Реактивация противоопухолевого белка p53 в клетках человека, содержащих высокоонкогенный вирус папилломы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Кочетков, Дмитрий Владимирович

• Кочетков, Дмитрий Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кочетков, Дмитрий Владимирович

Содержание ^ Список принятых сокращений

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Реактивация противоопухолевого белка p53 в клетках человека, содержащих высокоонкогенный вирус папилломы»

1.1 Общая характеристика фактора р53 7

1.1.1 Молекулярная организация гена р53 71.1.2 Доменная организация белка р53 81.2 Стабилизация и активация р53 91.2.1 Ингибирование р53 при помощи убиквитиновой лигазы MDM2 91.2.2 Посттрансляционные модификации белка р53 101.3 Латентная и активная формы р53 131.4 Клеточные и тканеспецифичные эффекты белка р53 141.4.1 Гены необходимые для ареста клеточного цикла 161.4.2 Гены участвующие в репарации ' 161.4.3 Гены кодирующие ингибиторы ангиогенеза и другие секретируемые факторы 171.4.4 Тканеспецифичность клеточного супрессора р53 171.4.5 р53-индуцируемый апоптоз 171.4.6 Выбор между апоптозом и арестом клеточного цикла 191.5 Белок - белковые взаимодействия р53 21 1.5.1 Взаимодействие р53 с клеточными белками 211.5.1.1 Взаимодействие р53 с ТАТА-связывающим белком (ТВР) и ТВР-связанными факторами (TAF) 221.5.1.2 Взаимодействие р53 с РНК-полимеразой И, а также с элонгационным фактором ELL 231.5.1.3 Комплекс р53 с CREB-связывающим белком (СВР) и рЗОО 24О-/1.5.1.4 Взаимодействие р53 с белком репарационной системы hRad 51 251.5.1.5 Роль транскрипционного фактора р53 в контроле пролиферации клеток эпителия 25 1.5.2 Взаимодействие фактора р53 с вирусными белками 261.5.2.1 Взаимодействие с аденовирусными белками 261.5.2.2 Связывание с белками вируса гепатита В 271.5.2.3 Механизм взаимодействия с ретровирусными белками 281.5.2.4 Связывание р53 с большим Т-антигеном вируса SV-40 281.5.2.5 Взаимодействие с белками папилломавируса человека (HPV-16) 292.1 Характеристика генома папилломавирусов 302.1.1 Геном HPVs 302.1.2 Роль белка Е7 312.1.3 Трансформирующая роль белка Е5 332.1.4 Белок Е6 и его функции 342.1.4.1 Структура белка Е6 342.1.4.2 Взаимодействие клеточных белков и вирусного онкогена Е6 352.1.4.3 Взаимодействие Е6 и р53 40 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка 452.2 Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов 452.3 Измерение концентрации белка по методу Бредфорд 462.4 Фракционирование белков в полиакриламидном геле 462.5 Перенос белков из гелей на фильтры и имму но детекция 472.6 Норзерн блот анализ 472.7 ОТ-ПЦР анализ 482.8 Выделение геномной ДНК из клеток эукариот 482.9 Получение компетентных клеток E.coli и трансформация 492.10 Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 502.11 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами 512.12 Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 512.13 Реакция лигирования 512.14 Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получение клеточных линий 522.15 Окрашивание клеток с помощью реагента ONPG для количественного определения эффективности работы репортсрного гена (3-галактозидазы. 532.16 Окраска клеток на X-Gal 54 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Разработка и оптимизация репортерной системы, позволяющей определять изменения активности р53 в клетках рака шейки матки. 563.2 Испытание репортерной системы на различных клеточных линиях после обработки ДНК-повреждающим агентом 5-фторурацилом. 583.3 Поиск модельных условий для индукции р53-зависимого репортерного гена в HPV-позитивных клетках рака шейки матки. 593.4 Отбор химических соединений, способных реактивировать р53 в НРУ18-позитивной линии клеток рака шейки матки. 623.5 Функциональные свойства 17 классов химических соединений, способных реактивировать р53 в линии клеток HeLa. 663.6 Специфичность действия активных соединений в отношении HPV-позитивных клеток HeLa. 673.7 Активация репортерного гена в клетках HeLa коррелирует с индукции эндогенных генов-мишеней р53. 683.8 Реактивация р53 некоторыми из активных соединений связана с подавлениемтранскрипции вируса папилломы человека. 713.9 Соединения PRESS-229 и PRESS-570 снижают уровень экспрессии белка Е6. 74ЗЛО PRESS-соединения специфически снижают выживаемость HPV-позитивных клетокрака шейки матки HeLa. 753.11 PRESS-229 индуцирует апоптоз в HPV-позитивных клетках HeLa. 783.12 Комплиментарное взаимодействие 5 классов химических веществ с соединением PRESS-229 в различных концентрациях, на клеточной линии HeLa 793.13 Противоопухолевая активность р53-реактивирующего соединения PRESS-229. 82 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 83 ВЫВОДЫ 84 БЛАГОДАРНОСТИ 86 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 88СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Кочетков, Дмитрий Владимирович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате поиска химических соединений, способных восстанавливать транскрипционную активность р53 в НРУ-позитивной линии клеток рака шейки матки человека НеЬа, нами было идентифицировано и исследовано около 17 классов химических соединений. Последующее испытание этих соединений на ряде контрольных линий клеток, различающихся по статусу гена р53, позволило сократить число перспективных молекул до шести. Из них два наиболее активных соединения (РЫЕ88-229 и Р11Е88-570) были способны избирательно угнетать транскрипцию встроенного генома вируса папилломы человека. Это угнетение вызывало снижение уровня экспрессии белка Е6 вируса папилломы, что приводило к стабилизации и накоплению транскрипционно-активного р53. В результате происходила активация как репортерного гена, находящегося под контролем синтетического р53-зависимого промотора, так и некоторых эндогенных мишеней р53. Реактивация р53 приводила к заметному и специфическому для НРУ-позитивных клеток НеЬа угнетению пролиферации, а также к индукции апоптоза. При внутрибрюшинном введении соединение Р11Е88-229 было способно снижать опухолеобразование у бестимусных мышей, которым были введены клетки НеЬа. Терапевтическое действие РЯЕ88-229 было особенно выражено при его комбинированном применении вместе с гамма облучением. Проведенные эксперименты указывают на возможность создания на основе соединений, родственных • Р11Е88-229, новых противоопухолевых препаратов, которые будут обладать терапевтическим действием в отношении опухолей человека, вызванных вирусами папиллом.