двух скринингов высокий, таким пациентам рекомендуется сделать амниоцентез во II триместре [20].

Способом постановки однозначного диагноза наследственных патологий плода сейчас являются только подходы, основанные на прямом анализе клеток плода. Для их проведения необходим забор биоматериала: ворсин хориона (на самом деле имеющих плацентарное происхождение) или амниотической жидкости -амниоцентез. Первый проводится на 10-12 неделе гестации, второй - 15-18 неделе [21]. Полученный биоматериал анализируется с помощью ряда методов: QF-PCR, MLPA, G-banding, FISH [22]. Обследование хорионических ворсинок проводят на 10-13-ой неделях гестации, амниоцентез - во втором триместре беременности, обычно после 15-ой недели гестации, а кордоцентез на 22-24-ой неделях беременности [23; 1]. После забора образца проводят цитогенетический анализ, используя метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), при помощи ДНК-микрочипов (DNA microarray) или используя метод количественной флуоресцентной ПЦР (QF

PCR), который включает этапы амплификации, детекции и анализа специфической ДНК-последовательности [24]

2.3 Подходы к оценке генома плода 2.3.1 Фетальные клетки

Несмотря на косвенные подтверждения наличия фетальных клеток в кровотоке матери, впервые наличие метафазных пластинок с генотипом 46,XY было показано цитогенетиками в 1969 году [25]. Вскоре выяснилось, что в русле матери присутствуют плодные клетки разных типов. К сожалению, оказалось, что эти клетки могут циркулировать еще в течение достаточно продолжительного срока, вплоть до 27 лет после родов [26]. Поэтому использовать ядерные фетальные в качестве диагностического подхода затруднительно, так как клетки плодов от предыдущих успешных беременностей, невынашиваний, а также микрохимеризм матери приведут к ложным результатам.

Среди всех типов фетальных клеток в кровотоке матери наиболее подходящими для диагностики казались фетальные ядерные красные клетки крови (Fetal nucleated red blood cells, FNRBC), так как они имеют ограниченный и небольшой срок существования и несут на себе специфические маркеры, которые могут использоваться при сортировке клеток [27; 28]. Но к настоящему времени надежной и воспроизводимой в несвязанных исследованиях технологии обогащения FNRBC не описано. Еще одним недостатком работы с фетальными клетками является их низкая концентрация в материнском русле - порядка 1 клетки на 1 мл крови.

2.3.2 Фетальная РНК

В 2000 году были обнаружены циркулирующие в кровотоке матери мРНК, имеющие плацентарное происхождение [29]. мРНК стала еще одним потенциальным типом материала для неинвазивной диагностики. Как и внфДНК, внфРНК характеризуется быстрым периодом полувыведения (~16 минут) и пропадает из кровотока матери в течение пары часов после родов. В 2007 году было опубликована методика выявления анеуплоидии по 21 хромосоме, основанная на использовании цифровой ПЦР [30], выявляющей несбалансированность долей ОНП в мРНК гена PLAC4, локализованного на 21 хромосоме и экспрессирующегося в плаценте. В исследовании было успешно выявлено 90% образцов с трисомией по 21 хромосоме и исключено 96,5% случаев эуплоидных плодов.

2.3.3 Внеклеточная фетальная ДНК

В 1997 году было показано, что внеклеточная фетальная ДНК преодолевает плацентарный барьер и циркулирует в кровотоке матери [31]. На сегодня именно на анализе внфДНК основаны все методы НИПС, что связано с рядом причин:

1. В крови матери циркулирует более-менее равномерно представленный геном плода [32]

2. Доля внфДНК составляет до 10% всей внДНК в актуальный для анализа период гестации

3. внДНК более устойчива, чем внРНК. С ней проще работать.

4. Влияние материнского микрохимеризма, как правило, несущественно по сравнению с долей фетальной ДНК

5. внфДНК происходит из проходящих апоптоз клеток синцитиотрофобласта, поэтому внфДНК быстро перестает циркулировать после родов, что позволяет использовать внфДНК как специфический для каждой беременности маркер [33; 34]

2.4 Внеклеточная ДНК

2.4.1 Происхождение внеклеточной фетальной ДНК

Внеклеточная ДНК плода может быть обнаружена современными методами в плазме крови матери, начиная с 4-й недели беременности, при этом содержание ее возрастает на протяжении всего гестационного периода, достигая максимального пика в последние 8 недель, и резко снижается практически до нуля в первые часы после родоразрешения [35; 36; 37].

Существует много предположений о том, как фетальная ДНК попадает в кровоток матери. Одной из гипотез являлся путь транспорта через фетоплацентарный барьер фетальных клеток плода, которые быстро разрушаются иммунной системой матери, и происходит прямой выброс молекул ДНК плода в кровь матери, однако было убедительно показано плацентарное происхождение внфДНК [38; 39].

In vitro подтверждения происхождения внфДНК из плаценты

В настоящее время многие авторы подтверждают, что источником внеклеточной ДНК плода в материнском кровотоке являются клетки трофобласта плаценты. На клеточном уровне плацента является динамическим органом. Происходит постоянное обновление ворсистого трофобласта (см. Рисунок 1) [40].

Рисунок 1. Строение фетоплацентарного барьера. Материнская кровь течет в относительно открытом межворсинчатом пространстве. Клетки трофобласта формируют фетоплацентарный барьер между кровеносной системой матери и кровеносной системой плода. У человека барьер состоит из синцитиотрофобласта, который контактирует непосредственно с материнской кровью. В первом триместре у женщин также определяется реплицированный слой клеток цитотро-фобласта под слоем синцитиотрофобласта [2].

Как описывают Huppertz и Kingdom, в плаценте существует физиологический цикл апоптоза, который начинается с пролиферации и дифференциации цитотро-фобласта [41]. За этим следует слияние цитотрофобласта с синцитиотрофобластом, дальнейшая дифференциация и экструзия апоптотического материала. При нормальных беременностях, несколько граммов плацентарного материала ежедневно проникают в кровоток матери, не вызывая воспаления.

Bischoff et al. отсортировали апоптотические тела, выделенные из плазмы беременных женщин и, используя электронную микроскопию, показали, что эти тела содержат нуклеосомы и хроматин [36].

Так, Tjoa et al. протестировали гипотезу о том, что высвобождение плодной ДНК происходит из синцитиотрофобласта после индукции апоптоза [42]. Были созданы органотипические культуры ворсин плаценты (эксплантов), которые культивировали в нормоксических условиях (10% кислорода) в течение 20 часов, в гипо-ксических условиях (0,5% кислорода) в течение 1 часа с последующей реоксигена-цией, индуцируя тем самым апоптоз. Было отмечено значительное увеличение

концентрации свободной ДНК гена бета-глобина в супернатанте через 20 часов в культуре, подвергавшейся гипоксии-реоксигенации - это коррелировало с более интенсивным иммуногистохимическим окрашиванием каспазы 3, локализованной в синцитиотрофобласте, что указывало на активные процессы апоптоза.

Дополнительные исследования in vitro показали непосредственно плацентарное происхождение внфДНК. Gupta et al. провели исследование, в котором они выделили микрочастицы синцитиотрофобласта из плацентарной ткани [43]. Микрочастицы - это гетерогенная популяция покрытых оболочкой везикул микроскопических размеров, включающих субклеточные белковые молекулы [3]. Они высвобождаются in vivo в процессе синтеза синцитиотрофобласта [41]. Фетальная ДНК была обнаружена и внутри полученных микрочастиц, и в свободном виде в куль-туральной жидкости эксплантов [43]. Эти результаты хорошо коррелируют с ранее полученными клиническими данными Lo и Bischoff об обнаружении внфДНК в материнской плазме как внутри микрочастиц, так и в виде свободно циркулирующих молекул [31; 36].

In vivo подтверждения происхождения внфДНК из плаценты

ВнфДНК была обнаружена в случаях анэмбрионической беременности, при которой отсутствует плод и присутствует только плацентарная ткань [44]. Известно, что внеклеточная фетальная ДНК обнаруживается уже на первых неделях развития плода (у 80% беременных женщин она обнаруживается на 28-й день после зачатия) [39]. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фетальная ДНК появляется в крови матери раньше времени формирования системы кровообращения плода. Также внфДНК в крови матери удавалось детектировать до установления плацентарного кровообращения [45].

Некоторые из наиболее убедительных доказательств плацентарного происхождения внфДНК приводятся в клинических исследованиях патологий беременности. Например, было отмечено относительное увеличение внфДНК в случае аномально глубокой имплантации плаценты в миометрий (placenta increta) [46; 47]. В

нормальных условиях внфДНК быстро выводится из организма и не обнаруживается уже спустя несколько часов после родов [48]. В случаях после проведения терапевтического аборта, при котором вытеснение плаценты является неполным, все еще можно обнаружить внфДНК [49].

