Прогностическое значение изменения окислительного статуса для течения АНЦА-ассоциированных васкулитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.04, кандидат наук Шеримова Аида Ержановна

• Шеримова Аида Ержановна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Шеримова Аида Ержановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Окислительный статус в условиях нормальных физиологических реакций

1.2 Окислительный стресс: оксиданты, антиоксиданты

1.3 АНЦА-ассоциированные системные васкулиты

1.4 Окислительный стресс в патогенезе ААВ: роль нейтрофилов, нетоз19

1.5 Окислительный стресс и сахарный диабет

1.6 Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Окислительный статус у больных ААВ

3.2 Сравнение окислительного статуса больных ААВ и СД 2 типа

3.3 Результаты математического моделирования функциональной активности нейтрофилов для пациентов с ААВ

3.4 Описание клинического случая №1

3.5 Описание клинического случая №2

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ

Практические рекомендации

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ААВ АНЦА-ассоциированные васкулиты

АНЦА антинейтрофильные цитоплазматические антитела

цАНЦА цитоплазматические АНЦА

пАНЦА перинуклеарные АНЦА

АОА антиоксидантная активность

АФК активные формы кислорода

БПГН быстропрогрессирующий гломерулонефрит

ГКС глюкокортикостероиды

ГН гломерулонефрит

ГПА гранулематоз с полиангиитом (гранулематоз Вегенера)

ДОА доля окисленного альбумина

ИКР интерквартильный размах

ИЛ-2 интерлейкин-2

МПА микроскопический полиангиит

МПО миелопероксидаза

НВЛ нейтрофильные внеклеточные ловушки

ПМЛ полиморфноядерные лимфоциты

ПР-3 протеиназа-3

САЧ сывороточный альбумин человека

СВ системный васкулит

СОД супероксиддисмутаза

СОЭ скорость оседания эритроцитов

СР свободные радикалы

СРБ С-реактивный белок

САР супероксид анион радикал

УЗИ ультразвуковое исследование

ФНО фактор некроза опухолей

ХЛ хемилюменесценция

ЦФА циклофосфамид

ЭГПА эозинофильный гранулематоз с полиангиитом (синдром Черга-Страусс)

BVAS Бирмингемский индекс активности васкулита (Birmingham Vasculitis Activity Score)

VDI Индекс повреждений при васкулите (Vasculitis Damage Score)

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Прогностическое значение изменения окислительного статуса для течения АНЦА-ассоциированных васкулитов»

Актуальность проблемы

Системные васкулиты ассоциированные с антителами к цитоплазме нейтрофилов (ААВ) относятся к разряду сложных междисплинарных проблем медицины. Сложность патогенетических механизмов, гетерогенность иммунологических форм и полиморфность клинических проявлений, способствуют непредсказуемости течения заболевания, несмотря на современную терапию. В группу ААВ входят гранулематоз с полиангиитом (болезнь Вегенера; ГПА), микроскопический полиангиит (МПА), эозинофильный гранулематозный васкулит с полиангиитом (ЭГПА) [1-3].

В патогенезе ААВ участвуют различные типы клеток, в первую очередь нейтрофилы [4, 5], моноциты [6] Т-клетки и В-клетки, особенности межклеточных взаимодействий которых во многом не расшифрованы. Центральное значение в повреждении сосудистой стенки играет индуцированная АНЦА активация нейтрофилов с их дегрануляцией, высвобождением протеолитических ферментов и активных форм кислорода (АФК) [7].

В результате многочисленных исследований хорошо изучена роль нарушений свободно-радикальных процессов в развитии и прогрессировании заболеваний, таких как атеросклероз, сахарный диабет. При этих заболеваниях показана неблагоприятная роль продуктов окисления липидов и белков в повреждении сосудистой стенки из-за развития вторичного воспаления, инициированного окислительным стрессом, что играет существенную патогенетическую роль в развитии сосудистых катастроф при невоспалительных заболеваниях. Одним из ключевых активаторов окислительного стресса является фермент миелопероксидаза, содержащийся в нейтрофиле [7]. Поскольку антитела к миелопироксидазе яляются важным патогенетическим звеном в развитии ААВ, можно предположить, что первичное повреждение нейтрофилов при ААВ существенным образом меняет функцию нейтрофилов, что

может приводить в том числе и к глубоким нарушениям окислительного статуса, способного самостоятельно повреждать сосудистую стенку и поддерживать воспалительные процессы. Вместе с тем глубина окислительного стресса определяется и состоянием антиоксидантной активности плазмы крови и степенью окислительной модификации альбумина - основной мишени АФК в крови. Изменение третичной формы альбумина в результате окисления может изменять его транспортную функцию, что в конечном итоге может влиять на результаты лечения [11]. В связи с этим, очевидна целесообразность комплексной оценки функционального статуса нейтрофилов путем изучения их суммарной активности.

Новые люминесцентные методы определения активности нейтрофилов позволяют производить комплексную оценку нарушений окислительного статуса.

Цель исследования

Изучить роль нарушении окислительного статуса в патогенезе АНЦА-ассоциированных васкулитов и уточнить его прогностическую значимость для течения заболевания.

Задачи исследования

1. Оценить радикал-продуцирующую способность нейтрофилов у больных ААВ и СД 2 типа.

2. Определить значимость окисленной модификации альбумина для уточнения степени окислительного стресса при ААВ.

3. Изучить антиоксидантную активность при ААВ и СД 2 типа.

4. Сопоставить показатели окислительного стресса с особенностями клинической картины ААВ.

5. Изучить вклад внутри и внеклеточной радикал продуцирующей способности нейтрофила в нарушение окислительного статуса и прогноз для течения заболевания.

Положения, выносимые на защиту

1. Собственная и стимулированная радикал-продуцирующая способность нейтрофилов у больных ААВ повышена по сравнению с группой здоровых доноров и больных СД 2 типа.

2. При ААВ отмечается дефицит внутриклеточной продукции АФК по сравнению с донорами и больными СД 2 типа.

3. Повышение доли окисленного альбумина у пациентов с ААВ по сравнению с группой здоровых доноров и СД 2 типа свидетельствует о роли системного окислительного стресса, затрагивающего белковое звено.

4. Антиоксидантная активность у больных ААВ выше антиоксидантной активности здоровых доноров и ниже, чем у больных СД 2 типа.

5. Показатели нарушения окислительного статуса ассоциируются с клиническими особенностями ААВ.

6. Математическое моделирование функции нейтрофилов демонстрирует важное предикторное значение нарушения окислительного статуса для течения ААВ.

Научная новизна

Впервые в рамках одного исследования на основе новых хемилюминесцентных методик произведена комплексная оценка показателей окислительного стресса у пациентов с ААВ: функциональной активности главного источника свободных радикалов крови — нейтрофильных гранулоцитов; антиоксидантной системы плазмы крови; окислительной модификации сывороточного альбумина.

Впервые оценен вклад внутри и внеклеточной продукции свободных радикалов нейтрофилами в формирование клинической картины заболевания, выражающийся в изменении формы кривой ХЛ, а также наличием или снижением/отсутствием «медленной» вспышки.

На основе сравнительного анализа окислительного статуса у больных ААВ и СД 2 типа впервые продемонстрировано определяющее значение первичного повреждения нейтрофилов и потери их функции в индукции дебюта, рецидива и прогноза течения заболевания.

Впервые созданы прогностические модели, позволяющие на базе математического моделирования функции нейтрофилов выявлять больных с наиболее неблагоприятным течением болезни, развитием необратимых изменений и высоким риском вторичных инфекций.

Практическая значимость

Показатели окислительного стресса в практике позволяют уточнить степень повреждения сосудов и выраженность воспалительных реакций, что позволяет более точно определить прогноз течения ААВ.

Больные с дефектом внутриклеточной радикал-продуцирующей активности нейтрофила имеют высокий риск развития вторичной инфекций и возможно нуждаются в превентивном лечении антибактериальными препаратами.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования используются врачами нефрологического и ревматологического отделений Университетской клинической больницы №3 Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (главный врач - к.м.н. В.В. Панасюк) и сотрудниками кафедры внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова (зав. - академик РАН, д.м.н., профессор Н.А. Мухин), кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (зав. - академик РАН, д.м.н., профессор Н.А. Мухин); внедрены в практику преподавания курса внутренних болезней студентам Факультета фундаментальной медицины 12 МГУ имени М.В. Ломоносова и Первого МГМУ имени И.М. Сеченова. Апробация работы

Апробация диссертационной работы проведена 27 июня 2017 года на совместном заседании сотрудников кафедрой терапии и профессиональных болезней Первого МГМУ имени И.М. Сеченова, кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова. Материалы диссертации были представлены на конференциях: «Ломоносов -2016» (Москва, 2016), <^СШЖЕ4НЕАЦШ-2016» (Москва, 2016)

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 86 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов, практических рекомендаций, списка литературы, иллюстрирована 13 таблицами и 7 рисунками. Библиография включает 115 источника (15 - отечественных, 100 - зарубежных).

