Разработка модели немиелоаблативного кондиционирования при пересадках костного мозга у мышей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Гринько Екатерина Константиновна

• Гринько Екатерина Константиновна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Гринько Екатерина Константиновна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Соответствие темы диссертации паспорту научной специальности

Степень разработанности темы исследования

Цель исследования

Задачи исследования

Научная новизна работы

Теоретическая значимость работы

Практическая значимость работы

Внедрение результатов исследования в практику

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Апробация результатов

Личный вклад автора

Полнота изложения материалов диссертации в опубликованных работах

Объем и структура диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

1.2. Показания для ТГСК

1.3. Осложнения ТГСК

1.4. Костномозговой химеризм и иммунная толерантность

1.5. Кондиционирование реципиентов перед ТГСК

1.6. Использование моноклональных антител для немиелоаблативного кондиционирования с формированием толерантности на модели мышей

1.7. Использование моноклональных антител для немиелоаблативного кондиционирования с формированием толерантности в доклинических исследованиях на модели нечеловеческих приматов (НЧП)

1.8. Использование моноклональных антител для немиелоаблативного кондиционирования с формированием толерантности в клинике

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.1.1. Животные

2.1.2. Антитела

2.1.3. Лекарственные препараты и другие реактивы

2.2. Методы исследования

2.2.1. Метод и обстоятельства эвтаназии

2.2.2. Облучение животных

2.2.3. Трансплантация аллогенных клеток костного мозга кондиционированным реципиентам

2.2.4. Цитометрическая оценка уровня химеризма и динамики восстановления клеток лимфоидных органов мышей после различных способов кондиционирования реципиентов

2.2.5. Хирургические операции на аллогенных химерах

2.2.6. Трансплантация аллогенного кожного лоскута

2.2.7. Трансплантация аллогенного тимуса

2.2.8. Введение препаратов животным при отработке режима кондиционирования мышей линии ВАЬВ/с с помощью МАТ

2.2.9. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Определение уровня химеризма в крови и лимфоидных органах реципиентов

3.2. Подбор минимальной дозы облучения

3.3. Модель немиелоаблативного кондиционирования с помощью облучения на мышах

3.4. Модель немиелоаблативного кондиционирования с помощью облучения и пересадки аллогенного тимуса на мышах

3.5. Модель немиелоаблативного кондиционирования с помощью облучения и использования МАТ на мышах

3.6. Модель немиелоаблативного кондиционирования с помощью облучения и использования МАТ и венетоклакса на мышах

3.7. Модель немиелоаблативного кондиционирования с использованием МАТ и венетоклакса на мышах

3.8. Формирование химеризма при использовании разработанных режимов кондиционирования

3.9. Уровни химеризма в субпопуляции гранулоцитов при использовании различных режимов кондиционирования

3.10. Уровни химеризма в субпопуляции моноцитов при использовании различных режимов кондиционирования

3.11. Уровни химеризма в субпопуляции Т-лимфоцитов при использовании различных режимов кондиционирования

3.12. Уровни химеризма в субпопуляции В-лимфоцитов при использовании различных режимов кондиционирования

3.13. Уровни химеризма в субпопуляции ГСК в костном мозге при использовании различных режимов кондиционирования

3.14. Уровни химеризма клеток в тимусе и трансплантате тимуса при использовании различных режимов кондиционирования

3.15. Уровни химеризма клеток в лимфоузлах при использовании различных режимов кондиционирования

3.16. Трансплантация аллогенного кожного лоскута для оценки индукции иммунной толерантности

3.17. Восстановление общего числа клеток в костном мозге и количества ГСК

3.18. Восстановление тимопоэза

3.19. Восстановление иммунных клеток селезенки

3.20. Возрастной фенотип Т-лимфоцитов в селезенке

3.21. Восстановление субпопуляций лимфоцитов в лимфоузлах

3.22. Возрастной фенотип Т-лимфоцитов в лимфоузлах

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Формирование донорского химеризма при сублетальном облучении

4.2. Формирование химеризма при использовании селективных режимов кондиционирования

4.3. Эффективность приживления аллогенных кожных трансплантатов при низких уровнях химеризма

4.4. Восстановление костного мозга после разных режимов кондиционирования

4.5. Восстановление тимопоэза при различных режимах кондиционирования97

4.6. Восстановление клеток селезенки после сублетального облучения и немиелоаблативных режимов кондиционирования

4.7. Восстановление клеток в лимфоузлах после сублетального облучения и немиелоаблативных режимов кондиционирования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги

Рекомендации

Перспективы дальнейшей разработки темы

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка модели немиелоаблативного кондиционирования при пересадках костного мозга у мышей»

Актуальность темы исследования

На сегодняшний день трансплантация аллогенного костного мозга (ТКМ) или гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является одним из методов лечения гематологических заболеваний, некоторых солидных опухолей и ряда аутоиммунных заболеваний [7, 15]. Согласно данным регистра Всемирной сети по трансплантации крови и костного мозга (WBMT) доминирующими показаниями к проведению ТГСК являлись злокачественные новообразования кроветворной и лимфоидной тканей [36]. Также ТГСК может приводить к формированию устойчивой иммунной толерантности у реципиента к органам и тканям донора костного мозга.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) сопряжена с необходимостью предварительного кондиционирования реципиента. В настоящее время в основе большинства режимов кондиционирования лежит применение высокодозной химиотерапии и/или тотального облучения тела, обладающих выраженной цитотоксичностью и низкой селективностью и имеющих побочные эффекты [24, 29].

В связи с этим, особую актуальность приобретает разработка селективных и малотоксичных режимов кондиционирования. Перспективной альтернативой выступают режимы на основе моноклональных антител (МАТ), селективно элиминирующие субпопуляции клеток при существенно меньшей токсичности по сравнению с химио- и радиотерапией. В качестве мишеней используются маркеры Т-клеток и гемопоэтических стволовых клеток, а также костимулирующие молекулы Показано, что такое кондиционирование обеспечивает безопасное приживление ГСК (гемопоэтических стволовых клеток) от полностью МНС-несовместимых доноров, что позволяет индуцировать толерантность для приживления донорских органов.

Соответствие темы диссертации паспорту научной специальности

Тема диссертации полностью соответствует паспорту научной специальности «3.2.7. Иммунология» (Направления исследований: №1; №4; №7).

Степень разработанности темы исследования

Создание устойчивой иммунной толерантности к аллогенному трансплантату без применения пожизненной иммуносупрессии представляет собой сложную научно-практическую задачу, в рамках которой были детально изучены фундаментальные механизмы формирования иммунной толерантности, установлены принципы развития костномозгового химеризма, оптимизированы протоколы кондиционирования реципиентов и разработаны стратегии посттрансплантационной иммуносупрессии. Накоплен значительный объем данных, касающихся ограничений и побочных эффектов различных методов миелоаблации и иммуносупрессивной терапии [26, 37, 39]. Несмотря на существенный прогресс в понимании базовых механизмов, внедрение этих знаний в клиническую практику остается ограниченной: на сегодняшний день не разработано широко применимых клинических протоколов, позволяющих добиться долговременного приживления аллогенных трансплантатов без риска развития РТПХ, отторжения трансплантата, токсических осложнений кондиционирования и необходимости пожизненной иммуносупрессии.

Цель исследования

Разработка модели немиелоаблативного кондиционирования на мышах с использованием моноклональных антител для трансплантации аллогенного костного мозга.

Задачи исследования

1. Разработать безопасные режимы кондиционирования перед аллогенной трансплантацией костного мозга.

2. Оценить частоту формирования химеризма у реципиентов после аллогенной трансплантации костного мозга на фоне разработанных режимов кондиционирования.

3. Провести сравнительный анализ уровня донорского химеризма в крови и лимфоидных органах после трансплантации костного при разных режимах кондиционирования.

4. Провести сравнительную оценку темпов и полноты восстановления иммунной системы после применения разработанных режимов кондиционирования мышей и последующей пересадки костного мозга.

5. Оценить формирование иммунной толерантности к аллогенному трансплантату по выживаемости кожного лоскута от мышей-доноров костного мозга при разных режимах кондиционирования.

Научная новизна работы

Впервые разработана и экспериментально апробирована принципиально новая стратегия немиелоаблативного кондиционирования реципиентов перед аллогенной трансплантацией костного мозга, основанная на сочетанном применении подобранной комбинации моноклональных антител и индуктора апоптоза. Данный подход является инновационной альтернативой стандартному сублетальному облучению.