Faas et al. сообщили о беременности, при которой слой цитотрофобласта имел кариотип 45X, хотя мезенхимальная ткань плаценты имела нормальный кариотип 46,XX [55]. ВнфДНК в материнской плазме также исключительно имела кариотип 45X, что является еще одним доказательством происхождения внфДНК из тро-фобласта.

2.4.2 Характеристики внфДНК: размеры и концентрация в плазме

Размеры внфДНК

Доказано, что в плазме крови беременных женщин циркулируют более длинные молекулы ДНК, чем в плазме небеременных женщин. При этом молекулы фе-тальной ДНК в целом короче, чем материнской ДНК, и более фрагментированы [56; 57]. Различия в размерах фрагментов внеклеточной ДНК матери и плода авторы объясняют тем, что механизмы, ответственные за высвобождение материнской и фетальной ДНК в кровоток матери отличаются [58; 59].

В первом из исследований, посвященных проблеме определения размеров внфДНК и внеклеточной материнской ДНК, Chan et al. амплифицировали участки генов LEP и SRYразных размеров: от 107 до 524 пар оснований для гена SRY на Y-хромосоме плода и от 105 до 798 п.о. для гена LEP (лептина), который является общим для генома матери и плода [56]. Проведя серию анализов ПЦР в реальном времени, исследователи смогли измерить относительные концентрации различных фрагментов материнской и фетальной внеклеточной ДНК. Их исследование показало, что большинство ампликонов внфДНК были короче 193 п.о., и редко больше

313 п.о., в то время как молекулы ДНК длиной 500-700 п.о. составляют не более 5 % ДНК плода, а молекулы большего размера практически не определяются. При этом 57% ампликонов внеклеточной материнской ДНК были больше 201 п.о.

В другом исследовании, Li et al. фракционировали внДНК электрофорезом в агарозном геле, и затем определяли размеры наиболее ярких дискретных на геле фрагментов с помощью ПЦР в реальном времени [60]. Это исследование показало, что фрагменты внфДНК, в целом меньше 300 п.о., тогда как фрагменты материнской внеклеточной ДНК значительно больше. Так, исследователи пришли к заключению, что этот подход может быть использован для селективного обогащения фрагментов внфДНК (примерно до 30-50% от общей ДНК), тем самым позволяя проводить генотипирование плода и выявлять различные мутации.

В следующем исследовании, Fan et al. использовали технологию секвенирова-ния следующего поколения для определения размеров внДНК у беременных женщин [61]. Главной задачей их исследования было проведение парноконцевого (англ. paired-end, PE) секвенирования всей фракции внеклеточной ДНК в материнской плазме крови и затем использование биоинформатических методов анализа полученных коротких прочтений для фракционирования внДНК. Их данные показали, что большинство фрагментов внДНК имеют длину приблизительно 162 п.о. и редко превышают 340 п.о. Размер внфДНК, определенный по последовательностям Y-хромосомы, редко превышает 250 п.о., а основная доля фрагментов имеет размер до 150 п.о. Фрагментов размером более 1 т.п.о. было получено очень мало. На основе этой оценки авторы пришли к выводу, что, хотя фракционирование по размеру внДНК может успешно применяться для обогащения фрагментов внфДНК, как показал Li et al., оно не приводит к резкому увеличению чувствительности методов, таких как NGS, определяющих длину фрагментов in situ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Коростин Дмитрий Олегович, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Коротеев А. Л. Инвазивные вмешательства в пренатальной диагностике наследственных и врожденных болезней //Журнал акушерства и женских болезней. - 2007. - Т. 56. - №. 1.

2. Румянцев А. Г. и др. Клиническое значение фетального микрохимеризма у матери //Гены и клетки. - 2012. - Т. 7. - №. 2.

3. Воронцова Е. В., Горева О. Б., Перепечаева М. Л. Биогенез и характеристика микровезикул опухолевого происхождения //Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2013. - Т. 11. - №. 2. - С. 144-151

4. Информационно-методическое письмо Минздрава РФ от 19.03.2015 №154/607. URL: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_177689/

5. Сухих Г. Т. и др. Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий плода по крови матери методом высокопроизводительного секвенирования (Клинические рекомендации) //Акушерство и гинекология. - 2016. - №. 6. - С. 322.

6. Васильев А. Ю. Анализ данных лучевых методов исследования на основе принципов доказательной медицины: Учеб. пос. - 2008.

7. Berry R. J. et al. Birth weight-specific infant mortality due to congenital anomalies, 1960 and 1980 //Public Health Reports. - 1987. - Т. 102. - №. 2. - С. 171.

8. Kumar P. et al. Prevalence and patterns of presentation of genetic disorders in a pediatric emergency department //Mayo Clinic Proceedings. - Elsevier, 2001. - Т. 76. - №. 8. - С. 777-783.

9. McCandless S. E., Brunger J. W., Cassidy S. B. The burden of genetic disease on inpatient care in a children's hospital //The American Journal of Human Genetics. -2004. - Т. 74. - №. 1. - С. 121-127.

10. Hassold T., Hall H., Hunt P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going //Human molecular genetics. - 2007. - T. 16. - №. R2. - C. R203-R208.

11. Driscoll D. A., Gross S. Prenatal screening for aneuploidy //New England Journal of Medicine. - 2009. - T. 360. - №. 24. - C. 2556-2562.

12. Nagaoka S. I., Hassold T. J., Hunt P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem //Nature Reviews Genetics. - 2012. - T. 13. - №. 7. - C. 493-504.

13. Peroos S. et al. Longevity and Patau syndrome: what determines survival? //Case Reports. - 2012. - T. 2012. - C. bcr0620114381.

14. Ehrich M. et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting //American journal of obstetrics and gynecology. - 2011. - T. 204. - №. 3. - C. 205. e1-205. e11.

15. Morris J. K., Mutton D. E., Alberman E. Revised estimates of the maternal age specific live birth prevalence of Down's syndrome //Journal of medical screening. -2002. - T. 9. - №. 1. - C. 2-6.

16. Buckley F., Buckley S. Wrongful deaths and rightful lives-screening for Down syndrome //Down Syndrome Research and Practice. - 2008. - T. 12. - №. 2. - C. 7986.

17. Rozenberg P. et al. Screening for Down syndrome using first-trimester combined screening followed by second-trimester ultrasound examination in an unselected population //American journal of obstetrics and gynecology. - 2006. - T. 195. - №. 5. -C. 1379-1387.

18. Wald N. J., Hackshaw A. K. Combining ultrasound and biochemistry in first -trimester screening for Down's syndrome //Prenatal Diagnosis: Published in Affiliation With the International Society for Prenatal Diagnosis. - 1997. - T. 17. - №. 9. - C. 821-829.

19. Sillence K. A. et al. Non-invasive screening tools for Down's syndrome: a review //Diagnostics. - 2013. - T. 3. - №. 2. - C. 291-314.

20. Nicolaides K. H. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks //Prenatal diagnosis. - 2011. - T. 31. - №. 1. - C. 7-15.

21. Olney R. S. et al. Chorionic villus sampling and amniocentesis: recommendations for prenatal counseling //MMWR Recomm Rep Centers for Disease Control and Prevention. - 1995. - T. 44. - C. 1-12.

22. Choy K. W. et al. Diagnostic accuracy of the BAC s - on - Beads™ assay versus karyotyping for prenatal detection of chromosomal abnormalities: a retrospective consecutive case series //BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology. -2014. - T. 121. - №. 10. - C. 1245-1252.

23. ACoP B. ACOG Practice Bulletin No. 77: screening for fetal chromosomal abnormalities //Obstet Gynecol. - 2007. - T. 109. - №. 1. - C. 217-27.

24. Stembalska A. et al. Prenatal diagnosis—principles of diagnostic procedures and genetic counseling //Folia histochemica et cytobiologica. - 2007. - T. 45. - №. I. - C. 11-16.

25. Walknowska J., Conte F. A., Grumbach M. M. Practical and theoretical implications of fetal/maternal lymphocyte transfer //The Lancet. - 1969. - T. 293. - №. 7606.

- C. 1119-1122.

26. Bianchi D. W. et al. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1996. -T. 93. - №. 2. - C. 705-708.

27. Bianchi D. W. Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis //British journal of haematology. - 1999. - T. 105. - №. 3. - C. 574-583.

28. Choolani M., Mahyuddin A. P., Hahn S. The promise of fetal cells in maternal blood //Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. - 2012. - T. 26.