Работа выполнена на кафедре внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, в Клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней имени Е.М. Тареева (УКБ №3 Первого МГМУ имени И.М. Сеченова) и кафедре медицинской биофизики Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова.

Выражаю глубокую благодарность за повседневную помощь в работе над диссертацией научному руководителю академику РАН, профессору Н.А. Мухину. Сердечно признательна за помощь в работе и ценные консультации к.м.н., доценту кафедры внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, Т.Н. Красновой; к.х.н., доценту кафедры медицинской биофизики Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова Е.В. Проскурниной; рецензентам - к.м.н., доценту кафедры внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, Авдееву В.Г., к.м.н., ассистенту кафедры внутренних болезней Первого МГМУ имени И.М. Сеченова, Новикову П.И., а также всему коллективу Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней имени Е.М. Тареева. Автор благодарит за плодотворное сотрудничество коллектив

лаборатории кафедры медицинской биофизики Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова (зав. - академик РАН, профессор, д.б.н., Владимиров Ю.А.).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Окислительный статус в условиях нормальных физиологических реакций

В середине XX века появилась теория о повреждении клетки свободными радикалами (СР) кислорода [8]. К настоящему моменту достижения в этой области науки не только позволяют говорить о ведущей роли свободнорадикальных процессов, но о важных физиологических функциях свободных радикалов кислорода, обеспечивающих многообразные стороны клеточного метоболизма. Присутствие свободных радикалов может быть очень благоприятно для клеток. Они постоянно образуется в организме и необходимы для биологических процессов [9, 10]. Однако в случае гиперпродукции свободных радикалов, и ослаблении защитных систем организма (антиоксидантов) могут сложиться условия для клеточного повреждения [11].

Таким образом, очевидно, что живые системы не только адаптированы к существованию в условиях непрерывного формирования СР, но и используют их в различных физиологических функциях [8, 10].

Известно что, значительный вклад в окислительный статус организма вносят нейтрофильные гранулоциты. Кислородзависимый ответ нейтрофилов на антиген осуществляется активацией респираторного взрыва, сопутствующий фагоцитозу [11].

Активация респираторного взрыва приводит к генерации супероксидного радикала нейтрофилами за счет сборки фермента НАДФН-оксидазы в клеточной мембране. НАДФН-оксидаза катализирует восстановление молекулярного кислорода до супероксидного радикала, который затем превращается в пероксид водорода и другие токсичные формы кислорода (гидропероксидный и гидроксидный радикалы). Пероксид водорода, хлор и миелопероксидаза нейтрофила образуют систему, вырабатывающую чрезвычайно токсичные вещества: гипохлорит и молекулярный хлор [12, 13]. Следует отметить, что

специализированные ферментативные системы продукции свободных радикалов являются основными участниками микробиоцидного действия фагоцитов. Генетические дефекты НАДФН

оксидазы, в результате которых нарушается ее способность восстанавливать кислород, являются причиной хронического гранулематоза [10, 14, 15].

Таким образом, окислительные реакции играют важную роль как в регуляторной, так и в защитной функции нейтрофилов.

1.2 Окислительный стресс: оксиданты, антиоксиданты

Состояние, приводящее к нарушению баланса оксидант-антиоксидант в пользу первого, с повреждением различных билмолекул определяется термином -окислительный стресс [15].

Оксиданты

К одним из наиболее распространенных оксидантов относятся свободные радикалы - молекулы или молекулярные фрагменты, содержащие один или несколько неспаренных электронов на атомных или молекулярных орбиталях [16]. Ввиду своей неустойчивой электронной конфигурации, свободные радикалы обладают высокореакционной способностью повреждать биомолекулы (липиды, углеводы, белки) [17, 18].

Наиболее значимые для организма человека являются свободные радикалы кислорода - активные формы кислорода (АФК), такие как супероксид анион радикал (О2-;), гидроксильный радикал (•ОН) и пероксид водорода (Н202). Гиперпродукция АФК приводит к изменениям структуры ДНК, модификации белков и липидов, активации нескольких стресс-индуцированных факторов, транскрипции и производства провоспалительных цитокинов [18].

Супероксидный анион образуется при присоединении одного электрона к молекулярному кислороду. Этот процесс опосредуется НАДФН-оксидазой и ксантиноксидазой или системой митохондриального транспорта электронов. Фермент НАДФН-оксидаза находится полиморфноядерных лейкоцитах,

моноцитах и макрофагах, при фагоцитозе которых происходит «респираторный взрыв» с гиперпродукцией АФК [19]. Супероксидный анион с участием фермента супероксиддисмутазы превращается в пероксид водорода. Пероксид водорода легко диффундирует через плазматическую мембрану и с помощью металлов переносчиков образует гидроксил радикал [20]. Гидроксил радикал является одним из самых активных и может приводить к повреждению белков, углеводов, ДНК и перекисному окислению липидов.

Ферменты гранулоцитов, такие как эозинофильная пероксидаза и миелопероксидаза усиливают реакционную способность пероксида водорода. Например, пероксид водород, образованный в нейтрофилах с помощью МПО в присутсвии ионов хлора превращается в сильный окислитель, гипохлорную кислоту (ГОО) [21, 22].

Биомедицинский интерес представляют собой и активные формы азота, в частности монооксид азота (N0), которая образуется с помощью фермента N0 синтазы. N0 синтаза переводит аргинин в цитруллин с образованием монооксида азота. Влияние N0- на жизнедеятельность клетки можно свести к его прямым и непрямым эффектам. К прямым воздействиям относят те реакции, в которых N0 непосредственно взаимодействует с молекулами-мишенями. В свою очередь опосредованные эффекты N0, осуществляются через продукты его метаболизма -активные формы монооксида азота [23, 24]. Свои прямые эффекты N0 оказывает в низких концентрация. Это очень быстрые реакции, как правило с гем-содержащими белками (гуанилатциклаза, цитохром Р450, гемоглобин). В этих реакциях N0- ведет себя как сигнальная молекула, в различных физиологических процессах (передача нервного импульса, регуляцию АД, расслабление гладкомышечных волокон, регуляция иммунной системы) [23]. Для осуществления непрямых эффектов необходимо взаимодействие N0 с супероксид анионом или кислородом с формированием активных форм N0, которые вступают в реакции с белками, липидами и ДНК, что впоследствии может привести к N0-опосредованной гибели клетки. Однако эти реакции

возможны только при высокой локальной концентрации N0 (>1ммоль/л) в течение длительного времени. Такие условия создаются вокруг активированных лейкоцитов или других клеток, чувствительных к стимуляции цитокинами [11, 24]. Активированные клетки иммунной системы продуцируют и супероксид анион, и монооксид азота во время реакций респираторного взрыва.

Помимо эндогенной продукции свободные радикалы могут поступать в организм извне. Наиболее частыми экзогенными источниками АФК являются:

Сигаретный дым, который кроме того что содержит супероксид анион и оксид азота, запускает активацию нейтрофилов и макрофагов, усиливающих окислительное повреждение [25].

Озон вызвает перекисное окисление липидов, а также индуцирует миграцию нейтрофилов в эпителий дыхательных путей. Даже у здоровых людей воздействие озона вызывает снижение легочных функций [26, 27]. В работах Чо и др. показали, что твердые частицы (смесь твердых частиц и капель жидкости, взвешенных в воздухе) катализирует восстановление кислорода [28].

Гипероксия - повышенное содержание кислорода в легких или других тканях, приводящее к усилению продукции АФК [29, 30].

Ионизирующее излучение активирует внутриклеточное увеличение 02 и Н202 фибробластов, за счет активации мембран-связанной НАДФ(Н) оксидазы. Окислительному стрессу при радиациях в основном подвержены молекулы ДНК [31, 32].

Антиоксиданты

Группа биологически активных веществ, которые позволяют нейтрализовать негативное воздействие свободных радикалов называются антиоксидантами. Принцип их действия заключается в том, что встречаясь со свободным радикалом, вещество-антиоксидант отдает ему свой электрон, оставаясь при этом химически нейтральным [8].

Во многих источниках антиоксиданты условно делят на ферментные и неферментные.

