Регуляция редокс-гомеостаза стволовых клеток человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Люблинская Ольга Геннадьевна

• Люблинская Ольга Геннадьевна
• доктор наук
• 2026

Оглавление диссертации доктор наук Люблинская Ольга Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Стволовые клетки

1.1.1 Плюрипотентные стволовые клетки человека

1.1.2 Мультипотентные мезенхимные стволовые/прогениторные клетки

1.2 Внутриклеточный редокс-гомеостаз

1.2.1 Активные формы кислорода

1.2.2 Внутриклеточные источники АФК

1.2.3 Внутриклеточные системы элиминации АФК

1.2.4 Регуляторные свойства АФК

1.2.5 Концепция окислительного стресса

1.2.6 Нарушения редокс-гомеостаза клеток под действием антиоксидантов

1.2.6.1 Концепция антиокислительного (редуктивного) стресса

1.3 Определение параметров редокс-гомеостаза клеток

1.3.1 Методы измерения внутриклеточного уровня АФК

1.3.2 Методы оценки активности редокс-ферментов

1.4 Особенности редокс-гомеостаза стволовых клеток млекопитающих

1.4.1 Уровень АФК в стволовых и дифференцированных клетках

1.4.2 Источники АФК в стволовых клетках

1.4.3 АФК-зависимая регуляция в стволовых клетках

1.4.4 Реакция стволовых клеток на окислительный стресс

1.5 Заключительный раздел обзора литературы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клеточные культуры

2.2 Модуляторы/ингибиторы физиологической активности клеток

2.3 Измерение уровня и удельного содержания АФК в клетках

2.4 Методы молекулярно-клеточной биологии

2.5 Статистический анализ данных

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка и апробация методов для характеристики

редокс-гомеостаза стволовых клеток

3.1.1 Флуоресцентные АФК-чувствительные красители

3.1.1.1 Флуоресцентный зонд гидроэтидин

3.1.1.2 Флуоресцентный зонд H2DCFDA

3.1.2 Генетически кодируемый биосенсор перекиси водорода НуРег

3.1.2.1 Детекция флуоресценции НуРег с использованием проточной цитометрии

3.1.2.2 Количественное определение внутриклеточной

концентрации перекиси водорода с помощью НуРег

3.1.2.3 Оценка пероксидазной активности клеток с помощью НуРег

3.1.2.4 Оценка внутриклеточной дисульфидредуктазной

активности с помощью НуРег

3.1.2.5 Оценка базального уровня внутриклеточной

перекиси водорода с помощью НуРег

3.1.3 Заключение раздела

3.2. Регуляция редокс-гомеостаза стволовых клеток человека

в условиях физиологической нормы

3.2.1 Внутриклеточный уровень и концентрация АФК в стволовых и дифференцированных клетках человека

3.2.2 Вариация внутриклеточного уровня АФК в

пролиферативном цикле стволовых клеток

3.2.2.1 Динамика уровня АФК в пролиферативном цикле эМСК

3.2.2.2 Динамика уровня АФК в пролиферативном цикле

плюрипотентных клеток

3.2.3 АФК-зависимая регуляция пролиферативного цикла

стволовых клеток человека

3.2.3.1 АФК-зависимые события пролиферативного цикла эМСК

3.2.3.2 АФК-зависимые регуляторы пролиферативного цикла эМСК

3.2.3.3 АФК-зависимые события пролиферативного цикла плюрипотентных клеток

3.2.3.4 АФК-зависимые регуляторы пролиферативного цикла

плюрипотентных клеток

3.2.3.5 АФК-зависимая регуляция пролиферативного цикла дифференцированных клеток-потомков ЭСК и фибробластов человека

3.2.4 Заключение раздела

3.3 Реакция стволовых клеток человека на окислительный стресс

3.3.1 Пероксидазная активность в стволовых и не стволовых клетках человека

3.3.2 Ферментативные пути, контролирующие пероксидазную активность

в стволовых и не стволовых клетках

3.3.3 Дисульфидредуктазная активность в клетках стволового и не стволового фенотипа

3.3.4 Устойчивость к цитотоксическому действию H2O2 клеток

стволового и не стволового фенотипа

3.3.5 Заключение раздела

3.4 Реакция стволовых клеток человека на нарушения редокс-гомеостаза,

вызванные действием фармакологических антиоксидантов

3.4.1 Репликативный стресс и активация программ стресс-индуцированного старения в культурах эМСК, обработанных высокими дозами антиоксидантов в фазе синтеза ДНК

3.4.1.1 Молекулярные триггеры репликативного стресса,

индуцированного в культурах эМСК высокими дозами антиоксидантов

3.4.2 Репликативный стресс и активация программы апоптоза в культурах плюрипотентных клеток, обработанных высокими дозами антиоксидантов

3.4.4 Заключение раздела

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ №1 - РИСУНКИ И ТАБЛИЦЫ

«Самое непостижимое в этом мире — это то, что он постижим»

(А.Эйнштейн)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция редокс-гомеостаза стволовых клеток человека»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Окислительно-восстановительные (редокс-) реакции относятся к одному из наиболее распространенных типов химических взаимодействий в живых клетках. В цепочках этих реакций в качестве финального акцептора электронов аэробные организмы используют молекулярный кислород (О2). В ходе реакций с участием О2 выделяется энергия, запасаемая клетками в виде АТФ, формируется третичная и четвертичная структура белков, расщепляются сахара, аминокислоты и жирные кислоты. В физиологическом диапазоне температур химическая активность О2 невысока, и редокс-реакции с его участием требуют катализа, наличия специфических ферментов, что предохраняет молекулярный пул клетки от неспецифического окисления кислородом. Однако, в качестве побочных продуктов аэробного метаболизма в клетках образуется целый ряд кислородсодержащих, низкомолекулярных и высокомолекулярных соединений, обладающих высокой окислительной способностью, получивших обобщенное название - активные формы кислорода (АФК). Среди этих веществ есть нерадикальные (напр. перекись водорода H2O2, органические гидроперекиси ROOH, синглетный кислород 1О2) и свободно-радикальные формы (напр. супероксид анион-радикал O2-*, гидроксильный радикал OH*, пероксильный радикал ROO*). Обладая высокой неспецифической реакционной способностью, АФК могут наносить серьезный ущерб макромолекулам клетки -окислять ДНК, белки, липиды, приводя к накоплению мутаций, неразлагаемых белковых и липопротеиновых агрегатов [Sies, Berndt, Jones, 2017].

Для нейтрализации негативного влияния продуктов аэробного метаболизма, уже на самых ранних этапах эволюции - одновременно с появлением фотосинтезирующих бактерий - в одноклеточных организмах появились молекулярные системы антиоксидантной защиты, способные элиминировать АФК и восстанавливать окисленные макромолекулы. Позже, при образовании в аэробной среде более сложных форм жизни, механизмы, позволяющие быстро производить из легко доступных витальных молекул О2 высокореакционные соединения и эффективно их элиминировать, оказались востребованными для совершенствования регуляторных систем клеток. С эволюционной точки зрения, концепция АФК-зависимого сигналинга оказалась выгодной, и в клетках современных организмов АФК продуцируются не только как побочные продукты метаболизма О2, но и как регуляторные молекулы. Продукция АФК является составляющей частью жизненно важных сигнальных каскадов, контролирующих уничтожение патогенов при фагоцитозе, пролиферацию, миграцию, апоптотические программы

клеток [Sies, Jones, 2020]. В каскадах АФК-зависимых регуляторных реакций генерацию и элиминацию АФК, а также окисление/восстановление сигнальных молекул клетки, контролирует большая группа внутриклеточных редокс-ферментов (оксидазы, пероксидазы, редуктазы), вкупе со своими коферментами (NADH, NADPH, глутатион). Координированное взаимодействие макро- и низкомолекулярных редокс-активных молекул клетки обеспечивает поддержание внутриклеточного редокс-гомеостаза.

Гомеостаз обычно определяют как сумму скоординированных физиологических процессов, поддерживающих устойчивые состояния биологических систем [Davies, 2016a]. Соответственно, редокс-гомеостаз клетки - это сумма процессов в клеточных компартментах, обеспечивающая поддержание в определённых пределах соотношения между концентрациями редокс-активных веществ, доноров и акцепторов электронов [Мартинович, Черенкевич, 2008]. Нарушение физиологически-релевантного баланса между генерацией и элиминацией, окислением и восстановлением этих соединений, вызванное как внешними воздействиями, так и дисфункцией клеточного аппарата, может определять судьбу клеток, их выбор между жизнью и смертью. Тем не менее, представления научного сообщества о молекулярных механизмах, обеспечивающих поддержание внутриклеточного редокс-гомеостаза и особенностях функционирования этих механизмов в клетках разного типа пока ограничены и часто противоречивы. Хотя масштабная программа исследований, проведённая во второй половине прошлого и начале текущего века, позволила в целом разобраться в многообразии представителей семейства АФК, редокс-ферментов и коферментов, значительная доля этих исследований была проведена in vitro с использованием клеточных лизатов или выделенных из них белков и требует дальнейшей верификации в экспериментах на живых клетках. Актуальная задача сегодняшнего дня -транслировать полученные знания в систему in cellulo и выяснить, как обнаруженное многообразие редокс-активных соединений сосуществует и взаимодействует друг с другом в живой клетке, на каких принципах основаны механизмы редокс-регуляции и сигнализации, как формируется редокс-ландшафт в разных клеточных компартментах и в какой степени он является зависимым от клеточного фенотипа. В частности, настоящее диссертационное исследование нацелено на изучение особенностей редокс-гомеостаза и редокс-регуляции в клетках стволового фенотипа.

Степень разработанности темы исследований. Стволовыми называют недифференцированные (неспециализированные) клетки, поддерживающие способность к самообновлению и дифференцировке. Именно эти клеточные популяции дают начало всем функционально-зрелым клеткам организма, и именно этот тип клеток привлекает сейчас к себе особое внимание исследователей, занятых разработкой клеточных биомедицинских технологий.

Стволовые клетки различают по происхождению (напр. эмбриональные, постнатальные), а также по способности к дифференцировке (тотипотентные, плюрипотентные, мультипотентные, олигопотентные, унипотентные). Помимо стволовых, в организме существуют и другие клеточные типы, обладающие пластичностью - прогениторные клетки. В отличие от стволовых, эта разновидность клеток обладает меньшим потенциалом самообновления на уровне популяции, и, как правило, может дифференцироваться в определенном (или определенных) направлениях, занимая промежуточное положение между стволовыми и терминально-дифференцированными клетками в иерархии клеточных фенотипов. В настоящей работе речь пойдёт об особенностях редокс-гомеостаза двух типов клеток человека, имеющих первостепенное значение для развития биомедицины - мультипотентных мезенхимных стволовых/прогениторных клеток человека (МСК) [Dominici и др., 2006; Viswanathan и др., 2019], выделенных из тканей взрослого организма, и плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) [Liu и др., 2015], присутствующих в организме лишь на стадии эмбрионального развития.

ПСК обладают практически неограниченным пролиферативным и дифференцировочным потенциалом и являются источником формирования всех тканей и органов зародыша, исключая экстраэмбриональные ткани (напр. плаценту). In vitro ПСК получают либо из внутренней клеточной массы бластоцисты, либо путем генетического репрограммирования соматических клеток взрослого организма. В отличие от ПСК, МСК в условиях in vitro имеют ограниченный пролиферативный и дифференцировочный потенциал и способны преимущественно дифференцироваться в клетки мезенхимного ряда - в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлении. МСК могут быть выделены из различных тканей взрослого организма (костный мозг, жировая ткань, эндометрий, пульпа зуба и др.), а также из фетальных и экстраэмбриональных тканей (Вартонов студень, хорион). МСК в течение длительного времени считались мультипотентными стволовыми клетками тканей мезенхимного ряда, однако, в настоящее время, стволовой фенотип МСК всё чаще подвергается сомнению - накапливается множество доказательств прогениторной природы этих клеток [Viswanathan и др., 2019]. С учётом существующих неопределенностей, аббревиатура МСК расшифровывается в настоящей работе как «мультипотентные стволовые/прогениторные клетки», однако в качестве обобщающего термина для ПСК и МСК, для краткости, используется определение «стволовые», подчёркивающее пластичность обоих клеточных фенотипов.

Исторически, интерес к особенностям редокс-гомеостаза стволовых клеток возник сразу же после получения in vitro культур мультипотентных и плюрипотентных клеток. Мотивацией для проведения исследований послужил тот факт, что стволовые и прогениторные клетки в организме часто существуют в условиях специального микроокружения - стволовых ниш, обедненных кислородом. В особенности, это относится к ПСК, естественная ниша которых -

предимплантационная бластоциста - окружена внутриматочной жидкостью с содержанием кислорода, не превышающим 4% [Ng и др., 2018]. В ранних работах, посвященных характеристике редокс-гомеостаза клеток стволового фенотипа, было обнаружено, что по сравнению со своими дифференцированными клетками-потомками, стволовые клетки характеризуются пониженным уровнем АФК и повышенной экспрессией целого ряда генов антиоксидантной защиты [Armstrong и др., 2010; Saretzki и др., 2004]. Кроме того, выяснилось, что культивирование в условиях мягкой гипоксии приводит к увеличению их пролиферативной активности [Haque и др., 2013]. Принимая во внимание эти данные, а также учитывая гипоксическое окружение стволовых клеток в их естественных нишах, сформировалась концепция об особом редокс-статусе этих клеток [Armstrong и др., 2010; Bigarella, Liang, Ghaffari, 2014; Maraldi и др., 2021]. Согласно этой концепции, стволовой фенотип характеризуется низкой способностью продуцировать АФК и высокой антиоксидантной активностью, что позволяет стволовым клеткам избегать окислительных повреждений и длительное время сохранять свою функциональную активность. Однако недавно были опубликованы новые экспериментальные работы, свидетельствующие о прямо противоположных эффектах - повышении уровня АФК при репрограммировании дифференцированных клеток в плюрипотентное состояние и стимулирующей роли АФК в регуляции пролиферации как плюрипотентных, так и некоторых тканеспецифических стволовых клеток взрослого организма [Fan и др., 2011; Kang и др., 2016; Paul и др., 2014]. Таким образом, назрела очевидная необходимость последовательного и комплексного изучения особенностей регуляции редокс-гомеостаза в стволовых клетках разного типа и происхождения для верификации сформулированных ранее концепций.

Цели и задачи работы. Цель настоящего диссертационного исследования - характеристика молекулярных механизмов регуляции редокс-гомеостаза в стволовых клетках человека и экспериментальная проверка концепции о сопряжении этих механизмов с фенотипом стволовости.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. разработать методы, позволяющие количественно оценивать параметры редокс-гомеостаза в клеточных компартментах;

2. сравнить внутриклеточный уровень АФК в культурах стволовых и дифференцированных клеток человека и охарактеризовать взаимосвязь между стволовым фенотипом клеток и внутриклеточным содержанием АФК;

3. сравнить динамику уровня АФК в пролиферативном цикле стволовых клеток человека и их дифференцированных клеток-потомков;

4. определить фазы пролиферативного цикла стволовых и дифференцированных клеток человека, наиболее чувствительные к изменению равновесного внутриклеточного уровня АФК; идентифицировать АФК-зависимые регуляторные события пролиферативного цикла клеток стволового и не стволового фенотипа;

5. сравнить эффективность систем антиоксидантной защиты стволовых и дифференцированных клеток человека: оценить пероксидазную и дисульфидредуктазную активность стволовых клеток и их дифференцированных клеток-потомков в условиях окислительного стресса; охарактеризовать изменение этой активности при репрограммировании соматических клеток в плюрипотентное состояние;

6. определить вклад глутатион- и тиоредоксин-зависимых ферментативных систем в пероксидазную активность клеток стволового и не стволового фенотипа в условиях окислительного стресса, индуцированного экзогенной перекисью водорода;

7. проанализировать ответ стволовых и дифференцированных клеток человека на обработку фармакологическими антиоксидантами в высоких дозах; идентифицировать молекулярные механизмы, регулирующие эти клеточные реакции.

Научная новизна работы. Результаты проведенных исследований позволили существенно продвинуться вперед в расшифровке механизмов, регулирующих редокс-гомеостаз клеток человека - как стволового, так нестолового фенотипа - в нормальных физиологических условиях, а также в условиях стресса, вызванного повышением или понижением физиологически-релевантного уровня АФК. Для достижения этих результатов был разработан набор авторских методов, позволяющих с помощью HyPer, генетически кодируемого биосенсора Н2О2, количественно определять параметры редокс-гомеостаза клеток (внутриклеточную концентрацию Н2О2, пероксидазную и дисульфидредуктазную активность).

С использованием разработанных методов, впервые проведены экспериментальные оценки молярной концентрации Н2О2 в цитоплазме клеток человека в нормальных физиологических условиях, а также в условиях внешнего Н2О2-индуцированного окислительного стресса, обнаружена зависимость пероксидазной активности клеток человека от интенсивности внешней окислительной нагрузки, охарактеризован вклад глутатион- и тиоредоксин-зависимых ферментативных путей в пероксидазную активность клеток стволового и нестволового фенотипа при разной интенсивности Н2О2-индуцированного стресса, обнаружено негативное влияние высоких доз фармакологических антиоксидантов на регуляцию синтеза ДНК в стволовых и нестволовых клетках, расшифрованы потенциальные молекулярные механизмы повреждающего действия высоких доз антиоксидантов на клетки человека.

Пионерский характер работы и её концептуальность определяется основным результатом -доказательством несостоятельности общепризнанной концепции о сопряжении редокс-гомеостаза стволовых клеток с фенотипом стволовости.

Теоретическая значимость работы. Диссертационное исследование расширяет и корректирует существующие представления о ключевых параметрах редокс-гомеостаза клеток человека, АФК-зависимых механизмах регуляции клеточной пролиферации, механизмах антиоксидантной защиты стволовых и дифференцированных клеток человека в условиях внешнего окислительного стресса, клеточных реакциях на обработку высокими дозами фармакологических антиоксидантов. Фундаментальное значение работе придаёт формулировка положений о высокой степени консерватизма базовых параметров редокс-гоместаза и принципов редокс-регуляции в клетках человека.

Практическая значимость работы. Практическая значимость работы определяется, в перую очередь, её методической составляющей - разработкой новых методов количественной оценки параметров редокс-гомеостаза клеток. Предложенные методы основаны на использовании HyPer, генетически кодируемого биосенсора Н2О2. Эти наработки могут применяться в дальнейшем не только как инструментарий для фундаментальных исследований, но и как средство медицинской диагностики в случае нарушений внутриклеточного редокс-метаболизма при различных патологиях человека, а также в качестве методической базы при разработке биомедицинских клеточных платформ для тестирования фармакологических редокс-модуляторов.

Кроме того, важное практическое значение имеет раздел работы, описывающий ответ стволовых клеток на обработку высокими дозами фармакологических антиоксидантов. Проведенные исследования важны для подбора адекватных концентрационных диапазонов при проведении клинических испытаний новых препаратов с антиоксидантной активностью, а также для расшифровки молекулярных механизмов возможных побочных явлений при терапевтическом использовании фармакологических антиоксидантов.

Результаты работы могут быть включены в лекционные курсы для студентов ВУЗов, обучающихся по направлениям, включающим биологию, биофизику, молекулярную и медицинскую физику.

Методы исследования. При проведении исследований использовался комплексный подход, основанный на применении авторских методик, разработанных для оценки внутриклеточного содержания АФК и активности редокс-ферментов в живых клетках, а также стандартного набора методов молекулярно-клеточной биологии: флуоресцентной микроскопии, Вестерн-блоттинга,

количественного ПЦР, транскриптомного анализа, трансфекции и трансдукции. В качестве клеточных моделей МСК использовались преимущественно МСК эндометриального происхождения (эМСК), в качестве моделей ПСК - линии эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК), а также индуцированные ПСК, полученные путём генетического репрограммирования эМСК (иПСК). Для корректного сопоставления свойств стволовых и дифференцированных клеток человека были созданы две системы изогенных клеточных линий: один набор включал в себя ЭСК и культуры их фибробласто-подобных дифференцированных потомков, а второй - линию иПСК, линию их соматических клеток-предшественников эМСК, а также культуры дифференцированных потомков иПСК. Помимо этого, в качестве дополнительного примера клеток не стволового фенотипа, использовались дермальные фибробласты и лимфоциты человека, а также культуры опухолевых клеток HeLa и ^562.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Внутриклеточный уровень АФК, традиционно определяемый в клеточной биологии как усредненное по клеточной популяции содержание АФК в единичной клетке, без нормировки на клеточный объем или массу белка, не может быть использован для сравнительной характеристики редокс-гомеостаза клеток разного фенотипа. Для проведения подобного анализа более информативным подходом является оценка удельного внутриклеточного содержания АФК в расчете на грамм белка или оценка внутриклеточной концентрации АФК.