- №. 5. - C. 655-667.

29. Poon L. L. M. et al. Presence of fetal RNA in maternal plasma //Clinical chemistry.

- 2000. - T. 46. - №. 11. - C. 1832-1834.

30. Lo Y. M. D. et al. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection //Nature medicine. - 2007. - Т. 13. - №. 2. - С. 218-223.

31. Lo Y. M. D. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum //The lancet. - 1997. - Т. 350. - №. 9076. - С. 485-487.

32. Lo Y. M. D. et al. Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus //Science translational medicine. - 2010. -Т. 2. - №. 61. - С. 61ra91-61ra91.

33. Lo Y. M. D. et al. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma //The American Journal of Human Genetics. - 1999. - Т. 64. - №. 1. - С. 218-224.

34. Van der Schoot C. E. et al. Non-invasive antenatal RHD typing //Transfusion clinique et biologique. - 2006. - Т. 13. - №. 1-2. - С. 53-57.

35. Lo Y. M. D. et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma //New England Journal of Medicine. - 1998. - Т. 339. - №. 24. - С. 1734-1738.

36. Bischoff F. Z., Lewis D. E., Simpson J. L. Cell-free fetal DNA in maternal blood: kinetics, source and structure //Human reproduction update. - 2005. - Т. 11. - №. 1. -С. 59-67.

37. Curnow K. J. et al. Clinical experience and follow-up with large scale single-nu-cleotide polymorphism-based noninvasive prenatal aneuploidy testing //American journal of obstetrics and gynecology. - 2014. - Т. 211. - №. 5. - С. 527. e1-527. e17.

38. Ishihara N. et al. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsia or intrauterine growth retardation //American journal of obstetrics and gynecology. - 2002. - Т. 186. - №. 1. - С. 158-166.

39. Farina A. et al. Testing normality of fetal DNA concentration in maternal plasma at 10-12 completed weeks' gestation: a preliminary approach to a new marker for genetic screening //Prenatal Diagnosis: Published in Affiliation With the International Society for Prenatal Diagnosis. - 2002. - Т. 22. - №. 2. - С. 148-152.

40. Wong F. C. K., Lo Y. M. D. Prenatal diagnosis innovation: genome sequencing of maternal plasma //Annual review of medicine. - 2016. - T. 67. - C. 419-432.

41. Huppertz B., Kingdom J. C. P. Apoptosis in the trophoblast—role of apoptosis in placental morphogenesis //Journal of the Society for Gynecologic Investigation. -2004. - T. 11. - №. 6. - C. 353-362.

42. Tjoa M. L. et al. Trophoblastic oxidative stress and the release of cell-free fetoplacental DNA //The American journal of pathology. - 2006. - T. 169. - №. 2. - C. 400-404.

43. Gupta A. K. et al. Detection of fetal DNA and RNA in placenta-derived syncytio-trophoblast microparticles generated in vitro //Clinical chemistry. - 2004. - T. 50. -№. 11. - C. 2187-2190.

44. Alberry M. et al. Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast //Prenatal Diagnosis: Published in Affiliation With the International Society for Prenatal Diagnosis. - 2007. - T. 27. - №. 5. -C. 415-418.

45. Guibert J. et al. Kinetics of SRY gene appearance in maternal serum: detection by real time PCR in early pregnancy after assisted reproductive technique //Human Reproduction. - 2003. - T. 18. - №. 8. - C. 1733-1736.

46. Sekizawa A. et al. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta //Clinical chemistry. - 2002. - T. 48. - №. 2. - C. 353-354.

47. Jimbo M. et al. Placenta increta: postpartum monitoring of plasma cell-free fetal DNA //Clinical chemistry. - 2003. - T. 49. - №. 9. - C. 1540-1541

48. Wataganara T. et al. Changes of cell-free fetal DNA in maternal plasma after elective termination of pregnancy //Clinical chemistry. - 2005. - T. 51. - №. 1. - C. 217219

49. Yu S. C. et al. High-resolution profiling of fetal DNA clearance from maternal plasma by massively parallel sequencing //Clinical chemistry. - 2013. - T. 59. - №. 8. - C. 1228-1237

50. Kalousek D. K., Dill F. J. Chromosomal mosaicism confined to the placenta in human conceptions //Science. - 1983. - T. 221. - №. 4611. - C. 665-667.

51. Gardner R. J. M. K., Sutherland G. R., Shaffer L. G. Chromosome abnormalities and genetic counseling. - OUP USA, 2011. - №. 61.

52. Wang Y. et al. Maternal mosaicism is a significant contributor to discordant sex chromosomal aneuploidies associated with noninvasive prenatal testing //Clinical chemistry. - 2014. - T. 60. - №. 1. - C. 251-259.

53. Bianchi D. W. Cherchez la femme: maternal incidental findings can explain discordant prenatal cell-free DNA sequencing results //Genetics in Medicine. - 2018. - T. 20. - №. 9. - C. 910-917.

54. Hartwig T. S. et al. Discordant non - invasive prenatal testing (NIPT)-a systematic review //Prenatal diagnosis. - 2017. - T. 37. - №. 6. - C. 527-539.

55. Faas B. H. W. et al. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using massively parallel sequencing-by-ligation and evidence that cell-free fetal DNA in the maternal plasma originates from cytotrophoblastic cells //Expert opinion on biological therapy. - 2012. - T. 12. - №. sup1. - C. S19-S26.

56. Chan K. C. A. et al. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma //Clinical chemistry. - 2004. - T. 50. - №. 1. - C. 88-92.

57. Zimmermann B. et al. Optimized real-time quantitative PCR measurement of male fetal DNA in maternal plasma //Clinical chemistry. - 2005. - T. 51. - №. 9. - C. 15981604.

58. van Wijk I. J. et al. Detection of apoptotic fetal cells in plasma of pregnant women //Clinical chemistry. - 2000. - T. 46. - №. 5. - C. 729-731.

59. Hristoskova S., Holzgreve W., Hahn S. More than one-half of the erythroblasts in the fetal circulation and cord blood are TUNEL positive //Clinical chemistry. - 2001.

- T. 47. - №. 10. - C. 1870-1871.

60. Li Y. et al. Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms //Clinical Chemistry. - 2004. - T. 50. - №. 6.

- C. 1002-1011

61. Fan H. C. et al. Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by paired-end sequencing //Clinical chemistry. - 2010. - T. 56. - №. 8. - C. 1279-1286

62. Ivanov M. et al. Non-random fragmentation patterns in circulating cell-free DNA reflect epigenetic regulation //BMC genomics. - 2015. - T. 16. - №. 13. - C. S1.

63. Jiang P. et al. FetalQuant SD: accurate quantification of fetal DNA fraction by shallow-depth sequencing of maternal plasma DNA //NPJ genomic medicine. - 2016. - T. 1. - №. 1. - C. 1-7.

64. Sancho M. et al. Depletion of human histone H1 variants uncovers specific roles in gene expression and cell growth //PLoS genetics. - 2008. - T. 4. - №. 10. - C. e1000227

65. Sun K. et al. Size-tagged preferred ends in maternal plasma DNA shed light on the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2018. - T. 115. - №. 22. - C. E5106-E5114.

66. Collins F. S., Morgan M., Patrinos A. The Human Genome Project: lessons from large-scale biology //Science. - 2003. - T. 300. - №. 5617. - C. 286-290.

67. Illanes S. et al. Early detection of cell-free fetal DNA in maternal plasma //Early human development. - 2007. - T. 83. - №. 9. - C. 563-566.

68. Masuzaki H. et al. Detection of cell free placental DNA in maternal plasma: direct evidence from three cases of confined placental mosaicism //Journal of medical genetics. - 2004. - T. 41. - №. 4. - C. 289-292.

69. Ashoor G. et al. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13 weeks' gestation: effect of maternal and fetal factors //Fetal diagnosis and therapy. - 2012. -T. 31. - №. 4. - C. 237-243.

70. Tamminga S. et al. Maternal plasma DNA and RNA sequencing for prenatal testing //Advances in clinical chemistry. - Elsevier, 2016. - T. 74. - C. 63-102.

71. Wang E. et al. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell - free DNA in maternal plasma //Prenatal diagnosis. - 2013. - T. 33. - №. 7. - C. 662-666.

72. Zimmermann B. et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci //Prenatal diagnosis. - 2012. - Т. 32. - №. 13. - С. 1233-1241.

73. Liao G. J. W. et al. Targeted massively parallel sequencing of maternal plasma DNA permits efficient and unbiased detection of fetal alleles //Clinical chemistry. -2011. - Т. 57. - №. 1. - С. 92-101.