Супероксиддисмутазы (СОД) — семейство металлферментов, катализирующая реакцию диссмутации супероксидного радикала с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Существует 3 изоформы СОД, которые в основном экспрессируются в тканях легких [33, 34].

Каталаза - ферментный антиоксидант, восстанавливающий пероксид водорода до воды.

Глутатионпероксидазы — семейство тетрамерных ферментов катализирующее восстановление пероксида водорода до воды и гидропероксидов липидов до спиртов [35].

К неферментным антиоксидантам относятся низкомолекулярные соединения, такие как: витамины (А, Е, С), Р-каротин, глутатион и мочевую кислоту.

Витамин С (аскорбиновая кислота) - водорастворимый витамин, который обеспечивает внутри и внеклеточную антиоксидантную защиту, главным образом, путем удаления кислородных свободных радикалов. Уровень витамина С в плазме уменьшается с возрастом [36, 37].

Витамин Е - жирорастворимый витамин, наиболее активной формой которого является а-токоферол .Основная концентрация его на в внутренней гидрофобной стороне клеточной мембраны. Витамин Е отдает электрон пероксильному радикалу, который продуцируется во время перекисного окисления липидов. Витамин Е может вызывать апоптоз раковых клеток [18].

Каротиноиды ф-каротин) относятся к пигментным антиоксидантам, встречаются в растениях. К основным радикалам реагирующими с каротиноидами относятся: гидроксил, пероксил и супероксид радикалы.В-каротин ингибирует индуцированную окислительным стрессом продукцию ИЛ-6 и ФНОа [38].

Мочевая кислота - сильный антиоксидант, который является активным хелатором металлов и синергистом а-токоферола. В тоже время, мочевая кислота может проявлять себя как прооксидант, так как основным ферментом метаболизма пуринов является ксантиноксидаза, с помощью которой происходит генерация супероксид — аниона — активатора перекисного окисления липидов

Альбумин. Известно, что альбумин, кроме транспорта широкого класса органических веществ, участвует в поддержании и регуляции осмотического давления, обмене оксида азота, обладает антиоксидантными свойствами [40]. Связывая СР альбумин выполняет функцию внеклеточного антиоксиданта за счет окисления своей свободной SH-группы. Перехватывая свободные радикалы, альбумин подвергается окислительной модификацией и теряет свои транспортные свойства. Изменение транспортных свойств альбумина можно определить по изменению его способности связывать ряд флуоресцирующих соединений зондов [11]. В ряде работ показано, что связывающая способность зонда К-35 существенно меняется при сердечно-сосудистых заболеваниях. Одной из причин таких изменений может быть свободнорадикальная модификация альбумина. Таким образом, альбумин как антиоксидантом так и основной мишенью свободнорадикальных повреждении.

Недостаточное потребление продуктов содержащих антиоксиданты и основных компонентов для их синтеза (меди, железа, цинка и магния) также может приводить к окислительному стрессу. Например, у детей с болезнью Квашиоркор важными антиоксидантами, которых может не хватать в организме у могут включать глютатион, альбумин, витамин Е и полиненасыщенные жирные кислоты [41]. Окислительный стресс также может быть обусловлен наличием токсинов, продуцирующих АФК (например, параквата), или чрезмерной активации природных систем, продуцирующих АФК, например, повышенная активация фагоцитов [42].

1.3 АНЦА-ассоциированные системные васкулиты

К АНЦА-ассоциированным васкулитам (ААВ), относятся некротизирующие васкулиты, с преимущественным поражением мелких и средних сосудов (капилляров, венул, артериол и мелких артерий), с гранулематозным воспалением, чаще с поражением верхних и нижних дыхательных путей [43].

В настоящее время этиология АНЦА-СВ не установлена. Вместе с тем по данным литературы, обсуждается участие Staphylococcus aureus в инициации гранулематозного воспаления, с антителами к со специфичностью ПР-3 [44, 45].

Нозологические формы ААВ представлены: гранулематозом с полиангиитом (Вегенера; ГПА), микроскопическим полиангиитом (МПА) и эозинофильным гранулематозом с полиангиитом (ЭГПА) [1, 43]. Характерным для данных васкулитов является наличие АНЦА в сыворотке крови, которые, однако, определяются не у всех больных.

По специфичности к аутоантигенам АНЦА бывают к миеопероксидазе (МПО) и протеиназе-3 (ПР3). Кроме того, при непрямой иммунофлуоресценци антитела образуют различные типы свечения: цитоплазматический (цАНЦА) со специфичностью к ПР-3 или перинуклеарный (пАНЦА) со специфичностью к МПО [1]. Клиническая картина ААВ в зависимости от калибра и локализации пораженных сосудов может проявляться как генерализованное (полиорганное) или локальное поражение [46]. Разнообразные клинические проявления МПА обусловлены развитием некротизирующего васкулита мелких сосудов различной локализации и у половины больных проявляется тяжелым лёгочно-почечным синдромом, который протекает особенно неблагоприятно при наличии антител к ПР-3 [47]. Характерным для ГПА являются некротизирующий васкулит и гранулематозная воспалительная реакция, с поражением верхних и нижних дыхательных путей. Одним из частых и тяжело протекающих проявлении ГПА является некротизирующий гломерулонефрит, приводящий к хронической болезнь почек 3-4 стадии [48].

Особенности клинической картины при ЭГПА определяются наличием периферической и/или тканевой эозинофилии. Уже на ранней стадии ЭГПА можно отметить вовлеченность органов дыхания, для которой свойственно постепенное развитие симптомов бронхиальной астмы, аллергического ринита, синусита [49, 50].

Терапия АНЦА-ассоциированных включает комбинацию глюкокортикоидов

и цитостатиков, ремиссия при которой составляет около 75%, а в последнее время можно отметить успешное применение генно-инженерных биологических препаратов, в первую очередь, ритуксимаба [51]. Несмотря на то, что современные тактики терапии повышают выживаемость, течение и прогноз у больных АНЦА-ассоциированными зачастую непредсказуем.

1.4 Окислительный стресс в патогенезе ААВ: роль нейтрофилов, нетоз

Есть много данных, устанавливающих роль клеток иммунной системы и продуцируемых ими цитокинов, хемокинов, медиаторов в патогенезе ААВ, такие как: 1) инфекционный агент, 2) B- и T-лимфоциты, 3) аутоантитела АНЦА, 4) система комплемента, 5) нейтрофилы и моноциты (Staphylococcus aureus)[52, 53].

В-лимфоциты являются предшественниками плазматических клеток, продуцирующих АНЦА. Их число, равно как и уровень стимулирующих В-лимфоциты факторов, повышено у больных ААВ. Т-лимфоциты найдены в гранулемах при ААВ, и показан повышенный уровень как самих лимфоцитов, так и маркеров их активности (рецептор ИЛ-2, неоптерин, растворимый CD-30) [52]. АФК играют непосредственную роль в регуляции через АФК-сигнальные пути, в том числе в жизнедеятельности Т-клеток [54, 55].

Система комплемента участвует в патогенезе ААВ через альтернативный путь активации. Экспериментальные данные показывают, что праймированные нейтрофилы, активированные АНЦА, генерируют C5a, активирующие, в свою очередь, рецепторы на мембране нейтрофилов, что дополнительно праймирует нейтрофилы, замыкая порочный круг. Показано повышение уровня C3a, C5a, растворимого C5b-9 и Bb в плазме крови у пациентов с активными васкулитами по сравнению с ремиссией [56].

Патологическая роль избыточной продукции свободных радикалов (окислительный стресс), является одной из фундаметальных в патогенезе ААВ, где главным источником выступают нейтрофилы и антитела к их компонентам (АНЦА).

Роль нейтрофилов

Нейтрофилы с одной стороны, являются эффекторными клетками, вызывающими повреждение эндотелия, с другой стороны, мишенью аутоиммунного ответа. Они синтезируют огромное количество цитокинов и хемокинов, служащих модуляторами воспалительного и аутоиммунного процессов. Нейтрофилы больных ААВ отличаются повышенной экспрессией субъединиц интегринов, реэкспрессией генов, кодирующих синтез ферментов гранул, а также повышенной базальной секрецией АФК [4]. Считается, что циркулирующие в кровотоке больных нейтрофилы являются праймированными (активированными). После прайминга цитокинами нейтрофилы выставляют миелопероксидазу на поверхность клетки, в результате чего она может взаимодействовать с АНЦА-антителами [57].