Впервые в практике экспериментальной трансплантологии проведена комплексная сравнительная оценка эффективности кондиционирования комбинацией моноклональных антител и индуктора апоптоза в сопоставлении с

классическим режимом на основе сублетального облучения. Критериями оценки послужили уровень и стабильность донорского химеризма, динамика реконституции иммунной системы и индукции толерантности.

Установлено, что все разработанные режимы кондиционирования позволяют достичь устойчивого смешанного или полного донорского химеризма, но не все режимы способны индуцировать длительную иммунную толерантность к аллотрансплантату кожи от донора костного мозга.

Теоретическая значимость работы

Получены новые фундаментальные данные о корреляции между уровнем донорского химеризма, эффективностью восстановления иммунной системы и степенью периферической толерантности к аллогенным трансплантатам. Установлены причинно-следственные связи между режимом кондиционирования, глубиной деплеции собственных гемопоэтических клеток реципиента и последующим восстановлением иммунной системы реципиентов, что вносит вклад в понимание механизмов функционирования костномозговых клеточных ниш и органов иммунной системы. Кроме того, доказана принципиальная возможность использования ингибиторов апоптоза (венетоклакса) не только в онкогематологии, но и в качестве иммуномодулирующего агента в трансплантологии для преодоления гистонесовместимости.

Показано, что субпопуляция CD4+-T-клеток является более чувствительной у мышей по сравнению с субпопуляцией CD8+-Т-клеток после кондиционирования и последующей ТКМ. Продемонстрирована избирательная радиочувствительность лимфоузлов по сравнению с тимусом, селезенкой и костным мозгом. Полученные результаты способствуют углублению знаний о механизмах восстановления иммунной системы после кондиционирования и ТКМ, а также обеспечивают формирование научной базы для оптимизации протоколов кондиционирования и расширяют возможности применения

трансплантации аллогенного костного мозга для индукции иммунной толерантности.

Практическая значимость работы

Разработана новая экспериментальная модель индукции иммунной толерантности к трансплантату с помощью комбинированного немиелоаблативного кондиционирования на основе моноклональных антител и индуктора апоптоза.

Разработанные протоколы кондиционирования представляют собой менее токсичную альтернативу традиционным методам кондиционирования для получения химерных животных в доклинических исследованиях и характеризуются низким риском развития РТПХ, осложнений кондиционирования и отторжения трансплантата. Предложенная стратегия создания устойчивого химеризма и иммунной толерантности является основой для разработки протоколов трансплантации солидных органов без необходимости пожизненной иммуносупрессии и строгого подбора полностью HLA-идентичных пар донор-реципиент, что может значительно расширить пул доноров. Потенциальное внедрение полученных данных в клиническую практику может повысить доступность и безопасность трансплантации для пациентов с гематологическими, онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, а также нуждающихся в пересадке органов.

Таким образом, данное исследование вносит значительный вклад как в развитие фундаментальной иммунологии и трансплантологии, так и в создание новых терапевтических стратегий с высоким потенциалом клинического применения.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты включены в материал лекций для аспирантов, обучающихся в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Разработанные режимы кондиционирования мышей-реципиентов перед трансплантацией костного мозга, основанные на использовании комбинации моноклональных антител против молекул CD8 и CD40L, тотального облучения тела в дозе 3 Гр и 1,5 Гр и венетоклакса и приводящие к формированию смешанного гемопоэтического химеризма, внедрены в лаборатории дифференцировки лимфоцитов и используются для проведения исследований (акт внедрения от 1 июня 2024 г. и акт внедрения от 1 сентября 2024 г.).

Методология и методы исследования

Для выполнения диссертационной работы были использованы современные методы исследования. Кондиционирование реципиентов проведено с использованием установки для тотального облучения тела мышей, современных моноклональных антител, полученных гибридомным методом. Трансплантация аллогенных клеток, тканей и органов проведена с соблюдением одобренных протоколов. Оценка иммунной толерантности осуществлена с помощью пересадки аллогенного кожного трансплантата и последующей оценки его приживления. Оценка формирования химеризма и восстановления иммунной системы проведена с использованием проточной цитометрии. Обработка первичных результатов проведена с использованием программных обеспечений Microsoft Excel, GraphPad Prism 9, FlowJo.

Положения, выносимые на защиту

1. Представленные режимы немиелоаблативного кондиционирования по-разному влияют на характер приживления донорских гемопоэтических клеток: при сублетальном облучении формируется полный донорский химеризм, при сочетании облучения и моноклональных антител или моноклональных антител и препарата-индуктора апоптоза формируется смешанный химеризм.

2. Режим кондиционирования влияет на время выживаемости аллогенных кожных трансплантатов в зависимости от степени воздействия на периферические Т-клетки.

3. Режим кондиционирования, основанный на использовании облучения и моноклональных антител, обеспечивает приживление донорских гемопоэтических стволовых клеток и характеризуется наименьшим повреждающим воздействием на процессы иммунной реконституции.

Степень достоверности результатов

Достоверность представленных результатов определяется четко сформулированными целью и задачами, планом исследования, достаточным для статистического анализа количеством наблюдений, использованием статистических методов исследования, адекватных поставленным задачам. Приведённые в диссертации данные получены с использованием современного оборудования, прошедшего своевременную поверку и зарегистрированного в реестре средств измерения. Установлено, что результаты диссертационной работы являются достоверными.

Апробация результатов

Результаты диссертационной работы были представлены на: Научной школе-конференции «Молекулярные механизмы иммунитета и других физиологических процессов» (Сочи, 14-16 декабря 2023 г.); Международном конгрессе по молекулярной иммунологии и аллергологии 1МАС-24 (Москва, 28-29 ноября 2024 г.); Школе по аллергологии и иммунологии им. академика Р.М. Хаитова (Москва, Российская Федерация, 6-7 марта 2025 г.). Апробация диссертации состоялась на заседании секции №1 ученого совета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России 25 сентября 2025 г.

Личный вклад автора

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии во всех этапах выполнения исследований для диссертации, непосредственном участии в получении первичных результатов в экспериментах по разработке селективных режимов кондиционирования и оценке их эффективности, их обработке, анализе и интерпретации, а также в подготовке публикаций по теме исследования.

Полнота изложения материалов диссертации в опубликованных работах

По основным материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей в рецензируемых периодических научных изданиях, рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук и доктора наук.

Объем и структура диссертации

Диссертация оформлена в традиционном стиле, содержит 130 страниц машинописного текста, 32 рисунка и 12 таблиц. Работа включает «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список сокращений» и «Список литературы», включающий 105 источников, в том числе 8 отечественных и 97 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

Первую трансплантацию костного мозга (ТКМ) провел Э. Доннелл Томас в 1957 г. как новый метод лечения рака, чтобы заменить поврежденную кроветворную систему реципиента здоровыми гемопоэтическими клетками донора и вызвать эффект «трансплантат против опухоли» [94]. Несмотря на то, что изначально попытки ТКМ не всегда были удачны, за прошедшие десятилетия были внесены значительные изменения в протокол проведения этой сложной процедуры, которые значительно увеличили ее успешность. На сегодняшний день ежегодно во всем мире проводится около 50 000 трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) [98].

ТГСК классифицируется по источнику ГСК или по степени родства донора и реципиента. Источником ГСК может служить периферическая кровь, костный мозг или пуповинная кровь. По степени родства ТГСК делится на аутологичную, сингенную и аллогенную [4].

На сегодняшний день самым распространенным источником получения ГСК является периферическая кровь. Донору проводят мобилизацию ГСК (вводят гранулоцитарный колониестимулирующий фактор отдельно или в сочетании с препаратами, которые способствуют пролиферации и миграции гемопоэтических клеток из костного мозга) с последующим забором крови [34]. С помощью афереза собираются стволовые клетки, а остальная кровь возвращается донору. Однако трансплантация ГСК, полученных из крови, имеет больший риск развития РТПХ по сравнению с трансплантацией ГСК, полученными из костного мозга. Еще одним источником ГСК может быть костный мозг, который забирают из тазовых костей донора под общей анестезией. Пуповинную кровь собирают сразу после родов [9].