74. Fairley S. et al. The International Genome Sample Resource (IGSR) collection of open human genomic variation resources //Nucleic acids research. - 2020. - Т. 48. -№. D1. - С. D941-D947.

75. Kim M. et al. Cost-effective and accurate method of measuring fetal fraction using SNP imputation //Bioinformatics. - 2018. - Т. 34. - №. 7. - С. 1086-1091.

76. Geiman T. M., Muegge K. DNA methylation in early development //Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research. - 2010. - Т. 77. -№. 2. - С. 105-113.

77. Lun F. M. F. et al. Noninvasive prenatal methylomic analysis by genomewide bisulfite sequencing of maternal plasma DNA //Clinical chemistry. - 2013. - Т. 59. - №. 11. - С. 1583-1594.

78. Stephanie C. Y. et al. Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for noninvasive prenatal testing //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - Т. 111. - №. 23. - С. 8583-8588.

79. Cirigliano V. et al. Performance of the neoBona test: a new paired - end massively parallel shotgun sequencing approach for cell - free DNA - based aneuploidy screening //Ultrasound in Obstetrics & Gynecology. - 2017. - Т. 49. - №. 4. - С. 460-464.

80. Straver R. et al. Calculating the fetal fraction for noninvasive prenatal testing based on genome - wide nucleosome profiles //Prenatal diagnosis. - 2016. - Т. 36. - №. 7. -С. 614-621.

81. Kim S. K. et al. Determination of fetal DNA fraction from the plasma of pregnant women using sequence read counts //Prenatal diagnosis. - 2015. - Т. 35. - №. 8. - С. 810-815.

82. Bianchi D. W. et al. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening //New England journal of medicine. - 2014. - T. 370. - №. 9. - C. 799-808.

83. Norton M. E. et al. Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy //New England Journal of Medicine. - 2015. - T. 372. - №. 17. - C. 1589-1597.

84. Chen S. et al. A method for noninvasive detection of fetal large deletions/duplications by low coverage massively parallel sequencing //Prenatal diagnosis. - 2013. - T. 33. - №. 6. - C. 584-590.

85. Van den Veyver I. B. Recent advances in prenatal genetic screening and testing //F1000Research. - 2016. - T. 5.

86. Peters D. et al. Noninvasive prenatal diagnosis of a fetal microdeletion syndrome //The New England journal of medicine. - 2011. - T. 365. - №. 19. - C. 1847.

87. Jensen T. J. et al. Detection of microdeletion 22q11. 2 in a fetus by next-generation sequencing of maternal plasma //Clinical chemistry. - 2012. - T. 58. - №. 7. - C. 11481151.

88. Srinivasan A. et al. Noninvasive detection of fetal subchromosome abnormalities via deep sequencing of maternal plasma //The American Journal of Human Genetics. - 2013. - T. 92. - №. 2. - C. 167-176.

89. Lefkowitz R. B. et al. Clinical validation of a noninvasive prenatal test for ge-nomewide detection of fetal copy number variants //American journal of obstetrics and gynecology. - 2016. - T. 215. - №. 2. - C. 227. e1-227. e16.

90. Straver R. et al. WISECONDOR: detection of fetal aberrations from shallow sequencing maternal plasma based on a within-sample comparison scheme //Nucleic acids research. - 2014. - T. 42. - №. 5. - C. e31-e31.

91. Zhao C. et al. Detection of fetal subchromosomal abnormalities by sequencing circulating cell-free DNA from maternal plasma //Clinical chemistry. - 2015. - T. 61. -№. 4. - C. 608-616.

92. Nicolaides K. H. et al. Validation of targeted sequencing of single - nucleotide polymorphisms for non - invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y //Prenatal diagnosis. - 2013. - T. 33. - №. 6. - C. 575-579.

93. Wapner R. J. et al. Expanding the scope of noninvasive prenatal testing: detection of fetal microdeletion syndromes //American journal of obstetrics and gynecology. -2015. - Т. 212. - №. 3. - С. 332. e1-332. e9.

94. Costa J. M., Benachi A., Gautier E. New strategy for prenatal diagnosis of X-linked disorders //New England Journal of Medicine. - 2002. - Т. 346. - №. 19. - С. 15021502.

95. Faas B. H. W. et al. Detection of fetal RHD-specific sequences in maternal plasma //The Lancet. - 1998. - Т. 352. - №. 9135. - С. 1196.

96. Tang N. L. S. et al. Detection of fetal-derived paternally inherited X-chromosome polymorphisms in maternal plasma //Clinical chemistry. - 1999. - Т. 45. - №. 11. - С. 2033-2035.

97. Bustamante-Aragones A. et al. Non-invasive prenatal diagnosis of single-gene disorders from maternal blood //Gene. - 2012. - Т. 504. - №. 1. - С. 144-149.

98. Amicucci P. et al. Prenatal diagnosis of myotonic dystrophy using fetal DNA obtained from maternal plasma //Clinical chemistry. - 2000. - Т. 46. - №. 2. - С. 301302.

99. Lun F. M. F. et al. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2008. - Т. 105. - №. 50. - С. 19920-19925.

100. Tsui N. B. Y. et al. Noninvasive prenatal diagnosis of hemophilia by micro-fluidics digital PCR analysis of maternal plasma DNA //Blood, The Journal of the American Society of Hematology. - 2011. - Т. 117. - №. 13. - С. 3684-3691.

101. Barrett A. N. et al. Digital PCR analysis of maternal plasma for noninvasive detection of sickle cell anemia //Clinical chemistry. - 2012. - Т. 58. - №. 6. - С. 10261032.

102. Сайт компании Baylor Genetics. URL: https://bcm.box.com/shared/static/eehibpd8d7bpobn7wypiwoef3iv9z8hn.pdf

103. Eckhardt F. et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22 //Nature genetics. - 2006. - Т. 38. - №. 12. - С. 1378-1385.

104. Tong Y. K. et al. Noninvasive prenatal detection of trisomy 21 by an epige-netic-genetic chromosome-dosage approach //Clinical chemistry. - 2010. - T. 56. -№. 1. - C. 90-98.

105. Tsui D. W. Y. et al. Systematic identification of placental epigenetic signatures for the noninvasive prenatal detection of Edwards syndrome //PloS one. - 2010. - T. 5. - №. 11.

106. Yuen R. K. C. et al. DNA methylation profiling of human placentas reveals promoter hypomethylation of multiple genes in early-onset preeclampsia //European Journal of Human Genetics. - 2010. - T. 18. - №. 9. - C. 1006-1012.

107. Blair J. D. et al. Widespread DNA hypomethylation at gene enhancer regions in placentas associated with early-onset pre-eclampsia //Molecular human reproduction. - 2013. - T. 19. - №. 10. - C. 697-708.

108. Chu T. et al. Comprehensive analysis of preeclampsia-associated DNA methylation in the placenta //PloS one. - 2014. - T. 9. - №. 9.

109. Hahn S. et al. Cell-free nucleic acids as potential markers for preeclampsia //Placenta. - 2011. - T. 32. - C. S17-S20.

110. Wataganara T. et al. Inverse correlation between maternal weight and second trimester circulating cell-free fetal DNA levels //Obstetrics & Gynecology. - 2004. -T. 104. - №. 3. - C. 545-550.

111. Charames G. S., Bapat B. Genomic instability and cancer //Current molecular medicine. - 2003. - T. 3. - №. 7. - C. 589-596.

112. Attilakos G. et al. Quantification of free fetal DNA in multiple pregnancies and relationship with chorionicity //Prenatal diagnosis. - 2011. - T. 31. - №. 10. - C. 967-972.

113. Bevilacqua E. et al. Performance of screening for aneuploidies by cell - free DNA analysis of maternal blood in twin pregnancies //Ultrasound in Obstetrics & Gynecology. - 2015. - T. 45. - №. 1. - C. 61-66.

114. Curnow K. J. et al. Detection of triploid, molar, and vanishing twin pregnancies by a single-nucleotide polymorphism-based noninvasive prenatal test //American journal of obstetrics and gynecology. - 2015. - T. 212. - №. 1. - C. 79. e1-79. e9.

115. Gil M. M. et al. Analysis of cell - free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta - analysis //Ultrasound in obstetrics & gynecology. - 2015. - T. 45. - №. 3. - C. 249-266.

116. Zhang H. et al. Non - invasive prenatal testing for trisomies 21, 18 and 13: clinical experience from 146 958 pregnancies //Ultrasound in Obstetrics & Gynecology. - 2015. - T. 45. - №. 5. - C. 530-538.

117. Russell L. M. et al. X chromosome loss and ageing //Cytogenetic and genome research. - 2007. - T. 116. - №. 3. - C. 181-185.