Антинейтрофильные цитоплазматические антитела при ААВ продуцируются к протеиназе-3 (цитоплазматические, цАНЦА) и к миелопероксидазе (перинуклеарные, пАНЦА) — компонентам, присутствующим как в первичных гранулах нейтрофилов, так и лизосомах моноцитов [58]. Роль АНЦА многозначна. Они могут служить стимулами праймированных нейтрофилов и моноцитов, которые, активируясь, повреждают эндотелий сосудов в результате выброса протеолитических ферментов и активных форм кислорода [59]. Причем продукцию супероксид-анион радикала (САР) и ХЛ нейтрофилов могут провоцировать оба вида АНЦА [57]. При этом стимуляция НАДФН-оксидазы нейтрофилов протекает по механизму, сочетающему в себе элементы активационных каскадов форбол-12-миристат-13-ацетата (протеинкиназа С) и N формил-Мет-Лей-Фен (тирозинкиназы) [60] [20]. НАДФН-оксидаза может находится как на цитоплазматической мембране, так и мембране фаголизосом [61].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шеримова Аида Ержановна, 2018 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бекетова Т. В., Насонов Е. Л. Современные представления о классификации и лечении системных васкулитов, ассоциированных с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами: итоги 2011 г // Терапевтический архив. - 2012. - T. 84, № 5. - C. 68-74.

2. Моисеев С. В., Новиков П. И., Мешков А. Д., Иваницкий Л. В. АНЦА-ассоциированные васкулиты: спорные вопросы классификации, диагностики и оценки активности и современные подходы к лечению // Клиническая фармакология и терапия. - 2014. - T. 23, № 1. - C. 44-50.

3. Jennette J. C., Falk R. J., Bacon P. A., Basu N., Cid M. C., Ferrario F., Flores-Suarez L. F., Gross W. L., Guillevin L., Hagen E. C., Hoffman G. S., Jayne D. R., Kallenberg C. G., Lamprecht P., Langford C. A., Luqmani R. A., Mahr A. D., Matteson E. L., Merkel P. A., Ozen S., Pusey C. D., Rasmussen N., Rees A. J., Scott D. G., Specks U., Stone J. H., Takahashi K., Watts R. A. 2012 revised International Chapel Hill Consensus Conference Nomenclature of Vasculitides // Arthritis Rheum. - 2013. -T. 65, № 1. - C. 1-11.

4. Witko-Sarsat V., Daniel S., Noël L. H., Mouthon L. Neutrophils and B lymphocytes in ANCA-associated vasculitis // APMIS Suppl. - 2009. № 127. - C. 2731.

5. Hao J., Wang C., Yuan J., Chen M., Zhao M. H. A pro-inflammatory role of C5L2 in C5a-primed neutrophils for ANCA-induced activation // PLoS One. - 2013. -T. 8, № 6.

6. Muller Kobold A. C., Kallenberg C. G., Tervaert J. W. Monocyte activation in patients with Wegener's granulomatosis // Ann Rheum Dis. - 1999. - T. 58, № 4. - C. 237-45.

7. Keogan M. T., Esnault V. L., Green A. J., Lockwood C. M., Brown D. L. Activation of normal neutrophils by anti-neutrophil cytoplasm antibodies // Clin Exp Immunol. - 1992. - T. 90, № 2. - C. 228-34.

8. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. / Меньшикова Е. Б., Ланкин В. З., Зенков Н. К., Бондарь И. А., Круговых Н. Ф., Труфакин В. А. -М.: Фирма «Слово», 2006. - 556 с.

9. Davies K. J. Oxidative stress: the paradox of aerobic life // Biochem Soc Symp. - 1995. - T. 61. - C. 1-31.

10. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. / Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н. - СПб.: Фолиант, 2000. - 104 с.

11. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Книга 2. / Грызунов Ю. А., Добрецов Г. Е. - М.: ГЭОТАР, 1998.

12. Воробьева Н. В. Nadph-оксидаза нейтрофилов и заболевания, связанные с ее дисфункцией // Иммунология. - 2013. - T. 34, № 4.

13. Allen R. C. Neutrophil Leukocyte: Combustive Microbicidal Action and Chemiluminescence // J Immunol Res. - 2015. - T. 2015. - C. 794072.

14. Babior B. M. NADPH oxidase: an update // Blood. - 1999. - T. 93, № 5. - C. 1464-76.

15. Kallenberg C. G., Heeringa P., Stegeman C. A. Mechanisms of Disease: pathogenesis and treatment of ANCA-associated vasculitides // Nat Clin Pract Rheumatol. - 2006. - T. 2, № 12. - C. 661-70.

16. Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M. T., Mazur M., Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease // Int J Biochem Cell Biol. - 2007. - T. 39, № 1. - C. 44-84.

17. Владимиров Ю., Проскурина Е. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. - 2009. - T. 49, № 7. - C. 341-388.

18. Birben E., Sahiner U. M., Sackesen C., Erzurum S., Kalayci O. Oxidative stress and antioxidant defense // World Allergy Organ J. - 2012. - T. 5, № 1. - C. 9-19.

19. Miller D. M., Buettner G. R., Aust S. D. Transition metals as catalysts of "autoxidation" reactions // Free Radic Biol Med. - 1990. - T. 8, № 1. - C. 95-108.

20. Dupuy C., Virion A., Ohayon R., Kaniewski J., Deme D., Pommier J. Mechanism of hydrogen peroxide formation catalyzed by NADPH oxidase in thyroid plasma membrane // J Biol Chem. - 1991. - T. 266, № 6. - C. 3739-43.

21. Klebanoff S. J. Myeloperoxidase: friend and foe // J Leukoc Biol. - 2005. - T. 77, № 5. - C. 598-625.

22. Whiteman M., Spencer J. P., Jenner A., Halliwell B. Hypochlorous acid-induced DNA base modification: potentiation by nitrite: biomarkers of DNA damage by reactive oxygen species // Biochem Biophys Res Commun. - 1999. - T. 257, № 2. - C. 572-6.

23. Bergendi L., Benes L., Durackova Z., Ferencik M. Chemistry, physiology and pathology of free radicals // Life Sci. - 1999. - T. 65, № 18-19. - C. 1865-74.

24. Wink D. A., Miranda K. M., Espey M. G. Cytotoxicity related to oxidative and nitrosative stress by nitric oxide // Exp Biol Med (Maywood). - 2001. - T. 226, № 7. -C. 621-3.

25. Church D. F., Pryor W. A. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications // Environ Health Perspect. - 1985. - T. 64. - C. 111-26.

26. Hiltermann J. T., Lapperre T. S., van Bree L., Steerenberg P. A., Brahim J. J., Sont J. K., Sterk P. J., Hiemstra P. S., Stolk J. Ozone-induced inflammation assessed in sputum and bronchial lavage fluid from asthmatics: a new noninvasive tool in epidemiologic studies on air pollution and asthma // Free Radic Biol Med. - 1999. - T. 27, № 11-12. - C. 1448-54.

27. Nightingale J. A., Rogers D. F., Barnes P. J. Effect of inhaled ozone on exhaled nitric oxide, pulmonary function, and induced sputum in normal and asthmatic subjects // Thorax. - 1999. - T. 54, № 12. - C. 1061-9.

28. Cho A. K., Sioutas C., Miguel A. H., Kumagai Y., Schmitz D. A., Singh M., Eiguren-Fernandez A., Froines J. R. Redox activity of airborne particulate matter at different sites in the Los Angeles Basin // Environ Res. - 2005. - T. 99, № 1. - C. 40-7.

29. Matthay M. A., Geiser T., Matalon S., Ischiropoulos H. Oxidant-mediated lung injury in the acute respiratory distress syndrome // Crit Care Med. - 1999. - T. 27, № 9.

- C. 2028-30.

30. Comhair S. A., Thomassen M. J., Erzurum S. C. Differential induction of extracellular glutathione peroxidase and nitric oxide synthase 2 in airways of healthy individuals exposed to 100% O(2) or cigarette smoke // Am J Respir Cell Mol Biol. -2000. - T. 23, № 3. - C. 350-4.

31. Narayanan P. K., Goodwin E. H., Lehnert B. E. Alpha particles initiate biological production of superoxide anions and hydrogen peroxide in human cells // Cancer Res. - 1997. - T. 57, № 18. - C. 3963-71.

32. Chiu S. M., Xue L. Y., Friedman L. R., Oleinick N. L. Copper ion-mediated sensitization of nuclear matrix attachment sites to ionizing radiation // Biochemistry. -1993. - T. 32, № 24. - C. 6214-9.

33. Kinnula V. L., Crapo J. D. Superoxide dismutases in the lung and human lung diseases // Am J Respir Crit Care Med. - 2003. - T. 167, № 12. - C. 1600-19.

34. Kinnula V. L. Production and degradation of oxygen metabolites during inflammatory states in the human lung // Curr Drug Targets Inflamm Allergy. - 2005. -T. 4, № 4. - C. 465-70.