При аутологичной ТГСК (аутоТГСК) стволовые клетки собирают у самого реципиента и криоконсервируют для последующего повторного введения после

высокодозной химиотерапии с лучевой терапией или без нее. Такая форма ТГСК позволяет реципиенту выжить после частичной или полной миелоаблации и токсичности, вызванной терапией злокачественных заболеваний. При этом противоопухолевый эффект достигается за счет химиотерапии и лучевой терапии, а не ТГСК.

В случае сингенной ТГСК донором является монозиготный близнец реципиента. При аллогенной ТГСК (аллоТГСК) стволовые клетки берут от полностью МНС-несовместимого донора. При такой трансплантации развивается эффект «трансплантат против опухоли», когда здоровые иммунные клетки донора распознают злокачественные клетки реципиента как чужеродные и развивают на них иммунный ответ [78].

1.2. Показания для ТГСК

Большая часть процедур ТГСК выполняется для терапии гематологических злокачественных новообразований. Множественная миелома и лимфома являются основными показаниями к аутоТГСК. Острый миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, миелодиспластические синдромы и миелопролиферативные новообразования являются ведущими показаниями к аллоТГСК. Процедура ТГСК может также использоваться для лечения некоторых солидных опухолей, таких как опухоли из зародышевых клеток, нейробластома, саркома Юинга и медуллобластома [15].

ТГСК проводят также для лечения различных гематологических незлокачественных заболеваний, таких как тяжелая апластическая анемия, миелодиспластический синдром, серповидно-клеточная анемия, трансфузионно-зависимая талассемия, наследственные иммунодефициты и некоторые метаболические нарушения [15].

В последние годы начаты активные разработки методов индукции иммунной толерантности по отношению к аллогенному трансплантату, то есть

поиск таких «настроек» иммунной системы реципиента, чтобы свои и донорские антигены распознавались как «неопасные» при отсутствии внешней иммуносупрессивной поддержки. В частности, показано, что химеризм гемопоэтических клеток после аллоТГСК может обеспечивать толерантность к трансплантату, и в настоящее время при клинической трансплантации почки одним из методов, используемых для достижения толерантности, является ТГСК в сочетании с трансплантацией органа от того же донора [74]. Перед аллоТГСК проводится кондиционирование, которое подавляет иммунную систему реципиента, препятствует активации аллореактивных клонов Т-клеток и позволяет донорскому костному мозгу прижиться в костномозговых нишах, освободившихся после гибели клеток реципиента. Такие режимы кондиционирования обычно включают облучение, цитостатические препараты и средства, истощающие клеточный пул. Режимы кондиционирования могут быть как миелоаблативными, так и немиелоаблативными в зависимости от возможности аутологичного восстановления гематологической функции [27, 74]. Миелоаблативные режимы кондиционирования, которые обычно используются при гематологических опухолях, являются более агрессивными, не позволяют восстановить гематологическую функцию аутологичным способом, чтобы не было рецидива лейкоза, характеризуются высокой токсичностью и связаны с более высокой частотой развития реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [77]. Чтобы уменьшить цитотоксические побочные эффекты и обеспечить безопасность для реципиента, оптимальным решением при трансплантациях солидных органов было бы использовать и, по возможности, свести к минимальной интенсивности немиелоаблативные режимы кондиционирования.

1.3. Осложнения ТГСК

Побочные эффекты ТГСК можно разделить на 3 категории в зависимости от времени:

1) возникающие в период перед трансплантацией (от начала кондиционирования до ТГСК),

2) в ранний посттрансплантационный период (от ТГСК до 100 дней после трансплантации)

3) в поздний посттрансплантационный период (через 100-й день и позже)

[15].

Осложнения до трансплантации обычно являются следствием высокой токсичности режима кондиционирования. У реципиента наблюдается панцитопения, желудочно-кишечная токсичность, инфекции и органная дисфункция. Инфекции этого периода связаны с нейтропенией и вызваны грамположительным и грамотрицательным бактериями, вирусом простого герпеса, грибами рода Candida и Aspergillus [96].

В раннем посттрансплантационном периоде может возникнуть синдром эндотелиального повреждения печени, как правило, после миелоаблативного режима кондиционирования при аллогенной ТГСК. Также к «ранним осложнениям эндотелиального происхождения» после аллоТГСК относятся синдром капиллярной утечки, синдром приживления, мукозиты, геморрагические циститы, диффузное альвеолярное кровоизлияние и ТГСК-ассоциированная тромботическая микроангиопатия. Эти побочные эффекты считаются результатом повреждения капилляров [20]. В это же время при аллоТГСК может развиться острая РТПХ. Она развивается из-за того, что трансплантированные иммунные клетки донора распознают клетки и ткани организма реципиента как чужеродные, что приводит к их активации и запуску иммунного ответа, что приводит к повреждению тканей реципиента. При острой РТПХ поражается кожа, ЖКТ и печень. Наиболее распространенными клиническими проявлениями при острой РТПХ являются сыпь, водянистая диарея, постоянная тошнота или рвота, анорексия, холестатическая желтуха и отклонения показателей печеночного профиля. Острая РТПХ является основной причиной гибели после аллоТГСК [44]. В раннем посттрансплантационном периоде у реципиентов также отмечается повышенный риск развития инфекционных заболеваний, таких как

цитомегаловирусная инфекция и пневмония, вызванная Р. jirovecii, из-за недостаточности клеточного и гуморального иммунного ответа. Также развивается повышенная восприимчивость к обычным респираторным вирусам, таким как вирус гриппа, РСВ и аденовирус, а также герпесвирусам. Этот повышенный риск связан с тем, что лечение РТПХ приводит к иммуносупрессии

[15].

В более поздний период (через 100 дней и позже после ТГСК) может возникнуть хроническая РТПХ. Ее проявления разнообразны, поражаются один или несколько органов. Чаще всего поражается кожа, и у реципиентов может наблюдаться пойкилодермия, изменения, аналогичные системному склерозу. Более глубокие изменения могут проявляться в виде миозита и фасциита, которые приводят к фиброзу и снижению подвижности. Также возможно поражение слюнных и слезных желез, приводящее к сухости слизистых оболочек. Поражение легких может привести к хроническим обструктивным или рестриктивным заболеваниям легких. Как и при острой РТПХ, могут поражаться ЖКТ и печень [20].

Местные и системные кортикостероиды являются препаратами первой линии для терапии РТПХ и часто комбинируются с ингибиторами кальциневрина, такими как такролимус. Экстракорпоральный фотоферез, ингибиторы тирозинкиназ ибрутиниб и руксолитиниб являются препаратами второй линии и обычно используются при лечении реципиентов с хронической РТПХ, для которых кортикостероиды оказались неэффективны [15].

1.4. Костномозговой химеризм и иммунная толерантность

Костномозговой химеризм - это состояние у реципиента после ТГСК, при котором в организме присутствуют генетически чужеродные гемопоэтические и иммунные клетки. Определение типа кроветворения у больного после аТГСК имеет большое значение для изучения механизмов приживления и отторжения,

посттрансплантационной толерантности, реакций «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и «трансплантат против лейкоза» (РТПЛ).

Химеризм подразделяют на макрохимеризм (больше 1% клеток донора) и микрохимеризм (меньше 1% клеток донора). Макрохимеризм может быть транзиторным или постоянным, микрохимеризм обычно транзиторный, но ряд исследований показывает, что его бывает достаточно для приживления аллогенного трансплантата. Макрохимеризм может быть полным и смешанным [99]. При полном костномозговом химеризме вся кроветворная система реципиента полностью заменяется донорскими клетками. Полный химеризм необходим при терапии лейкозов, чтобы не было рецидива опухоли, однако он опасен повышенным риском развития РТПХ. Смешанный химеризм предполагает сосуществование донорских и реципиентских клеток [61, 94].

Впервые химеризм эритроцитов обнаружил Р.Оуэн у крупного рогатого скота породы Бгеетагйп в 1945 г [71]. До этого Ф. Лилли сообщил, что слияние плаценты двух эмбрионов крупного рогатого скота привело к объединению систем кровообращения двух эмбрионов и оказало влияние на развитие репродуктивной системы в случае, если эмбрионы были разного пола [8, 57]. Р. Оуэн предположил, что такое объединение систем кровообращения приводит к двунаправленной приобретенной иммунной толерантности, благодаря которой аллогенные эритроциты выживают в постнатальном периоде у обоих близнецов. Впоследствии выяснилось, что этот химеризм существует во всей популяции гемопоэтических клеток [74].