118. Bianchi D. W. et al. Noninvasive prenatal testing and incidental detection of occult maternal malignancies //Jama. - 2015. - T. 314. - №. 2. - C. 162-169.

119. UK National Screening Committee et al. Screening in the UK: making effective recommendations. - 2017. URL: https://assets.publishing.service.gov.uk/gov-ernment/uploads/system/uploads/attachment_data/file/538524/Screen-

ing_in_the_UK_making_effective_recommendations_2015_to_2016_180716_fina

l.pdf

120. SFOG et al. Analysis of foetal DNA in the woman's blood: non-invasive prenatal testing (NIPT) for trisomy 13, 18 and 21 - SFOG Guidelines 2016. URL: http://www.nfog.org/files/guidelines/NIPT%202016%2006%2005%20.pdf

121. French National Authority for Health (HAS) trisomy 21 testing - HAS Guidelines 2017. URL: https://www.has-sante.fr/jcms/c_2768535/fr/trisomie-21-la-has-actualise-ses-recommandations-concernant-le-depistage-prenatal-de-la-trisomie-21

122. Wright D. et al. First-trimester screening for trisomies 21, 18 and 13 by ultrasound and biochemical testing //Fetal diagnosis and therapy. - 2014. - T. 35. - №. 2. - C. 118-126.

123. Allyse M. et al. Non-invasive prenatal testing: a review of international implementation and challenges //International journal of women's health. - 2015. - Т. 7.

- С.113.

124. Rose N. C. et al. Screening for Fetal Chromosomal Abnormalities: ACOG Practice Bulletin, Number 226 //Obstetrics & Gynecology. - 2020. - Т. 136. - №. 4. -С. e48-e69.

125. Benn P. et al. Position statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis //Prenatal diagnosis. - 2015. - Т. 35. - №. 8. - С. 725-734.

126. Giammarco M. et al. Prenatal cell-free DNA screening. National Society of Genetic Counselors - 2016. URL: http://www.nsgc.org/p/bl/et/blogaid=805#.WCTELTNRftw.linkedin.

127. Gregg A. R. et al. Noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy, 2016 update: a position statement of the American College of Medical Genetics and Ge-nomics //Genetics in medicine. - 2016. - Т. 18. - №. 10. - С. 1056-1065.

128. Allyse M., Wick M. J. What do the new American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) guidelines mean for the provision of non-invasive prenatal genetic screening? //Journal of Obstetrics and Gynaecology. - 2017. - Т. 37. -№. 6. - С. 795-798.

129. Gregg A. R. et al. Noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy, 2016 update: a position statement of the American College of Medical Genetics and Genomics //Genetics in medicine. - 2016. - Т. 18. - №. 10. - С. 1056-1065.

130. Velculescu V. E. et al. Serial analysis of gene expression //Science. - 1995.

- Т. 270. - №. 5235. - С. 484-487.

131. Saha S. et al. Using the transcriptome to annotate the genome //Nature biotechnology. - 2002. - Т. 20. - №. 5. - С. 508-512.

132. Matsumura H. et al. Gene expression analysis of plant host-pathogen interactions by SuperSAGE //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2003. -Т. 100. - №. 26. - С. 15718-15723.

133. Wang Z. et al. SMASH, a fragmentation and sequencing method for genomic copy number analysis //Genome research. - 2016. - Т. 26. - №. 6. - С. 844-851.

134. Yamamoto M. et al. Use of serial analysis of gene expression (SAGE) technology //Journal of immunological methods. - 2001. - Т. 250. - №. 1-2. - С. 45-66.

135. Chandrananda D., Thorne N. P., Bahlo M. High-resolution characterization of sequence signatures due to non-random cleavage of cell-free DNA //BMC medical genomics. - 2015. - Т. 8. - №. 1. - С. 29.

136. Сайт Национального Института Исследования Генома Человека (NHGRI). URL: https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Sequencing-Human-Genome-cost

137. bcl2fastq2 Conversion Software v2.20. URL: https://support.illu-mina.com/downloads/bcl2fastq-conversion-software-v2-20.html

138. Сборка генома человека GRCh38. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.26/

139. Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform //bioinformatics. - 2009. - Т. 25. - №. 14. - С. 1754-1760.

140. Li H. et al. The sequence alignment/map format and SAMtools //Bioinformatics. - 2009. - Т. 25. - №. 16. - С. 2078-2079.

141. Jiang P. et al. FetalQuant: deducing fractional fetal DNA concentration from massively parallel sequencing of DNA in maternal plasma //Bioinformatics. - 2012. -Т. 28. - №. 22. - С. 2883-2890.

142. Johansson L. F. et al. Novel algorithms for improved sensitivity in noninvasive prenatal testing //Scientific Reports. - 2017. - Т. 7. - №. 1. - С. 1-11.

143. Wang T. et al. An optimized method for accurate fetal sex prediction and sex chromosome aneuploidy detection in non-invasive prenatal testing //PloS one. - 2016. - Т. 11. - №. 7.

144. Hudecova I. et al. Maternal plasma fetal DNA fractions in pregnancies with low and high risks for fetal chromosomal aneuploidies //PloS one. - 2014. - Т. 9. - №. 2.

145. Xu X. P. et al. A method to quantify cell-free fetal DNA fraction in maternal plasma using next generation sequencing: Its application in non-invasive prenatal chromosomal aneuploidy detection //PloS one. - 2016. - T. 11. - №. 1.

146. Magoc T., Salzberg S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies //Bioinformatics. - 2011. - T. 27. - №. 21. - C. 29572963.

147. Breitbach S. et al. Direct quantification of cell-free, circulating DNA from unpurified plasma //PloS one. - 2014. - T. 9. - №. 3.

148. 1000 Genomes Project Consortium et al. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes //Nature. - 2012. - T. 491. - №. 7422. - C. 56.

149. Lek M. et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans //Nature. - 2016. - T. 536. - №. 7616. - C. 285-291.

150. Danecek P. et al. The variant call format and VCFtools //Bioinformatics. -2011. - T. 27. - №. 15. - C. 2156-2158.

151. Bianchi D. W. et al. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing //Obstetrics & Gynecology. - 2012. - T. 119. - №. 5. - C. 890-901.

152. McCullough R. M. et al. Non-invasive prenatal chromosomal aneuploidy testing-clinical experience: 100,000 clinical samples //PLoS one. - 2014. - T. 9. - №. 10.

153. Loane M. et al. Twenty-year trends in the prevalence of Down syndrome and other trisomies in Europe: impact of maternal age and prenatal screening //European Journal of Human Genetics. - 2013. - T. 21. - №. 1. - C. 27-33.

154. Syngelaki A. et al. Replacing the combined test by cell-free DNA testing in screening for trisomies 21, 18 and 13: impact on the diagnosis of other chromosomal abnormalities //Fetal diagnosis and therapy. - 2014. - T. 35. - №. 3. - C. 174-184.

155. Rego de Sousa M. J. et al. Evaluation of Noninvasive Prenatal Testing (NIPT) guidelines using the AGREE II instrument //The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine. - 2020. - T. 33. - №. 3. - C. 455-463.

156. Van Opstal D. et al. False negative NIPT results: risk figures for chromosomes 13, 18 and 21 based on chorionic villi results in 5967 cases and literature review //PLoS One. - 2016. - T. 11. - №. 1. - C. e0146794.

157. Yang J. et al. A case of placental trisomy 18 mosaicism causing a false negative NIPT result //Molecular cytogenetics. - 2017. - T. 10. - №. 1. - C. 40.

158. Knierim E. et al. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing //PloS one. - 2011. - T. 6. - №. 11. - C. e28240.

159. Poptsova M. S. et al. Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing //Scientific reports. - 2014. - T. 4. - C. 4532.

160. Prabakar R. K. et al. SMURF-seq: efficient copy number profiling on long-read sequencers //Genome biology. - 2019. - T. 20. - №. 1. - C. 134.

161. Grendar M. et al. Uncertainty of fetal fraction determination in Non-Invasive Prenatal Screening by highly polymorphic SNPs //Journal of biotechnology. - 2019. -T. 299. - C. 32-36.

162. Chen M. et al. Validation of fetal DNA fraction estimation and its application in noninvasive prenatal testing for aneuploidy detection in multiple pregnancies //Prenatal Diagnosis. - 2019. - T. 39. - №. 13. - C. 1273-1282.

163. Song Y. et al. Quantitation of fetal DNA fraction in maternal plasma using circulating single molecule amplification and re-sequencing technology (cSMART) //Clinica Chimica Acta. - 2016. - T. 456. - C. 151-156.