35. Arthur J. R. The glutathione peroxidases // Cell Mol Life Sci. - 2000. - T. 57, № 13-14. - C. 1825-35.

36. Manevich Y., Feinstein S. I., Fisher A. B. Activation of the antioxidant enzyme 1-CYS peroxiredoxin requires glutathionylation mediated by heterodimerization with pi GST // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2004. - T. 101, № 11. - C. 3780-5.

37. Bunker V. W. Free radicals, antioxidants and ageing // Med Lab Sci. - 1992. -T. 49, № 4. - C. 299-312.

38. El-Agamey A., Lowe G. M., McGarvey D. J., Mortensen A., Phillip D. M., Truscott T. G., Young A. J. Carotenoid radical chemistry and antioxidant/pro-oxidant properties // Arch Biochem Biophys. - 2004. - T. 430, № 1. - C. 37-48.

39. Галунска Б., Паскалев Д., Янкова Т., Чанкова П. Двуликий янус биохимии: мочевая кислота-оксидант или антиоксидант? // Нефрология. - 2004. -T. 8, № 4.

40. Kelly F. J., Mudway I. S. Protein oxidation at the air-lung interface // Amino Acids. - 2003. - T. 25, № 3-4. - C. 375-96.

41. Fuchs G. J. Antioxidants for children with kwashiorkor // BMJ. - 2005. - T. 330, № 7500. - C. 1095-6.

42. Halliwell B. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life // Plant Physiol. - 2006. - T. 141, № 2. - C. 312-22.

43. Системные некротизирующие васкулиты. / Семенкова Е. Н. - М.: Русский врач, 2001.

44. Stegeman C. A., Tervaert J. W., Sluiter W. J., Manson W. L., de Jong P. E., Kallenberg C. G. Association of chronic nasal carriage of Staphylococcus aureus and higher relapse rates in Wegener granulomatosis // Ann Intern Med. - 1994. - T. 120, № 1. - C. 12-7.

45. Popa E. R., Stegeman C. A., Abdulahad W. H., van der Meer B., Arends J., Manson W. M., Bos N. A., Kallenberg C. G., Tervaert J. W. Staphylococcal toxic-shock-syndrome-toxin-1 as a risk factor for disease relapse in Wegener's granulomatosis // Rheumatology (Oxford). - 2007. - T. 46, № 6. - C. 1029-33.

46. Wiik A. Clinical and pathophysiological significance of anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies in vasculitis syndromes // Mod Rheumatol. - 2009. - T. 19, № 6. - C. 590-9.

47. Savage C. O., Winearls C. G., Evans D. J., Rees A. J., Lockwood C. M. Microscopic polyarteritis: presentation, pathology and prognosis // Q J Med. - 1985. -T. 56, № 220. - C. 467-83.

48. Новиков П. И. Клиническая оценка вариантов течения и прогноза гранулематоза с полиангиитом (Вегенера): диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.01.04. - Москва, 2015. - 113 c.

49. Lanham J. G., Elkon K. B., Pusey C. D., Hughes G. R. Systemic vasculitis with asthma and eosinophilia: a clinical approach to the Churg-Strauss syndrome // Medicine (Baltimore). - 1984. - T. 63, № 2. - C. 65-81.

50. Моисеев С. В., Новиков П. И., Федоров К. Е., Жабина Е. С.

Эозинофильный гранулематоз с полиангиитом (Черга-Страусс): клинические варианты, диагностика и лечение // Клиническая фармакология и терапия. - 2013.

- T. 22, № 5. - C. 86-92.

51. Мухин Н. А., Новиков П. И., Моисеев С. В., Семенкова Е. Н., Козловская Л. В., Фомин В. В., Игнатова Т. М., Стрижаков Л. А., Гуляев С. В., Янушкевич Т. Н. Эффективность и безопасность генно-инженерных биологических препаратов у пациентов с ревматоидным артритом и другими ревматическими заболеваниями (проспективное неконтролируемое исследование) // Клин фармакол тер. - 2012. -T. 21, № 5. - C. 25-32.

52. Cartin-Ceba R., Peikert T., Specks U. Pathogenesis of ANCA-associated vasculitis // Curr Rheumatol Rep. - 2012. - T. 14, № 6. - C. 481-93.

53. Jennette J. C., Falk R. J. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-mediated disease // Nat Rev Rheumatol. - 2014. - T. 10, № 8. - C. 46373.

54. Griffiths H. R. ROS as signalling molecules in T cells—evidence for abnormal redox signalling in the autoimmune disease, rheumatoid arthritis // Redox Rep. - 2005.

- T. 10, № 6. - C. 273-80.

55. D'Autreaux B., Toledano M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2007. - T. 8, № 10.

- C. 813-24.

56. Charles L. A., Jennette J. C., Xiao H., Hu P. Complement in ANCA-associated vasculitis // Semin Nephrol. - 2013. - T. 33, № 6. - C. 557-64.

57. Falk R. J., Terrell R. S., Charles L. A., Jennette J. C. Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies induce neutrophils to degranulate and produce oxygen radicals in vitro // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1990. - T. 87, № 11. - C. 4115-9.

58. Millet A., Pederzoli-Ribeil M., Guillevin L., Witko-Sarsat V., Mouthon L. Antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitides: is it time to split up the group? // Ann Rheum Dis. - 2013. - T. 72, № 8. - C. 1273-9.

59. Salama A. D. Pathogenesis and treatment of ANCA-associated systemic

vasculitis // J R Soc Med. - 1999. - T. 92, № 9. - C. 456-61.

60. Radford D. J., Lord J. M., Savage C. O. The activation of the neutrophil respiratory burst by anti-neutrophil cytoplasm autoantibody (ANCA) from patients with systemic vasculitis requires tyrosine kinases and protein kinase C activation // Clin Exp Immunol. - 1999. - T. 118, № 1. - C. 171-9.

61. Bae Y. S., Lee J. H., Choi S. H., Kim S., Almazan F., Witztum J. L., Miller Y. I. Macrophages generate reactive oxygen species in response to minimally oxidized low-density lipoprotein: toll-like receptor 4- and spleen tyrosine kinase-dependent activation of NADPH oxidase 2 // Circ Res. - 2009. - T. 104, № 2. - C. 210-8, 21p following 218.

62. Ohta N., Fukase S., Aoyagi M. Study of peripheral neutrophil functions of patients with Wegener's granulomatosis // Arerugi. - 1994. - T. 43, № 9. - C. 1156-62.

63. Savage C. O., Pottinger B. E., Gaskin G., Pusey C. D., Pearson J. D. Autoantibodies developing to myeloperoxidase and proteinase 3 in systemic vasculitis stimulate neutrophil cytotoxicity toward cultured endothelial cells // Am J Pathol. -1992. - T. 141, № 2. - C. 335-42.

64. Lu X., Garfield A., Rainger G. E., Savage C. O., Nash G. B. Mediation of endothelial cell damage by serine proteases, but not superoxide, released from antineutrophil cytoplasmic antibody-stimulated neutrophils // Arthritis Rheum. - 2006. - T. 54, № 5. - C. 1619-28.

65. Wai Y. T., Williams J., Pall A., Wilkes M., Savage C. O., Adu D. Antineutrophil cytoplasm antibody-induced neutrophil nitric oxide production is nitric oxide synthase independent // Kidney international. - 2001. - T. 59, № 2. - C. 593-600.

66. Bruce I., McNally J., Bell A. Enhanced monocyte generation of reactive oxygen species in primary systemic vasculitis // J Rheumatol. - 1997. - T. 24, № 12. -C. 2364-70.

67. Weidner S., Neupert W., Goppelt-Struebe M., Rupprecht H. D. Antineutrophil cytoplasmic antibodies induce human monocytes to produce oxygen radicals in vitro // Arthritis Rheum. - 2001. - T. 44, № 7. - C. 1698-706.

68. Ames P. R., Alves J., Murat I., Isenberg D. A., Nourooz-Zadeh J. Oxidative stress in systemic lupus erythematosus and allied conditions with vascular involvement // Rheumatology (Oxford). - 1999. - T. 38, № 6. - C. 529-34.

69. Guilpain P., Chereau C., Goulvestre C., Servettaz A., Montani D., Tamas N., Pagnoux C., Hachulla E., Weill B., Guillevin L., Mouthon L., Batteux F. The oxidation induced by antimyeloperoxidase antibodies triggers fibrosis in microscopic polyangiitis // Eur Respir J. - 2011. - T. 37, № 6. - C. 1503-13.