Примерно в то же время П. Медавар сообщил, что у дизиготных близнецов крупного рогатого скота не отторгаются пересаженные друг от друга кожные лоскуты. Это позволило Медавару выдвинуть гипотезу о том, что «у млекопитающих и птиц никогда не развивается способность иммунологически реагировать против чужеродных гомологичных тканей или клеток от организма, с которыми они контактировали на достаточно раннем этапе эмбриогенеза». Для доказательства этой гипотезы Медавар в раннем постнатальном периоде

пересадил донорские клетки реципиенту и получил гемопоэтический химеризм, однако у новорожденных особей он был нестабильный [17].

Вскоре после заявления Медавара о неонатальной толерантности было сообщено об успешной индукции толерантности к кожным аллотрансплантатам через индукцию полного донорского химеризма после облучения всего тела (ТОТ) и пересадки донорского костного мозга (KM), однако у реципиентов развилась РТПХ [68]. В 1964 г. Бальнер сообщил, что у химерных крыс после ТОТ и пересадки КМ прижился кожный аллотрансплантат, причем даже у особей с временным химеризмом. По мнению Бальнера, это было выгодно, т.к. временный химеризм уменьшает риск развития РТПХ [13].

В 1977 г. Slavin D. соавт. впервые сообщили об успешной индукции стойкого смешанного химеризма, который обеспечил толерантность к кожному или сердечному аллотрансплантату у мышей после тотального облучения тела. Однако такой режим не привел к успешной индукции стойкого химеризма у бабуинов и собак [79].

Иммунная толерантность представляет собой явление, когда иммунная система не отвечает на конкретный антиген, но при этом сохраняет способность реагировать на другие антигены. Толерантность важна для приживления донорских тканей и органов у реципиента. Она бывает центральной и периферической.

Центральная толерантность развивается в тимусе и костном мозге на стадии пре Т- и пре-В-лимфоцитов во время отрицательной селекции лимфоцитов. Наиболее изучена и имеет наибольшее значение для приживления трансплантатов отрицательная селекция Т-лимфоцитов: она обеспечивается экспрессией тканеспецифических антигенов (TSA) на эпителиальных клетках медуллярного тимуса (mTEC) и ДК. В этом процессе ключевую роль играет фактор транскрипции AIRE (аутоиммунный регулятор) [90]. После ТГСК стволовые клетки донора, прижившись в костном мозге, дают начало предшественникам Т-клеток и дендритных клеток (ДК), которые заселяют тимус реципиента. Таким образом, донорские ДК участвуют в процессе отрицательной

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гринько Екатерина Константиновна, 2026 год

и использования МАТ на мышах

В 3-й группе (группа «3Гр+МАТ») мышам вводили МАТ против СБ8 в -2 сутки, облучали в дозе 3 Гр в -1 сутки, вводили МАТ против СЭ40Ь для блокады костимуляции и пересаживали аККМ в 0 сутки с интервалом в 6 часов. Ранее было установлено, что использование только облучения без дополнительных воздействий в дозе меньше, чем 4,5 Гр (от 3 Гр до 5 Гр с интервалом 0,5 Гр), не приводит к формированию химеризма. Режим кондиционирования схематично представлен на Рисунке 5.

Уровень химеризма в крови определяли на 14-е, 28-е, 56-е и 90-е сутки. Кожные аллотрансплантаты пересаживали на 60-е сутки. На 180-е сутки группу

выводили из эксперимента и выполняли оценку субпопуляционного состава лимф оидных органов и уровня химеризма в тимусе, лимфоузлах и костном мозге.

ТОТ 3 Гр

трансплантация кожи

aCD40L(MRl) 2,0 мг Тза 6-12 ч до аТКМ

I

-2 -1 о1 t +14 +28 1

//]-l-//f //

I I о а I . j_o г

aCD8 (2.43) 0,5 мг ЗОмлнаККМ

+56'+60 +90

оценка субпопуляционного состава и химеризма в крови

+180

Забой и цитометрическое исследование

Рисунок 5 - Схема эксперимента с использованием ТОТ в дозе 3 Гр и МАТ против CD8 и CD40L для кондиционирования реципиентов перед ТКМ

3.6. Модель немиелоаблативного кондиционирования с помощью облучения и использования МАТ и венетоклакса на мышах

В 4-й группе (группа «1,5 Гр+АВТ-199) мышам вводили венетоклакс с -3 по + 12 сутки, кроме 0 суток, облучали в дозе 1,5 Гр в -1 сутки, вводили МАТ против СЭ40Ь для блокады костимуляции и пересаживали аККМ в 0 сутки с интервалом в 6 часов (Рисунок 6).

Рисунок 6 - Схема эксперимента с использованием ТОТ в дозе 1,5 Гр, МАТ против CD40L и венетоклакса для кондиционирования реципиентов перед ТКМ

3.7. Модель немиелоаблативного кондиционирования с использованием МАТ

и венетоклакса на мышах

В 5-й группе (группа «АВТ-199+МАТ») мышам вводили индуктор апоптоза венетоклакс (АВТ-199) с -8 по -2 сутки, МАТ против СБ 117 в -6 сутки, МАТ против СБ8 в -5 сутки, МАТ против СБ4 в -2 и -1 сутки, МАТ против СБ40Ь и пересаживали аККМ в 0 сутки с интервалом в 6 часов. Временные интервалы введения венетоклакса и МАТ подобраны на основе объединения и анализа данных, указанных в работах, на которых построен литературный обзор. Это схематично отражено на Рисунке 7. Этот разработанный режим кондиционирования полностью исключает использование облучения.

Уровень химеризма в крови определяли на 14-е, 28-е, 56-е и 90-е сутки. Кожные аллотрансплантаты пересаживали на 60-е сутки. На 180-е сутки группу выводили из эксперимента и выполняли оценку субпопуляционного состава лимфоидных органов и уровня химеризма в тимусе и лимфоузлах.

аСР8 (2.43) 0,5 мг

аСР117 (АСК2) 0,5 мг

Т

аСР4 (СК1.5) 0,5 мг аСР401_ (МШ) 0,5 мгза 6-12 ч до аТКМ

п т

I I I I

+14

+30

I +56

Трансплантация кожи

//\//\// 1 +60

АВТ-199 2,0 мг х 7

аККМ 30 млн

Оценка субпопуляционного состава и химеризма в крови

+180

Забой и цитометрическое исследование

Рисунок 7 - Схема эксперимента с использованием МАТ против СП8, СБ4, СБ117 и CD40L и венетоклакса для кондиционирования реципиентов перед ТКМ

3.8. Формирование химеризма при использовании разработанных режимов

кондиционирования

В группах «4,5 Гр» и «4,5 Гр+аТТ» для освобождения нищ для ГСК в костном мозге и удаления аллореактивных клонов Т-клеток использовали ТОТ в дозе 4,5 Гр. Суммарно, из 20 животных 19 стали полными костномозговыми химерами, как видно из Рисунка 8.

При использовании режима кондиционирования, включающего в себя ТОТ 3 Гр и анти-CD8 и анти-CD40L MAT, 10 из 10 мышей стали смешанными костномозговыми химерами (Рисунок 8).

Режим кондиционирования, включающий в себя ТОТ 1,5 Гр, введение МАТ против CD40L и венетоклакса, приводит к формированию химеризма у 9 из 10 животных (Рисунок 8).

Поскольку использование тотального облучения тела в таких дозах в клинической практике вызывает ряд затруднений, разработан режим кондиционирования, основанный на использовании венетоклакса и анти-CD8, анти-CD4, анти-CD40L МАТ для удаления Т-клеток реципиента и МАТ против CD117 для деплеции ГСК реципиента. Однако после использования данного режима кондиционирования химеризм сформировался только у 7 из 10 реципиентов (Рисунок 8).

Рисунок 8 - Количество химерных и нехимерных животных при использовании различных режимов кондиционирования и аллогенной ТКМ

3.9. Уровни химеризма в субпопуляции гранулоцитов при использовании различных режимов кондиционирования

Уровень химеризма определялся в периферической крови на 14-е, 28-е, 56-е и 90-е сутки после ТКМ. Для анализа использовали показатели только тех мышей, у которых развился стабильных химеризм. В группе «4,5 Гр» процент донорских клеток в субпопуляции гранулоцитов составлял 100,0% во всех точках тестирования, что отражено в Таблице 1 и на Рисунке 9А. Такая же закономерность была выявлена и в группе «4,5 Гр+аТТ» и отражена в Таблице 1 и на Рисунке 9Б.