2. При стандартных условиях культивирования клеток человека удельное содержание АФК, оцениваемое в расчёте на массу клеточного белка, является высококонсервативным параметром и значимо не различается в клетках разного фенотипа. Не существует взаимосвязи между стволовым фенотипом клеток и удельным внутриклеточным содержанием АФК.

3. В культивируемых клетках человека направленное понижение внутриклеточного содержания АФК, индуцированное высокими дозами фармакологических антиоксидантов, тормозит инициацию и прогрессию синтетической фазы клеточного цикла, вызывает репликативный стресс, накопление разрывов ДНК и, как следствие, активацию молекулярных программ сенесценции или апоптоза. Стволовые и дифференцированные клетки человека отвечают на обработку антиоксидантами схожим образом.

4. В условиях острого окислительного стресса, индуцированного внеклеточной Н2О2, эффективность систем антиоксидантной защиты в клетках человека зависит от окислительной нагрузки; при малой интенсивности стресса способность клеток утилизировать избыточный пероксид максимальна и, постепенно снижаясь при увеличении нагрузки, контролируется тиоредоксин-зависимой ферментативной системой, а при высокой - поддерживается на

постоянном невысоком уровне благодаря активности глутатион-зависимых ферментативных путей. Не существует однозначной взаимосвязи между эффективностью систем антиоксидантной защиты и стволовым фенотипом клеток.

Достоверность полученных результатов. Все применяемые в ходе выполнения работы приборы проходили плановую поверку, используемые материалы являлись сертифицированными коммерческими продуктами известных фирм, оценка достоверности полученных результатов выполнена с использованием соответствующих методов статистической обработки данных.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях в виде стендовых и устных докладов, в том числе: International Society for Stem Cell Research (ISCCR) 12th Annual meeting (Canada, 2014); Society for Free Radical Biology and Medicine (SFRBM) 22nd Annual meeting (USA, 2015); Society for Free Radical Research Europe (SFRR-E), Annual meetings (Hungary, 2016; Turkey, 2024); Society for Free Radical Research - International (SFRR-I) Biennial meeting (Portugal, 2018); EMBO Conference "Redox Biology" (Russia, 2017); EMBO Workshops:

"Thiol oxidation in toxicity and signaling" (Spain 2017)

"Thiol oxidation in biology: Biochemical mechanisms to physiological outcomes" (Spain 2022) "Thiol-based redox switches: From chemistry to physiology and pathology" (Spain 2025) SPP1710 Conference "Thiol-based switches and redox regulation" (Spain, 2019); Gordon Research Conference "Thiol-Based Redox Regulation and Signaling" (Spain, 2022); 15th BCRB Fall Symposium & Biosensors Brussels Symposium (Belgium, 2024)

V съезд биохимиков России (Дагомыс, 2016);

V Международная конференция "Постгеном'2018" (Казань, 2018);

III, IV, V, VI Национальный конгресс по регенеративной медицине (Москва 2017, 2019, 2022 и Санкт-Петербург, 2024);

V Международная конференция «Физика — наукам о жизни» (Санкт-Петербург, 2023, 2025)

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 научная статья, в том числе 2 статьи в ведущих отечественных и 19 статей в зарубежных журналах, индексируемых в международных наукометрических базах данных, а также 27 тезисов докладов в сборниках трудов конференций.

Финансовая поддержка работы. Диссертационная работа выполнялась в рамках государственного задания Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института Цитологии РАН при финансовой поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 14-04-01903 и 19-04-00994), грантов Российского научного фонда (№№ 14-50-00068, 19-14-00108, 21-74-20178, 21-74-20178-П), гранта в форме субсидии Минобрнауки РФ (Соглашение № 075-15-2020-773).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 260 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка основных публикаций автора по теме диссертации и списка литературы, включающего 287 источников. Работа содержит 97 рисунков и 8 таблиц.

Вклад соискателя. Результаты экспериментальных и теоретических исследований, представленные в диссертации, получены лично автором или под его непосредственным руководством. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследований, обобщении полученных данных, подготовке материалов к публикации в научных рецензируемых журналах и представлении результатов на российских и международных конференциях.

Работа выполнена на базе лаборатории внутриклеточной сигнализации в отделе внутриклеточной сигнализации и транспорта Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии Российской академии наук (ИНЦ РАН) в 2011-2024 гг. Эксперименты по изучению ответа стволовых клеток на стрессовые воздействя проводились совместно с к.б.н. Алексеенко Л.Л. (ИНЦ РАН), к.б.н. Кожухаровой ИВ. (ИНЦ РАН), к.б.н. Шороховой М.А. (ИНЦ РАН), к.х.н. Буровой Е.Б (ИНЦ РАН) и к.б.н. Бородкиной А.В. (ИНЦ РАН), эксперименты по репрограммированию и дифференцировке клеток человека - совместно с к.б.н. Ивановой Ю.С. (ИНЦ РАН), эксперименты по оценке пероксидазной и дисульфидредуктазной активности стволовых и не стволовых клеток человека - совместно с к.б.н. Ивановой Ю.С. (ИНЦ РАН), Гурьевым Н А. (ИНЦ РАН) и Усатых А.А (ИНЦ РАН). Материалы, вошедшие в работу, обсуждались и публиковались совместно с коллегами и соавторами. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Автор работы благодарит всех сотрудников и руководство Отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта ИНЦ РАН, студентов, проходивших научно-исследовательскую

практику в Отделе, сотрудников из других подразделений и администрацию ИНЦ РАН, а также своих зарубежных соавторов, без помощи которых эта работа была бы невозможна.

Особую признательность автор выражает своему научному наставнику в Институте цитологии РАН - академику РАН, д.б.н. Николаю Николаевичу Никольскому - за всемерную многолетнюю научно-организационную поддержку при проведении исследований, за культивирование духа товарищества и свободы творчества в руководимом им коллективе, а также за неоценимый вклад в формирование научного и личностного мировоззрения автора.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Стволовые клетки

Стволовыми называют неспециализированные клетки, обладающие способностью к самообновлению и дифференцировке. Именно эти клетки дают начало всем специализированным клеткам организма. Стволовые клетки различаются по происхождению, дифференцировочному потенциалу и эпигенетическому статусу.

Классификация по происхождению. Стволовые клетки могут быть выделены из организма на разных этапах его развития, и, в зависимости от источника получения, их делят на эмбриональные, фетальные и постнатальные. Помимо этого, культуры стволовых клеток могут быть получены in vitro с помощью различных техник клеточного репрограммирования, путем генетических и эпигенетических манипуляций с дифференцированными клетками взрослого организма [Takahashi и др., 2007; Yagi, Yamanaka, Yamada, 2017].

Классификация по способности к дифференцировке. Исходя из дифференцировочного потенциала, различают следующие типы стволовых клеток [Zakrzewski и др., 2019]:

• Тотипотентные - могут дифференцироваться в клетки эмбриональных и экстраэмбриональных тканей. Тотипотентные клетки дают начало полноценному жизнеспособному организму. К ним относится оплодотворённая яйцеклетка, или зигота, а также, у большинства биологических видов, клетки, образованные при первых нескольких циклах деления зиготы.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Люблинская Ольга Геннадьевна, 2026 год

// // //

IKK "

ssg

IKK

sh

» «

Lb

■'„О

I kB «

IkB NF-kB

SH [_

' »

NF-KB S» NF-kB _r»

Протеасомная Trx. 4 sU f/ //

деградация

Ядро

FOXO

НА

0!

НА

®i

sh

НА

CD

FOXO I

Ядро

АКТ TNPO sh ■ * FOXO s» ' рЭОО sh FOXO

FOXO ♦

Протеасомная

* s рЭОО

S чг

FOXO.

FOXO

// // //

FOXO

деградация

Ядро

Рисунок 1.16 - АФК-зависимая регуляция транскрипционной активности (Lennicke, Cocheme, 2021,

адаптировано)

Сокращения и обозначения: NF-kB, HIF1a, NRF2, FOXO - транскрипционные факторы; IkB (Inhibitor of kB) и IKK (IkB kinase) - регуляторы активности NF-kB; AKT, протеинкиназа B; KEAP1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) и GSK3 (Glycogen synthase kinase-3) - регуляторы активности NRF2; PHD2 (Prolyl hydroxylase domain protein 2) - кислород-зависимый регулятор HIF1a; TNPO (Transportin) и p300, регуляторы активности FOXO; Trx, тиоредоксин.

Nrf2-Keap-1. Система Nrf2-Keap-1 [Suzuki, Yamamoto, 2015] является наиболее хорошо изученным примером редокс-регуляции транскрипционной активности клеток. Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) - это транскрипционный фактор, который играет ключевую роль в поддержании клеточного гомеостаза в условиях окислительного стресса, а также стресса, вызванного ксенобиотиками. Его активность регулируется разными путями, но основным редокс-зависимым негативным регулятором Nrf2 является Keap-1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), адаптерный белок убиквитинлигазного комплекса CUL3-RBX1, направляющего Nrf2 на путь протеасомной деградации в нормальных физиологических условиях (см. рисунок 1.16). При H202-опосредованном окислении тиоловых групп Keap-1, убиквитинирование Nrf2 прерывается, что приводит к его стабилизации в цитоплазме, регулируемому транспорту в ядро

и регулируемому связыванию с элементом ARE/EpRE. Последний расположен в промоторных областях генов, кодирующих белки антиоксидантной защиты, ферменты детоксикации и транспортеры ксенобиотиков, обеспечивающие защиту от окислительного стресса, воспаления, старения и апоптоза.

NF-kB (Nuclear factor kB) служит главным транскрипционным регулятором воспаления, которое связано с усиленной продукцией H2O2, и, следовательно, неудивительно, что активность NF-kB зависит от H2O2. В отсутствии стимулирующих про-воспалительных факторов (цитокины, TNF - tumour necrosis factor и др.), димеры NF-kB секвестированы в клеточной цитоплазме с помощью семейства белков-ингибиторов, называемых IkB (Inhibitor of kB), которые содержат множественные анкириновые повторы (см. рисунок 1.16). Благодаря этим тандемным повторам, IkB маскируют сигналы ядерной локализации (NLS) белков NF-kB и удерживают их в неактивном состоянии в цитоплазме. H2O2 может играть как стимулирующую, так и ингибирующую роль по отношению к NF-kB в зависимости от контекста [Oliveira-Marques и др., 2009]. Цитозольная H2O2 может активировать путь NF-kB посредством Ш02-опосредованного окисления и активации киназ IKK (IkB kinase), которые контролируют стабильность IkB и, фосфорилируя, отправляют эти ингибирующие NF-kB белки на деградацию. Помимо этого, H2O2 может негативно модулировать активность NF-kB, благодаря наличию окисляемых цистеинов в ДНК-связывающей области NF-kB. Показано, что повышение внутриядерного уровня H2O2 препятствует связыванию NF-kB с ДНК, снижая его транскрипционную активность.

HIF1a (Hypoxia-inducible factor 1а) регулирует клеточные реакции на понижение уровня кислорода, увеличивая в энергетическом метаболизме клетки вклад гликолиза, и снижая вклад окислительного фосфорилирования [Movafagh, Crook, Vo, 2015; Semenza, 2011]. Пролилгидроксилаза PHD2 является ключевым редокс-активным ингибитором HIFla (см. рисунок 1.16). В условиях нормоксии PHD2 гидроксилирует HIFla, направляя его на путь деградации. Однако локальное повышение уровня АФК может инактивировать PHD2 способствуя димеризации белка, что приводит к стабилизации HIF1a даже в нормоксических условиях.

FOXO (Forkhead box O). Семейство белков FOXO поддерживает клеточный и организменный гомеостаз в условиях различных стрессов, и в том числе - регулирует ответ на окислительный стресс [Klotz и др., 2015]. В дополнение к классической регуляции FOXO посредством AKT-опосредованного фосфорилирования, которое негативно влияет на его активность, FOXO может подвергаться окислительно-восстановительным модификациям (см. рисунок 1.16), модулирующим его транскрипционную активность. В частности, цистеин-опосредованная димеризация FOXO с транспортином (TNPO) облегчает его транспорт в ядро [Putker и др., 2013]. С другой стороны, повышение уровня H2O2 может приводить к ацетилированию FOXO,

благодаря активности ацетилазы p300, что снижает его способность связываться с ДНК [Dansen и др., 2009].

Регуляция клеточной пролиферации. О взаимосвязи пролиферации и редокс-гомеостаза клеток впервые сообщалось ещё в научной работе 1931 года, посвященной дроблению яиц морских ежей [Rapkine, Rapkine, Louis, 1937]. В этой работе было обнаружено, что редокс-статус тиольных групп белков циклически изменяется в соответствии с пролиферативным циклом делящихся клеток. Более поздние исследования подтвердили справедливость этих наблюдений и для клеток человека, доказав, что, как в нормальных, так и опухолевых клетках, внутриклеточный уровень АФК повышается на границе Gi и S фаз цикла и снижается к началу следующего пролиферативного цикла [Sarsour и др., 2009]. В течение последнего десятилетия были идентифицированы многочисленные АФК-зависимые молекулярные регуляторы пролиферации. Как показали эксперименты, в целом, все АФК-зависимые события клеточного цикла можно разделить на те, которые способствуют активации и проведению митогенного сигнала с рецепторов клеточной мембраны в ядро, и те, которые стимулируют прогрессию пролиферативных фаз цикла и обеспечивают их последовательную смену [Burhans, Heintz, 2009]. К первой группе редокс-регулируемых сигнальных каскадов относятся канонические митогенные пути MAPK/ERK и PI3K/AKT, стимулируемые лиганд-зависимой активацией тирозинкиназных рецепторных комплексов. Как обсуждалось в предыдущих параграфах обзора, генерация АФК с участием ферментов NOX способствует проведению митогенного сигнала в ответ на инсулин и другие ростовые факторы, являющиеся лигандами тирозинкиназных рецепторов. Вторая большая группа АФК-зависимых событий цикла стимулирует прогрессию G1, S и G2/M фаз. Как известно, корректное протекание этих фаз обеспечивается последовательным накоплением ключевых белковых регуляторов цикла - циклинов. Циклин D необходим на стадии Gi, циклин Е - для перехода из Gi в S, циклин А обеспечивает прогрессию фазы синтеза ДНК и переход к G2/M фазе, а циклин В отвечает за корректное протекание митоза. Основная функция циклинов - образовывать комплекс с циклин-зависимыми киназами (CDK), тем самым стимулируя их активность. Показано, что модуляция внутриклеточного уровня АФК, синхронизованная с фазами пролиферативного цикла, необходима для своевременной активации/деактивации киназ, убиквитин-лигаз и фосфатаз, которые обеспечивают своевременное накопление и деградацию циклинов, а также контролируют активность их комплексов с циклин-зависимыми киназами [Burhans, Heintz, 2009]. Рассмотрим подробнее редокс-регуляцию различных фаз клеточного цикла.

Рисунок 1.17 - АФК-зависимая регуляция клеточной пролиферации (Burhans, Heintz, 2009,

адаптировано)

Сокращения и обозначения: RTKs, рецепторные тирозинкиназы; PTEN (Phosphatase and tensin homolog

deleted on chromosome 10) - липидфосфатаза; AKT, протеинкиназа B; PTP1B, протеин-тирозинфосфатаза; p38, JNK, ERK - митоген-активируемые протеинкиназы; p53, транскрипционный

фактор; p21 и p16 - ингибиторы CDK; APC/C (Anaphase-promoting complex/cyclosome) -убиквитинлигаза; Emi1 (Early mitotic inhibitor-1) - ингибитор APC/C; CDK2, циклин-зависимая киназа 2; Cdc25C и Cdc14B - фосфатазы; CDH1 (Cdc20 homolog 1) - адаптерный белок APC/C.

Gl и S фазы клеточного цикла. Известно, что опосредуемая АФК митогенная стимуляция необходима пролиферирующим клеткам для преодоления точки рестрикции - контрольной точки в G1 фазе клеточного цикла (см. рисунок 1.17). При этом, избыточное повышение внутриклеточного уровня АФК при инициации клеточного цикла, напротив, препятствует прохождению точки рестрикции и блокирует клеточную пролиферацию в G1 фазе, приводя к активации АФК-чувствительного транскрипционного фактора р53 и его нижележащих мишеней (р21 и р16 - ингибиторов CDK). При поддержании физиологически-релевантного уровня АФК, клетки, преодолев контрольную точку Gi фазы, начинают подготовку к делению. Переход из Gi в S фазу цикла контролируется сразу несколькими АФК-зависимыми регуляторами цикла, наиболее изученные из которых - APC/C (Anaphase promoting complex/cyclosome) и CDK2 (cyclin-dependent kinase 2) (рисунок 1.17). APC/C- это E3 убиквитинлигаза, препятствующая накоплению регуляторов репликации ДНК (в частности, циклина А и геминина) в ранней Gi фазе цикла [Alfieri, Zhang, Barford, 2017]. В поздней Gi фазе, непосредственно перед переходом к S фазе цикла, APC/C инактивируется, благодаря активности циклин-зависимых киназ и накоплению Emi1 (Early mitotic inhibitor-1), ингибиторного белка APC/C [Cappell и др., 2018]. Временная инактивация APC/C, стимулируемая Emi1, позволяет накапливаться мишеням этого

комплекса - циклину А, геминину и другим белкам, необходимым для инициации репликации ДНК. Из литературных данных известно, что повышение уровня АФК, происходящее на границе G1 и S фаз цикла, необходимо для инактивации APC/C и инициации S фазы, а обработка клеток антиоксидантами может индуцировать несвоевременную активность APC/C и приводить к деградации ключевых регуляторов фазы синтеза ДНК - циклина А, геминина, а также Emi1, который в этих условиях может становиться мишенью APC/C [Havens и др., 2006]. Наряду с APC/C, другим важным АФК-зависимым регулятором G1-S перехода является циклин-зависимая киназа CDK2, чья активность в комплексе с циклином А обеспечивает инициацию и корректное протекание процесса репликации ДНК [Kirova и др., 2022]. Повышение уровня АФК на границе G1 и S фаз цикла, опосредованное, в том числе, и митохондриальными источниками АФК, приводит к окислению редокс-активного цистеинового остатка в активной области CDK2, что препятствует взаимодействию CDK2 с фосфатазой KAP, инактивирующей CDK2, и обеспечивает инициацию S фазы цикла [Kirova и др., 2022]. Снижение внутриклеточного уровня АФК под действием фармакологических антиоксидантов способно отменять эти события.

G2 и M фазы клеточного цикла. Активность молекулярных регуляторов фазы подготовки к митозу и фазы митоза также подвержена редокс-контролю. Известными в данный момент АФК-зависимыми регуляторами G2/M фаз являются: Cdc25C - фосфатаза, которая отменяет ингибирующее фосфорилирование комплекса циклин B/CDK1 [Sohn, Rudolph, 2003] и обеспечивает его активность в митозе, а также фосфатаза Cdc14B [Lim и др., 2015], чья АФК-опосредованная деактивация предотвращает преждевременную активность уже обсуждавшейся выше убиквитинлигазы APC/C, которая отправляет на деградацию белки-регуляторы митоза после завершения клеточного деления. Источником локального повышения уровня АФК в фазе G2/M, обеспечивающим активность фосфатаз, считается CDK1-зависимое ингибирующее фосфорилирование пероксидазы Prx1, которая контролирует содержание H2O2 вблизи центросомы, где локализуются основные регуляторы митоза и происходят основные сигнальные события [Rhee, Woo, 2020].