70. Ohlsson S. M., Ohlsson S., Söderberg D., Gunnarsson L., Pettersson Ä., Segelmark M., Hellmark T. Neutrophils from vasculitis patients exhibit an increased propensity for activation by anti-neutrophil cytoplasmic antibodies // Clin Exp Immunol. - 2014. - T. 176, № 3. - C. 363-72.

71. Barnado A., Crofford L. J., Oates J. C. At the Bedside: Neutrophil extracellular traps (NETs) as targets for biomarkers and therapies in autoimmune diseases // J Leukoc Biol. - 2016. - T. 99, № 2. - C. 265-78.

72. Zhong X. Y., von Mühlenen I., Li Y., Kang A., Gupta A. K., Tyndall A., Holzgreve W., Hahn S., Hasler P. Increased concentrations of antibody-bound circulatory cell-free DNA in rheumatoid arthritis // Clin Chem. - 2007. - T. 53, № 9. -C. 1609-14.

73. Neeli I., Khan S. N., Radic M. Histone deimination as a response to inflammatory stimuli in neutrophils // J Immunol. - 2008. - T. 180, № 3. - C. 1895-902.

74. Remijsen Q., Vanden Berghe T., Wirawan E., Asselbergh B., Parthoens E., De Rycke R., Noppen S., Delforge M., Willems J., Vandenabeele P. Neutrophil extracellular trap cell death requires both autophagy and superoxide generation // Cell Res. - 2011. - T. 21, № 2. - C. 290-304.

75. Fuchs T. A., Abed U., Goosmann C., Hurwitz R., Schulze I., Wahn V., Weinrauch Y., Brinkmann V., Zychlinsky A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps // J Cell Biol. - 2007. - T. 176, № 2. - C. 231-41.

76. Kuma A., Hatano M., Matsui M., Yamamoto A., Nakaya H., Yoshimori T., Ohsumi Y., Tokuhisa T., Mizushima N. The role of autophagy during the early neonatal

starvation period // Nature. - 2004. - T. 432, № 7020. - C. 1032-6.

77. Eskelinen E. L., Saftig P. Autophagy: a lysosomal degradation pathway with a central role in health and disease // Biochim Biophys Acta. - 2009. - T. 1793, № 4. - C. 664-73.

78. Ermert D., Urban C. F., Laube B., Goosmann C., Zychlinsky A., Brinkmann V. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections // J Innate Immun. - 2009. -T. 1, № 3. - C. 181-93.

79. Fang F. C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies // Nat Rev Microbiol. - 2004. - T. 2, № 10. - C. 820-32.

80. Papayannopoulos V., Metzler K. D., Hakkim A., Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps // J Cell Biol. - 2010. - T. 191, № 3. - C. 677-91.

81. Almyroudis N. G., Grimm M. J., Davidson B. A., Röhm M., Urban C. F., Segal B. H. NETosis and NADPH oxidase: at the intersection of host defense, inflammation, and injury // Front Immunol. - 2013. - T. 4. - C. 45.

82. Kessenbrock K., Krumbholz M., Schönermarck U., Back W., Gross W. L., Werb Z., Gröne H. J., Brinkmann V., Jenne D. E. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis // Nat Med. - 2009. - T. 15, № 6. - C. 623-5.

83. Nakazawa D., Shida H., Tomaru U., Yoshida M., Nishio S., Atsumi T., Ishizu A. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis // J Am Soc Nephrol. - 2014. - T. 25, № 5. - C. 990-7.

84. Keshari R. S., Jyoti A., Kumar S., Dubey M., Verma A., Srinag B. S., Krishnamurthy H., Barthwal M. K., Dikshit M. Neutrophil extracellular traps contain mitochondrial as well as nuclear DNA and exhibit inflammatory potential // Cytometry A. - 2012. - T. 81, № 3. - C. 238-47.

85. Wang Y., Wang W., Wang N., Tall A. R., Tabas I. Mitochondrial Oxidative Stress Promotes Atherosclerosis and Neutrophil Extracellular Traps in Aged Mice // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2017. - T. 37, № 8. - C. 99-107.

86. Pitocco D., Tesauro M., Alessandro R., Ghirlanda G., Cardillo C. Oxidative stress in diabetes: implications for vascular and other complications // Int J Mol Sci. -2013. - T. 14, № 11. - C. 21525-50.

87. Das P., Biswas S., Mukherjee S., Bandyopadhyay S. K. Association of Oxidative Stress and Obesity with Insulin Resistance in Type 2 Diabetes Mellitus // Mymensingh Med J. - 2016. - T. 25, № 1. - C. 148-52.

88. Du X., Stocklauser-Färber K., Rösen P. Generation of reactive oxygen intermediates, activation of NF-kappaB, and induction of apoptosis in human endothelial cells by glucose: role of nitric oxide synthase? // Free Radic Biol Med. -1999. - T. 27, № 7-8. - C. 752-63.

89. Gupta S., Chough E., Daley J., Oates P., Tornheim K., Ruderman N. B., Keaney J. F. Hyperglycemia increases endothelial superoxide that impairs smooth muscle cell Na+-K+-ATPase activity // Am J Physiol Cell Physiol. - 2002. - T. 282, № 3. - C. C560-6.

90. Nishikawa T., Edelstein D., Du X. L., Yamagishi S., Matsumura T., Kaneda Y., Yorek M. A., Beebe D., Oates P. J., Hammes H. P., Giardino I., Brownlee M. Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage // Nature. - 2000. - T. 404, № 6779. - C. 787-90.

91. Mullarkey C. J., Edelstein D., Brownlee M. Free radical generation by early glycation products: a mechanism for accelerated atherogenesis in diabetes // Biochem Biophys Res Commun. - 1990. - T. 173, № 3. - C. 932-9.

92. Ahmad W., Ijaz B., Shabbiri K., Ahmed F., Rehman S. Oxidative toxicity in diabetes and Alzheimer's disease: mechanisms behind ROS/ RNS generation // J Biomed Sci. - 2017. - T. 24, № 1. - C. 76.

93. Gerber P. A., Rutter G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus // Antioxid Redox Signal. -2017. - T. 26, № 10. - C. 501-518.

94. Domingueti C. P., Dusse L. M., Carvalho M., de Sousa L. P., Gomes K. B., Fernandes A. P. Diabetes mellitus: The linkage between oxidative stress, inflammation,

hypercoagulability and vascular complications // J Diabetes Complications. - 2016. - T. 30, № 4. - C. 738-45.

95. Inoguchi T., Nawata H. NAD(P)H oxidase activation: a potential target mechanism for diabetic vascular complications, progressive beta-cell dysfunction and metabolic syndrome // Curr Drug Targets. - 2005. - T. 6, № 4. - C. 495-501.

96. Savu O., Ionescu-Tirgoviste C., Atanasiu V., Gaman L., Papacocea R., Stoian I. Increase in total antioxidant capacity of plasma despite high levels of oxidative stress in uncomplicated type 2 diabetes mellitus // J Int Med Res. - 2012. - T. 40, № 2. - C. 709-16.

97. Marra G., Cotroneo P., Pitocco D., Manto A., Di Leo M. A., Ruotolo V., Caputo S., Giardina B., Ghirlanda G., Santini S. A. Early increase of oxidative stress and reduced antioxidant defenses in patients with uncomplicated type 1 diabetes: a case for gender difference // Diabetes Care. - 2002. - T. 25, № 2. - C. 370-5.

98. Pitocco D., Di Stasio E., Romitelli F., Zaccardi F., Tavazzi B., Manto A., Caputo S., Musella T., Zuppi C., Santini S. A., Ghirlanda G. Hypouricemia linked to an overproduction of nitric oxide is an early marker of oxidative stress in female subjects with type 1 diabetes // Diabetes Metab Res Rev. - 2008. - T. 24, № 4. - C. 318-23.

99. Aouacheri O., Saka S., Krim M., Messaadia A., Maidi I. The investigation of the oxidative stress-related parameters in type 2 diabetes mellitus // Can J Diabetes. -2015. - T. 39, № 1. - C. 44-9.

100. Tupe R. S., Diwan A. G., Mittal V. D., Narayanam P. S., Mahajan K. B. Association of plasma proteins at multiple stages of glycation and antioxidant status with erythrocyte oxidative stress in patients with type 2 diabetes // Br J Biomed Sci. -2014. - T. 71, № 3. - C. 93-9; quiz 138.

101. Schaffer S. W., Jong C. J., Mozaffari M. Role of oxidative stress in diabetesmediated vascular dysfunction: unifying hypothesis of diabetes revisited // Vascul Pharmacol. - 2012. - T. 57, № 5-6. - C. 139-49.