В группе «3Гр+МАТ» наблюдали формирование смешанного химеризма во всех линиях дифференцировки, в частности, в гранулоцитах, и он оставался стабильным на протяжении всего исследования. На 14-е сутки в гранулоцитах было 57,95 (50,13-65,55) % донорских клеток, на 28-е сутки - 66,7 (58,5-72,0) %, на 56-е сутки - 83,85 (81,65-88,25) %, а на 90-е сутки - 79,00 (71,80-83,30) % (Таблица 1 и Рисунок 9В).

В группе «1,5 Гр+АВТ-199» на 14-е сутки донорских гранулоцитов в крови реципиентов было 44,60 (38,45-56,35) %, на 28-е сутки - 60,90 (52,05-67,50) %, на 56-е сутки - 29,20 (21,55-44,20) %, на 90-е сутки - 27,00 (24,25-61,35). Данные отражены в Таблице 1 на Рисунке 9Г.

Режим кондиционирования, который не включал в себя ТОТ, а только агенты, направленные на ГСК и Т-клетки, в группе «АВТ-199+МАТ» привел к формированию более низких уровней химеризма, по сравнению с другими группами, как видно из Таблицы 1 и Рисунка 9Д. В гранулоцитах на 14-е сутки процент донорских клеток составлял - 5,90 (3,80-10,20) %, на 28-е сутки - 21,90 (11,20-49,00) %, на 56-е сутки - 27,70 (24,40-50,50) %, на 90-е сутки - 14,00 (12,1017,50) %.

Таблица 1 - Динамика формирования уровня химеризма в субпопуляции гранулоцитов во всех группах, %

Группы 14-е сутки 28-е сутки 56-е сутки 90-е сутки

4,5 Гр 100,00 (100,0100,0) 100,0 (99,8-100,0) 100,0 (99,90100,0) 99,90 (99,90100,0)

4,5 Гр+аТТ 100,0 (99,9100,0) 99,90 (99,8-100,0) 100,0 (99,98100,0) 99,90 (100,0100,0)

3 Гр+МАТ 57,95 (50,1365,55) 66,65 (58,5371,98) 83,85 (81,6588,25) 79,00 (71,8083,30)

1,5 Гр+АВТ-199 44,6 (38,4556,35) 60,90 (52,0567,50) 29,20 (21,5544,20) 27,00 (24,2561,35)

АВТ-199+МАТ 5,90 (3,80-10,20) 21,90 (11,2049,00) 27,70 (24,4050,50) 14,00 (12,1017,50)

А

а 150"1

о

I-

5

=Г

0

ц 100-

1

ID

£ 50 -

CN

т

4,5 Гр

4,5 Гр+аТТ

а

о

н з-

0

Q ЮОН

>.

X

я а.

1 зон

-h

AV / ¿V ¿f jj

ao -V -V A*-

сл сЛ сл СЛ

^

ABT-199+MAT

Д

3 Гр+МАТ

100-1

гУ ji" ^

^ ^ a-^ д^

СЛ СЛ c7> СЛ

dif1 d^ J^

cf Л /Cr л* A* ! о" о" о"

/ У &

Г Я » <$>

1,5 Гр+АВТ-199

ji ^ ^

A ¿Г А

л I? (? О (Л

/ у ^ у у

Ж f f f f & & & &

^ У У У У

А - группа «4,5 Гр»; Б - группа «4,5 Гр+аТТ»; В - группа «3Гр+МАТ»; Г -группа «1,5 Гр+АВТ-199»; Д - группа «АВТ-199+МАТ». Данные представлены в виде значений процента Н2-Кь-положительных клеток среди гранулоцитов. Данные представлены как медиана ± IQR. Рисунок 9 - Процент донорских клеток (фенотип Н2-Кь+) во всех группах среди субпопуляции гранулоцитов в периферической крови у мышей-

реципиентов

В

Б

Г

Кондиционирование с помощью ТОТ в дозе 4,5 Гр приводит к формированию 100% химеризма в субпопуляции моноцитов уже на ранних сроках после ТКМ в обеих группах, что можно увидеть в Таблице 2 и на Рисунке 10А-Б.

В группе «3 Гр+МАТ» среди моноцитов сформировался смешанный химеризм и процент донорских клеток постепенно увеличивался (Таблица 2): на 14-е сутки он составлял 54,15 (48,80-61,98) % (Рисунок 7А), на 28-е сутки - 84,70 (83,38-86,53) % (Рисунок 7Б), на 56-е сутки - 87,65 (83,80-91,98) % (Рисунок 7В), на 90-е сутки почти 100% моноцитов были донорского происхождения - 96,25 (94,48-97,18) % (Таблица 2 и Рисунок 10В).

В группе «1,5 Гр+АВТ-199» на 14-е сутки 88,90 (62,20-91,85) % моноцитов имели донорское происхождение, на 28-е сутки - 83,60 (80,05-86,70) %, на 56-е сутки - 89,20 (86,30-93,50) %, на 90-е сутки - 69,70 (52,40-79,55) %. Данные представлены в Таблице 2 на Рисунке 10Г.

В группе «АВТ-199+МАТ» без использования ТОТ, уровень химеризма среди моноцитов так же был ниже, чем в других группах, как видно из табл. 2. На 14-е сутки он составлял 2,60 (1,00-4,9) %, на 28-е сутки - 4,10 (1,3 - 8,00) %, на 56-е сутки - 4,20 (3,50-6,70) %, на 90-е - 5,40 (3,00-8,70) % (Таблица 2 и Рисунок 10Д).

Группы 14-е сутки 28-е сутки 56-е сутки 90-е сутки

4,5 Гр 100,0 (99,85100,0) 100,0 (100,0-100,0) 100,0 (100,0-100,0) 100,0 (100,0-100,0)

4,5 Гр+аТТ 100,0 (99,28100,0) 100,0 (99,98-100,0) 100,0 (99,83-100,0) 100,0 (100,0-100,0)

3 Гр+МАТ 54,15 (48,8061,98) 84,70 (83,38-86,53) 87,65 (83,80-91,98) 96,25 (94,48-97,18)

1,5 Гр+АВТ-199 88,90 (62,2091,85) 86,60 (80,05-86,70) 89,20 (86,30-93,50) 69,70 (52,40-79,55)

АВТ-199+МАТ 2,60 (1,00-4,90) 4,10 (1,30-8,00) 4,20 (3,50-6,70) 5,40 (3,00-8,70)

А

4,5 Гр

4,5 Гр+аТТ

3 Гр+МАТ

150—1

150-1

л^ ^f*

ь" о" о" о"

ь Л в Я _ Я ф

у ОС « « Л»

* ^ ^ ^ ^

<f -f -f -f -f CP сЛ CP О

о^ Jb a» rJ>

Ч9 -lS5 <§> &

1,5 Гр+АВТ-199

Д

ABT-199+MAT

100-1

АР jS!4

,/ oi <f oi с/

^ y V*

fX>

! CP <îi cp ср

CP CP CP CT

f . Vй

А - группа «4,5 Гр»; Б - группа «4,5 Гр+аТТ»; В - группа «3Гр+МАТ»; Г -группа «1,5 Гр+АВТ-199»; Д - группа «АВТ-199+МАТ». Данные представлены в виде значений процента Н2-Кь-положительных клеток среди моноцитов. Данные

представлены как медиана ± IQR.

Рисунок 10 - Процент донорских клеток (фенотип Н2-Кь+) во всех группах среди субпопуляции моноцитов в периферической крови у мышей-реципиентов

В

Б

Г

В группе «4,5 Гр», с режимом кондиционирования, который включал в себя только ТОТ, все Т-клетки в крови имели донорское происхождение (Таблица 3). На 14-е сутки после ТКМ он составлял 97,40 (76,25-100,0) % (Рисунок 11А). На 28-е сутки после ТКМ процент донорских клеток был 97,20 (83,60-99,95) % (Рисунок 11А). На 56-е сутки в Т-клетках наблюдалось 100,0 (100,0-100,0) % донорских клеток (Рисунок 11А). На 90-е сутки этот процент остался неизменным - 100,0 (99,95-100,0) % (Рисунок 11А).