Регуляция проводимости ионных каналов. Редокс-регуляция активности ионных каналов обнаружена в клетках самого разного типа. Одним из примеров АФК-регулируемых каналов на плазматической мембране являются потенциал-зависимые ^-каналы [Sahoo, Hoshi, Heinemann, 2014]. Ещё в 90-х годах прошлого века было показано, что инактивация быстрых Iк(A)-каналов млекопитающих регулируется окислением цистеиновых остатков [Ruppersberg и др., 1991]. Помимо этого, известно, что АФК-зависимому контролю подвержены каналы с транзиторным рецепторным потенциалом (TRP), кальциевые каналы ORAI и потенциал-зависимые кальциевые каналы [Bogeski, Niemeyer, 2014]. Стоит отметить, что не только ионные каналы пламатической

мембраны считаются АФК-зависимыми игроками - в эндоплазматическом ретикулуме, инозитол-1,4,5-трифосфат-связанные рецепторы Са2+ содержат функционально значимые цистеиновые остатки и также считаются мишенями редокс-сигналинга (см. схему на рисунке 1.14).

Регуляция фагоцитоза. Помимо сигнальных функций, NOX-опосредованная генерация 02-*/Н202 используется фагоцитирующими клетками (напр. нейтрофилами, эозинофилами и моноцитами) для борьбы с патогенами [Nauseef, 2019; Winterbourn, Kettle, Hampton, 2016]. После связывания чужеродного агента с рецепторами на поверхности фагоцита (опсониновые рецепторы, скевенджер-рецепторы и Toll-подобные рецепторы), происходит поглощение агента, и он оказывается в составе фагосомы. Фагосома сливается с лизосомой или гранулами, содержащими ферменты, с образованием фаголизосомы. Процесс фагоцитоза активирует комплекс NOX2, расположенный в мембране фаголизосом (см. схему на рисунке 1.14). Это приводит к интенсивной генерации 02-* внутрь фаголизосомы. Супероксид дисмутирует с образованием Н2О2. В случае нейтрофилов, благодаря ферменту миелопероксидазе, высвобождаемой из внтруклеточных гранул, с участием Н2О2 образуется еще более реактивное соединение - хлорноватистая кислота, которая является эффективным противомикробным агентом. Эквивалентные реакции в эозинофилах приводят к образованию бромноватистой кислоты. В какой степени сам супероксид может напрямую участвовать в уничтожении патогенов до конца не установлено [Winterbourn, 2020].

1.2.5 Концепция окислительного стресса

Как следует из предыдущих разделов обзора литературы, поддержание физиологически релевантных концентраций АФК критически важно для сохранения клеточного функционала и жизнеспособности. Ситуация, когда внутриклеточное или внутрикомпартментное содержание АФК превышает прецизионно контролируемый редокс-системами уровень, необходимый клетке в данный момент времени для реализации своих функций, классифицируется как окислительный стресс или, более точно, ди-стресс («oxidative distress») [Sies, Berndt, Jones, 2017]. Напротив, ситуация, при которой локальное накопление АФК имеет физиологический смысл и протекает под контролем редокс-систем клетки, классифицируется как эу-стресс («oxidative eustress») [Sies, Berndt, Jones, 2017].

Окислительный эу-стресс обычно имеет регуляторное значение - эти функции АФК уже обсуждались в предыдущем разделе обзора. Напротив, окислительный ди-стресс нарушает внутриклеточную регуляцию, повреждает макромолекулы и приводит к тяжелым последствиям

для клеток. Так, окисление ДНК может вызывать генетическую нестабильность [Storz и др., 1987]. Основным источником мутаций при окислительном воздействии на ДНК является окислительная модификация гуанина, 8-гидроксигуанин, который склонен образовывать пару с аденином, а не с цитозином, и, таким образом, вызывает трансверсионные мутации в процессе репликации ядерной ДНК [Freudenthal и др., 2015]. Накопление 8-оксогуанина в мито-ДНК вызывает митохондриальную дисфункцию и носит онкогенный характер [Leon и др., 2016]. Белковый пул клетки также подвержен окислительным повреждениям, и при значительном повышении внутриклеточного уровня АФК возникает множество окислительных модификаций в боковых цепях аминокислот [Davies, 2016b]. При этом часто образуются необратимые повреждения - в частности, тиольные группы белков превращаются в сульфоновые кислоты (-SO3H). При окислении липидов могут образовываться гидроперекиси липидов, гидроксиды и эпоксиды липидов (включая продукты окисления холестерина), изопростаны, малоновый диальдегид, другие альдегиды, кетоны, и т.д. [Spickett, Pitt, 2015].

Н2О2-индуцированный окислительный ди-стресс. Важнейшей разновидностью окислительного ди-стресса является повышение внутриклеточного уровня Н2О2. Источниками избыточного накопления H2O2 в клетках организма могут быть факторы, приводящие к нарушению внутриклеточного редокс-метаболизма, а также увеличение потока H2O2, проникающего в клетки извне. Будучи нейтральной молекулой, H2O2 способна легко проникать через биологические мембраны путем пассивной диффузии. Однако, с гораздо большей скоростью H2O2 транспортируется через мембранные водные каналы (аквапорины) [Henzler, Steudle, 2000], а точнее через некоторые представители семейства аквопоринов (AQP3, AQP5, AQP8, AQP9 и AQP11), называемые «пероксипоринами» [Bienert и др., 2007]. Во внеклеточном пространстве индуцирующее стресс повышение уровня H2O2 может наблюдаться под действием внешних стимулов (таких как табачный дым, радиация, токсины), вследствие иммунных реакций организма, а также при нарушении обмена веществ в окружающих тканях, вызванном различными патологиями.

В условиях H2O2-индуцированного окислительного ди-стресса, активизируются системы антиоксидантной защиты клетки описанные в разделе обзора 1.2.3, в которых задействованы ферменты, отвечающие как за элиминацию H2O2 (пероксиредоксины, глутатионпероксидазы, каталаза), так и за восстановление белков, окисленных в процессе детоксификации H2O2 (тиоредоксины и глутаредоксины) [Sies, 2020]. В случае внешнего стресса, конечная скорость проникновения H2O2 через плазматическую мембрану и эффективная внутриклеточная элиминация H2O2 ферментами антиоксидантной защиты приводит к значительной разнице между внеклеточной и внутриклеточной концентрацией пероксида - устанавливающийся

внутриклеточный уровень H2O2 зависит от конкуренции этих двух процессов [Antunes, Cadenas, 2000]. Клеточные пероксидазы элиминируют избыточную перекись намного быстрее, чем она проникает в клетку, и внутри клетки уровень H2O2 оказывается намного меньше, чем снаружи (см. рисунок 1.18). В исследованиях, посвященных влиянию повышенных внеклеточных уровней H2O2 на физиологию клеток, отношение внеклеточной к внутриклеточной концентрации H2O2 принято называть градиентом H2O2 [Adimora, Jones, Kemp, 2010; Domenech и др., 2018; Huang, Sikes, 2014; Marinho и др., 2013], хотя с точки зрения физической химии это некорректно - в этой области науки под концентрационным градиентом, как правило, понимается разность концентраций, но не их отношение. Однако, поскольку термин «градиент H2O2» стандартно используется в клеточной редокс-биологии для характеристики внешнего окислительного стресса, мы позволим себе использовать его и в настоящей диссертационной работе, толкуя его как безразмерную величину, отвечающую на вопрос - во сколько раз внеклеточная концентрация H2O2 превышает внутриклеточную.

Рисунок 1.18 - Н2О2 -индуцированный внешний окислительный стресс Сокращения и обозначения: ЛрРБ, аквапорины; вРх, глутатионпероксидазы; Ргх, пероксиредоксины

Первые теоретические оценки градиента H2O2, вычисляемого как отношение внеклеточной к внутриклеточной концентрации пероксида при его постоянном присутствии извне клеток, были проведены для культур Jurkat в работе Фернандо Антюнеса и Энрике Каденаса в 2000 г [Antunes, Cadenas, 2000]. Согласно предложенному в этой работе методу, градиент вычисляется, основываясь на разнице между скоростью проникновения H2O2 в клетку и скоростью её элиминации внутриклеточными пероксидазами:

kperm X [^202]ex — ^i^PXi X [^202]i

■perm

in

(1)

gradient — [H202]ex/[^202]in — likPXi/k-

■perm

(2)

где к

perm

это константа скорости проникновения Н2О2 внутрь клетки, кРХ[ - это константа

скорости элиминации пероксида внутриклеточной пероксидазой типа i (вклад различных пероксидаз в формулах 1-2 суммируется), а [Н202]ех и [H202]in - вне- и внутриклеточная концентрации пероксида. Авторы работы [Antunes, Cadenas, 2GGG] определяли крегт, измеряя фотометрическим способом скорость элиминации Н2О2 из внеклеточной среды, а kPXi - путем измерения пероксидазной активности (глутатионпероксидаз и каталазы) в клеточных лизатах. Результаты проведенных вычислений показали, что внутри клетки может устанавливаться концентрация H2O2 примерно на порядок ниже внеклеточной. Позднее, при более подробном рассмотрении процесса внутриклеточной элиминации H2O2 и при учете вклада в этот процесс таких эффективных ферментов как пероксиредоксины, стало ясно, что градиент H2O2 может составлять несколько сотен раз [Huang, Sikes, 2G14] и устанавливается он очень быстро - спустя миллисекунды после повышения уровня H2O2 снаружи клетки [Lim и др., 2016].

В зависимости от интенсивности H2O2-индуцированного ди-стресса, его последствия могут быть очень тяжёлыми - как на уровне клеток, так и на уровне всего организма в целом. Одним из наиболее опасных факторов считается образование в клетках гидроксильного радикала (НО*), источником которого служит взаимодействие H2O2 с ионами переходных металлов, т.н. реакция Фентона. Известно, что именно генерация НО* преимущественно приводит к образованию 8-гидроксигуанина и повреждениям ДНК. Вместе с тем, помимо НО*, разрывы ДНК при избыточном накоплении H2O2 могут быть связаны и с репликативным стрессом, который индуцирует опосредованная избыточным пероксидом разрегулировка синтеза ДНК [Venkatachalam, Surana, Clément, 2017]. Образующиеся тем или иным образом повреждения генетического материала и других макромолекул клетки, в свою очередь, способны вызывать широкий спектр клеточных реакций - индукцию клеточного старения (сенесценции), апоптоза, ферроптоза (тип программируемой некротической клеточной гибели, вызванный железо-зависимым перекисным окислением липидов) [Sies, 2G2G]. К числу патологий человека, которые ассоциированы с H2O2-индуцированным стрессом относят нейродегенеративные, онкологические, ишемические, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие [Forman, Zhang, 2G21; Sies, Berndt, Jones, 2G17].

1.2.6 Нарушения редокс-гомеотаза клеток, вызванные действием антиоксидантов

Несмотря на то, что окислительный стресс способен вызывать серьезные повреждения молекулярного пула клетки, противоположный эффект - сдвиг баланса в сторону восстановительных реакций - также может приводить к негативным последствиям и нарушениям клеточной физиологии [Dundar Y, Asian R, 2000]. История этого вопроса уходит корнями в далёкое прошлое.

Термин «антиоксидант» появился в начале ХХ века и изначально относился к веществам, способным ингибировать окислительные процессы в производственных циклах химической и пищевой промышленности. Интенсивное развитие редокс-биохимии во второй половине ХХ века привело к тому, что этот термин был заимствован и получил широкое распространение в биомедицине. Согласно определению 1995 г. [Halliwell, Gutteridge, 1995], антиоксидант — это «любое вещество, которое предотвращает, замедляет или репарирует окислительные повреждения молекул-мишеней». Исходя из этого определения, под антиоксидантами могут пониматься как эндогенные молекулы, производимые клетками организма-хозяина, так и экзогенные фармакологические агенты, обладающие способностью ингибировать окисление биомолекул. Вместе с тем, успехи в области клеточной редокс-биологии, достигнутые в последнее время, привели к пониманию, что в клетке антиоксидантную функцию выполняют не отдельно взятые соединения, а разветвленные метаболические пути, состоящие из многих молекул-участников с различным функционалом. Поэтому в настоящее время под термином антиоксидант, в контексте отдельно взятого химического соединения, понимают обычно фармпрепараты, идея терапевтического применения которых является очень распространенной на протяжении уже нескольких десятков лет. Изначально эта идея возникла, благодаря появлению свободно-радикальной теории старения человека. В 1956 г. Дэнхемом Харменом была сформулирована концепция, постулирующая что старение и связанные со старением болезни, являются следствием повреждающего действия избытка свободных радикалов [Harman, 1956]. В более поздней работе Дэнхем Хармен предложил способ увеличения срока жизни человека путем добавления ингибиторов свободно-радикальных реакций к диете с минимальным потреблением продуктов, вступающих в подобного рода реакции [Harman, 1969]. С тех пор природные и синтетические антиоксиданты стали использоваться в фармакологии, косметологии, пищевой промышленности. Проведены сотни тысяч исследований механизмов действия и эффективности различных агентов, обладающих антиоксидантной активностью, как в исследовательских лабораториях, так и в клинике (682 032 документа в PubMed), разработаны диетические рекомендации с акцентом на употребление растительных продуктов богатых антиоксидантами, синтезированы сотни новых антиоксидантов, разработаны протоколы лечения

различных патологий с использованием антиоксидантов [Fromage, 2012]. Помимо этого, антиоксидантные добавки широко используются в витаминных комплексах и пищевой промышленности (антиоксиданты и регуляторы кислотности, E300-E399).

Однако, огромный объем проведенных исследований, нацеленных на имплементацию концепции антиоксидантной терапии, привел к неожиданным результатам - согласно экспертным заключениям, и в том числе, согласно ресурсу The Cochrane Library (https://www.cochranelibrary.com/ - коллекция баз данных доказательной медицины, содержащая тысячи независимых и высококачественных обзоров, созданных на основании анализа более чем 1.8 млн. клинических испытаний), антиоксиданты демонстрируют очень скромные успехи в клинической практике. Большинство обзоров клинических испытаний фармпрепаратов с антиоксидантной активностью резюмируют, что доказательный уровень эффективности антиоксидантов и отсутствия побочных эффектов не является достаточным и не дает возможность однозначно оценить наличие эффекта от применения антиоксидантов. Вместе с тем, негативные последствия от высокодозной антиоксидантной терапии задокументированы надежно. Прием антиоксидантов может вызвать такие побочные эффекты как геморрагический инсульт (витамин Е), носовое кровотечение (витамин Е), кожная сыпь (поливитамины) и рак легких (витамин С - у женщин, и витамин А - у курильщиков и лиц, контактирующих с асбестом) [Burch, Anderson, 2017; Burch, Gruenebaum, 2014; Cortes-Jofre и др., 2020]. Соответственно, в научной литературе последних лет появляется всё больше исследований, нацеленных на изучение молекулярных причин негативного влияния высоких доз антиоксидантов на физиологию клетки и организма человека.

1.2.6.1 Концепция антиокислительного (редуктивного) стресса

В 2000 г. Дундаром и Асланом был введен термин «антиокислительный стресс»: «Many of antioxidant vitamins and the other antioxidants can cause pathologic changes to the exposed tissues and to the organs of the bodies by initiating different mechanisms... This article uses the term "antioxidative stress" for the first time for the negative effects of antioxidants.» [Dundar Y, Asian R, 2000]. Опубликованные к настоящему времени обзорные работы определяют антиокислительный стресс как состояние, при котором существенный сдвиг физиологически обусловленного баланса в организме между активностью про- и антиоксидантов в сторону последних приводит к нарушению функциональных свойств клеток и тканей [Poljsak, Milisav, 2012]. Экспериментальных исследований, посвященных этому эффекту, пока немного, хотя частота появления подобных публикаций постоянно растёт - в особенности, в последние годы. В обзоре [Gostner и др., 2015], описывающем негативное влияние усиленного употребления в пищу

диетических антиоксидантов, показано, что хронический антиокислительный стресс влияет на метаболические пути, регулирующие иммунный ответ организма, что ведет к развитию таких заболеваний как астма, аллергия и ожирение. Кроме того, доказано [Rajasekaran, 2020], что хронический антиокислительный стресс, вызванный постоянной гиперактивацией транскрипционного фактора NRF2, индуцирующего оверэкспрессию антиоксидантных ферментов в клетке, может приводить к метаболическому дисбалансу, недавно получившему новое название - «редуктивный стресс», который определяется как избыточное накопление в клетках восстанавительных эквивалентов в виде NAD(P)H и/или GSH. Показано, что редуктивный стресс нарушает дыхательный метаболизм клеток и приводит к коллапсу митохондриального гомеостаза и к цитотоксичности [Kolossov и др., 2015; Korge, Calmettes, Weiss, 2015]. Помимо этого, в экспериментах на клеточных и животных моделях с гиперактивацией NRF2 обнаружено, что редуктивный стресс может вызывать стресс эндоплазматического ретикулума, агрегацию белков и протеотоксичность [Quiles и др., 2017; S Narasimhan и др., 2020]. Эти эффекты способны замедлять нейрогенез, активируя патогенные GSK3ß/TAU каскады в нейрональных клетках. Опубликован уже целый ряд независимых экспериментальных свидетельств о том, что редуктивный стресс служит предвестником развития целого ряда заболеваний - кардиомиопатии, ишемии и нейродегенерации [Brewer и др., 2013; Lloret и др., 2016; Yan, 2014] .

Таким образом, негативное влияние хронического антиокислительного стресса на организм человека обсуждается в научной литературе, хотя, конечно, заслуживает большего внимания в контексте широко распространенной идеи о потенциальной клинической пользе антиоксидантов. В то же время, вопрос о том, каковы характерные черты, причины и следствия острого антиокислительного стресса, в особенности на уровне отдельных клеток, до сих пор остается открытым. Из немногочисленных работ, посвященных негативному влиянию антиоксидантов на культивируемые клетки, следует, что вещества, обладающие антиоксидантной активностью, часто демонстрируют двухфазную концентрационную зависимость своего действия [Li, Marbán, 2010; Peltz и др., 2012]. Антиоксиданты, применяемые в малых дозах, способствуют поддержанию стабильности клеточного генома [Li, Marbán, 2010], вызывают повышение пролиферативной активности клеток и противодействуют клеточному старению [Peltz и др., 2012], тогда как высокие дозы этих же веществ могут вызывать разрывы ДНК [Fox и др., 2012; Li, Marbán, 2010; Lu, Ou, Lu, 2013], кариотипическую нестабильность [Li, Marbán, 2010; Lu, Ou, Lu, 2013], апоптоз [Fox и др., 2012; Lu, Ou, Lu, 2013], замедление клеточной пролиферации [Gamalei и др., 2001; Havens и др., 2006; Kim и др., 2001; Menon и др., 2007; Paul и др., 2014]. Как правило, опубликованные исследования относятся к конкретному, отдельно-взятому веществу (NAC [Kim и др., 2001] ресвератрол [Peltz и др., 2012], EGCG [Lu, Ou, Lu, 2013]), и возможный

общий для всех антиоксидантов характер большинстве случаев, и молекулярные антиоксидантов на клетки.

наблюдаемых эффектов неочевиден. Неясны, в триггеры негативного влияния высоких доз

1.3 Определение параметров редокс-гомеостаза клеток 1.3.1 Методы измерения внутриклеточного уровня АФК

Ключевым параметром клеточного редокс-гомеостаза является содержание различных представителей семейства АФК в клеточных компартментах. Для оценки уровня АФК в живых клетках используют АФК-чувствительные флуоресцентные красители и генетически-кодируемые биосенсоры. В целом, флуоресцентные красители просты в использовании и позволяют проводить быстрые, хотя и не всегда специфичные, тесты по оценке уровня перекиси водорода (H2DCFDA, DHR, боронатные красители), супероксид-анион радикала (HE, Mito-SOX), пероксинитрита (HPF), оксида азота (DAF-FM Diacetate) и некоторых других разновидностей АФК как на уровне целой клетки, так и внутри отдельных компартментов, преимущественно митохондрий. По сравнению с красителями, генетически-кодируемые биосенсоры более специфичны, более чувствительны и позволяют проводить анализ в режиме реального времени в широком наборе клеточных компартментов, однако требуют предварительных манипуляций с клетками - трансфекции или трансдукции. Рассмотрим наиболее распространенные методы оценки уровня АФК в живых клетках.

АФК-чувствительный краситель H2DCFDA. H2DCFDA (2 ', 7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат) - флуоресцеин-содержащий краситель, наиболее часто применяемый для оценки внутриклеточного уровня АФК [Chen и др., 2010]. Известно, что H2DCFDA легко проникает через плазматическую мембрану клеток и удерживается в цитоплазме, приобретая отрицательный заряд при отщеплении ацетатных групп внутриклеточными эстеразами (рисунок 1.19). Исходная форма зонда флуоресцентно неактивна, но при окислении краситель приобретает флуоресцентные свойства и при возбуждении голубым светом излучает свет в зелёной области спектра аналогично другим флуоресцеиновым красителям.