102. Ceriello A., Mercuri F., Quagliaro L., Assaloni R., Motz E., Tonutti L., Taboga C. Detection of nitrotyrosine in the diabetic plasma: evidence of oxidative stress

// Diabetologia. - 2001. - T. 44, № 7. - C. 834-8.

103. Tannous M., Rabini R. A., Vignini A., Moretti N., Fumelli P., Zielinski B., Mazzanti L., Mutus B. Evidence for iNOS-dependent peroxynitrite production in diabetic platelets // Diabetologia. - 1999. - T. 42, № 5. - C. 539-44.

104. Gao L., Mann G. E. Vascular NAD(P)H oxidase activation in diabetes: a double-edged sword in redox signalling // Cardiovasc Res. - 2009. - T. 82, № 1. - C. 920.

105. Kartha G. K., Moshal K. S., Sen U., Joshua I. G., Tyagi N., Steed M. M., Tyagi S. C. Renal mitochondrial damage and protein modification in type-2 diabetes // Acta Diabetol. - 2008. - T. 45, № 2. - C. 75-81.

106. Tibaut M., Petrovic D. Oxidative Stress Genes, Antioxidants and Coronary Artery Disease in Type 2 Diabetes Mellitus // Cardiovasc Hematol Agents Med Chem. - 2016. - T. 14, № 1. - C. 23-38.

107. Ates I., Kaplan M., Yuksel M., Mese D., Alisik M., Erel O., Yilmaz N., Guler S. Determination of thiol/disulphide homeostasis in type 1 diabetes mellitus and the factors associated with thiol oxidation // Endocrine. - 2016. - T. 51, № 1. - C. 47-51.

108. Hernandez-Perez M., Chopra G., Fine J., Conteh A. M., Anderson R. M., Linnemann A. K., Benjamin C., Nelson J. B., Benninger K. S., Nadler J. L., Maloney D. J., Tersey S. A., Mirmira R. G. Inhibition of 12/15-Lipoxygenase Protects Against beta-Cell Oxidative Stress and Glycemic Deterioration in Mouse Models of Type 1 Diabetes // Diabetes. - 2017. - T. 66, № 11. - C. 2875-2887.

109. Mukhtyar C., Lee R., Brown D., Carruthers D., Dasgupta B., Dubey S., Flossmann O., Hall C., Hollywood J., Jayne D., Jones R., Lanyon P., Muir A., Scott D., Young L., Luqmani R. A. Modification and validation of the Birmingham Vasculitis Activity Score (version 3) // Ann Rheum Dis. - 2009. - T. 68, № 12. - C. 1827-32.

110. Suppiah R., Mukhtyar C., Flossmann O., Alberici F., Baslund B., Batra R., Brown D., Holle J., Hruskova Z., Jayne D. R., Judge A., Little M. A., Palmisano A., Stegeman C., Tesar V., Vaglio A., Westman K., Luqmani R. A cross-sectional study of the Birmingham Vasculitis Activity Score version 3 in systemic vasculitis //

Rheumatology (Oxford). - 2011. - T. 50, № 5. - C. 899-905.

111. Алексеев А. В., Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Определение антиоксидантов методом активированной хемилюминесценции с использованием 2, 2'-азо-бис (2-амидинопропана) // Вестник Московского университета. Серия 2: Химия. - 2012. - T. 53, № 3. - C. 187-193.

112. Образцов И. В., Годков М. А., Полимова А. М., Дёмин Е. М., Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Оценка функциональной активности нейтрофилов цельной крови методом двухстадийной стимуляции: новый подход к хемилюминесцентному анализу // Российский иммунологический журнал. - 2015.

- T. 9, № 4. - C. 418-425.

113. Созарукова М. М., Проскурнина Е. В., Владимиров Ю. А. Сывороточный альбумин как источник и мишень свободных радикалов в патологии // Вестник Российского государственного медицинского университета.

- 2016. № 1. - C. 61-67.

114. Giacco F., Brownlee M. Oxidative stress and diabetic complications // Circ Res. - 2010. - T. 107, № 9. - C. 1058-70.115. Csernok E., Ernst M., Schmitt W., Bainton D. F., Gross W. L. Activated neutrophils express proteinase 3 on their plasma membrane in vitro and in vivo // Clin Exp Immunol. - 1994. - T. 95, № 2. - C. 244-50.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Метод определения антиоксидантной активности плазмы крови методом кинетической люминол-активированной хемилюминесценции

Для оценки антиоксидантной емкости плазмы крови использовали модифицированную методику[12], основанную на подавлении хемилюминесценции (ХЛ). В качестве источника свободных радикалов в системе использовали диазосоединение - 2'-азо-бис(2амидинопропан) дигидрохлорид (АБАП; Fluka, США). В качестве хемилюминесцентного зонда использовали люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид 3-аминофталевой кислоты, (C8H7N3O2; Sigma- Aldrich, США, М=177,16). Хемилюминесцентный анализ плазмы проводили на однокюветном хемилюминометре SmartLum 5773 (ДИСофт, Россия).

В микропробирку объемом 1,5 мл помещали 50,0 мкл 50 мМ раствора АБАП и 20,0 мкл 0,1 мМ люминола. Смесь перемешивали в течение двух минут на встряхивателе «Vortex yellow line tts2» при частоте 1400 об/мин и инкубировали 20 минут в темноте при комнатной температуре. Образование свободных радикалов в системе инициировали добавлением в кювету 930 мкл нагретого (37°С) фосфатного буферного раствора (100мМ КН2РО4, рН 7,4; Sigma, США) к 70,0 мкл смеси АБАП и люминола. Помещали пробирку в кюветное отделение хемилюминометра. Регистрировали свечение до достижения стационарного уровня (/о) при 37°С, затем добавляли 10 мкл плазмы крови, предварительно разбавленной в 10 раз. После добавления плазмы крови свечение прекращалось благодаря нейтрализации радикалов антиоксидантами плазмы крови, прежде всего, мочевой кислотой. После расходования антиоксидантов свечение вновь нарастало и достигало нового стационарного уровня / (рис. П6), превышение которого над уровнем ХЛ до добавления плазмы служит показателем прооксидантного действия белков крови. Общий объем пробы в кювете составлял 1,000 мл.

^ 3,0 ф

и

* 2,0

X

1,0

0,0

"с, В

I |Ц|МШЛ

0

5

10

15

", В

20

25

30

Время, мин

Рис. П6. Типичная кривая развития хемилюминесценции при исследовании антиоксидантных свойств плазмы крови. Аналитические сигналы: Б (В*с) -интегральная сумма (площадь над кривой), 1о (В) - исходный уровень образования свободных радикалов, задаваемый введением определенного количества АБАП, I (В) - уровень свечение, достигаемый после введения плазмы.

Принцип метода кинетической хемилюминесценции заключается в регистрации и обработке полной кривой развития ХЛ во времени. В качестве аналитических сигналов использовали: £ - площадь над кривой, М0 -относительный прирост ХЛ. после добавления плазмы к системе.

Оценка функциональной активности нейтрофильного звена лейкоцитов методом люминол-активированной хемилюминесценции

Подход оценки функциональной активности нейтрофилов в цельной крови основан на регистрации развития во времени свечения нейтрофилов, стимулированных последовательно двумя веществами с разным механизмом действия (Образцов И.В., 2015/2016). На первом этапе нейтрофилы стимулировали форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) с внутриклеточным

81

механизмом действия, на втором этапе проводили основную стимуляцию формил-метионил-лейцил-фенилаланином (фМЛФ), стимула с внеклеточным механизмом действия. Двойная стимуляция приводит к максимально полному ответу нейтрофилов, следовательно, к улучшению чувствительности и точности получаемых результатов.

В кювету, содержащую раствор Хенкса, стабилизированный HEPES (Sigma-Aldricg, США) и люминол в конечной концентрации 45 мкМ, помещали цельную кровь, отобранную в вакутейнеры с гепарином, в конечной концентрации 4,5% (45 мкл на 1,000 мл раствора в кювете) и регистрировали спонтанную ХЛ в течение 12 минут, затем вносили стимул ФМА (конечная концентрация в кювете 50 нг/мл; Sigma-Aldricg, США). После 20 минут инкубации проводили стимуляцию фМЛФ (конечная концентрация 10 мкМ; Sigma-Aldricg, США) и регистрировали индуцированный ХЛ ответ в течение не менее 60 мин (Рис. П7).

Основная стимуляция 3

0 10 20 30 40 50 60 70 80

время, мин

Рис.П7. Типичная кривая развития ХЛ при двойной стимуляции

нейтрофилов: (1) — спонтанная ХЛ, (2) — предстимуляция ФМА, (3) — основная

стимуляция фМЛФ. Стрелками обозначены моменты добавления стимулов.