В группе «4,5 Гр+аТТ», где реципиентам дополнительно трансплантировали долю аллогенного тимуса после ТКМ, химеризм в субпопуляции Т-клеток так же был полным, как видно из Таблицы 3. На 14-е сутки наблюдали 97,55 (69,8599,55) % донорских клеток (Рисунок 11Б). На 28-е сутки 99,65 (89,73-99,93) %, на 56-е сутки - 100,0 (99,83-100,0) %, а на 90-е сутки 100,0 (99,90-100,0) % донорских Т-клеток (Рисунок 11Б).

В группе «3 Гр+МАТ» сформировался смешанный химеризм с постепенным увеличением числа донорских клеток, данные отражены в Таблице 3. На 14-е сутки было только 0,40 (0,25-0,45) % донорских клеток, (Рисунок 11В). На 28-е сутки процент донорских клеток увеличился до 24,7 (20,88-31,03) % (Рисунок 11В). На 56-е сутки было 56,90 (47,45-60,33) % клеток донора, а на 90-е сутки -72,55 (69,08-77,75) % донорских клеток (Рисунок 11В).

В группе «1,5 Гр+АВТ-199» уровень химеризма среди Т-клеток увеличивался постепенно: 1,40 (1,20-2,50) % на 14-е сутки, затем увеличивался до 16,20 (13,40-18,50) %, 34,50 (29,90-37,80) %, 48,20 (34,50-51,15) % на 28-е, 56-е и 90-е сутки, соответственно. Динамика формирования химеризма указана на Рисунке 10Г и в Таблице 3.

В группе «АВТ-199+МАТ» уровень химеризма в субпопуляции Т-клеток оставался относительно низким (Таблица 3). На 14-е сутки был 0,00 (0,00-5,40) %,

Таблица 3 - Динамика формирования уровня химеризма в субпопуляции Т-лимфоцитов во всех группах, %

Группы 14-е сутки 28-е сутки 56-е сутки 90-е сутки

4,5 Гр 97,40 (76,25100,0) 97,20 (83,6099,95) 100,0 (100,0100,0) 100,0 (99,95100,0)

4,5 Гр+аТТ 97,55 (69,8599,55) 99,65 (89,7399,93) 100,0 (99,83100,0) 100,0 (99,90100,0)

3 Гр+МАТ 0,40 (0,25-0,45) 24,70 (20,8831,03) 56,90 (47,4560,33) 72,55 (69,0877,75)

1,5 Гр+АВТ-199 1,40 (1,20-2,50) 16,20 (13,4018,50) 34,50 (29,9037,80) 48,20 (34,5051,15)

АВТ-199+МАТ 0,00 (0,00-5,40) 21,50 (13,3028,90) 16,40 (12,0028,70) 10,40 (8,30-17,40)

А

4,5 Гр

4,5 Гр+аТТ

III

лХ7 J^ ¿h и^

«о ¿Р ¿г А А

? СЛ СЛ СЛ <Л

у у <%?

3 Гр+МАТ

JÎ" JÎ JÎ1 jï^

^ A ¿r

СЛ <Л СЛ СЛ

л^ ji1 jÎ J1

/ / / jt /

1,5 Гр+АВТ-199

Д

ABT-199+MAT

g 40

I

1 I I

J? / / /

A û" ОТ G^

> У V»

I .

J^ /

YT JP ¿Г

? <J> СЛ & СЛ

Б

В

Г

А - группа «4,5 Гр»; Б - группа «4,5 Гр+аТТ»; В - группа «3Гр+МАТ»; Г -группа «1,5 Гр+АВТ-199»; Д - группа «АВТ-199+МАТ». Данные представлены в виде значений процента Н2-Кь-положительных клеток среди Т-лимфоцитов. Данные представлены как медиана ± IQR. Рисунок 11 - Процент донорских клеток (фенотип Н2-Кь+) во всех группах среди субпопуляции СЭ3+ Т-клеток в периферической крови у мышей-

реципиентов

В субпопуляции В-клеток в группе «4,5 Гр» процент донорских клеток на 14-е сутки был 100,0 (99,90-100,0) %, на 28-е сутки - 99,80 (99,70-99,95) %, на 56-е сутки - 100,0 (100,0-100,0) %, на 90-е сутки - 100,0 (100,0-100,0) %. Данные отображены в Таблице 4 и Рисунке 12А.

Как и в случае с Т-клетками, в субпопуляции В-клеток в группе «4,5 Гр+аТТ» химеризм был полным (Таблица 4), и, как видно из Рисунка 12Б, процент донорских клеток на 14-е, 28-е, 56-е и 90-е сутки составлял 100,0 (99,90-100,0)%, 100,0 (99,98-100,0) %, 100,0 (100,0-100,0) % и 100,0 (100,0-100,0) %, соответственно.

Смешанный химеризм в группе «3 Гр+МАТ» наблюдался и в субпопуляции В-клеток, где процент донорских клеток на 14-е сутки составил 26,10 (23,5528,70) % (Рисунок 12В). На 28-е сутки это число увеличилось до 66,75 (65,0868,85) %, на 56-е сутки донорских В-лимфоцитов было 76,65 (70,35-78,68) %, а на 90-е сутки - 80,9 (75,98-82,33) % (Рисунок 12В).

В группе «1,5 Гр+АВТ-199» среди В-клеток уровень смешанного химеризма был высоким уже к 14-м суткам и составлял 80,00 (73,55-85,65) %. На 28-е, 56-е и 90-е сутки процент донорских клеток практически не менялся и составлял: 82,90 (79,75-84,80) %, 83,10 (77,00-84,15) %, 76,20 (68,75-84,10) %, соответственно (Рисунок 12Г).

В группе «АВТ-199+МАТ» процент клеток донора среди В-лимфоцитов составлял 4,00 (3,40-4,50) % на 14-е сутки (Рисунок 12Д). На 28-е, 56-е и 90-е процент химеризма тоже не отличался от контрольных значений и был 6,90 (4,108,80) %, 7,20 (5,50-8,30) % и 4,70 (4,00-8,10) %, соответственно (Рисунок 12Д).

Группы 14-е сутки 28-е сутки 56-е сутки 90-е сутки

4,5 Гр 100,0 (99,90100,0) 99,80 (99,7099,95) 100,0 (100,0100,0) 100,0 (100,0100,0)

4,5 Гр+аТТ 100,0 (99,90100,0) 100,0 (99,98100,0) 100,0 (100,0100,0) 100,0 (100,0100,0)

3 Гр+МАТ 26,10 (23,5528,70) 66,75 (65,0866,85) 76,65 (70,3578,68) 80,90 (75,9882,33)

1,5 Гр+АВТ-199 80,00 (73,5585,65) 82,90 (79,7584,80) 83,10 (77,0084,15) 76,20 (68,7584,10)

АВТ-199+МАТ 4,00 (3,40-4,50) 6,90 (4,10-8,80) 7,20 (5,50-8,30) 4,70 (4,00-8,10)

А

4,5 Гр

150-

+ п

50-

///// чР* у у у у

Б

150-

ье О н <в

5 юо

л

¥ 50

4,5 Гр+аТТ

В

100-

£ 80

<11

с

■ боса

| АО-

200-

3 Гр+МАТ

^ ^ ^ ? (? ¿1 р

У ^ ^ / ^

<9 ел сл <л сл

^ ^ у У У

Д

АВТ-19Э+МАТ

О 40-

■о 20 "I

о'5' ^ ^ ^ О сл сл СР

У у у у

1,5 Гр+АВТ-199

юо

А - группа «4,5 Гр»; Б - группа «4,5 Гр+аТТ»; В - группа «3Гр+МАТ»; Г -группа «1,5 Гр+АВТ-199»; Д - группа «АВТ-199+МАТ». Данные представлены в виде значений процента Н2-Кь-положительных клеток среди Т-лимфоцитов. Данные представлены как медиана ± IQR. Рисунок 12 - Процент донорских клеток (фенотип Н2-Кь+) во всех группах среди субпопуляции СП19+ В-клеток в периферической крови у мышей-

реципиентов

Г

На 180-е сутки после ТКМ проведено цитометрическое исследование лимфоидных органов и определен уровень химеризма в костном мозге, тимусе и лимфоузлах реципиентов.