Рисунок 1.19 - Внутриклеточная конверсия АФК-чувствительного красителя Н2БСРБА (Ка1уапагатап е! а1., 2012, адаптировано)

Сокращения и обозначения: БСРН2-БА, дихлордигидрофлуоресцеин диацетат; БСРН2, дихлордигидрофлуоресцеин; БСР, дихлорофлуоресцеин

Соответственно, измерение интенсивности флуоресцентного сигнала клеток, окрашенных H2DCFDA, используется для оценки уровня внутриклеточных окислителей. Хотя считается, что основным окислителем H2DCFDA является перекись водорода, доказано его взаимодействие и с другими соединениями (цитохром с, гидроксильный радикал, активные формы азота и т.д.). Известно также, что окисление зонда происходит двухстадийно с образованием промежуточных радикалов и зависит от присутствия катализаторов ^е2+-содержащие соединения) [Ка1уапагатап и др., 2012]. В современной версии применяемых протоколов, для измерения флуоресцентного сигнала зонда используется преимущественно проточная цитометрия. Стоит отметить, что важной, но редко использующейся составляющей этих протоколов [Аукт-Виг^ и др., 2009], является наличие контрольной, АФК-независимой модификации красителя (2 ', 7'-дихлорфлуоресцеин диацетат, БСРБА). Подобно Н2БСРБА, его контрольная версия БСРБА исходно не является флуоресцирующим соединением, но, подвергаясь химическим превращениям внутри клетки, преобразуется во флуоресцентный продукт дихлорфлуоресцеин (DCF). Единственное различие между двумя зондами (H2DCFDA и DCFDA) заключается в том, что преобразование DCFDA в БСР не включает в себя окисление - в отличие от H2DCFDA.

Соответственно, совместное применение в одном эксперименте АФК-чувствительной и нечувствительной версии флуоресцеиновых красителей часто позволяет избежать влияния артефактов, сопровождающих эксперименты с живыми клетками, на результаты проведенного анализа. Именно этот приём использовался для решения ряда задач в настоящей диссертационной работе (см. раздел 3.2.1).

АФК-чувствительный краситель гидроэтидин. Гидроэтидин (англ. hydroethidine, НЕ) -прижизненный синий флуоресцентный краситель, который при двухэлектронном окислении внутри клетки превращается в окисленные продукты, флуоресцирующие в красном спектральном диапазоне [Kalyanaraman и др., 2012] [1]. Гидроэтидин с давних пор применяется для внутриклеточной детекции O2-* [Carter, Naryanan, Robinson, 1994]. До 2003 года предполагалось, что НЕ специфически окисляется O2-*, образуя флуоресцентный катион этидия, который интеркалирует в ядерную ДНК. Позднее химические превращения НЕ внутри клетки подверглись пересмотру (см. обзор [Zielonka, Kalyanaraman, 2010]). В настоящее время считается, что в результате двухстадийного окисления НЕ образуется два различных продукта, излучающих красный цвет при оптическом возбуждении, а именно катион 2-гидроксиэтидия (2-ОН-Е+) и катион этидия (Е+). В то время как специфическая реакция между НЕ и O2-* приводит к образованию 2-OH-E +, другие представители семейства АФК способствуют образованию E+ (рисунок 1.20). Так как продукты окисления гидроэтидина 2-ОН-Е+ и Е+ излучают спектрально неразличимые флуоресцентные сигналы, для детекции O2-* было предложено использовать прием селективного оптического возбуждения на длине волны 400 нм, при котором продукт специфического окисления красителя (2-ОН-Е+) возбуждается намного эффективнее, чем неспецифического (Е+) [Robinson и др., 2006]. Однако, более распространенным методом для количественного определения супероксида с использованием НЕ является жидкостная хроматография, которая обеспечивает возможность дифференциации 2-гидроксиэтидия и этидия [Zielonka, Kalyanaraman, 2010].

В то время как детали внутриклеточных превращений HE стали намного яснее в последнее время, вопросы, касающиеся ответа клеток на накопление его окисленных продуктов (2-гидроксиэтидия и этидия - вместе сокр. oxHE), все еще нуждаются в разъяснении. До сих пор существуют разногласия по поводу сайтов локализации oxHE внутри клеток. В 1984 году Галлоп и соавт. [Gallop и др., 1984] сообщили, что НЕ легко проникает в живые клетки, окисляется с образованием этидия, который интеркалирует в ядерную ДНК, и обнаруживается благодаря интенсивной ярко-красной окраске клеточного ядра. С тех пор преобладает мнение, что oxHE накапливается в ядре из-за высокого сродства к ДНК. Известно, что при связывании с ДНК этидий в 20 раз увеличивает интенсивность флуоресценции. В то же время, несколько

исследований выявили преимущественное накопление oxHE в митохондриальном матриксе [Bindokas и др., 1996; Budd, Castilho, Nicholls, 1997]. Анализ работ, в которых НЕ используется для оценки уровня Ü2-* в живых клетках, показывает, что разные авторы приводят изображения клеток, существенно отличающиеся паттерном окраски. На некоторых изображениях доминирует ярко-флуоресцирующее ядро, а на других преобладает точечный рисунок в цитоплазме клеток, напоминающий митохондриальную сеть. Кроме сайтов локализации окисленного красителя, нерешенным остается и вопрос о природе цитотоксичности HE. Несколько исследований продемонстрировали токсичное действие высоких концентраций НЕ на клетки [Olive, 1989]. В то же время Бенов и др. [Benov, Sztejnberg, Fridovich, 1998] опубликовали данные, свидетельствующие о том, что не сам HE, а продукты его окисления ответственны за токсичность HE в E. coli. Было показано, что инкубация бактерий с красителем вызывала гибель SOD-нулевого штамма E. coli в большей степени, чем для SOD-компетентного родительского штамма, и что цитотоксический эффект НЕ ослаблялся в анаэробных условиях. В рамках настоящего диссертационного исследования вопросы о внутриклеточной локализации и токсичности охНЕ для клеток человека, а также о потенциальном влиянии этого эффекта на определение уровня Ü2-* в живых клетках, подробно рассматриваются в разделе 3.1.1.1 работы.

Генетически-кодируемые биосенсоры. Генетически кодируемые биосенсоры - это флуоресцентные химерные белки, которые разрабатываются и используются для изучения динамики различных биохимических процессов в живых клетках in vitro и in vivo. К настоящему времени сконструирована целая палитра генетически-кодируемых биосенсоров для мониторинга уровня АФК (Н2О2, ROOH, ONOO- и др. - см. обзор [Kostyuk и др., 2019]). Остановимся

К^ Et 2-гидроксиэтвдий (2-ОН-Е+)

(флуоресцентный)

Рисунок 1.20 - Внутриклеточная конверсия АФК-чувствительного красителя гидроэтидина

(Kalyanaraman et al., 2016, адаптировано)

подробнее на биосенсорах Н2О2. ^к правило, эти инструменты состоят из Н2О2-чувствительного домена (позаимствованного у редокс-активных белков из дрожжей или бактерий) и репортерного домена (различных модификаций флуоресцентных белков). Принципиально, все существующие сенсоры Н2О2 можно разделить на две большие группы, различающиеся репортерным доменом: одна группа использует редокс-активную модификацию белка GFP (roGFP), а другая -циркулярно-пермутированные варианты флуоресцентных белков (напр. YFP, mApple). K первой группе относятся биосенсоры roGFP2-0rp1 [Gutscher и др., 2009], roGFP2-Tsa2ЛCR [Morgan и др., 2016], roGFP2-Tpx1.C169S [Carmona и др., 2019]. ^ второй группе относится большое семейство биосенсоров HyPer, отличающихся широким динамическим диапазоном, высокой чувствительностью, специфичностью, а также быстрым ответом на изменение уровня Н2О2 в клетках. ^мандой разработчиков HyPer, под руководством чл.-корр. PAR В. В. Белоусова (Институт биоорганической химии PAK, Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБA России), создана целая палитра этих инструментов с возможностью таргетной экспрессии в разных клеточных компартментах, а также в системе in vivo - HyPer [Belousov и др., 2006], HyPer3 [Bilan и др., 2013], HyPer7 [Pak и др., 2020]. В настоящей диссертационной работе используется первая версия биосенсора HyPer, созданная в 2006 г.

HyPer представляет собой химерный белок (рисунок 1.21), сконструированный путем внедрения пермутированной формы желтого флуоресцентного белка (cpYFP) в регуляторный домен природного сенсора Н2О2 - бактериального транскрипционного фактора OxyR, регулирующего в E. coli экспрессию антиоксидантных генов при повышении внутриклеточного уровня пероксида [Belousov и др., 2006]. Под действием Н2О2 в регуляторном домене OxyR образуется дисульфидная связь, домен претерпевает конформационные изменения, которые влияют на протонирование аминокислотных остатков cpYFP, что приводит к изменению его флуоресцентных свойств. Максимум спектра флуоресценции HyPer расположен в зеленой области спектра (516 нм). Для биосенсора характерно наличие двух пиков возбуждения флуоресценции - в фиолетовой области (400 - 420 нм, соответствует восстановленной, протонированной, форме HyPer) и голубой области спектра (480 - 500 нм, соответствует окисленной, депротонированной, форме HyPer). Соответственно, при увеличении доли окисленных молекул биосенсора в клетках, в спектре возбуждения флуоресценции HyPer происходит пропорциональное увеличение возбуждения в полосе 480 - 500 нм и уменьшение возбуждения в полосе 400 - 420 нм [Belousov и др., 2006]. Флуорофор биосенсора (cpYFP) отличается высокой яркостью и светостойкостью. Kоэффициент экстинкции при 490 нм составляет 17000 М-1см-1 [Bilan и др., 2013]. Высокая чувствительность HyPer к Н2О2 определяется константой скорости его реакции с пероксидом (5 105 М-1с-1 [Bilan и др., 2013]).

Рисунок 1.21 - Принцип действия (А) и структура (Б) биосенсора перекиси водорода HyPer (Bilan, Belousov, 2016, адаптировано). Структура HyPer предсказана с использованием ресурса AlphaFold2 [Zhuravlev и др., 2024]

Генетическая последовательность, кодирующая HyPer, может доставляться в клетки или отдельные клеточные компартменты с использованием методов плазмидной трансфекции или вирусной трансдукции [Bilan, Belousov, 2016]. Для доставки HyPer в выбранный клеточный компартмент используется вариант генетической последовательности, слитый с сигналом локализации в этом компартменте. Измерение флуоресцентных сигналов HyPer в клетках или тканях модельных животных при использовании возбуждающих лазеров с длиной волны 405 и 488 нм позволяет судить о соотношении окисленной и восстановленной форм биосенсора. Мониторинг этого соотношения предоставляет возможность отслеживать изменение уровня Н2О2 в клеточных компартментах с высокой степенью специфичности и чувствительности, которые недоступны для других существующих методов детекции пероксида в живых системах.

Важно отметить, что флуоресцентный сигнал HyPer является pH-зависимым, так как спектральные свойства биосенсора, как уже обсуждалось выше, зависят от протонирования аминокислотных остатков домена cpYFP. Поскольку величина pKa HyPer составляет 8.5, то даже при небольшом защелачивании внутриклеточной среды, рН которой типично находится в диапазоне 7.0 - 7.5, наблюдаются изменения в спектре возбуждения экспрессируемого клетками HyPer, аналогичные тем, которые наблюдаются при его окислении - ратиометрический сигнал сенсора растет. Чтобы разделить два эффекта (депротонирование при изменении рН и депротонирование при окислении под действием Н2О2), в экспериментах, наряду с HyPer,

используется его контрольный белок - SypHer, отличающийся от HyPer одной аминокислотной заменой C199S. Мутация C199S приводит к утрате белком Н2О2-чувствительности, но сохраняет в неизменности зависимость его флуоресцентных свойств от рН [Bilan, Belousov, 2016].

Как правило, в системе in vitro, в экспериментах с клетками, экспрессирующими HyPer, используется лазерная конфокальная микроскопия, которая позволяет визуализировать флуоресценцию биосенсора и отслеживать его редокс-статус в клетках [Mishina и др., 2013]. Еще одним эффективным методом детекции сигнала биосенсора является использование планшетных флуориметров [Malinouski и др., 2011]. Использование в экспериментах различных модификаций биосенсора, локализованных в разных клеточных компартментах (цитозоль, ядро, митохондрии) или суб-компартментах (межмембранное митохондриальное пространство, заякоревание на промежуточных филаментах) обеспечивает возможность изучать метаболизм пероксида на уровне отдельных сайтов локализации HyPer [Malinouski и др., 2011; Mishina и др., 2019].

В процессе измерений обычно детектируется ратиометрический сигнал HyPer - отношение сигналов флуоресценции биосенсора при двух разных длинах волн возбуждения (488 и 405 нм), соответствующих его окисленной и восстановленной форме. Измерение ратиометрического сигнала позволяет проводить качественный анализ - наблюдать изменение внутриклеточного или внутрикомпартментного уровня Н2О2 под воздействием различных стимулов. При использовании планшетных флуориметров удается, кроме того, определять долю окисленного/восстановленного сенсора в клеточных компартментах и суб-компартментах, используя прием калибровки флуоресцентных сигналов биосенсора [Malinouski и др., 2011]. Для калибровки к клеткам добавляются высокие дозы дитиотреитола (типично 10 - 30 мМ) и экзогенной Н2О2 (100 - 1000 мкМ), обеспечивающие полное восстановление и окисление HyPer, соответственно. При подобной калибровке долю окисленного сенсора в клетке ( OxD) , изменяющуюся в пределах от 0 до 1, можно определить по формуле [Meyer, Dick, 2010]:

Qx£) — _I488Xl405 DTT-I488 DTTXl405__^^

¡488Xl405 DTT-l488Xl405 H202+^488 H2O2Xl405-l488 DTTXl405

Где OxD = Nox/Ntot - отношение количества окисленных молекул HyPer к их общему количеству в клетке, 1488 и 1405 - флуоресцентные сигналы биосенсора в клетках интереса, измеренные при длинах волн возбуждения 488 и 405 нм (соответствующие его окисленной и восстановленной форме, соответственно), а IDTT и 1Н202 - сигналы, измеренные в образцах клеток при инкубации с калибровочными дозами DTT и Н2О2.

Какой из методов детекции флуоресцентных сигналов HyPer и какие параметры (ратиометрический сигнал или степень окисления биосенсора) необходимы для проводимого

анализа - зависит от конкретной задачи, решаемой с использованием HyPer. Конфокальная микроскопия позволяет отслеживать изменение внутриклеточного и внутрикомпартментного содержания Н2О2 на уровне индивидуальных клеток, а использование планшетного флуориметра - проводить анализ на уровне больших клеточных массивов. Вместе с тем, до недавнего времени не было разработано протоколов для детекции сигналов HyPer в режиме реального времени с помощью проточной цитофлуорометрии - метода, предоставляющего возможность одновременно исследовать флуоресцентный ответ HyPer и на уровне единичных клеток, и на уровне больших клеточных популяций. В рамках настоящей диссертационной работы эта задача была успешно решена (см. раздел 3.1.2.1).

1.3.2 Методы оценки активности редокс-ферментов

Помимо уровня АФК, другим важнейшим параметром редокс-гомеостаза клеток является активность внутриклеточных редокс-ферментов. Как известно, существует 7 классов ферментов, катализирующих метаболические реакции (EC 1 - EC 7: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы, транслоказы). Редокс-ферменты относятся к классу оксидоредуктаз (EC 1) и делятся на 22 подкласса (например, пероксидазы, дегидрогеназы, оксигеназы и др.). Именно эти ферменты отвечают за поддержание редокс-гомеостаза клетки, обеспечивая баланс между продукцией и элиминацией АФК, а также контролируя окислительно-восстановительный статус редокс-активных белков, липидов и других биомолекул клетки. Для характеристики оксидоредуктаз были разработаны методики, основанные либо на оценке активности ферментов, содержащихся в клеточных лизатах, либо на использовании флуоресцентных зондов и генетически-кодируемых биосенсоров в живых клетках. Рассмотрим существующие методы подробнее.

При анализе ферментативной активности в лизированных клетках, к очищенным белкам или цельноклеточным лизатам добавляются реакционные смеси, содержащие редокс-активные вещества, изменяющие свои оптические свойства в редокс-реакциях, опосредованных активностью анализируемого фермента (рисунок 1.22). Так, использование гидроксиэтилдисульфида или диэозинглутатиондисульфида (Di-E-GSSG) позволяют детектировать пикомолярные уровни глутаредоксина [Coppo и др., 2016], а применение реагента Эллмана (5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота), DTNB) - оценивать активность тиоредоксинредуктазы [Arner, Holmgren, 2001]. Преимуществами этих методик является высокая чувствительность и специфичность, однако, серьезным недостатком - невозможность отслеживать активность ферментов в живых клетках и длительная пробоподготовка.

In vitro :

Определение ферментативной активности

Клеточный Флуорогенный

Рисунок 1.22 - Определение активности внутриклеточных оксидоредуктаз в лизатах клеток

Синтетические флуоресцентные зонды, созданные для характеризации окисдоредуктаз в живых клетках, состоят как правило, из двух частей - домена, распознающего фермент, и флуорофора (рисунок 1.23). В качестве распознающего домена используется соединение, служащее субстратом ферментативной реакции. Субстрат может быть соединен с флуорофором либо непосредственно, либо через линкер. Когда зонды вступают в контакт с ферментами, распознающий домен подвергается биокатализу и модулирует фотофизические свойства флуорофора, анализируя которые можно характеризовать течение ферментативных реакций. Примерами подобных зондов, позволяющих детектировать внутриклеточную активность тиоредоксина или тиоредоксинредуктазы, служат пробы семейства Thio [Sidhu, Kaur, Singh, 2021; Zhang и др., 2014] или RX1 [Zeisel и др., 2022]. Преимущества синтетических зондов - простота анализа и возможность экспериментировать с живыми клетками, а недостатки - необратимость их реакции с ферментами, а также влияние на экспериментальные результаты разнообразных артефактов, связанных с присутствием ксенобиотиков в клетках.

Ещё одним актуальным инструментом, позволяющим изучать поведение оксидоредуктаз в живых клетках, являются генетически-кодируемые биосенсоры. Биосенсоры представляют собой химерные белки, состоящие, как правило, из анализируемого фермента и редокс-чувствительной модификации флуоресцентного белка (roGFP или rxRFP), соединенных между собой короткими линкерами (рисунок 1.23). В качестве примеров можно привести биосенсоры на основе тиоредоксина (Trx1-rxRFP1 [Fan и др., 2017]) или глутаредоксина (Grx1-roGFP2 [Gutscher и др., 2008]). Эктопическая экспрессия биосенсоров в культивируемых клетках

позволяет отслеживать редокс-статус ферментов в режиме реального времени в условиях различного физиологического контекста.

Рисунок 1.23 - Методы оценки внутриклеточного содержания и редокс-статуса оксидоредуктаз в живых

клетках

Сокращения и обозначения: вгх1, глутаредоксин 1; Тгх1, тиоредоксин 1; говРР и гхРРР1, редокс-активные

модификации флуоресцентных белков

Несмотря на широкий спектр методов, разработанных для характеристики внутриклеточных редокс-ферментов, количественная оценка их активности в живых клетках до недавних пор оставалось нерешённой задачей, с которой удалось справиться только в рамках настоящей диссертационной работы (см. разделы 3.1.2.3-4).

1.4 Особенности редокс-гомеостаза стволовых клеток млекопитающих

В 70 - 90-х годах ХХ в., практически сразу же после получения культур мультипотентных стволовых/прогениторных и плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих, появились масштабные исследовательские проекты, нацеленные на изучение их физиологических

особенностей. Выяснилось, что клетки стволового фенотипа значительно отличаются по своим морфологическим, метаболическим и регуляторным характеристикам от дифференцированных клеток-потомков. Следующие части обзора посвящены анализу данных, полученных при сравнении параметров редокс-метаболизма и редокс-регуляции в стволовых и дифференцированных клетках человека и мыши.