Анализ всей кинетической кривой позволяет значительно повысить

информативность метода. Изучали аналитические показатели — среднюю

82

активность нейтрофила, коэффициент затухания (А2М^) и 5фмлф, полученные данные сравнивали с контрольной группой (практически здоровые доноры; Образцов И.В., 2015/2016).

Дополнительный метод математической обработки кривой -деконволюция

Для деконволюции кривых разработан программный модуль на базе платформы LabView (разработчик А.Ю. Рябов), который позволяет разложить итоговый контур для экспоненциально-квадратичные составляющие.

В результате деконволюции каждая кривая может быть разложена на три составляющие:

а) ФМА-индуцированная продукция АФК (красная кривая)

б) быстрая вспышка фМЛФ-индуцированной кривой, возможно, вызванная продукцией АФК цитоплазматической НАДФН-оксидазой (зеленая кривая)

в) медленная вспышка, возможно, вызванная АФК НАФДН-оксидазы фаголизосом.

Для каждой кривой считают время наступления максимума t1, ?2, Ь и светосумму за 3000 секунд 51, 52, S3.

Метод наглядно демонстрирует вклады различных источников продукции АФК в нейтрофилах.

Метод оценки уровня окислительного стресса в крови по степени окисленности альбумина, оцененная методом флуоресценции

Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре КЕ-5301РС (SHIMADZU, Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1,00 см.

Альбумин предварительно выделяли из плазмы. Для этого к 100 мл плазмы крови добавляли равное количество насыщенного раствора сульфата аммония ((N^^04, Sigma-Aldrich, США). При этом глобулиновая фракция осаждалась, а альбуминовая оставалась в растворе. Полученную смесь перемешивали на

встряхивателе, образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течение 10 минут при 450 g (микроцентрифуга MiniSpin — Eppendorf, Нидерланды). Использование сульфата аммония в качестве высаливателя на результаты спектрофлуориметрических исследований мешающего влияния не оказывало

Выделенный САЧ предварительно разбавляли в 500 раз в 100 мМ ФБ (рН 7,4) и одновременно регистрировали спектр флуоресценции и спектр поглощения. Для расчета доли окисленного альбумина использовали формулу:

ДОА = ^

1о

где I - флуоресценция выделенного из плазмы крови альбумина (335 нм), I0 -теоретическая флуоресценция САЧ, рассчитанная с использованием градуировочной зависимости 1фл (335 нм) = 0,6688-с (САЧ, мкг/мл). Содержание САЧ в кварцевых кюветах рассчитывали спектрофотометрически при 225 нм, использую градуировочную зависимость: А (225 нм) = 0,0063-c (САЧ, мкг/мл).

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Birmingham Vasculitis Activity Score (version 3) Patient ID: Date of birth:

Total score:

Assessor: Date of assessment

Tick an item only if attributable to active vasculitis If there are no abnormalities in a section, please tick 'None' for that organ-system. If all abnormalities are due to persistent disease (active vasculitis which is not new/worse in the prior 4 weeks), tick the PERSISTENT box at the bottom right corner

Is this the patient's first assessment? Yes O No O

None Active disease None Active disease

I.General O Myalgia O Arthralgia 1 arthritis O Fever >38° C O Weight loss >2 kg O 6. Cardiovascular O Loss of pulses O Valvular heart disease O Pericarditis O Ischaemic cardiac pain O Cardiomyopathy O Congestive cardiac failure O

2. Cutaneous O Infarct O Purpura O Ulcer O Gangrene O Other skin vasculitis O

7. Abdominal O Peritonitis O Bloody diarrhoea O Ischaemic abdominal pain O

3. Mucous membranes 1 q eyes Mouth ulcers O Genital ulcers O Adnexal inflammation O Significant proptosis O Scleritis i Episcleritis O Conjunctivitis / Blepharitis / Keratitis O Blurred vision O Sudden visual loss O Uveitis O Retinal changes (vasculitis / thrombosis I exudate / O haemorrhaqe) 8. Renal O Hypertension O Proteinuria >1+ O Haematuria >10 RBCs/hpf O Serum creatinine 125-249 pmol/L* O Serum creatinine 250-499 pmol/L" O Serum creatinine >500 pmol/L' O Rise in serum creatinine >30% or fall in ^ creatinine clearance >25% 'Can only be scored on the first assessment

9. Nervous system O Headache O Meningitis O Organic confusion O Seizures (not hypertensive) O Cerebrovascular accident O Spinal cord lesion O Cranial nerve palsy O Sensory peripheral neuropathy O Mononeuritis multiplex O

4. ENT O Bloody nasal discharge 1 crusts 1 O ulcers / granulomata Paranasal sinus involvement O Subglottic stenosis O Conductive hearing loss O Sensorineural hearing loss O

5. Chest O Wheeze O Nodules or cavities O Pleural effusion / pleurisy O Infiltrate O Endobronchial involvement O Massive haemoptysis / alveolar _ haemorrhage q Respiratory failure

10. Other O a O b. O c O d. O

PERSISTENT DISEASE ONLY: (Tick here if all the abnormalities are due to persistent disease)

References:

Version 1 : Luqmani, RA, et al. (1994). "Birmingham Vasculitis Activity Score (BVAS) in systemic necrotizing vasculitis." QJM 87[11):671-8. Version 2: Luqmani. RA, et al. (1997). "Disease assessment and management of the vasculites." Baillieres Clin Rheumatol 11(2): 423-4G. Version 3: Mukhtyar C, et al (2008). "Modification and validation of the Birmingham Vasculitis Activity Score (version 3) Ann Rheum Dis. 2008 Dec 3. [Epub ahead of print]

VASCULITIS DAMAGE INDEX (VDI)

This is for recording organ damage that has occurred in patients since the onset of vasculitis Patients often have co-morbidity before they develop vasculitis, which must not be scored Record features of active disease using the Birmingham Vasculitis Activity Score (BVAS) A new patient should usually have a VDI score of zero, unless:

(a) they have had vasculitis for more than three months of onset of disease, and

(b) the damage has developed or become worse since the onset of vasculitis

1. Musculoskeletal No Yes

None □

Significant muscle atrophy or weakness O

Deforming/erosive arthritis O

Osteoporosis/vertebral collapse O

Avascular necrosis O

Osteomyelitis O

2. Skin^Mucous membranes

None □

Alopecia O

Cutaneous ulcers O

Mouth ulcers O

3. Ocular

None □

Cataract O

Retinal change O

Optic atrophy O

Visual impairment'diplopia O

Blindness in one eye O

Blindness in second eye O

Orbital wall destruction O

4. ENT

None □

Hearing loss O

Nasal blockage/chronic discharge/crusting O

Nasal bridge collapse/septa I perforation O

Chronic sinusitis/radiological damage O

Subglotticstenosis(nosurgery) O

Subglottic stenosis (with surgey) O

5. Pulmonary

None □

Pulmonary hypertention O

Pulmonary fibrosis O

Pulmonary infarction O

Pleural fibrosis O

Chronic asthma O

Chronic breathlessness O

Impaired lung function O

6. Cardiovascular

None □

Angina angioplasty O

Myocardial infarction O

Subsequent myocardial infarction O

Cardiomyopathy O

Valvular disease O

Pericaritis > 3 mths or pericardectomy O

Diastolic BP > 95 or requiring O antihypertensives

Name

Trial Number

Date

Centre

7. Peripheral vascular disease No Yes

None □

Absent pulses in one limb O

2"i episode of absent pulses in one limb O

Major vessel stenosis O

Claudication >3 mths O

Minor tissue loss O

Major tissue loss O

Subsequent major tissue loss O

Complicated venous thrombosis O

8. Gastrointestinal

None □

Gut infarction/resection O

Mesenteric insufficiency/pancreatitis O

Chronic peritonitis O

Oesophageal stricture/surgery O

9. Renal

None □

Estimated/measured GFR < 50% O

Proteinuria > 0.5g/24hr O

End stage renal disease O

10. Neuropsychiatrie

None □

Cognitive impairment O

Major psychosis O

Seizures O

Cerebrovascular accident O

2rri cerebrovascular accident O

Cranial nerve lesion O

Peripheral neuropathy O

Transverse myelitis O

11. Other

None □

Gonadal failure O

Marrow failure O

Diabetes O

Chemical cystitis O

Malignancy O

Other O

Total VDI Score. Record the number of positive Items (1 point for each). The VDI score can either increase or remain the same over time. Remember to carry forward any previous items of damage