Процент ГСК донорского происхождения в группах с режимом кондиционирования, основанном на ТОТ 4,5 Гр, был 99,80 (99,63-99,98) % и 99,70 (99,25-99,80) %, соответственно. В группе с режимом кондиционирования, основанном на ТОТ 3 Гр и введении МАТ, процент донорских клеток составлял 61,15 (45,68-68,10) %. При уменьшении дозы ТОТ до 1,5 Гр и использовании анти-СБ40Ь МАТ и венетоклакса у реципиентов было 9,45 (8,13-25,98) % донорских ГСК. В группе «АВТ-199+МАТ» среди ГСК сформировался микрохимеризм: 0,50 (0,00-0,50) % донорских ГСК. Для наглядности данные отображены на Рисунке 13.

Данные представлены в виде значений процента Н2-Кь-положительных клеток среди ГСК. Данные представлены как медиана ± IQR. Рисунок 13 - Процент донорских клеток (фенотип Н2-Кь+) во всех группах среди ГСК в костном мозге у мышей-реципиентов

Уровень химеризма оценивался в тимусе (s, сингенный) и тимусном трансплантате (a, аллогенный) в субпопуляциях DN (double-negative, дубль-негативные), SP (single-positive, сингл-позитивные) CD4+ и SP CD8+-тимоцитов, т.к. DP-тимоциты (double-positive, дубль-позитивные) не экспрессируют молекулы MHC I класса.

На 180-е сутки в группе «4,5 Гр» и «4,5 Гр+аТТ» процент донорских клеток среди DN-тимоцитов и SP-тимоцитов составлял около 100%, как в собственных тимусах, так и в аллотрансплантате тимуса (Рисунки 14А-В).

А

150

g 100

к Г

4,5 Гр Б 4,5 Гр+аТТ В рансплантат тимуса 3 Гр+МАТ

150-1 150-1 150-

Д 1,5 Гр+АВТ-199

100-

4 4

А - тимус в группе «4,5 Гр»; Б - собственный тимус в группе «4,5 Гр+аТТ»; В - тимусный трансплантат в группе «4,5 Гр+аТТ»; Г - тимус в группе «3 Гр+МАТ»; Д - тимус в группе «1,5 Гр+АВТ-199»; Е - тимус в группе «АВТ-

199+МАТ» Данные представлены в виде значений процента H2-Kb-положительных клеток среди тимоцитов. Данные представлены как медиана ±

Рисунок 14 - Процент донорских клеток (фенотип H2-Kb+) во всех группах среди ГСК в тимусе у мышей-реципиентов

Е

В группе «3 Гр+МАТ» уровень химеризма среди ЭК, БР СЭ4+ и СЭ8+-тимоцитов был 71,07 (65,73-75,09) %, 76,57 (69,90-80,74) %, 95,79 (92,38-96,24) %, соответственно (Рисунок 14Г). В группе «1,5 Гр+АВТ-199» среди ЭК-тимоцитов было 33,12 (24,54-48,84) % клеток донора, процент донорских клеток среди БР СЭ4+ и СЭ8+-тимоцитов был 50,53 (35,05-65,88) % и 64,65 (55,56-79,00) % клеток донора, соответственно (Рисунок 14Д). В группе «АВТ-199+МАТ» в субпопуляции ЭК-тимоцитов процент донорских клеток составлял 4,41 (3,267,69) %. В субпопуляциях сингл-позитивных СЭ4+- и СЭ8+-тимоцитов наблюдали 8,04 (4,81-9,27) % и 10,08 (8,70-19,46) %, соответственно (Рисунок 14Е).

3.15. Уровни химеризма клеток в лимфоузлах при использовании различных

режимов кондиционирования

Исследование уровней химеризма в лимфоузлах реципиентов на 180-е стуки после ТКМ проводилось в субпопуляциях Т- и В-лимфоцитов. После использования ТОТ в дозе 4,5 Гр к 180-м суткам после ТКМ процент донорских клеток среди Т- и В-лимфоцитов составлял почти 100%. Это отражено на Рисунках 15А-Б.

При использовании селективных режимов кондиционирования наблюдалось формирование смешанного химеризма, и в группе с ТОТ 3 Гр и МАТ половина Ти В-лимфоцитов была донорского происхождения: 44,75 (41,55-78,33) % и 45,75 (37,45-82,33) %, соответственно (Рисунок 15В). В группе «1,5 Гр+АВТ-199» количество клеток донора среди Т-лимфоцитов было 37,60 (28,98-42,95) %, а среди В-лимфоцитов - 43,00 (30,00-56,68) %, что показано на Рисунке 15Г. В группе «АВТ-199+МАТ» химеризм в лимфоузлах был на низком уровне: 6,80 (4,10-7,20) % среди Т-лимфоцитов и 2,20 (1,30-3,40) % среди В-лимфоцитов (Рисунок 15Д).

А

150-1

2 100-

сд 50-

4,5 Гр

Б 4,5 Гр+аТТ В 3 Гр+МАТ Г ^ Гр+АВТ_

199

150-1

100-1

Д АВТ-199+МАТ

* 4

* 2

А - лимфоузлы группе «4,5 Гр»; Б - лимфоузлы в группе «4,5 Гр+аТТ»; В -лимфоузлы в группе «3 Гр+МАТ»; Г - лимфоузлы в группе «1,5 Гр+АВТ-199»; Д - «АВТ-199+АВТ-199». Данные представлены в виде значений процента Н2-Кь-положительных клеток среди тимоцитов. Данные представлены как медиана ±

Рисунок 15 - Процент донорских клеток (фенотип Н2-Кь+) во всех группах среди лимфоцитов в лимфоузлах у мышей-реципиентов

3.16. Трансплантация аллогенного кожного лоскута для оценки индукции

иммунной толерантности

Всем животным для проверки индукции иммунной толерантности трансплантировали аллогенный кожный лоскут (от мышей линии C57BL/6). В контрольной группе (п=6) у всех животных отторглись кожные трансплантаты, среднее время выживаемости трансплантата составило 16 (14-18) суток (Рисунок 16).

В группе "4,5 Гр" (п=10) аллогенные кожные трансплантаты успешно прижились у всех мышей на длительный срок 180 (180-180) суток (р<0,0001) (Рисунок 16) без признаков острого или хронического отторжения. У одной мыши, которая не являлась химерой, трансплантат был отторгнут на 30 сутки.

В группе "4,5 Гр+аТТ" (п=9) кожный лоскут донора прижился у всех мышей так же на длительный срок 180 (180-180) суток (р<0,0001) (Рисунок 16) без признаков острого или хронического отторжения.

В группе "3 Гр+МАТ" (п=10), где уровень костномозгового химеризма был ниже, среднее время выживания трансплантата составило 180 (180-180) суток (р<0,0001) (Рисунок 16), к концу периода наблюдения трансплантаты были жизнеспособны и успешно функционировали. У мыши с низким уровнем химеризма относительно других мышей наблюдалось воспаление вокруг трансплантата, а затем отторжение на 28-е сутки.

В группе "1,5 Гр+АВТ-199" (п=10) у 5 из 10 реципиентов трансплантаты отторглись (Рисунок 16). У 3 из 5 химер к концу периода наблюдения выявлены фрагменты трансплантата и воспаление вокруг, что может свидетельствовать о хроническом отторжении, у 2 реципиентов наблюдались фрагменты трансплантата меньше 10% без воспаления.

В группе " АВТ-199+МАТ" (п=10) у трех мышей-нехимер кожные лоскуты отторглись на 18 сутки после трансплантации, у 7 мышей к концу наблюдения не выявлено фрагментов донорской кожи в размере 10% и более от площади трансплантата. Наблюдались лишь единичные черные волосы или волосяные луковицы. Поскольку трансплантаты, вероятно, испытывали хроническое отторжение в течение всего периода наблюдения, невозможно однозначно определить день отторжения. В анализе выживаемости Каплана-Майера эти данные цензурированы на 180 сутки, когда не было видимых признаков приживления донорской кожи (Рисунок 16).