1.4.1 Уровень АФК в стволовых и дифференцированных клетках

Основной характеристикой редокс-гомеостаза клеток считается внутриклеточный уровень АФК, который в большинстве случаев определяют, оценивая способность клетки в целом окислять редокс-активные зонды. Первые исследования, посвященные оценке уровня АФК в плюрипотентных клетках (ЭСК и иПСК), были проведены с использованием наиболее распространенного среди всех ШО2-чувствительных зондов, 2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин-диацетата (H2DCFDA) - принцип его использования был описан в разделе 1.3.1 настоящей диссертации. В работе [Saretzki и др., 2004], было обнаружено, что уровень АФК в эмбриональных стволовых клетках мыши (мЭСК) в несколько раз ниже, чем в их спонтанно дифференцированных клетках-потомках, а также в мышиных эмбриональных фибробластах и мышиных фибробластах линии 3Т3. Позже, аналогичные результаты были получены при измерении с помощью H2DCFDA уровня АФК в эмбриональных стволовых клетках человека (чЭСК) и их дифференцированных клетках-потомках [Guo и др., 2010; Saretzki и др., 2008; Vinoth и др., 2015], а также при сравнении уровня АФК в иПСК мыши и их дифференцированных предшественниках (родительских клетках) - фибробластах [Zhou и др., 2016]. Таким образом, все проведенные исследования показали, что как мышиные, так и человеческие ПСК обладают очень слабой способностью окислять H2DCFDA по сравнению с дифференцированными клетками. Эксперименты, проведенные с использованием других АФК-чувствительных красителей (ШО2-чувствительным зондом DHR 123 [Armstrong и др., 2010; Saretzki и др., 2008], супероксид-чувствительным зондом HE [Vinoth и др., 2015; Zhou и др., 2016] и его митохондриальной версией MitoSOX [Armstrong и др., 2010; Saretzki и др., 2008]), привели к аналогичным результатам. Полученные данные хорошо согласовывались с наблюдениями о гипоксическом микроокружении ЭСК в организме. В частности, известно, что предимплантационная бластоциста человека, естественная ниша для чЭСК, окружена внутриматочной жидкостью с содержанием кислорода, не превышающим 4% [Ng и др., 2018]. С учётом гипоксических условий существования ПСК в организме, была сформулирована гипотеза об их сниженной способности продуцировать и повышенной способности утилизировать АФК -свойствах, которые позволяют предотвращать в этих клетках окислительные повреждения

белков, липидов и ДНК [Armstrong и др., 2010; Bigarella, Liang, Ghaffari, 2014; Maraldi и др., 2021].

Помимо ПСК, проводились эксперименты и по оценке уровня АФК в тканеспецифических мультипотентных стволовых/прогениторных клетках. В работе [Jang, Sharkis, 2007] было показано, что наиболее потентные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), обладающие способностью к длительному поддержанию стволового фенотипа, могут быть выделены из тотальной популяции ГСК мышей с помощью метода проточной сортировки путём отбора клеток по признаку низкого уровня АФК, измеряемого с помощью H2DCFDA. Согласно гипотезе авторов работы, выделенная при сортировке фракция ГСК с ярко выраженным стволовым фенотипом ассоциирована в организме с гипоксической нишей костного мозга и обладает способностью поддерживать низкую про-окислительную активность, которая предохраняет ГСК от окислительных повреждений. Помимо этого, в 2008 г. было опубликовано исследование, где оценивался внутриклеточный уровень АФК в процессе остеогенной дифференцировки МСК человека, выделенных из костного мозга [Chen и др., 2008]. С использованием АФК-чувствительных красителей (H2DCFDA, а также DHE) было обнаружено, что в пра-родительских МСК уровень АФК ниже, чем в их остеогенных клетках-потомках.

Таким образом, концепция о сниженном содержании АФК в стволовых клетках, сформулированная на основе экспериментов с использованием АФК-чувствительных красителей и клеток разного фенотипа и происхождения, закрепилась в научной литературе. Однако, какие молекулярные механизмы лежат в основе наблюдаемого эффекта - до конца непонятно.

1.4.2 Источники АФК в стволовых клетках

Как уже обсуждалось выше (см. раздел работы 1.2.2), основными продуцентами АФК в клетках являются ЭТЦ митохондрий и ферменты семейства NOX. Остановимся подробнее на том, что известно об этих источниках АФК в стволовых клетках млекопитающих.

Активность NADPH оксидаз (NOX). В целом, во всех культивируемых мультипотентных и плюрипотентных и стволовых клетках человека и мыши (гематопоэтических, сперматогониальных стволовых клетках, нейрональных предшественниках, МСК, а также иПСК и ЭСК) была обнаружена активность членов семейства NOX [Maraldi и др., 2021]. В то же время, было показано, что паттерн экспрессии разных представителей этого семейства может отличаться в стволовых клетках разного фенотипа. Так, методом количественной ПЦР авторы [Kang и др., 2016] показали, что мышиные иПСК экспрессировали на очень высоком уровне Nox2 и Nox4, в то время как экспрессия других изоформ (Noxl, Duoxl, Duox2) была существенно ниже,

или же не детектировалась вовсе (Nox3 and Nox5). В отличие от этого, в культурах МСК, выделенных из жировой ткани человека, на высоком уровне экспрессировались изоформы NOX4, экспрессия изоформ NOX5 и DUOX1 была ниже, а экспрессия других представителей семейства не обнаруживалась [Kim и др., 2012]. Функциональная значимость NOX была подтверждена в обширной серии работ, посвященных регуляторным свойствам АФК в стволовых клетках разного происхождения и фенотипа (см. раздел 1.4.3)

Митохондриальная продукция АФК. Митохондриальная продукция АФК тесно связана с биоэнергетикой клетки, и этой тематике посвящен большой объем исследований, проводимых на разных моделях стволовых клеток человека и мыши. В большинстве этих работ обсуждается склонность клеток стволового фенотипа использовать гликолитический путь для синтеза АТФ.

Так, в ранних исследованиях, посвященных биоэнергетике ПСК, было обнаружено, что плюрипотентные клетки по сравнению со своими дифференцированными клетками-потомками производят небольшое количество АТФ, обладают низкой скоростью потребления кислорода, а также отличаются небольшой митохондриальной массой и незрелой морфологией митохондрий [Prigione и др., 2010; Suhr и др., 2010]. Кроме того, было показано, что в ПСК активен гликолиз, приводящий к накоплению лактата [Prigione и др., 2010]. Эти данные были интерпретированы как свидетельство незначительного вклада процессов окислительного фосфорилирования в биоэнергетику ПСК, что хорошо согласовывалось с гипотезой о низкой окислительной активности в ПСК, описанной в разделе обзора 1.4.1. Однако, в дальнейшем, концепция гликолитической биоэнергетики ПСК подверглась существенной корректировке. В 2011 г. д-р Zhang с коллегами показали, что при сравнении функциональных свойств митохондриального аппарата ПСК и их дифференцированных клеток-потомков, отношение митохондриальной массы к тотальному белку и отношение скорости потребления кислорода к митохондриальной массе является более информативными характеристиками, чем те же параметры, исчисляемые в расчете на клетку [Zhang и др., 2011]. Проведенные с использованием этого подхода оценки показали, что несмотря на морфологические особенности митохондриальной сети ПСК и активное использование гликолитического пути для синтеза АТФ, эти клетки обладают функциональными комплексами дыхательной цепи митохондрий и активно потребляют O2. В дальнейшем эти наблюдения были подтверждены анализом метаболического профиля клеток [Turner и др., 2014]. Результаты метаболического профилирования подтвердили высокую гликолитическую активность в чЭСК, но, кроме того, выявили и высокую активность цикла ТСА в митохондриях этих клеток [Turner и др., 2014]. Анализ показал, что ПСК используют в этом цикле субстраты, полученные преимущественно не в процессе гликолиза, а альтернативным путем - в процессе катаболизма аминокислот, в частности глютамина. Помимо этого, авторы

сравнили метаболические характеристики чЭСК, культивируемых при 2 и 20% содержании О2, и обнаружили высокую метаболическую пластичность ПСК [Turner и др., 2014]. Они показали, что при разных условиях оксигенации активность путей окислительного фосфорилирования ПСК может изменяться, и что при низком содержании кислорода для удовлетворения общей потребности клетки в энергии чЭСК могут увеличивать активность гликолиза. Результаты дальнейших исследований [Tohyama и др., 2016] подтвердили, что глутамин является основным источником энергии для процессов окислительного фосфорилирования в ПСК, и что способность производить АТФ и жизнеспособность плюрипотентных клеток критически зависит от присутствия глутамина. Таким образом, проведенные исследования доказали, что для производства АТФ ПСК полагаются на все возможные пути как аэробного, так и анаэробного метаболизма для обеспечения высоких нужд в энергии и субстратах для анаболизма.

Помимо биоэнергетики ПСК, в нескольких опубликованных исследованиях обсуждалась и биоэнергетика мультипотентных мезенхимных стволовых/прогениторных клеток. Как и в случае с ПСК, проводилось сравнение метаболического профиля МСК, выделенных из разных тканей человека, и дифференцированных клеток-потомков МСК - остеобластов и адипоцитов [Chen и др., 2008; Pietila и др., 2011; Sanchez-Arago и др., 2013]. Обнаружено, что при дифференцировке МСК в клетках повышается содержание ряда белков, участвующих в митохондриальном биогенезе (mtTFA, ДНК-полимераза у и PGC-1a), увеличивается уровень экспрессии некоторых ферментов цикла трикарбоновых кислот и белковых субъединиц ферментов ЭТЦ. Кроме того, сообщалось, что дифференцировка МСК сопровождается повышением активности комплексов дыхательных ферментов, снижением гликолитической активности, а также увеличением скорости дыхания, митохондриального мембранного потенциала и внутриклеточного содержания АТФ [Chen и др., 2008]. Таким образом, как и в случае ПСК, обнаружен вклад гликолитического метаболизма в биоэнергетику МСК человека, который снижается в процессе дифференцировки клеток.

В целом, результаты проведённых исследований доказывают, что для продукции АТФ стволовые клетки человека и мыши используют как кислородзависимый, так и кислороднезависимый метаболизм, чтобы обеспечить высокие потребности в производстве энергии и субстратах для анаболизма, необходимых для их высокой пролиферативной и синтетической активности. Изначальная идея об исключительно анаэробном метаболизме стволовых клеток с низкой активностью митохондрий не подтвердилась. Вместе с тем, как влияют метаболические особенности стволовых клеток на параметры их редокс-гомеостаза и, в том числе, на внутриклеточное содержание и регуляторную активность АФК - неясно.

1.4.3 АФК-зависимая регуляция в стволовых клетках

В стволовых клетках млекопитающих, как и в дифференцированных клетках, АФК -медиаторы сигнальных процессов. Участие АФК в регуляции дифференцировки, репрограммирования, пролиферации, миграции и апоптоза доказано как для мультипотентных, так и плюрипотентных стволовых клеток. Так, мониторинг уровня АФК, соотношения окисленного/восстановленного глутатиона, уровня экспрессии редокс ферментов, клеточного метаболома, проводимый на разных этапах дифференцировки ПСК человека и мыши, позволяет утверждать, что NOX-опосредованное повышение уровня АФК характерно для ранних этапов самых разных направлений дифференцировки - кардиального, мышечного, нейрального, эндодермального и др. [Sauer, Wartenberg, 2005; Schmelter и др., 2006; Urao, Ushio-Fukai, 2013; Xiao и др., 2009]. Помимо NOX-продуцируемых, в регуляции дифференцировки ПСК участвуют и митохондриальные АФК [Pashkovskaia, Gey, Rödel, 2018], выплеск которых в цитоплазму обеспечивается, по-видимому, за счёт транзиентного открытия митохондральной поры [Cho и др., 2014; Crespo и др., 2010; Ding и др., 2008; Wei, Cong, 2018]. Основными сигнальными путями, активирующимися в ответ на регуляторное повышение уровня АФК при дифференцировке ПСК, являются MAPK и PI3K сигнальные каскады [Crespo и др., 2010; Ding и др., 2008; Ji и др., 2010; Kim и др., 2014; Murray и др., 2013; Sauer и др., 2000]. Аналогично дифференцировке, процесс де-дифференцировки - репрограммирования соматических клеток в плюрипотентное состояние - также сопровождается повышением внутриклеточного уровня АФК на ранних этапах этого многоступенчатого процесса [Esteban и др., 2010; Hawkins и др., 2016; Skvortsova и др., 2022; Zhou и др., 2016]. Мультипотентные стволовые/прогениторные клетки взрослого организма также подвержены АФК-зависимой регуляции - показано, что повышение уровня АФК в костномозговой нише способствует дифференцировке, пролиферации и миграции гемопоэтических стволовых клеток, МСК и др. типов мультипотентных клеток, населяющих костный мозг [Urao, Ushio-Fukai, 2013]. В целом, закономерностям редокс-регуляции в клетках стволового фенотипа посвящены многочисленные обзорные работы - [Maraldi и др., 2021; Nugud, Sandeep, El-Serafi, 2018; Sinenko и др., 2021]. В настоящем литературном обзоре обсудим чуть подробнее редокс-регуляцию пролиферации стволовых клеток, поскольку часть задач диссертационного исследования связана именно с этой тематикой.

АФК-зависимая регуляция пролиферации стволовых клеток. Как известно (см. раздел 1.2.4), в случае соматических клеток, АФК участвуют в регуляции клеточной пролиферации на двух уровнях: 1) на уровне проведения сигналов от рецепторов цитоплазматической мембраны (или внутриклеточных рецепторов) в ядро (митогенный сигналинг); 2) на уровне регуляции

активности белков клеточного цикла. Основными путями, вовлеченными в митогенный сигналинг, являются MAPK и PI3K/AKT сигнальные пути, а основные АФК-зависимые регуляторы клеточного цикла - это фосфатазы (CDC25c, CDC14c) и убиквитин-лигазы (APC/C), контролирующие последовательную смену фаз цикла. За последние 10 - 20 лет был опубликован ряд работ, посвященных редокс-регуляции пролиферации стволовых клеток человека и мыши -суммируем коротко наблюдения авторов.

Плюрипотентные стволовые клетки. Вовлеченность АФК в редокс-регуляцию пролиферации ПСК была доказана как на модели ЭСК, так и иПСК. В частности, авторы нескольких работ наблюдали стимуляцию пролиферации ПСК мыши при оверэкспрессии NOX2 и NOX4, а также при добавлении к клеткам малых доз перекиси [Kang и др., 2016; Lee и др., 2009]. Помимо этого, митогенная стимуляция ПСК мыши была обнаружена и при повышении внутриклеточного уровня АФК, опосредованном сигнальными каскадами с участием PPAR5 (ядерный рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом) [Jeong и др., 2009]. В согласии с этими наблюдениями, подавление активности ферментов семейства NOX с помощью малых интерферирующих РНК или ингибиторов (DPI/Apocynin) приводило к замедлению пролиферации и уменьшению количества колоний мышиных ПСК [Kang и др., 2016; Kucera и др., 2016]. Показано, что основными редокс-зависимыми митогенными путями в ПСК, как и в дифференцированных клетках млекопитающих (см. рисунок 1.15), являются каскады, контролируемые киназами p38, JNK и ERK1/2, фосфорилирование которых уменьшается при ингибировании NOX [Lee и др., 2009] и нарастает при увеличении внутриклеточного уровня АФК. Помимо этого, недавняя работа показала, что АФК вовлечены и в активацию PI3K/AKT сигнального пути в ПСК [Fojtík и др., 2021]. Было обнаружено, что в ПСК человека АФК могут стимулировать PBK-опосредованное превращение PIP2 в PIP3, ингибируя PTEN (антагонист PI3K) - в полном соответствии с механизмами, характерными для дифференцированных клеток (см. рисунок 1.15).

Мультипотентные стволовые/прогениторные клетки. Эффект АФК-зависимой митогенной стимуляции был обнаружен и в культивируемых тканеспецифических мультипотентных стволовых клетках человека и мыши, выделенных из разных тканей и органов.

В работе [Belle Le и др., 2011] была обнаружена стимулирующая роль АФК в регуляции пролиферации и самообновления в культурах первичных нейрональных стволовых/прогениторных клеток, выделенных из головного мозга мыши и человека, которые обладали способностью дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Пролиферативно-активные, самообновляющиеся мультипотентные нейрональные стволовые клетки поддерживали высокий уровень АФК и были чувствительны к стимуляции экзогенной перекисью водорода. Ингибирование и делеция NOX способствовали снижению

пролиферативной и клональной активности клеток, и, более того, подавляли нейрогенез в системе in vivo. С использованием мутантных животных было показано, что стимулирующая роль АФК реализуется через активацию PI3K/AKT/mTOR каскада, опосредованную обратимой инактивацией PTEN.

В работе [Paul и др., 2014] исследовалась роль АФК в регуляции пролиферации стволовых базальных клеток дыхательных путей мыши и человека. Обнаружено, что повышение внутриклеточного уровня АФК на границе G1 и S фаз клеточного цикла является необходимым условием самообновления и пролиферации стволовых клеток. Изменение уровня АФК приводит к активации редокс-чувствительного транскрипционного фактора Nrf2, который, в свою очередь, стимулирует сигнальный путь Notch, а также транскрипцию антиоксидантных генов клетки. Эти события, с одной стороны, поддерживают процесс самообновления клеточной популяции, а с другой - обеспечивают последующее снижение уровня АФК для поддержания гомеостатического баланса.

В работе [Morimoto и др., 2013] сперматогониальные стволовые клетки при снижении уровня АФК останавливали пролиферацию, и напротив - повышали пролиферативную активность при обработке перекисью водорода, которая индуцировала фосфорилирование киназ p38 MAPK и JNK. Более того, в мышах с нокаутом NOX1 фиксировалось истощение популяции стволовых клеток в их естественной нише, а клетки с дефицитом NOX1 обладали сниженной способностью к самообновлению при последовательной трансплантации. Эти результаты, согласно выводам авторов работы, свидетельствуют о том, что АФК, генерируемые NOX1, стимулируют самообновление сперматогониальных стволовых клеток путём активации путей p38 MAPK и JNK.

Наконец, авторы работы [Kim и др., 2012] наблюдали стимуляцию пролиферации и миграции МСК, выделенных из жировой ткани человека, при увеличении базального уровня АФК, опосредованном активностью NOX4. Делеция NOX4 подавляла пролиферативную и миграционную активность клеток, а также приводила к снижению фосфорилирования AKT, рецептора PDGF и ERK1/2.

Таким образом, все ранее опубликованные работы свидетельствуют о митогенной стимуляции плюрипотентных и мультипотентных стволовых/прогениторных клеток млекопитающих при NOX-опосредованном повышении внутриклеточного уровня АФК. Стимуляция обеспечивается активацией сигнальных каскадов MAPK и PI3K/AKT. Обнаруженные эффекты в точности повторяют закономерности, наблюдаемые для культур дифференцированных клеток. В то же время, подвержена ли последовательная смена фаз клеточного цикла стволовых клеток АФК-зависимой регуляции и если да, то какие сигнальные белки являются мишенями этой регуляции - до сих пор неясно.

1.4.4 Реакция стволовых клеток на окислительный стресс

Известно, что реакция клеток человека на окислительный стресс определяется целым набором факторов - эффективностью их антиоксидантных ферментативных систем, систем репарации окислительных повреждений, особенностями ответа на повреждения макромолекул и т.д. Изучению этих аспектов с использованием культивируемых моделей плюрипотентных стволовых и мультипотентных стволовых/прогениторных клеток млекопитающих посвящен целый ряд опубликованных научных исследований.

В цикле работ [Armstrong и др., 2010; Cho и др., 2006; Saretzki и др., 2004; Saretzki и др., 2008], посвященных особенностям антиоксидантной защиты в мышиных и человеческих ЭСК и иПСК, было показано, что плюрипотентные клетки, являясь источником формирования всех тканей будущего организма, снабжены эффективной антиоксидантной системой, и что их паттэрн экспрессии генов и белков антиоксидантной защиты отличается от характерного для дифференцированных клеток-потомков ПСК. Так, с использованием метода ПЦР было обнаружено, что уровень экспрессии некоторых антиоксидантных генов, таких как GPX2-4, MnSOD, GSR, заметно снижается при дифференцировке ПСК [Armstrong и др., 2010; Saretzki и др., 2004; Saretzki и др., 2008]. В работе [Cho и др., 2006] методом вестерн-блоттинга при дифференцировке чЭСК обнаружено повышение уровня таких белков, как PRX1,2, CuSOD, GPX1 и одновременно - снижение уровня MnSOD и каталазы. C учётом полученных данных, в ряде работ было высказано предположение о том, что плюрипотентные клетки в большей степени, чем их дифференцированные потомки, способны защищать себя от повреждающего действия окислительного стресса благодаря высокой антиоксидантной активности клеточных редокс-систем [Armstrong и др., 2010]. Однако в более поздних работах, посвященных сравнению транскриптомного профиля ПСК и их дифференцированных потомков, в списках дифференциально экспрессируемых генов не было обнаружено генов антиоксидантной защиты [Bhattacharya и др., 2004; Wu и др., 2010]. Аналогично, в исследованиях, использующих генетические скрининги или транскриптомное профилирование для выявления набора генов, критически важных для инициации и поддержания плюрипотентности, не встречаются гены, относящиеся к антиоксидантным системам клеток [Chia и др., 2010; Ghosh, Som, 2020; Müller и др., 2008]. Таким образом, можно заключить, что на данный момент надёжного подтверждения гипотезы о высокой активности антиоксидантных систем стволовых клеток в научной литературе нет.