164. Pe'er Dar M. D. et al. Clinical experience and follow-up with large scale single-nucleotide polymorphismebased noninvasive prenatal aneuploidy testing //American Journal of Obstetrics & Gynecology. - 2014.

Список ОНП, использованных для подготовки библиотек amplifet.

Номер в dbSNP Хромосома Координата начала Координата конца

ге10799145 chr1 5021199 5021200

rs1281000 Лг1 10929927 10929928

ге12064796 chr1 20141919 20141920

rs3828139 chr1 44253014 44253015

rs2182832 chr1 55480210 55480211

rs10874851 chr1 92106636 92106637

rs10493980 Лг1 102540083 102540084

ге4604720 chr1 107837158 107837159

rs6680785 chr1 170560331 170560332

rs7515208 chr1 209052332 209052333

rs10863614 chr1 221615450 221615451

rs778536 Лг1 229114637 229114638

ге6429216 chr1 240814350 240814351

rs2688847 chr10 14844883 14844884

rs4948235 chr10 61385730 61385731

rs3104051 chr10 71560998 71560999

rs7920628 ЛгШ 77866731 77866732

ге10882807 chr10 98268118 98268119

rs9419617 chr10 133507267 133507268

rs7941517 еЬг11 1429615 1429616

rs2723664 еЬг11 6441050 6441051

rs7130553 ОЬГ11 21536417 21536418

ге11030665 ОЬГ11 29355931 29355932

rs2198256 ОЬГ11 80187595 80187596

rs7115718 оЬГ11 91581282 91581283

rs10790289 еЬг11 119215164 119215165

rs7135976 chr12 6186115 6186116

ге10846153 chr12 15307167 15307168

rs4930945 chr12 27911099 27911100

rs11067768 chr12 116219714 116219715

rs4941753 chr13 31693876 31693877

rs4886118 Лг13 53616556 53616557

ге9593054 chr13 75838465 75838466

rs9302083 chr13 96374385 96374386

rs9583190 chr13 108332073 108332074

rs9323178 chr14 23113645 23113646

rs10438003 chr14 44269321 44269322

rs11157723 chr14 50537087 50537088

rs2242614 chr14 73722276 73722277

rs929608 chr14 92336774 92336775

rs7175060 chr15 60221243 60221244

rs11072418 chr15 73704163 73704164

rs8026959 chr15 80443035 80443036

rs11636460 chr15 102073363 102073364

rs11648458 chr16 439549 439550

rs1800775 chr16 56995235 56995236

rs7204177 chr16 77580777 77580778

rs12102757 chr16 84446953 84446954

rs7219780 chr17 3418553 3418554

rs11204328 chr17 20872330 20872331

rs8081659 chr17 27213989 27213990

rs603769 chr17 47570084 47570085

rs7359497 chr17 75352172 75352173

rs7506674 chr18 3133301 3133302

rs8099616 chr18 46307948 46307949

rs4337382 chr18 74379834 74379835

rs2047139 chr19 6732614 6732615

rs28513 chr19 54699385 54699386

rs2037147 chr2 2540385 2540386

rs6731656 chr2 23353833 23353834

rs3814043 chr2 46763586 46763587

rs4672216 chr2 52859828 52859829

rs4852547 chr2 80224754 80224755

rs7607896 chr2 167140837 167140838

rs7606036 chr2 181314518 181314519

rs6075784 chr20 2177884 2177885

rs6112659 chr20 19904468 19904469

rs1005241 chr22 47687617 47687618

rs13091584 chr3 7405043 7405044

rs716384 chr3 55212013 55212014

rs4894924 chr3 105113236 105113237

rs4855963 chr3 116608305 116608306

rs4679115 chr3 125997197 125997198

rs4974500 chr3 134109629 134109630

rs4696765 chr4 8125787 8125788

rs1032133 chr4 20053907 20053908

rs2703489 chr4 55426617 55426618

rs6848521 chr4 190093245 190093246

rs4701724 chr5 6365688 6365689

rs9312937 chr5 16836004 16836005

rs6891459 chr5 31677084 31677085

rs7701591 chr5 53215991 53215992

rs11241901 chr5 125883227 125883228

rs10038863 chr5 132562730 132562731

rs4912768 chr5 141086578 141086579

rs11952941 chr5 159354774 159354775

rs7729819 chr5 170971826 170971827

rs2789503 chr6 149802178 149802179

rs10945973 chr6 158412831 158412832

rs10270738 chr7 30782393 30782394

rs741304 chr7 36802999 36803000

rs4540368 chr7 155059373 155059374

rs399123 chr8 8747536 8747537

rs7822518 chr8 19748855 19748856

rs1031177 chr8 72196657 72196658

rs4736442 chr8 134273867 134273868

rs3861706 chr9 14947471 14947472

rs1176844 chr9 36814646 36814647

rs11792411 chr9 92848754 92848755

rs10760755 chr9 103534707 103534708

rs10816679 chr9 111283187 111283188

rs2797840 chr9 136536632 136536633

Метрики образцов контрольной выборки, прошедших фильтрацию.

ГО образца Кари-топи плода Количество пар ридов smash % data Q20 % data Q30 Количество картированных пар ридов smash Количество фильтрованных фрагментов Средняя длина фрагмента, п.о. Среднее количество фрагментов на пару до фильтрации Среднее количество фрагментов после фильтрации Доля внфДНК Среднее покрытие на ОНП Количество полезных ОНП

ts9597 46,XX 2 138 149 97,64 94,98 1 575 732 3 068 085 40,44 3,74 1,95 4,201% 5469,7 46

jq4469 46,XX 2 821 747 98,75 97,12 2 044 864 3 539 867 50,04 3,33 1,73 4,701% 5982,9 53

zg3730 46,XX 2 388 840 97,55 95,53 1 896 364 5 461 460 39,13 5,54 2,88 6,501% 4559,7 50

ш5629 46,XX 2 124 116 98,33 96,35 1 712 641 3 369 903 46,83 3,78 1,97 6,901% 5941,8 46

in9497 46,XX 2 364 713 98,48 96,58 1 905 039 3 779 220 44,59 3,81 1,98 6,901% 5067,4 34

уо3346 46,XX 2 077 604 98,22 96,66 1 621 385 4 648 816 39,70 5,51 2,87 12,101% 2867,2 39

hb7074 46,XX 2 252 897 98,31 96,30 1 812 845 3 591 093 45,15 3,81 1,98 12,801% 2917,4 48

hb4287 46,XX 2 632 181 98,45 96,58 1 991 850 3 651 444 48,69 3,52 1,83 23,301% 5854,3 43

oi7023 46,XX 1 773 822 97,26 95,12 1 140 860 3 354 247 46,60 5,65 2,94 24,201% 5755,1 30

уо2116 46,XY 3 250 148 97,76 95,87 2 637 319 7 344 396 37,75 5,35 2,78 4,301% 6232,9 46

hg1379 46,XY 2 319 078 98,43 96,57 1 823 447 3 480 361 48,54 3,67 1,91 4,801% 6133,4 50

jc5123 46,XY 3 032 590 98,82 97,20 2 148 845 3 788 755 42,70 3,39 1,76 5,801% 6192,4 48

hf2964 46,XY 2 222 273 98,14 96,07 1 770 567 3 466 465 49,10 3,76 1,96 5,901% 5938,3 51

ху2778 46,XY 3 742 587 97,84 96,03 3 201 786 9 502 950 43,54 5,71 2,97 6,301% 4851,5 49

iu2866 46,XY 1 876 837 97,80 96,01 1 559 932 4 779 108 43,68 5,89 3,06 6,501% 3229,9 33

ir7778 46,XY 2 450 839 97,80 95,62 1 639 114 2 965 082 46,02 3,48 1,81 6,901% 5695,2 46

qt2506 46,XY 1 911 916 97,56 94,92 1 543 949 3 270 864 41,62 4,07 2,12 7,001% 5943,6 47

he4029 46,XY 2 458 140 98,23 96,17 1 897 815 3 584 285 47,49 3,63 1,89 7,401% 6012,5 37

he4649 46,XY 2 715 355 98,43 96,59 1 974 233 3 558 774 49,36 3,47 1,80 8,001% 6143,9 40

xj7097 46,XY 3 712 514 98,07 96,39 3 013 300 6 771 345 36,67 4,32 2,25 8,801% 5394,1 47

xg1978 46,XY 5 448 124 97,31 95,18 5 086 114 14 401 526 41,02 5,44 2,83 9,001% 891,7 27

vi2218 46,XY 2 471 911 97,48 95,41 1 861 897 5 121 162 38,87 5,29 2,75 9,201% 3850,5 31