Выживаемость кожных трансплантатов

с 100 2 го с

-1- контроль 4,5 Гр

jt №

4,5 Гр+аТТ J- ЗГр+МАТ

о

в >

— 1,5 Гр+АВТ-199 -■- АВТ-199+МАТ

о

■Q

га о £

о

50

100

150

200

сутки

А - кривые выживаемости Каплана-Майера. Данные представлены в виде вероятности выживаемости трансплантата в процентах. Каждая точка соответствует одной мыши. Кривые выживаемости построены с использованием анализа выживаемости Каплана-Майера. Логранговый тест проведен для каждой группы по сравнению с группой «контроль»: «4,5 Гр» vs «контроль», р<0,0001; «4,5 Гр+аТТ» vs «контроль», р<0,0001; «3 Гр+МАТ» vs «контроль», р<0,0001; «1,5 Гр+АВТ-199» vs «контроль, р<0,0001; «АВТ- 199+МАТ» vs «контроль»,

р=0,0006.

Рисунок 16 - Анализ выживаемости кожных аллотрансплантатов у мышей-

3.17. Восстановление общего числа клеток в костном мозге и количества ГСК

Для оценки восстановления костного мозга после разных режимов кондиционирования и ТКМ исследовано общее количество и количество ГСК в костном мозге. На 180-е сутки после ТКМ обнаружено, что общее количество клеток в костном мозге в группах не отличалось от такового в контрольной группе, независимо от режима кондиционирования (Таблица 5 и Рисунок 17А), только в группе «1,5 Гр+АВТ-199» число лимфоцитов превосходило контрольные значения (р=0,0032).

Однако, число ГСК в группах с сублетальным облучением в дозе 4,5 Гр было достоверно меньше, по сравнению с контролем (р=0,0013 и р=0,0165) (Таблица 5 и Рисунок 17Б).

реципиентов при разных режимах кондиционирования

Группы Клеточность Число ГСК

Контроль 56,25 (49,50-63,48) 0,88 (0,65-1,13)

4,5 Гр 62,05 (48,95-66,23) 0,49 (0,43-0,59)*

4,5 Гр+аТТ 58,30 (47,80-71,70) 0,57 (0,39-0,65)*

3 Гр+МАТ 58,80 (46,88-66,40) 0,79 (0,60-0,86)

1,5 Гр+АВТ-199 76,90 (69,75-83,63)* 0,93 (0,70-0,99)

АВТ-199+МАТ 60,65 (57,20-68,70) 0,89 (0,68-0,99)

*^<0,05

А

С 1

а) 10СН

о О

ш

5

0

1

н о о £

со

о н

о

с

о с о Е т

80-

60-

40-

20-

о0* Л* ^

<<9 «6 ,6

ч? ^

А - клетки костного мозга; Б - ГСК. Данные представлены в виде значений абсолютного числа клеток в млн. Данные представлены как медиана ± IQR. Звездочки указывают на значительную разницу между группами, определенной с использованием критерия Краскела-Уоллиса. Отличия считались значимыми при

р < 0,05.

Рисунок 17 - Число всех клеток в костном мозге и ГСК во всех группах у мышей-реципиентов на 180-е сутки

Б

На 180-е сутки после ТКМ проанализировано восстановление тимопоэза при использовании различных режимов кондиционирования. Для этого определяли общую клеточность в тимусе (s, сингенный) и тимусном аллотрансплантате (а, аллогенный), количество клеток в субпопуляциях DN-тимоцитов (double-negative, двойные негативные), DP-тимоцитов (double-positive, двойные позитивные), SP (single-posivite, сингл-позитивные) CD4+-тимоцитов и CD8+-тимоцитов. Поскольку в группе «4,5 Гр+аТТ» у всех мышей два тимуса: собственный сингенный и аллогенный под капсулой почки, каждый из них будет рассмотрен отдельно.

К 180-м суткам общее количество тимоцитов во всех тимусах, кроме сингенного тимуса в группе «4,5 Гр+аТТ» и тимуса в группе «4,5 Гр», не отличалось от контроля. В группе «4,5 Гр» число тимоцитов уменьшилось в 2 раза (р=0,0296). В сингенном тимусе число тимоцитов уменьшилось в 6 раз (p<0,0001), напротив, в аллогенном тимусе численность тимоцитов не отличалась от контроля (Таблица 6 и Рисунок 18).

Таблица 6 - Количество тимоцитов (на весь орган) и клеток в субпопуляциях тимуса у мышей-реципиентов на 180-е сутки после ТКМ, млн

Группы Тимоциты DN DP SP CD4+ SP CD8+

контроль 43,00 (37,9046,85) 2,89 (2,004,46) 33,43 (26,1935,71) 4,89 (4,036,85) 1,28 (1,061,92)

4,5 Гр 24,10 (18,7534,40)* 0,75 (0,521,10)* 17,86 (12,9124,73)* 4,25 (3,286,15) 1,40 (1,111,78)

4,5 Гр+аТТ 6,30 (3,6511,20)* 1,02 (0,741,73)* 3,04 (0,715,29)* 1,29 (0,812,41)* 1,44 (0,852,26)

4,5 Гр+аТТа 43,30 (38,6553,70) 1,82 (1,342,01) 37,39 (31,7044,12) 4,00 (3,245,64) 1,48 (1,092,03)

3 Гр+МАТ 38,85 (25,6540,50) 1,79 (1,092,53) 29,88 (20,1531,20) 4,61 (3,024,95) 1,46 (1,082,10)

1,5 Гр+АВТ-199 30,75 (23,2536,75) 2,27 (1,663,40) 21,11 (16,8727,80) 3,99 (3,065,64) 1,13 (0,902,02)

АВТ-199+МАТ 30,50 (23,0038,50) 2,42 (2,183,48) 23,87 (16,6429,80) 3,73 (3,324,81) 0,89 (0,741,25)

*-<0,05

Данные представлены в виде абсолютных значений числа клеток в млн. Данные представлены как медиана ± IQR. Звездочки указывают на значительную разницу между группами, определенной с использованием критерия Краскела-Уоллиса. Отличия считались значимыми при р < 0,05.

Рисунок 18 - Число тимоцитов во всех группах у мышей-реципиентов на

180-е сутки

Число клеток в субпопуляции ЭК-тимоцитов было достоверно меньше также только в группе «4,5 Гр» и сингенном тимусе в группе «4,5 Гр+аТТ» (Таблица 6 и Рисунок 19А).

Среди субпопуляции ЭР-тимоцитов в сингенном тимусе в группе «4,5 Гр+аТТ» количество клеток уменьшилось в 10 раз по сравнению с контролем (р<0,0001). В группе «4,5 Гр» число ЭР-тимоцитов уменьшилось в 2 раза по сравнению с контролем (р= 0,0336). В аллогенном тимусе и в тимусах в группах с минимальной дозой ТОТ или без него количество ЭР-тимоцитов достоверно не отличалось от контроля (Таблица 6 и Рисунок 19Б).

а

**

####

\<ь ж^ ^ <<г у? ж^ Л* л ^

\ч 1

А - ЭК-тимоциты; Б - ЭР-тимоциты. Данные представлены в виде абсолютных значений числа клеток в млн. Данные представлены как медиана ±

IQR. Звездочки указывают на значительную разницу между группами, определенной с использованием критерия Краскела-Уоллиса. Отличия считались

значимыми при р < 0,05.

Рисунок 19 - Число клеток в субпопуляции ЭК-тимоцитов и ЭР-тимоцитов во всех группах у мышей-реципиентов на 180-е сутки

Восстановление числа клеток в контрольной группе в субпопуляциях БР СЭ4+- и СЭ8+-тимоцитов наблюдалось на 180-е сутки во всех группах, независимо от режима кондиционирования (Рисунки 20А и 20Б). Исключение составляет сингенный тимус в группе «4,5 Гр+аТТ», где чисто БР СЭ4+ Т-клеток было значительно меньше, чем в контроле (р=0,0002), что отражено в Таблице 6 и на Рисунке 20А.

б

а

Е 8-|

^ V? лР Л ^

<9 <<г ^ ^л®

^ Л

¿Ъ х* -Л

К- ^

А - БР СВ4+-тимоциты; Б - БР СВ8+-тимоциты. Данные представлены в виде абсолютных значений числа клеток в млн. Данные представлены как медиана ± IQR. Звездочки указывают на значительную разницу между группами, определенной с использованием критерия Краскела-Уоллиса. Отличия считались

значимыми при р < 0,05. Рисунок 20 - Число клеток в субпопуляции БР-тимоцитов во всех группах у мышей-реципиентов на 180-е сутки

б