Разработка методов получения рекомбинантных белков-цитокинов на примере γ-интерферона, интерлейкина-3 и фактора некроза опухолей- α тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Печенов, Сергей Евгеньевич

• Печенов, Сергей Евгеньевич
• кандидат химических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат химических наук Печенов, Сергей Евгеньевич

Список сокращений.

Введение.

1. Литературный обзор "Методы получения рекомбинантных белков, структура и свойства фактора некроза опухолей-a, у-интерферона и интерлейкина-3."

1.1 Методы получения рекомбинантных белков.

1.1.1 Выбор системы экспрессии при получении рекомбинантных белков.

1.1.2 Ренатурация белка in vivo в Е. coli.

1.1.3 Ренатурация in vitro белков, экспрессируемых в

Е. coli в виде тел включения.

1.2 Фактор некроза опухолей альфа - структура и свойства.

1.2.1 Продукция a-фактора некроза опухолей человека (а-ФНО).

1.2.2 Молекулярная структура а-ФНО.

1.2.3 Биологически активная форма а-ФНО.

1.2.4 Изучение функционально важных участков молекулы а-ФНО.

1.2.5 Механизмы противоопухолевого и цитотоксического действия а-ФНО.

1.2.6 Токсичность а-ФНО.

1.2.7 Методы получения а-ФНО.

1.3 Гамма-интерферон: структура и биологическое действие.

1.3.1 Анализ первичной структуры гамма-интерферона у-ИФН). а) Анализ последовательности нуклеотидов гена б) Последовательность аминокислот природного у-ИФН в) Последовательность аминокислот рекомбинантного у-ИФН из трансформированных клеток Е. coli.

1.3.2 Вторичная и третичная структура у-ИФН.

1.3.3 Влияние С- и N-концевых аминокислотных последовательностей молекулы у-ИФН на конформацию и биологическую активность.

1.3.4 Механизм биологического действия у-ИФН.

1.3.5 Стабильность у-ИФН и методы ее повышения.

1.3.6 Методы выделения и очистки у-ИФН, экспрессируемого в Е. coli.

1.4. Интерлейкин-3: структура и биологическое действие.

1.4.1 Биосинтез ИЛ-3 клетками.

1.4.2 Молекулярная структура ИЛ-3.

1.4.3 Механизм биологического действия ИЛ-3.

1.4.4 Методы выделения и очистки ИЛ-3, экспрессируемого Е. coli.

2. Обсуждение результатов

2.1 Разработка метода выделения и очистки а-ФНО.

2.1.1 Разработка метода выделения и очистки а-ФНО дикого типа.

2.1.2 Выделение и очистка мутантного а-ФНО.

2.2 Выделение и очистка у-ИФН. Получение стабильных аналогов у-ИФН и их исследование.

2.2.1 Разработка метода выделения, очистки и ренатурации у-ИФН дикого типа.

2.2.2 Получение мутантных аналогов у-ИФН и исследование их свойств.

2.2.2.1 Выделение, очистка и ренатурация мутантных аналогов у-ИФН.

2.2.2.2 Изучение влияния введения дисульфидной связи, С-концевого укорочения и концевой замены и их комбинаций на свойства у-ИФН.

2.3 Разработка метода выделения, очистки и ренатурации ИЛ-3 человека, экспрессируемого в клетках Е. coli.

2.4 Исследование ренатурации.

2.4.1 Исследование влияния параметров реакционной среды.

2.5.1.1 Влияние клеточных компонентов.

2.4.1.2 Влияние рН реакционной среды.

2.4.1.3 Влияние концентрации белка и температуры среды.

2.4.1.4 Влияние окислительно-восстановительного потенциала.

2.4.1.5 Влияние природы реакционной среды.

2.4.2 Кинетика ренатурации.

2.5 Унифицированная схема получения рекомбинантных белков.

3. Экспериментальная часть.

4. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов получения рекомбинантных белков-цитокинов на примере γ-интерферона, интерлейкина-3 и фактора некроза опухолей- α»

Биотехнология рекомбинантных белков медицинского назначения в настоящее время является одной из наиболее перспективных, динамически развивающихся областей науки и производства в мире. На мировом рынке реализуются уже около 100 коммерческих лекарственных препаратов на основе рекомбинантных белков, которые составляют все более реальную альтернативу обычным лекарственным средствам. Ещё десятки препаратов, прошедших клинические испытания, находятся на стадии регистрации и начала производства. Большое количество белков находятся на клинических испытаниях [1].

Цитокины - полипептиды, относящиеся к семейству гормоноподобных молекул, которые действуют на различные типы клеток и участвуют в регуляции иммунных и воспалительных процессов. Человеческие белки-цитокины - фактор некроза опухолей-альфа (а-ФНО), гамма-интерферон (у-ИФН), и интерлейкин-3 (ИЛ-3) - перспективны с точки зрения их медицинского применения. а-ФНО обладает противоопухолевой и цитотоксической активностью. Возможное клиническое использование а-ФНО связано с его противоопухолевой, а в сочетании с у-ИФН и интерлейкинами антивирусной активностью [2]. у-ИФН проявляет противовирусное, антипролиферативное и иммунорегулирующие действия. Применяется для лечения различных заболеваний, в том числе и таких тяжелых, как рак и артрит [3, 4]. Механизм действия ИЛ-3 исследуется до сих пор, но уже имеются данные о применении его как лекарственного препарата при лечении больных с недостаточностью функции костного мозга при прогрессирующих опухолевых заболеваниях, лечении рака легких и апластической анемии [5, 6]. Важно отметить, что в различных физиологических процессах цитокины действуют синергично; так, эффект а-ФНО усиливается у-ИФН при действии на злокачественные опухоли [7].

Часто природные белки имеют характеристики, осложняющие их терапевтическое использование. Клинические испытания а-ФНО ограничиваются высокой системной токсичностью при концентрациях выше 500 Е/мл крови [8]. Низкая стабильность у-ИФН создает сложности при медико-биологических испытаниях, при приготовлении и хранении лекарственных препаратов [9, 10]. В отличие от других цитокинов и интерферонов, у-ИФН не содержит в своей последовательности остатков цистина, а биологическую активность проявляет в виде нековалентно связанного димера, что и обуславливает его низкую стабильность. Многообещающим походом к решению таких проблем является создание методами белковой инженерии мутантных аналогов а-ФНО с меньшей системной токсичностью и воспалительными свойствами и аналогов у-ИФН, обладающих повышенной стабильностью и биологической активностью.

Для широкого исследования свойств белков и проведения клинических испытаний требуется разработка эффективных методов их получения. В настоящее время подавляющее большинство новых белковых препаратов медицинского назначения получается выделением из генетически трансформированных клеток. Среди большого количества микробиологических систем, доступных для продуцирования рекомбинантных белков, грам-отрицательная бактерия Escherichia coli является одной из широко используемых.

Экспрессия рекомбинантных белков в Е. coli может достигать 50% от всего клеточного белка. Но клеточный аппарат бактериальных систем, за редким исключением, не способствует полной ренатурации рекомбинантного белка. При так называемой "сверхэкспрессии" белка часто образуются тела включения -нерастворимые агрегаты целевого рекомбинантного белка и его комплексы с клеточными белками и небелковыми компонентами. Образование тел включения дает возможность легко отделить целевой белок от водорастворимых клеточных компонентов. Но для получения биологически активного белка необходимо его ренатурировать. Как правило, опубликованные в литературе методы получения белков не всегда позволяют достичь высокого выхода целевого продукта, зачастую дороги, трудоемки и требуют больших временных затрат.

Методы выделения, очистки и ренатурации сильно различаются для каждого получаемого рекомбинантного белка. Наличие клеточных примесей -нуклеиновых кислот, гидрофобных компонентов и клеточных белков, снижает эффективность ренатурации, являющейся ключевой стадией получения рекомбинантного белка в биологически активной форме. Поэтому выбор методов выделения и очистки белка определяет правильное и эффективное протекание ренатурации и производительность всего процесса получения рекомбинантного белка. Таким образом, исследование ренатурации является самостоятельной важной задачей.

Разработка эффективных методов получения названных рекомбинантных белков являлась основной задачей настоящей работы. Большое внимание уделялось исследованию ренатурации.