При изучении эффективности систем репарации повреждений в стволовых клетках было обнаружено, что активность репарации ДНК после окислительного стресса, индуцированного

радиационным воздействием, в мышиных ЭСК значительно выше, чем в их клетках-потомках, полученных из эмбриоидных телец, а также выше, чем в эмбриональных фибробластах мыши [Saretzki и др., 2004]. мЭСК быстрее репарировали повреждения ДНК, чем мышиные фибробласты линии 3Т3, а при культивировании в условиях гипероксии (40% О2), мЭСК почти не изменяли своей пролиферативной активности, в то время как эмбриональные фибробласты мыши почти останавливали деление. Было обнаружено, что многие гены, вовлеченные в ответ на стресс (белки теплового шока, Bmil, Ercc4) снижают свою экспрессию при дифференцировке мЭСК. В другом исследовании [Fan и др., 2011] было показано, что как ЭСК, так и иПСК человека отличаются повышенным содержанием белков, отвечающих за репарацию двойных и одиночных разрывов ДНК, а также за эксцизионную репарацию оснований (RAD51, Ku70, XLF, DNA LigIIIa, XRCC1 и PARP1). Используя функциональные тесты, основанные на репарации плазмидной ДНК, авторы этой работы показали, что для плюрипотентных клеток человека характерна повышенная активность основного пути репарации двойных разрывов ДНК -механизма негомологичного соединения концов.

Наконец, ряд работ был посвящён оценке цитотоксического действия окислительного стресса на стволовые клетки [Borodkina и др., 2014; Guo и др., 2010]. Проведенные исследования [Guo и др., 2010] показали, что ЭСК мыши быстро и эффективно элиминируют поврежденные клетки путем апоптоза, тогда как эмбриональные фибробласты мыши не гибнут, но подвергаются преждевременному старению - стресс-индуцируемой сенесценции. Важно отметить при этом, что мЭСК, пережившие сублетальный окислительный стресс, сохраняли стволовой фенотип и способность к самоподдержанию [Guo и др., 2010]. Помимо плюрипотентных клеток мыши, аналогичные данные были получены и для ЭСК человека - в работе [Borodkina и др., 2014] сравнивался ответ на окислительный стресс плюрипотентных (чЭСК) и мультипотентных мезенхимных стволовых/прогениторных клеток (МСК) взрослого организма. Обнаружено, что поврежденные стрессом чЭСК, как и плюрипотентные клетки мыши, активировали программу апоптоза, а МСК - программу клеточной сенесценции.

Таким образом, имеющиеся литературные данные показывают, что реакция плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих на окислительный стресс может принципиально отличаться -как от своих дифференцированных клеток-потомков, так и от соматических стволовых клеток. ПСК надёжно защищены от повреждающего воздействия стресса, благодаря способности эффективно элиминировать повреждения как на уровне одной клетки, так и на уровне клеточной популяции. Вместе с тем, особенности молекулярных механизмов антиоксидантной защиты плюрипотентных и мультипотентных стволовых/прогениторных клеток человека, вплоть до последнего времени, не были ясны - проведённые исследования ограничивались выборочными

молекулярными тестами на уровень экспрессии отдельных генов и белков антиоксидантных систем.

1.5 Заключительный раздел обзора литературы

Многочисленные исследования, о которых шла речь в настоящей главе диссертационной работы, легли в основу современной парадигмы редокс-биологии, постулирующей, что в клетках аэробных организмов продукты метаболизма молекулярного кислорода - различные представители семейства АФК - являются не только побочными производными метаболических реакций, но и медиаторами регуляторных процессов. Однако, плюри- и мультипотентные стволовые/прогениторные клетки человека, которые служат основным объектом исследований в настоящей работе, часто существуют in vivo в гипоксических нишах, обедненных кислородом. Соответственно, ещё на заре биологии стволовых клеток возник вопрос - какое влияние эта локализация оказывает на внутриклеточный редокс-метаболизм и регуляцию? Как было показано в текущей главе, на основе ряда экспериментальных фактов в научной литературе сформировалась и получила широкое распространение гипотеза о специфическом характере редокс-гомеостаза клеток стволового фенотипа. Предполагается, что этот фенотип характеризуется низкой способностью продуцировать и повышенной способностью детоксифицировать АФК, что позволяет стволовым клеткам в течение длительного времени поддерживать свой функционал, минимизируя окислительные повреждения макромолекул -ДНК, белков, липидов (см. рисунок 1.24). Настоящее диссертационное исследование направлено на экспериментальную проверку этой гипотезы с использованием широкой палитры клеточных культур, а также недавно появившихся молекулярных инструментов - редокс-активных генетически-кодируемых биосенсоров, которые открывают принципиально новые возможности для изучения внутриклеточного редокс-метаболизма. Сочетание технологий биосенсорики, методов генетического репрограммирования и направленной дифференцировки клеток позволили нам охарактеризовать механизмы, контролирующие редокс-гомеостаз и редокс-регуляцию в плюрипотентных и мультипотентных стволовых/прогениторных клетках человека, их дифференцированных клетках-потомках, других соматических клетках человека, ответив, таким образом, на вопросы, являющиеся в данный момент ключевыми для редокс-биологии стволовых клеток:

• действительно ли существует взаимосвязь между внутриклеточным содержанием АФК и стволовым фенотипом клеток; каковы молекулярные основы этого эффекта?

• принимают ли представители семейства АФК участие в регуляции самообновления стволовых клеток, и если да, то какие фазы и сигнальные события клеточного цикла подвержены АФК-зависимой регуляции?

Рисунок 1.24 - Гипотеза о специфическом характере редокс-гомеостаза стволовых клеток: стволовой

фенотип ассоциируется со сниженной способностью клеток производить АФК и повышенной антиоксидантной активностью; эта особенность позволяет стволовым клеткам в течение длительного времени поддерживать функциональность своего макромолекулярного пула - белков, ДНК, липидов.

• в чём специфика ответа клеток стволового фенотипа на нарушения редокс-гомеостаза, вызванные окислительным стрессом - справедливо ли предположение о повышенной эффективности систем антиоксидантной защиты стволовых клеток в сравнении с их дифференцированными клетками-потомками и какие ферментативные пути контролируют антиоксидантную активность клеток стволового и нестволового фенотипа?

• как отвечают стволовые клетки на нарушения редокс-гомеостаза, вызванные высокими дозами фармакологических антиоксидантов, и какие молекулярные детерминанты регулируют эти реакции?

Ответы на эти вопросы содержатся в Главе 3 настоящего диссертационного исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Клеточные культуры

Все клеточные культуры, использованные в работе, были либо получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), либо любезно предоставлены для проведения исследований коллегами. В последнем случае в работе содержатся ссылки на публикации, в которых приведена вся необходимая информация о протоколах получения клеточных культур, источниках донорского материала и одобрении локальными этическими комитетами процедуры забора материала.

2.1.1 Культуры стволовых клеток человека

Мезенхимные стволовые/прогениторные клетки эндометрия человека (эМСК) были выделены из десквамированного эндометрия менструальной крови здоровых доноров и охарактеризованы в отделе внутриклеточной сигнализации и транспорта ИНЦ РАН ранее [Zemelko и др., 2011]. Все использованные в работе линии эМСК (2304, 2804, 2503) продемонстрировали свойства, характерные для культур мезенхимных стромальных/стволовых клеток, экспрессировали поверхностные маркеры CD90, CD105, CD73, CD44, CD146, CD140b и не экспрессировали CD34 и HLA-DR. Клетки культивировались в среде DMEM/F12 (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС - HyClone, США), 1% L-глутамина и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, США). Клетки с 3-го по 25-й пассажи пересевались два раза в неделю в соотношении 1:3. Культуры поддерживали при температуре 37oC, 5% CO2.

Плюрипотентные стволовые клетки человека. В диссертационном исследовании были использованы три линии плюрипотентных стволовых клеток: две линии эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК С910, Н9) и одна линия индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (иПСК).

Н9, каноническая линия ЭСК [Thomson и др., 1998], полученная из WiCell Research Institute (Мэдисон, США), была любезно предоставлена для проведения исследований д-ром И.Э.Негановой (ИНЦ РАН).

ЭСК С910 были ранее получены и охарактеризованы в отделе внутриклеточной сигнализации и транспорта ИНЦ РАН [Kozhukharova и др., 2009]. Клетки обладали типичной клональной

морфологией роста, диплоидным кариотипом, экспрессировали маркеры плюрипотентности (ОСТ-4, NANOG, SSEA-4, SOX-2, TRA-1-60, щелочную фосфатазу), были способны к дифференцировке в различные типы клеток трех зародышевых листков in vitro, а также in vivo в тесте на формирование тератом.

, " / -5»

Г& * иС Р1

3 л V* <

Я

SOX-2

А- ^ 4Í/ \ *

; Г4 / гч » '

Цитбкератин / 18 W ■

Виментин

Рисунок 2.1 - Фенотипическая характеристика иПСК, полученных путем генетического репрограммирования

эМСК (линия 2804) [Zenin и др., 2022]

(А) - клональный характер роста иПСК и экспрессия маркеров плюрипотентности. (Б) - способность иПСК дифференцироваться в клетки 3-х зародышевых листков in vitro. А, Б: масш. отрезок 10 мкм.

Сокращения и обозначения: иПСК, индуцированные плюрипотентные клетки; ЩФ, щелочная фосфатаза.

Линия иПСК была получена путем репрпограммирования эМСК (линия 2804) с использованием коммерческого набора CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Thermofisher Scientific, США) согласно инструкции производителя. Через 28 дней после индукции репрограммирования формировались колонии клеток с четко-очерченной границей, экспрессирующие канонические маркеры плюрипотентности (ОСТ-4, NANOG, SSEA-4, SOX-2,

щелочную фосфатазу) (см. рисунок 2.1 А). Плюрипотентность иПСК была подтверждена тестами на способность дифференцироваться в различные типы клеток трех зародышевых листков при дифференцировке in vitro. (см. рисунок 2.1 Б).

Все линии плюрипотентных стволовых клеток культивировали в среде mTeSR (STEMCELL Te^nologies, Канада) при 370С и нормоксии (21% О2) с содержанием СО2 5%. Среду меняли ежедневно, клетки пересевали механически один раз в неделю на чашки Петри, покрытые матригелем (Corning, США).

2.1.2 Культуры дифференцированных клеток человека

Лимфоциты человека (Лимф) были любезно предоставлены д-ром И. И. Мараховой (ИНЦ РАН). Клетки выделяли из свежей венозной крови здоровых доноров в соответствии с методикой, описанной в [Shatrova и др., 2016], и суспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 5% термоинактивированной сыворотки человека (AB IV Rh+). Для активации покоящихся лимфоцитов на следующий день после выделения клеточную суспензию (>85% CD3+ клеток) доводили до концентрации 1.5х106 клеток/мл, добавляли фитогемагглютинин (PHA-M, Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали при температуре 37°C с 5% содержанием CO2 в течение 48 часов.

Клетки дермальных фибробластов человека (ДФ) были получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10% ФБС (HyClone, США), 1% L-глютамина и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, США). Культуры поддерживали при температуре 37oC, 5% CO2 и пассировали два раза в неделю в соотношении 1:3.

Дифференцированные клетки-потомки ЭСК С910 (ДифЭСК) были получены ранее в в отделе внутриклеточной сигнализации и транспорта ИНЦ РАН путем спонтанной дифференцировки ЭСК [Kozhukharova и др., 2009]. Культура состояла из морфологически-гомогенных фибробласто-подобных клеток, экспрессирующих маркер мезенхимного ряда виментин (см. рисунок 2.2). Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10% ФБС (HyClone, США), 1% L-глютамина и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, США). Культуры поддерживали при температуре 37oC, 5% CO2 и пассировали два раза в неделю в соотношении 1:3.

^ S -

' r<- V Ш

\ i-^fii Виментин ДифЭСК

Рисунок 2.2 - Фенотипическая характеристика фибробласто-подобных потомков ЭСК С910 (ДифЭСК), полученных путем спонтанной дифференцировки [ЬуиЪИшкауа и др., 2017]

(А) - культура ДифЭСК, пассаж 5; метод: световая микроскопия. (Б) - экспрессия мезенхимного маркера виментин; метод: конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. А, Б: масш. отрезок 10 мкм.

МСК-подобные дифференцированные клетки-потомки иПСК (ипск-МСК) были получены путем спонтанной дифференцировки иПСК. Колонии иПСК были механически разделены на небольшие куски и помещены в чашки Петри с неадгезивной поверхностью в нокаутную среду DMEM/F12 (Gibco, США) с добавлением 20% заменителя эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco, США), 1% заменимых аминокислот (Sigma, USA), 0.1 мМ ß-меркаптоэтанола, 1% L-глутамина и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, США). В течение 4-7 дней в чашках формировались ЭТ - трехмерные клеточные агрегаты с четко-очерченной границей. Затем ЭТ переносили в чашки с адгезивной поверхностью и культивировали в среде DMEM/F12 (Gibco, США) с добавлением 10% ФБС (HyClone, США), 1% L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (Gibco, США). Дифференцированные клетки, полученные из прикрепленных ЭТ, пересевали один-два раза в неделю в соотношении 1:3. После 3 - 4 циклов пассирования в среде DMEM/F12 культура состояла из морфологически-гомогенных фибробласто-подобных клеток (см. рисунок 2.3 А). При фенотипировании культуры было обнаружено, что клетки утратили маркеры плюрипотентности (TRA-1-60 и TRA-1-80) и экспрессировали мезенхимный маркер виментин, все канонические поверхностные маркеры МСК ^D90, CD105, CD73, СD44, CD140b), и не экспрессировали CD34 и HLA-DR (см. рисунок 2.3 Б, В). Мультипотентность клеток подтверждалась тестами на способность дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлении in vitro (см. рисунок 2.3 Г).

В

ипск-МСК Антиген % клеток

jji CD 90 97±1

л , /Р A A s CD 105 98±1

"v? Щ ^ CD 73 96±3

CD 44 97±2

i-Ч» Ш т. CD 140b 96±2

Виментин _ HLADR 2±1

ипск-ОС

-; v« •fbTJBsttr' >

ЩШ^.'1 Ализариновый

красный

Рисунок 2.3 - Фенотипическая характеристика МСК-подобных потомков иПСК (ипск-МСК), полученных путем спонтанной дифференцировки [2етп и др., 2022]

(А) - культура ипск-МСК, пассаж 4; метод: световая микроскопия. (Б) - экспрессия мезенхимного маркера виментин; метод: конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. (В) - экспрессия поверхностных

маркеров, характерных для МСК; метод: проточная цитометрия. (Г) - способность ипск-МСК дифференцироваться в адипогенном (левая панель) и остеогенном (правая панель) направлении; метод: световая микроскопия, окраска липидных гранул (масляный красный) и кальциевых отложений (ализариновый красный) в клетках через 18 дней после индукции дифференцировок. А, Б, Г: масш. отрезок

100 мкм.

Сокращения и обозначения: иПСК, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные путем генетического репрограммирования культур эМСК (линия 2804); ипск-МСК, МСК-подобные потомки иПСК, полученные путем спонтанной дифференцировки иПСК; ипск-АД, адипогенные потомки иПСК, полученные методом направленной дифференцировки ипск-МСК; ипск-ОС, остеогенные потомки иПСК, полученные

методом направленной дифференцировки ипск-МСК.

Адипогенные дифференцированные клетки-потомки иПСК (ипск-АД) были получены путем направленной дифференцировки иПСК с использованием коммерческого набора StemPro™ Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco, США). Процедура проводилась согласно рекоммендациям производителя (https://documents.thermofisher. com/TF S -

Assets/LSG/manuals/StemProAdipoDifKit.pdf). Продолжительность процесса дифференцировки составляла 18 дней, после чего клетки были охарактеризованы на фенотипические маркеры. В клетках наблюдалось накопление жировых гранул, выявляемых путем окраски клеток 0.5% раствором Oil Red O (масляного красного) в 60% изопропаноле (см. рисунок 2.3 Г).

2.1.3 Культуры малигнизированных клеток

Клетки эритробластоидной лейкемии человека K-562 были получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% ФБС (HyClone, США), 1% L-глютамина и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, США). Культуры поддерживали при температуре 37oC, 5% CO2 и пассировали два раза в неделю в соотношении 1:5.

Клетки эпителиоидной карциномы шейки матки человека HeLa были получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10% ФБС (HyClone, США), 1% L-глютамина и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, США). Культуры поддерживали при температуре 37oC, 5% CO2 и пассировали два раза в неделю в соотношении 1:5.

2.1.4 Получение культур клеток, экспрессирующих генетически-кодируемый

биосенсор перекиси водорода HyPer

Для получения стабильных клеточных линий с экспрессией HyPer [Belousov и др., 2006] в различных клеточных компартментах (цитоплазме, ядре и митохондриях), клетки (K-562, HeLa, эМСК, ДФ) были трансдуцированы лентивирусами, кодирующими компартментализованные версии HyPer (cyto-, nuc-, mito-HyPer). Вирусные частицы были собраны в ЗАО «Евроген» (г.Москва). Трансдукцию проводили с использованием полибрена в концентрации 5 мкг/мл через 20 часов после посева клеток при кратности инфицирования (MOI), равной 5 (cyto-HyPer) или 1 (mito- и nuc-HyPer).

Для получения палитры изогенных клеточных линий стволовой и нестволовой природы с экспрессией биосенсора были использованы методы генетического репрограммирования (см. п. 2.1.1) и направленной дифференцировки клеток (см. п. 2.1.2). В качестве пра-родительских культур были выбраны эМСК с экспрессией HyPer в клеточной цитоплазме. В результате был получен следующий набор HyPer-экспрессирующих линий: культуры эМСК (линия 2804), культуры иПСК (получены путем репрограммирования эМСК 2804), культуры МСК-подобных дифференцированных потомков иПСК (ипск-МСК), культуры дифференцированных потомков ипск-МСК адипогенной природы (ипск-АД). Фенотипические характеристики всех перечисленных культур клеток приведены в предыдущем разделе работы 2.1. Доля клеток,

экспрессирующих HyPer в клеточной цитоплазме, составляла в полученных культурах 90 - 95% (см. рисунок 2.4).

Помимо HyPer, клеточные культуры были также трансдуцированы контрольной, Н2О2-нечувствительной версией биосенсора - SypHer [Bilan, Belousov, 2016], которая вследствие одной аминокислотной замены теряет редокс-активность, но сохраняет в неизменности все остальные свойства биосенсора (флуоресцентную активность, зависимость от рН и т.д.). Трансдукцию проводили с использованием того же протокола, что и в случае HyPer.

зМСК иПСК ипск-МСК

HyPer HyPer НуРег

Рисунок 2.4 - Доля клеток, экспрессирующих HyPer в культурах эМСК, иПСК и ипск-МСК; метод: проточная цитометрия, гейтирование основано на сигналах автофлуоресценции клеток без экспрессии HyPer [2етп и др.,

2022]

Сокращения и обозначения: эМСК, мультипотентные мезенхимные стволовые/прогениторные клетки эндометрия

человека (линия 2804); иПСК, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные путем генетического репрограммирования эМСК (линия 2804); ипск-МСК, МСК-подобные потомки иПСК, полученные

путем спонтанной дифференцировки иПСК.

2.2 Модуляторы/ингибиторы физиологической активности клеток 2.2.1 Синхронизация клеточного цикла

Использовалось два приема синхронизации клеток по фазам клеточного цикла: с помощью нокодазола, ингибирующего сборку веретена деления, а также путем бессывороточного культивирования клеток или культивирования в плотном монослое.