уи0881 46,XY 5 788 239 97,75 95,90 5 432 452 15 715 436 41,57 5,56 2,89 9,401% 6556,3 45

ие5647 46,XY 1 844 409 97,15 94,26 1 416 138 2 963 747 41,46 4,02 2,09 10,201% 5843,0 37

ус9809 46,XY 5 502 993 98,02 96,34 5 103 968 14 096 565 42,02 5,31 2,76 11,001% 6881,4 60

1Г3861 46,XY 2 697 561 98,46 96,63 2 125 139 4 134 932 47,53 3,74 1,95 11,501% 6016,9 42

hb0343 46,XY 2 480 135 98,14 95,94 1 845 753 3 432 712 46,25 3,58 1,86 11,901% 5397,4 46

hm1091 46,XY 4 771 512 97,83 96,04 4 511 068 13 414 289 42,63 5,72 2,97 12,001% 74,1 10

hc5259 46,XY 2 582 050 98,39 96,38 2 050 628 4 054 894 45,23 3,80 1,98 12,401% 3090,6 43

ir1888 46,XY 1 575 266 97,73 95,90 1 244 007 3 720 903 44,16 5,75 2,99 12,501% 6218,8 48

hy8424 46,XY 4 877 081 97,69 95,82 4 591 159 13 435 618 43,96 5,63 2,93 12,501% 6228,0 43

ic4318 46,XY 2 144 209 98,15 96,13 1 453 697 2 676 837 44,34 3,54 1,84 13,101% 5595,1 59

kq5562 46,XY 5 442 669 97,61 95,65 5 124 604 14 994 239 43,01 5,63 2,93 13,401% 1140,9 12

yy3261 46,XY 2 237 674 98,53 96,82 1 439 931 2 573 705 45,07 3,44 1,79 14,101% 5779,7 51

oj9168 46,XY 2 067 650 98,06 95,92 1 407 472 2 550 792 40,25 3,48 1,81 14,201% 5478,7 44

ij5466 46,XY 5 053 134 97,97 96,28 4 804 722 14 543 550 43,43 5,82 3,03 14,201% 5819,0 49

ip3092 46,XY 3 085 501 98,86 97,25 2 221 245 3 838 671 44,36 3,32 1,73 15,601% 5318,7 50

zf9167 46,XY 1 992 963 97,93 96,21 1 716 759 4 647 355 43,13 5,20 2,71 15,701% 583,5 27

ic7592 46,XY 4 840 319 97,39 95,30 4 508 927 13 482 870 43,53 5,75 2,99 16,101% 92,0 17

zb8197 46,XY 3 281 799 99,42 98,44 2 251 563 3 584 150 45,77 3,06 1,59 17,501% 5269,2 42

fm2325 46,XY 4 255 143 97,44 95,40 3 976 349 11 290 479 45,63 5,46 2,84 17,801% 274,7 26

ik5829 46,XY 3 506 833 98,26 96,72 3 225 655 8 718 329 42,41 5,20 2,70 20,001% 6388,7 52

wa8898 46,XY 2 403 413 98,78 97,27 1 518 434 2 600 987 44,24 3,29 1,71 20,401% 5254,0 52

il9721 46,XY 7 970 184 97,68 95,79 7 150 012 19 880 917 46,10 5,35 2,78 21,201% 5950,6 41

it9574 46,XY 6 368 094 97,80 95,93 5 912 883 16 675 780 40,85 5,42 2,82 21,301% 6201,5 40

vt5136 46,XY 2 429 264 98,34 96,35 1 860 722 3 514 958 47,67 3,63 1,89 21,401% 6189,6 44

it1704 46,XY 2 568 721 97,87 96,10 2 109 101 5 114 505 45,79 4,66 2,42 30,701% 6497,1 20

xc6831 46,XY 2 295 118 97,79 95,97 1 880 673 5 559 227 44,56 5,68 2,96 31,101% 1556,8 27

xr3360 47,XX,[phone] 97,22 95,01 2 698 590 8 092 210 43,58 5,77 3,00 10,801% 6223,1 43

wo0957 47,XX,[phone] 97,50 95,46 2 492 169 7 698 670 42,57 5,94 3,09 11,701% 5429,8 51

tk2368 47,XY,[phone] 97,56 95,55 900 129 2 676 921 41,82 5,72 2,97 6,501% 4965,7 46

ve4143 47,XY,[phone] 98,75 97,58 1 119 566 3 046 747 43,53 5,23 2,72 7,201% 4827,2 51

zp9372 47,XX,[phone] 97,59 95,62 1 737 759 5 183 187 43,89 5,73 2,98 8,501% 5680,1 37

hd5340 47,XX,[phone] 97,80 95,99 1 547 693 4 695 365 44,18 5,83 3,03 9,101% 5350,6 44

ob7269 47,XY,[phone] 97,01 94,66 1 208 222 3 509 476 42,20 5,58 2,90 5,601% 5571,6 54

hb5433 47,XY,[phone] 98,03 96,33 1 917 299 5 410 195 41,98 5,43 2,82 7,801% 5522,2 47

ie6204 47,XY,[phone] 97,36 95,19 2 161 207 5 939 920 40,39 5,28 2,75 14,401% 5552,3 46

zl0151 47,XY,[phone] 97,54 95,56 3 421 798 10 050 601 44,15 5,65 2,94 24,501% 5509,2 42

yl4131 47,XX,[phone] 97,69 95,77 3 276 003 9 992 007 40,80 5,86 3,05 6,201% 5888,6 45

ig4272 47,XX,[phone] 96,63 94,09 845 527 2 505 779 46,33 5,70 2,96 6,601% 5386,2 48

tv3786 47,XX,[phone] 97,50 95,50 1 152 780 3 492 696 45,10 5,83 3,03 7,501% 5851,8 52

yl0410 47,XX,[phone] 97,82 95,96 1 241 770 3 294 484 39,25 5,10 2,65 7,701% 2583,5 37

hd3519 47,XX,[phone] 98,02 96,32 1 639 066 4 660 893 41,07 5,47 2,84 9,301% 5907,1 49

ud7784 47,XX,[phone] 98,07 96,44 2 421 107 7 381 665 44,91 5,86 3,05 9,801% 5502,2 46

gh2402 47,XX,[phone] 97,67 95,36 1 416 779 2 663 661 45,41 3,61 1,88 10,001% 5954,8 52

zf7633 47,XX,[phone] 97,96 96,24 2 325 344 7 160 772 42,36 5,92 3,08 11,801% 3390,4 39

nl8615 47,XX,[phone] 97,65 95,71 4 630 221 12 436 598 45,21 5,16 2,69 18,101% 6229,3 51

tg6596 47,XX,[phone] 97,05 91,18 1 519 560 2 665 123 40,91 3,37 1,75 21,201% 5268,4 51

yn4733 47,XY,[phone] 97,95 96,24 2 508 693 7 589 679 45,59 5,82 3,03 4,601% 5533,7 46

xh6710 47,XY,[phone] 97,48 95,45 932 979 2 717 539 43,47 5,60 2,91 5,601% 5767,6 45

uc9112 47,XY,[phone] 97,48 95,41 1 180 124 3 505 183 41,28 5,71 2,97 6,601% 5867,6 47

fr1785 47,XY,[phone] 97,32 95,23 1 700 318 5 069 096 46,98 5,73 2,98 8,101% 5985,1 52

hc3395 47,XY,[phone] 98,24 96,73 942 138 2 550 212 49,49 5,20 2,71 9,401% 5635,5 42

ec5520 47,XY,[phone] 97,60 95,65 3 575 804 11 423 867 41,93 6,14 3,19 10,701% 5629,6 52

zu0318 47,XY,[phone] 99,19 98,06 2 303 202 3 577 443 45,53 2,99 1,55 11,001% 6691,4 50

zg4902 47,XY,[phone] 97,66 95,74 1 543 815 4 299 509 43,04 5,35 2,78 11,801% 149,3 26

jf9577 47,XY,[phone] 97,96 96,25 967 994 2 780 123 44,20 5,52 2,87 12,001% 5284,4 39

ge2975 47,XY,[phone] 97,87 95,69 1 459 488 2 620 034 45,96 3,45 1,80 18,201% 5465,5 37

vs7166 47,XY,[phone] 96,89 94,49 3 033 982 8 470 979 43,79 5,37 2,79 20,701% 6774,1 42

yo5986 47,XY,[phone] 97,65 95,77 1 214 066 3 401 576 48,37 5,39 2,80 24,801% 6278,3 36

iu6081 47,XY,[phone] 96,77 94,31 897 705 2 564 909 47,07 5,49 2,86 26,601% 5921,1 34

wn2699 47,XY,[phone] 97,43 95,37 1 478 468 3 831 368 43,30 4,98 2,59 27,101% 6520,5 30

hp8036 47,XY,[phone] 97,10 94,84 1 256 380 3 400 327 45,99 5,20 2,71 33,401% 4566,7 24

Результаты расчета Z-статистики для 13, 18 и 21 хромосом образцов контрольной выборки.