Плюрипотентные стволовые клетки (ЭСК, Н9, иПСК) были синхронизированы по циклу с помощью нокодазола (Sigma-Aldrich, США). Клетки инкубировали в ростовой среде, содержащей 0.2 мкг/мл нокодазола в течение 16 ч для их накопления в G2/M фазе цикла, после чего пролиферация клеток стимулировали путем однократной промывки PBS и сменой ростовой среды на свежую.

Дифференцированные потомки плюрипотентных клеток (ДифЭСК), а также эМСК и ДФ, накапливали в G0/G1 фазе цикла путем бессывороточного культивирования. Клетки переводили на бессывороточную среду через 20 ч после посева. Спустя сутки, пролиферацию стимулировали переводом клеток на полную ростовую среду. В некоторых случаях, использовался альтернативный подход - клетки культивировали стандартным образом, заполнение монослоя приводило к обратимой остановке клеточного деления и накоплению клеток в G0/G1 фазе цикла, после чего пролиферацию стимулировали пересевом культуры. При подготовке клеток к РНК-секвенированию использовался именно этот подход, чтобы избежать влияния бессывороточного культивирования на транскрипционный профиль клеток.

2.2.2 Обработка клеток антиоксидантами

Для понижения физиологически-релевантного уровня АФК в клетках использовалась обработка веществами с антиоксидантной активностью (см. Таблицу 2.1). Для приготовления стокового раствора Темпол растворяли в дистиллированной воде в концентрации 1 М, а ресвератрол и DPI - в ДМСО в концентрации 100 мМ и 5 мкМ, соответственно. Рабочий раствор NAC (1 М в воде) доводили до рН 7.4 и использовали свежеприготовленным. Все вещества добавлялись в полную ростовую среду клеток в указанных в таблице 2.1 концентрациях. Время инкубации составляло от 2 до 30 часов в зависимости от задачи.

Таблица 2.1 - Используемые в работе агенты с антиоксидантной активностью

Вещество / производитель Происхождение / использование Антиоксидантная активность Используемые концентрации

Темпол (4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1 -оксил) Santa Cruz Biotechnologies, США Синтетический нитроксид / входит в состав БАДов Миметик супероксиддисмутазы [Wilcox, 2010] 1- 2 мМ

ресвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен) Sigma-Aldrich, США Природный фенольный фитоалексин / входит в состав БАДов Активатор Nrf2-опосредованной антиоксидантной активности клетки [Vang, 2013] 10 - 60 ^M

NAC (№ацетил^-цистеин) Sigma-Aldrich, США Ацетилированная производная цистеина / фармакологический препарат Тиол-содержащий антиоксидант, предшественник синтеза глутатиона [Sun, 2010] 10 - 40 mM

DPI (дифенилениодониум) Sigma-Aldrich, США Малая молекула / реагент для экспериментальной биологии Неспецифический ингибитор NOX [Aldieri и др., 2008] 0.1 - 2 ^M

2.2.2 Обработка клеток ингибиторами/активаторами редокс-ферментов

Для подавления Trx/TrxR-зависимой ферментативной активности клетки инкубировали в стандартных ростовых условиях в течение 3 ч с ингибиторами TrxR: ауранофином (20 - 1000 нМ), митомицином С (100 - 500 мкМ), или Tri-1 (200 - 1000 нМ). Для подавления GSH-зависимой ферментативной активности клетки инкубировали в течение 24 ч с ингибитором синтеза GSH бутионинсульфоксимином (BSO, 500-1000 мкМ) или в течение 1 ч c ингибитором GR кармустином (BCNU, 10 - 25 мкМ). Двойное ингибирование осуществляли путём добавления ауранофина (100 нМ) на 3 ч к клеткам, предварительно преобработанным в течение 3-х часов BSO (500 мкм). Для повышения активности TrxR к клеткам на 24 ч добавляли источник селена Na2SeO3 (100-1000 нМ). Для повышения внутриклеточной пероксидазной активности использовали проникающий через клеточные мембраны миметик каталазы EUK-134 (100 мкМ, 3 ч).

2.3 Измерение уровня и удельного содержания АФК в клетках 2.3.1 Измерение уровня АФК методом проточной цитометрии

Использование красителя H2DCFDA. АФК-чувствительный краситель 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCFDA, Invitrogen, D-399) растворяли в ДМСО для получения стокового раствора (10 мМ) и дополнительно разбавляли PBS для получения красящего раствора (5 мкМ) перед использованием. Адгезивные клетки, предобработанные при необходимости различными агентами, инкубировали с красящим раствором в темноте в течение 20 - 30 мин при 37°C, добавляя к клеткам при необходимости Н2О2 в качестве положительного контроля. При взаимодействии с АФК изначально нефлуоресцентный H2DCFDA превращался

во флуоресцирующий продукт дихлорофлуоресцеин (DCF). Окрашенные клетки открепляли от подложки 0.05% раствором трипсина-ЭДТА, суспендировали в свежей среде и немедленно анализировали с помощью проточного цитометра (EPICS XL или CytoFLEX, Beckman Coulter, США; канал EX488/FL525). Суспензионные культуры, предобработанные при необходимости различными агентами, ресуспендировали в PBS, добавляя при необходимости к клеткам Н2О2 в качестве положительного контроля, инкубировали с 5 мкМ H2DCFDA в темноте в течение 20 -30 мин при 37°C и немедленно анализировали на приборе. В некоторых экспериментах, наряду с зондом H2DCFDA, в качестве негативного контроля, использовали АФК-нечувствительную модификацию красителя 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетат (DCFDA). Процедура окрашивания была такой же, как и для H2DCFDA.

Использование супероксид-чувствительного зонда гидроэтидина (НЕ). Гидроэтидин (Invitrogen, D-1168) растворяли в ДМСО для получения стокового раствора (10 мМ) и дополнительно разбавляли свежей полной средой перед использованием. После удаления ростовой среды адгезивные клетки окрашивались согласно стандартному протоколу - в 10 мкМ красящем растворе НЕ в полной среде DMEM/F12 в течение 30 минут в темноте при 37оС. В некоторых экспериментах концентрация красителя варьировалась в пределах 10 - 50 мкМ, а время обработки НЕ - в пределах 10 - 180 минут. После окраски клетки промывали PBS, открепляли от культуральной поверхности с использованием 0.05% раствора трипсин-ЭДТА, суспендировали в полной ростовой среде DMEM/F12 и сразу же анализировали на проточном цитометре (EPICS XL, Beckman Coulter, США; канал EX488/FL585). Суспензионные культуры инкубировали с НЕ согласно описанному выше протоколу, затем отмывали от красителя, снова ресуспендировали в свежей среде и немедленно анализировали на приборе.

В ряде экспериментов перед обработкой HE клетки предварительно нагружали Родамином 123 (Rh123), потенциал-зависимым митохондриальным красителем. Rh123 (Invitrogen, R-302) растворяли в дистиллированной воде для получения стокового раствора (5 мМ). Адгезивные клетки инкубировали с Rh123 в полной в полной среде DMEM/F12 в течение 20 минут в темноте при 37оС при концентрациях Rh123 0.5 - 5 мкм. После этого клетки промывали PBS и окрашивали HE. Суспензионные клетки ресуспендировали в полной ростовой среде и инкубировали с Rh123 в течение 20 минут в темноте при 37оС при концентрациях Rh123 0.5 - 5 мкм. После этого клетки центрифугировали, промывали PBS, повторно ресуспендировали в культуральной среде и окрашивали HE.

Использование митохондриального супероксид-чувствительного зонда MitoSOX. После удаления ростовой среды адгезивные клетки окрашивались 5 мкМ раствором MitoSox (Invitrogen,

США) в бессывороточной среде DMEM/F12 в течение 15 минут в темноте при 37оС. Затем клетки промывали PBS, открепляли от культуральной поверхности с использованием 0.05% раствора трипсин-ЭДТА, суспендировали в полной ростовой среде DMEM/F12 и сразу же анализировали на проточном цитометре (CytoFLEX, Beckman Coulter, США) с использованием лазеров с длиной волны 405 (канал EX405/FL585) или 488 нм (канал EX488/FL585). Возбуждение с длиной волны 405 нм использовали для селективного обнаружения митохондриального супероксида [Robinson и др., 2006].

2.3.2 Измерение уровня АФК c использованием конфокальной микроскопии

Для оценки уровня АФК с помощью конфокальной микроскопии адгезивные культуры выращивали на покровных стеклах. Покровные стекла с клетками помещали в раствор АФК-чувствительного красителя H2DCFDA в PBS (5 мкМ), и инкубировали в течение 1 часа при 37°C в темноте, затем промывали и визуализировали окрашенные клетки с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SL, оснащенного аргоновым лазером с длиной волны 488 нм, избегая длительной засветки образцов. Количественную оценку сигнала проводили с использованием программного пакета ImageJ (US National Institutes of Health, США). Определяли среднюю интенсивность флуоресценции, приходящуюся на единицу площади клетки [Wojtala и др., 2014] (параметр АФК/площ), а также средний сигнал единичной клетки (АФК/клетка). Не менее 150 клеток из разных полей зрения было проанализировано для каждого стекла.

2.3.3 Измерение удельного содержания или концентрации АФК

Использование красителя H2DCFDA. Удельное содержание АФК определяли путём нормировки уровня АФК, измеренного с использованием проточной цитометрии и АФК-чувствительного зонда H2DCFDA (см. п. 2.3.1) на клеточный объем или белок. Объем клеток в пиколитрах определялся с помощью счетчика клеток Scepter™ 2.0 (Millipore, США) согласно инструкции производителя. Содержание внутриклеточного белка измеряли методом Брэдфорда [Bradford, 1976].

Использование генетически-кодируемого биосенсора перекиси водорода HyPer. В

настоящем диссертационном исследовании разработаны авторские методики, позволяющие использовать проточную цитометрию для оценки с помощью HyPer внутриклеточной концентрации Н2О2, а также пероксидазной и дисульфидредуктазной активности клеток. Все

протоколы пробоподготовки и обработки цитометрических данных подробно описаны в разделе 3.1.2. Проточно-цитометрический анализ образцов клеток, экспрессирующих HyPer, проводился на приборе CytoFLEX (Beckman Coulter, США). Для проведения измерений использовались суспензии клеток в полной ростовой среде (если не указано иное). В процессе анализа в пробирку с образцом подавалась смесь теплого (37°C) воздуха с СО2 (5%) для поддержания нормальных физиологических условий для клеток. Детектировалось два флуоресцентных сигнала в каналах EX488/FL525 (!ш) и EX405/FL525 (I405), которые соответствуют окисленной и восстановленной форме биосенсора, соответственно. Помимо этих сигналов, в режиме реального времени регистрировался также ратиометрический сигнал, традиционно используемый в экспериментах с HyPer [Mishina и др., 2013] как мера внутриклеточного содержания Н2О2. Ратиометрический параметр (Ratio) был определен в измерительном протоколе, как /488 X 100//405. Для калибровки биосенсора в каждом эксперименте измерялись также флуоресцентные сигналы полностью восстановленного и окисленного HyPer в образцах клеток, обработанных высокими дозами дитиотреитола (DTT, 30 мМ, 10 мин) и Н2О2 (100 мкМ, 5 мин), соответственно. Обработку клеток этими агентами проводили в стандартных ростовых условиях (37 oC и 5% CO2) в пробирках для проточной цитометрии непосредственно перед измерениями.

2.4 Методы молекулярно-клеточной биологии

2.4.1 Иммунофлуоресцентный анализ

Клетки фиксировались 1% раствором параформальдегида (PFA, Sigmа-Аldriсh, США) в течение 20 мин, пермеабилизовались 0,1% Triton X-100, а затем блокировались в растворе, содержащем 3% инактивированной нагревом козьей сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, ^егто Fishеr Sсiеntifiс, США). Клетки инкубировались с первичными антителами в течение 18 - 20 ч при +4°С в 1% растворе BSA. Затем после многократной промывки раствором PBS, содержащим 0.05% Tween 20, клетки инкубировались с соответствующими вторичными антителами конъюгированными c флуорохромом при комнатной температуре в течение 1 часа в 1% растворе BSA. Ядра были окрашены DAPI (^егто Fishеr Sсiеntifiс, США) в концентрации 1 мкг/мл. Визуализацию проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа OLYMPUS FV3000 (Olympus Corporation, Япония). Для обработки и анализа полученных изображений использовали программное обеспечение ImаgеJ (US National Institutes of Health, США).

В работе использовались следующие первичные антитела: анти-Nanog (1:200, Fortis Life Sciences, США), анти^ОХ2 (1:200, Millipore, США), анти-ОСТ3/4 (1:200, Sаntа Cruz В^есИлоЬеу, США), SSEA-4 (1:200 Millipore, США); анти-Виментин (1:100, Abcam, Великобритания), анти- бета-Ш-тубулин (1:200, Cell Signaling, США), анти-цитокератин 18 (1:200, Cell Signaling, США), анти-циклин А (1:250, Santa Cruz Biotechnology, США), анти-геминин (1:250, Cell Signaling Technology, США), анти-yH2AX (1:200, Abcam, Великобритания) анти-Ki-67 (1:500, Abcam, Великобритания). В качестве вторичных антител использовались GAM и GAR Alexa Fluor ® 488 (1:500, Abcam, Великобритания).

2.4.2 Вестерн-блоттинг

Клетки были отмыты от остатков ростовой среды холодным PBS и лизированы в RIPA буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 1мМ ЭГТА, 50 мМ Трис-HCl 1мМ ЭДТА, 1% Тритона Х-100, 10% глицерина, 1мМ NaF, 1мМ Na3VO4, 0.5 мМ PMSF и фосфатазно-протеазный коктейль (1:100; Sigma, США) в течение 30 минут на ледяной подложке, установленной на механическую качалку, при температуре 4оС. Далее клетки механически снимались с чашек, полученная суспензия переносилась в эппендорф и выдерживалась при комнатной температуре на льду в течение 15 минут. После этого клетки были пропипетированы шприцом маленького объема для избавления от клеточных агрегатов. Затем клетки центрифугировались в течение 20 минут при 13000g. Часть отобранного супернатанта шла на анализ концентрации белка по методу Бредфорда. В оставшуюся часть был добавлен Лэммли буфер (40мМ Трис-HCl pH=6.8, 10% SDS, 20% ß-меркаптоэтанола и 40% глицерина) в соотношении 1:4. Пробы с Лэммли буфером были проинкубированы при температуре 99°С в течение 5 минут для того, чтобы обеспечить их денатурацию. Далее белки были разделены в соответствии с их молекулярными массами с помощью электрофореза в SDS-буфере в 10% полиакриламидном геле. Разделенные в геле белки были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra (Amsterdam Pharmacia Biotech, Швеция) для дальнейшей инкубации с антителами. Далее мембрана была промыта раствором T-TBS (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0.1% Tween-20, рН=7.6) 3 раза по 5 минут на механической качалке. Для блокирования сайтов неспецифического связывания мембраны инкубировались в 5% растворе сухого обезжиренного молока на T-TBS в течение часа. После отмывки от молока чистым T-TBS мембраны инкубировались с первичными моноклональными антителами: анти-циклин А (Santa Cruz, США), анти-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (Cell Signaling, США), анти-фосфорилированный белок ретинобластомы (Cell Signalling, США), anti-Ламин B (Cell Signaling, США), разведенными в 5% BSA на T-TBS концентрации 1:1000. Инкубация производилась в течение ночи при температуре 4°С. После отмывки мембран от

первичных антител они были инкубированы во вторичных антителах в течение 90 минут при комнатной температуре. В качестве вторичных антител были использованы антитела против кроличьих и мышиных иммуноглобулинов, конъюгированные с пероксидазой хрена (Cell Signaling, США). Количество белка интереса в пробах было визуализировано с ^пользованием реагента для реакции хемолюминесценции (SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity SubstrateL, Thermofisher Scientific, США) на ChemiDoc (Bio-Rad, США).

Для выделения и лизиса ядерной фракции клетки механически снимались с культуральной поверхности и оставлялись на льду на 10 минут. Затем образец центрифугировали при 40С при 3000 об/мин в течение 10 минут, полученный осадок содержал ядерную фракцию клеток. После этого осадок ресуспендировали в буфере RIPA и оставляли на льду на 20 минут. Затем лизат гомогенизировали путем двукратного пропускания через иглу шприца 27G и центрифугировали при 16000 g в течение 30 минут. Супернатант использовали для последующего электрофореза в SDS-полиакриламидном геле.

В работе использовались следующие первичные антитела: анти- бета-Ш-тубулин (1:200,), анти-цитокератин 18 (1:200), анти-phospho-pRb (Ser807/811, 1:1000), анти-циклин А2 (1:2000), анти-GAPDH (1:1000), анти-геминин (1:1000), анти-phospho-p53 (Ser15, 1:1000), анти-p21Waf1/Cip1 (1:1000), анти-phospho-ATM (Ser1981, 1:1000), анти-циклин D1 (1:1000) - все от Cell Signaling (США); анти-Emi! (1:1000), анти-ymAX (1:1000) - все от Abcam (Великобритания).

Денситометрический анализ проводили с использованием программного пакета ImageJ (US National Institutes of Health, США).

2.4.3 Количественный ПЦР

РНК выделяли из клеток с помощью набора RNeasy Micro (Qiagen, Хильден, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Количество РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, США). кДНК получали обратной транскрипцией с использованием набора RevertAid H Minus (Fermentas, США) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК амплифицировали с помощью специфических праймеров, используя краситель EvaGreen® (Biotium) и Dream-Taq™ PCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием амплификатора Bio-Rad CFX-96 (Bio-Rad, Япония). Экспрессию генов интереса нормализовали на актин либо GAPDH. Последовательности использованных праймеров приведены в таблице 2.2.

Таблица 2.2 - Последовательности используемых в работе праймеров.

Ген Последовательности праймеров Продукт (bp) Ссылка NCBI

GRP78 F 5' TAGCGTATGGTGCTGCTGTC 3' R 5' TGACACCTCCCACAGTTTCA 3' 117 NM 005347.5

HERPUD1 F 5' TCCAAAGCAGGAAAAACGGC 3' R 5' CCTCAGGATACTGTCCCCGA 3' 137 NM 014685.4

EDEM1 F 5' ACAACTACATGGCTCACGCC 3' R 5' AGATTTGAAGGGTCCCCGC 3' 91 NM 014674.3

DNAJC3 F 5' CCACACACCTTTCCTCCTCT 3' R 5' GCAGATCCACCAGGACTAGC 3' 113 NM 006260.5

DNAJB9 F 5' AGTCGGAGGGTGCAGGATATT 3' R 5' TTGATTTGGCGCTCTGATGC 3' 153 NM 012328.3

HSP47 F 5' ATGCAGAAGAAGGCTGTTGC 3' R 5' GGCCTTGTTCTTGTCAATGG 3' 117 NM 001207014.3

ACTIN F 5' GCACTCTTCCAGCCTTCC 3' F 5' AGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG 3' 385 NM 001101.5

2.4.4 Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла

Адгезивные клетки открепляли от культуральной поверхности с помощью 0.05% раствора трипсин-ЭДТА, суспендировали в полной среде DMEM/F12, обрабатывали 0.1% раствором Triton X-100 (Sigma-Aldrich, США) и добавляли на 5 мин 2 мкг/мл ДНК-интеркалирующий краситель DAPI (Sigma-Aldrich, США). Распределение по фазам клеточного цикла измеряли с помощью проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter, США; канал EX405/FL450) и анализировали с помощью программного обеспечения CytExpert 2.0.

2.4.5 Оценка жизнеспособности клеток

Адгезивные клетки открепляли от культуральной поверхности с помощью 0.05% раствора трипсин-ЭДТА, суспендировали в полной среде DMEM/F12, окрашивали в течение 10 мин раствором 40 мкг/мл йодистого пропидия (Sigma-Aldrich, США) и анализировали с помощью проточной цитометрии (CytoFLEX Beckman Coulter, США; канал EX488/FL610). Аналогичный протокол окраски и анализа клеток использовали для суспензионных культур.