ГО образца Ка-рио-тип Доля внфДН К, % Коли-че-ство симу-ля-ций Средний 2<-стат для 13 хромосомы min Z-стат 13 max Z-стат 13 о Z-стат 13 Средний 2<-стат для 18 хромосомы min Z-стат 18 max Z-стат 18 о Z-стат 18 Средний 2<-стат для 21 хромосомы min Z-стат 21 max Z-стат 21 о Z-стат 21

ЕС5520 Т21 10,701 200 -0,975512 -2,1668154 -0,060853 0,3985107 -0,0046523 -0,9219592 1,1875546 0,3157643 6,9335679 4,0826242 14,757285 1,73296 28

FR1785 Т21 8,101 200 1,098763 0,14457 3,6810481 0,5216943 -1,2245175 -3,1168743 -0,2062481 0,4447726 10,578944 6,3150672 21,575689 2,64483 88

GE2975 Т21 18,201 200 -1,6939317 -3,555471 -0,6069641 0,5303197 -1,6619622 -4,5806402 -0,8248696 0,5788553 13,547595 8,2661443 27,451577 3,39278 77

GH2402 Т21 10,001 200 -0,5469453 -1,6990602 0,746583 0,3909862 -1,1255699 -3,6193268 -0,1978741 0,4224501 7,3387082 4,2329437 15,728073 1,91100 27

GV2133 46 9,901 152 2,6058678 1,3883165 5,4137525 0,7178844 -2,356996 -6,0133208 -1,2178242 0,7155097 0,3964337 -0,6625041 1,2587488 0,31677 4

НВ0343 46 11,901 155 0,1110738 -0,7116975 1,9304519 0,3703271 0,3607366 -0,5169161 1,6334788 0,3923139 -1,0822932 -2,9919974 0,0061715 0,47593 52

НВ4287 46 23,301 163 -0,5660548 -1,5747232 0,4962218 0,3395656 -0,6731655 -1,8498149 0,5185057 0,3771412 -0,0386329 -1,3102001 1,0102717 0,37491 28

НВ5433 Т18 7,801 200 -2,483934 •4,6334211 -1,2461548 0,6218523 8,7944142 4,8714553 24,746117 2,8323057 -1,7925383 4,3758926 -0,5225028 0,59930 53

НВ7074 46 12,801 151 0,9727657 -0,0173535 3,0383217 0,4762485 0,7472941 0,015 2,6269274 0,4397886 -0,3924588 -2,0020624 0,6256747 0,38496 95

НС3395 Т21 9,401 200 1,1250791 0,0115588 3,8133906 0,5444192 -0,6042018 -1,9048488 0,6028207 0,3551912 7,288242 4,1941679 14,751558 1,86212 05

НС5259 46 12,401 149 -0,3858671 -1,1377553 0,3644252 0,343399 -0,5875166 -1,6159149 0,5569934 0,3570246 0,9306219 0,0912107 2,7991281 0,41622 69

HD3519 Т21 9,301 200 -1,4552464 -3,3846845 -0,2564501 0,5114381 1,902059 0,8684712 5,5066896 0,7383371 9,2606138 5,5478061 19,00332 2,33249 05

ГО5340 Т18 9,101 200 -0,6102829 -1,6452745 0,5352049 0,3678853 9,0759756 5,0681316 25,24174 2,8959278 -0,8089988 -2,7231277 0,122066 0,42765 96

НЕ4029 46 7,401 148 1,3890943 0,4540788 3,5984192 0,5425691 -0,2473781 -1,1011484 0,6006897 0,3010831 0,4466695 -0,5818651 1,7104079 0,35934 08

НЕ4649 46 8,001 150 0,679886 -0,2884092 2,8449942 0,4605677 -0,1929643 -1,0770759 0,9994808 0,3205096 1,3399789 0,3261181 2,7670754 0,51459 54

HF2964 46 5,901 159 -0,0513549 -0,814724 1,7889335 0,3575678 -1,0544359 -2,7897801 -0,3596778 0,396799 -0,0977577 -1,4093929 0,763613 0,34535 33

HG1379 46 4,801 153 -0,1285413 -1,1037415 1,6097086 0,36552 -1,5636563 -3,8303303 -0,8042276 0,4813371 -0,9494811 -2,8255075 0,1426588 0,45207 68

НР8036 Т21 33,401 200 0,7833031 -0,1775468 3,3015505 0,5051411 -0,789663 -2,4928954 0,3225362 0,3681376 12,431503 7,648343 25,523881 3,11420 96

HY8424 46 12,501 148 0,9935876 0,0940693 3,1461549 0,4913895 -0,6777589 -1,8490609 0,4379217 0,3452121 0,5280442 -0,7168624 1,8647332 0,36824 39

1С4318 46 13,101 149 -0,5417328 -1,6299173 0,482281 0,3721617 -1,8488417 4,8300141 -0,8496228 0,611975 -2,0044412 4,1049432 -0,9088687 0,60781 15

1Е6204 Т18 14,401 200 -4,2035521 -7,3821788 -2,4367308 1,0170129 13,191149 7,4885841 36,954058 4,1766192 -1,7397142 4,1502899 -0,7101738 0,58834 85

IF3 861 46 11,501 149 2,4915667 1,4204728 5,9001186 0,7359358 -1,7608054 -4,574575 -0,9728487 0,5705277 0,1828483 -0,9548704 1,0644947 0,31503 7

Ю4272 Т21 6,601 200 -0,4553604 -1,4111753 0,8205473 0,4119704 0,6802803 -0,2130121 2,0192627 0,4321719 6,9098736 3,9871012 13,634996 1,74772 09

и5466 46 14,201 144 0,6114295 -0,2546124 2,4158786 0,4073374 -0,381648 -1,274786 0,6713016 0,3272707 2,4493913 1,3821275 5,0726993 0,64381 07

1К5829 46 20,001 159 -0,5276485 -1,6755747 0,5561902 0,3934185 0,2353193 -0,5287333 1,4122037 0,3654222 -0,7676718 -2,4196781 0,0608359 0,39784 15

Ш9721 46 21,201 155 -0,8062953 -2,0745338 0,0562925 0,3809573 -0,2584049 -1,14724 0,8331357 0,2939509 0,2445457 -0,7801932 1,1157898 0,29567 97

1М5629 46 6,901 154 0,0555586 -1,0282269 1,438956 0,3986428 0,4527818 -0,5287513 1,6521457 0,391815 0,8084227 -0,3208681 2,24624 0,38861 31

IN9497 46 6,901 155 -0,6503001 -1,7062547 0,1776301 0,3502993 -0,0271718 -0,8163822 1,1740593 0,3246636 -0,8532607 -2,5594823 -0,0006313 0,39418 05

1Р3092 46 15,601 151 0,0452361 -1,1276652 1,3359541 0,4417557 1,1057434 0,220279 3,1805149 0,5649685 -1,3909274 -3,4042788 -0,5317236 0,48409 69

IR1888 46 12,501 162 0,2489566 -0,8081585 2,1688589 0,4336361 -0,4617298 -1,6337617 0,6219757 0,318961 1,2442871 0,3767989 3,0424056 0,45436 28

Ж.7778 46 6,901 156 -0,9529525 -2,4324368 -0,0476771 0,4357308 0,8913968 -0,1021415 2,2617482 0,4671415 0,2112897 -1,0314862 1,0584393 0,32469 4

ГГ1704 46 30,701 155 1,0583127 0,2415647 3,5631529 0,4950859 -0,2749739 -1,1949229 0,6122829 0,3207318 -0,067293 -1,4127142 1,0776045 0,35801 02

IU2866 46 6,501 156 -0,0746118 -0,956094 1,5168224 0,3848051 -2,0883932 4,9867003 -1,0711426 0,6378106 0,6553267 -0,4307953 1,805205 0,34587 49

IU6G81 T21 26,601 200 -0,8003785 -1,9032953 0,1153302 0,4170402 1,3123808 0,363734 3,9898428 0,5857334 11,046465 6,7108134 22,825952 2,76341 57

JC5123 46 5,801 160 -0,8452087 -2,2723837 0,1949376 0,4216872 1,0009964 0,0743634 2,9820727 0,5480697 0,2985413 -1,0315188 1,1680395 0,33515 14