2.4.6 Тест на апоптоз

Адгезивные клетки открепляли от культуральной поверхности с помощью 0.05% раствора трипсин-ЭДТА и суспендировали в среде DMEM/F12. Далее протокол был одинаковым для адгезивных и суспензионных культур - клетки суспендировали в буферном растворе и окрашивали с использованием йодистого пропидия (конечная концентрация 1 мкг/мл) и

раствора, содержащего аннексин V, конъюгированный с Alexa Fluor 647 (Invitrogen, США), в соответствии с инструкциями производителя. Апоптотические фракции клеток определяли с помощью проточного цитометра (CytoFLEX, Beckman Coulter, США; каналы EX488/FL610 и EX638/FL660) с последующим анализом в программе CytExpert 2.0 (Beckman Coulter). Аналогичный протокол окраски и анализа клеток использовали для суспензионных культур.

2.4.7 Оценка целостности ДНК клеток

Оценку целостности ДНК проводили 3 разными способами: визуализируя фокусы yH2AX с использованием конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (см. раздел 2.4), оценивая уровень фосфорилированной формы гистона H2AX методом Вестерн-блоттинга (см. раздел 2.5), определяя долю клеток с фокусами yH2AX методом проточной цитометрии.

Для проведения проточно-цитометрического анализа адгезивные клетки открепляли от культуральной поверхности с помощью 0.05% раствора трипсин-ЭДТА, дважды промывали PBS, а затем фиксировали и пермеабилизовали с использованием коммерческого набора Nuclear Factor Fix и Perm (BioLegend, США). Затем клетки обрабатывали антителами против yH2AX (1:200, Abcam, Великобритания) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте, после чего инкубировали с вторичными антителами против мышиных иммуноглобулинов Alexa Fluor 4BB (1:500) и DAPI в концентрации 1 мкг/мл в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Аналогичный протокол фиксации, пермеабилизации и обработки клеток антителами использовали для суспензионных культур. Тест на наличие фокусов yH2AX проводили с использованием проточного цитометра (CytoFLEX, Beckman Coulter, каналы EX488/FL525 и EX405/FL450).

2.4.8 Измерение скорости клеточного дыхания

Скорость потребления клетками кислорода измеряли с помощью кислородного электрода Кларка при температуре 37°C в термостатируемой инкубационной камере объемом 2 мл (CB1-D Hansatech). Клетки ресуспендировали в ростовой среде в концентрации 5*105 клеток/мл. Тестируемые вещества, а также агенты, ингибирующие дыхание, добавляли в суспензию непосредственно в ходе измерений.

2.4.9 Тест на экспрессию SA-ß-Gal

Активность Р-галактозидазы, ассоциированной со старением (SA-P-Gal), определяли в клетках с помощью набора Senescence P-Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology, США) в

соответствии с инструкциями производителя. Долю сенесцентных клеток определяли путем подсчета SA-ß-Gal -положительных клеток на изображениях, полученных с помощью световой микроскопии, с использованием программного обеспечения ImageJ (US National Institutes of Health, США). Для каждого образца было проанализировано не менее 500 клеток.

2.4.10 РНК-секвенирование

РНК-секвенирование проводили на базе ООО «Генотек» (г. Москва). Тотальную РНК выделяли из клеток в ходе трех независимых экспериментов. Экстракцию проводили с использованием набора ExtractRNA (Evrogen, Москва, Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Для синтеза кДНК использовался набор Mint-2 (Evrogen, Россия). ДНК-библиотеки были подготовлены с использованием набора NEBNext® Ultra™ для Illumina® (New England Biolabs, США) в соответствии с протоколами производителя. Секвенировали образцы на платформе Illumina HiSeq 2500. Наборы данных были сгенерированы в формате FASTQ.

2.4.11 Транскриптомный анализ

Результаты секвенирования были обработаны и выравнены на референсный геном человека (hg19/GRCh37) с помощью программы HISAT2 (версия 2.1.0) [Kim, Langmead, Salzberg, 2015], а подсчет прочтений осуществлялся с помощью StringTie [Pertea и др., 2015]. Анализ проведен с помощью программного пакета Ballgown, согласно алгоритму, описанному в [Pertea и др., 2016]. Анализ обогащенных сигнальных путей (BBID, BIOCARTA, EC_NUMBER, KEGG, REACTOME, OMIM) проводился с использованием платформы DAVID.

2.5 Статистический анализ данных

Все эксперименты повторялись не менее 3 раз. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием ANOVA-критерия Тьюки в случае множественных сравнений или t-критерия Стьюдента в случае парных сравнений. Значимыми считались значения p < 0.05. Степень линейной корреляции оценивали, основываясь на значении коэффициента корреляции Пирсона. Все проточно-цитометрические гистограммы и микроскопические изображения, представленные в работе, соответствуют наиболее репрезентативным экспериментам.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка и апробация методов для характеристики редокс-гомеостаза

стволовых клеток

Количественная и качественная характеристика клеточного редокс-гомеостаза - это основа для изучения окислительно-восстановительных взаимодействий в живых системах. К ключевым параметрам редокс-гомеостаза клеток относят уровень активных форм кислорода (АФК) в клеточных компартментах, соотношение между окисленными и восстановленными участниками редокс-пар клетки (NADШNAD+, NADPШNADP+, GSH/GSSH), а также активность ферментативных систем, контролирующих уровень АФК и редокс-статус клеточных молекул. Для определения ряда этих параметров в стволовых клетках человека в настоящем диссертационном исследовании были апробированы существующие и разработаны новые методики.

3.1.1 Флуоресцентные АФК-чувствительные красители

Использование редокс-активных флуоресцентных красителей является наиболее распространенным на сегодняшний день способом оценки внутриклеточного уровня АФК. Практически для каждого типа соединений, относящихся к семейству АФК, существуют специфические и неспецифические флуоресцентные зонды. В силу метаболических особенностей стволовых клеток, и в том числе - повышенной способности откачивать ксенобиотики и низкой толерантности к ним - протоколы для использования АФК-чувствительных красителей в экспериментах с клетками стволового фенотипа требуют уточнения. В настоящем разделе диссертационной работы были определены границы применимости двух флуоресцентных зондов, наиболее часто используемых для оценки уровня перекиси водорода и супероксид-аниона в живых клетках - H2DCFDA и гидроэтидина, соответственно.

3.1.1.1 Флуоресцентный зонд гидроэтидин

Гидроэтидин (англ. hydroethidine, НЕ) представляет собой синий флуоресцентный краситель, который, вступая в реакции с супероксид анионом O2-•, превращается в окисленный продукт, катион 2-гидрокси-этидия, а при взаимодействиях с другими представителями

семейства АФК - в катион этидия (см. раздел 1.3.1 обзорной главы диссертации). Оба продукта окисления НЕ флуоресцируют в красном спектральном диапазоне, но спектр их возбуждения отличается. Это обстоятельство позволяет использовать НЕ для специфической детекции O2-* в живых клетках с использованием приёма селективного оптического возбуждения. Краситель рутинно применяется в качестве супероксид-чувствительного зонда в проточно-цитометрических тестах на O2-*, однако ряд исследователей обращали внимание на потенциальную цитотоксичность продуктов окисления НЕ, которая может приводить к артефактам при оценке уровня O2-* в клетках [Benov, Sztejnberg, Fridovich, 1998; Olive, 1989]. Чтобы оценить пригодность НЕ для характеристики редокс-гомеостаза стволовых клеток человека был проведен цикл экспериментов с культурами мультипотентных мезенхимных стволовых/прогениторных клеток, выделенных из десквамированного эндометрия здоровых доноров (эМСК, линия 2304 [Zemelko и др., 2011]). Для сравнения полученных результатов с результатами для клеток других фенотипов использовались линии иммортальных клеток человека - А431 (эпидермоидная карцинома) и К-562 (эритробластоидная лейкемия).

А

Рисунок 3.1 - Митохондриальная локализация флуоресцентных продуктов окисления гидроэтидина в клетках К-562 и эМСК: стандартные протоколы окраски [Lyublinskaya и др., 2014]

(А) - клетка линии К-562 после окраски Rh123 (2 мкМ, 20 мин) и затем Ж (10 мкМ, 20 мин). (Б) - культуры эМСК, окрашенные Rh123 (5 мкМ, 20 мин) и затем обработанные Ж (10 мкМ, 60 мин); колокализация красителей свидетельствует о преимущественно митохондриальном накоплении продуктов окисления НЕ. А, Б: все изображения получены с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа; эксперименты проведены не менее 3 раз, на рисунках представлены результаты репрезентативных опытов;

масш. отрезок 10 мкм;

Сокращения и обозначения: эМСК, мультипотентные мезенхимные стволовые/прогениторные клетки эндометрия человека, линия 2304; Rh123, родамин 123 - митохондриальный краситель, маркер мембранного

потенциала митохондрий; НЕ, гидроэтидин.

Прежде всего, методом конфокальной флуоресцентной микроскопии исследовалась локализация продуктов окисления НЕ в клетках. Литературные данные на этот счёт противоречивы - ряд исследователей сообщали о митохондриальной локализации окисленного красителя, в то время как другие работы описывали интенсивное красное свечение ядер окрашенных клеток. Наши эксперименты показали, что при использовании стандартных протоколов окраски (НЕ 10 мкМ, 10-30 мин), продукты окисления красителя накапливаются в клеточных

митохондриях (см. рисунок 3.1), однако накопление этих продуктов приводит к быстрой деполяризации митохондриальных мембран (рисунок 3.2 А).

20 40 И

Время обработки НЕ; мин

I 1 I 1 1 р I 1 I < I 1 I 1 I

0 6 12 1S 24 30 36 42 4В

о

Омин

15мин

В

ЗОмин

Время; мин

45мин

бОмин

81 j 31 ft S11 31Й

/ \S2

/ \S2 / ч

1 \ А А

0 12 3 0 12 3 0 12 3 0 12 3 0 12 3

охНЕ. интенсивность флуоресценции (дл.волны 530 нм)

Рисунок 3.2 - Нарушение митохондриального гомеостаза, вызванное в клетках К-562 накоплением продуктов

окисления НЕ [Lyublinskaya и др., 2014]

(A) - уменьшение флуоресцентного сигнала Rh123 (0.5 мкМ, 20 мин) в клетках К-562, обработанных НЕ в разных концентрациях при использовании стандартного протокола окраски; метод: проточная цитометрия; сигнал отнормирован на начальное значение; снижение сигнала в зависимости от длительности обработки и

концентрации НЕ свидетельствует о падении митохондриального потенциала при накоплении продуктов окисления НЕ. (Б) - остановка клеточного дыхания, вызванная обработкой клеток НЕ в высокой концентрации.

(B) - флуоресцентный сигнал клеток К-562 при разных длительностях инкубации с НЕ (10 мкМ); метод: проточная цитометрия; при длинных временах окраски клеток появляется фракция ярко-флуоресцирующих

клеток (S2), что свидетельствует о НЕ-индуцированном нарушении внутриклеточного редокс-гомеостаза. А - Б: в качестве негативного контроля использовались клетки, обработанные ДМСО (растворитель для стокового раствора НЕ), на графиках представлены средние величины и стандартные отклонения (N=3).

Сокращения и обозначения: Rh123, родамин 123 - митохондриальный краситель, маркер мембранного потенциала митохондрий; OCR (oxygen consumption rate), скорость клеточного дыхания; NaCN, цианид натрия -блокатор клеточного дыхания; НЕ, гидроэтидин; oxHE, продукты окисления НЕ.

В случае нестандартных протоколов окраски (высоких концентраций НЕ или длительных инкубаций клеток с красителем), наработанные в клетке продукты окисления зонда вызывали митохондриальный коллапс, нарушали процесс клеточного дыхания и стимулировали разрушение митохондриальной сети (рисунки 3.2 Б и 3.3 В). Как показал проточно-цитометрический анализ, эти процессы сопровождались резким увеличением интенсивности сигнала в части окрашенных клеток из-за быстрого окисления НЕ в клетках с нарушенным митохондриальным гомеостазом. На цитометрических гистограммах, отражающих распределение клеток по интенсивности флуоресцентного сигнала, при значительном накоплении продуктов окисления НЕ появлялись артефакты - наблюдалось два пика и S2 -см. рисунок 3.2 В).

А

Рисунок 3.3 - Перераспределение из митохондрий в ядро флуоресцентных продуктов окисления НЕ в клетках эМСК и К-562 при длительной инкубации с красителем [Lyublinskaya и др., 2014]

(А) - культура эМСК после окраски Ж (10 мкМ) в течение 20 (слева) и 180 (справа) мин; (Б) - клетка линии К-562 после окраски Ж (10 мкМ) в течение 20 (слева), 60 (по центру) и 180 (справа) мин; паттерны окраски свидетельствуют о транслокации продуктов окисления НЕ из митохондрий в клеточное ядро в случае длительных инкубаций клеток с красителем. (В) - клетка линии К-562 после окраски Rh123 (2 мкМ, 20 мин) и затем Ж) (10 мкМ, 90 мин); паттерны окраски свидетельствуют о сокращении количества активных митохондрий и перераспределении продуктов окисления НЕ из митохондрий в клеточное ядро в случае длительных инкубаций с красителем. А - В: изображения получены с использованием конфокального микроскопа; эксперименты проведены не менее 3 раз, на рисунках представлены результаты репрезентативных

опытов; масш. отрезок 10 мкм.

Сокращения и обозначения: эМСК - мультипотентные мезенхимные стволовые/прогениторные клетки эндометрия человека, линия 2304; Rh123, родамин 123 - митохондриальный краситель, маркер мембранного

потенциала митохондрий; НЕ - гидроэтидин.

Таблица 3.1. Маркеры апоптоза (наличие пика 82 в цитометрических гистограммах клеток и фракции ЛиУ+ в тестах на апоптоз), обнаруженные после окраски НЕ клеток, обработанных различными модуляторами. Протокол окраски клеток НЕ - стандартный (10 мкМ, 30 мин)

Окраска НЕ Клетки Модуляторь1\. K-562 A431 эМСК

Пики S1/S2 AnV+ фракция Пики S1/S2 AnV+ фракция Пики S1/S2 AnV+ фракция

- Без модуляторов - - - - - -

+ S1 - S1 - S1 -

- Бессывороточное культивирование: 0% ФБС 48 ч - - - - - -

+ S1+S2 S2/AnV+ S1 - S1 -

- DPI: 1 мкМ 15 мин - - - - - -

+ S1+S2 S2/AnV+ S1+S2 S2/AnV+ S1+S2 S2/AnV+

- Ротенон: 5 мкМ 1 ч - - - - - -

+ S1+S2 S2/AnV+ S1+S2 S2/AnV+ S1 -

При этом, окисленный краситель терял митохондриальную локализацию, по-видмому из-за открытия неспецифической поры митохондриальной мембраны, и интеркалировал в ядерную ДНК (рисунок 3.3), а в клетках активировались программы апоптотической гибели (рисунок 3.4). Как показали цитометрические тесты на апоптоз, именно ярко-флуоресцирующие клетки (фракция S2 на рисунке 3.2 В) были AnV-положительными (рисунок П-3.1 в Приложении).

В случае, если используемые в экспериментах клетки (эМСК, К-562, А431) находились перед окрашиванием в нормальных физиологических условиях, стандартные протоколы окраски (HE 10 мкМ, 10-30 мин) не приводили к явной НЕ-индуцированной мито- и цитотоксичности. Однако в культурах с нарушенным редокс-гомеостазом стандартные протоколы часто работали некорректно. Так, AnV+ фракция клеток появлялась в тестах на апоптоз после окраски НЕ клеток, лишенных на 48 ч сыворотки, или предобработанных ротеноном (ингибитор комплекса I дыхательной цепи митохондрий) - в то время как в тех же культурах без обработки НЕ маркеры апоптоза отсутствовали. Во всех подобных случаях, НЕ-индуцированная активация апоптотических программ приводила к артефактам в цитометрическом тесте на O2-* - появлению пика S2 из-за повышенного окисления красителя в апоптотических клетках (таблица 3.1).

Более того, тесты, проведённые для клеток, предобработанных DPI (дифенилениодониум, ингибитор NOX-опосредованной продукции АФК) - агентом, который обычно используется для снижения продукции O2-* в клетках, - привели к аналогичному результату (рисунок 3.5 А).

Рисунок 3.4 - Индукция апоптоза в клетках К-562, вызванная накоплением продуктов окисления НЕ [ЬуиЪИшкауа

и др., 2014]

(А) - активация каспазы 3 после обработки клеток НЕ в высокой концентрации свидетельствует об индукции апоптоза в клетках с высоким содержанием продуктов окисления НЕ; метод: иммуноблоттинг. (Б) - фракция ЛпУ-положительных клеток после обработки НЕ, в зависимости от концентрации и длительности обработки красителем; метод: проточная цитометрия. А, Б: в качестве негативного контроля использовались клетки, обработанные ДМСО (растворитель для стокового раствора НЕ). Б: на графиках представлены средние величины и

стандартные отклонения (N=3), * р<0.05 (1-тест).

Сокращения и обозначения: БМЕО, диметилсульфоксид; ЛпУ, аннексин У-БПС - реактив, маркирующий

апоптотические клетки; НЕ, гидроэтидин.

В клетках, предобработанных DPI, после инкубаций с НЕ согласно стандартному протоколу окраски, активировались программы апоптоза и наблюдалось увеличение флуоресценции окисленного НЕ по сравнению с контрольными, не обработанными DPI, культурами. При этом, другие АФК-чувствительные красители (напр. H2DCFDA - см. рисунок 3.5 Б) не обнаруживали в этих условиях повышения уровня АФК в DPI-обработанных клетках, что подтверждает НЕ-индуцированный характер наблюдаемых явлений и указывает на некорректность результатов, полученных при использовании НЕ.

Таким образом, проведенные эксперименты обнаружили, что продукты окисления гидроэтидина, накопление которых обычно используется для количественной оценки внутриклеточного уровня супероксид-радикала, могут непредсказуемо влиять на клетки разного типа и физиологического состояния, вызывая нарушение функциональных свойств митохондрий, которые, как известно, являются одним из основных источников супероксида в клетке. Полученные результаты заставили нас в дальнейшем отказаться от использования гидроэтидина при определении уровня АФК в стволовых клетках человека.

Рисунок 3.5 - Сравнение результатов измерения внутриклеточного уровня АФК с использованием разных красителей (H2DCFDA и HE) в клетках К-562, предобработанных DPI, указывает на возможность возникновения артефактов при использовании НЕ [Lyublinskaya и др., 2014].

(А) - фракция AnV-положительных клеток, предобработанных DPI, после инкубации с НЕ согласно стандартному протоколу окраски (10 мкМ, 30 мин); метод: проточная цитометрия. (Г) - определение уровня АФК с использованием НЕ (10 мкМ, 30 мин) и АФК-чувствительного зонда H2DCFDA (10 мкМ, 30 мин) в

клетках, предобработанных DPI; метод: проточная цитометрия; результаты сравнительного анализа указывают на артефакты, возникающие при использовании НЕ для оценки внутриклеточного уровня АФК в DPI-обработанных клетках. А, Б: в качестве негативного контроля использовались клетки, обработанные ДМСО (растворитель для стокового раствора НЕ и DPI); на графиках представлены средние величины и

стандартные отклонения (N=3), * p<0.05 (t-тест).

Сокращения и обозначения: DMSO, диметилсульфоксид; AnV, аннексин V-FITC - реактив, маркирующий апоптотические клетки; DPI, дифенилениодониум, ингибитор NADPH-оксидаз - ферментов, продуцирующих

АФК; НЕ, гидроэтидин.

3.1.1.2 Флуоресцентный зонд H2DCFDA

Флуоресцеиновый зонд H2DCFDA (2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат) - АФК-чувствительный краситель, лидирующий по частоте использования в экспериментальной редокс-биологии. Исходная форма зонда излучательно неактивна и свободно проникает в клетку, где, подвергаясь деацетилированию внутриклеточными эстеразами и окислению, превращается в фуоресцентную производную - DCF (2',7'-дихлорофлуоресцеин, см. рисунок 3.6 А). DCF несёт на себе заряд и способен, благодаря этому, удерживаться клеткой. Согласно существующим представлениям, основным окислителем H2DCFDA является H2O2, однако, поскольку зонд всё же способен вступать в реакции и с другими представителями семейства АФК, его флуоресцентный сигнал принято считать мерой внутриклеточного уровня АФК в целом.

Рисунок 3.6 - Определение внутриклеточного уровня АФК в культурах ЭСК и эМСК с помощью редокс-чувствительного зонда H2DCFDA [Lyublinskaya и др., 2017]

(А) - схема внутриклеточных химических превращений АФК-чувствительного зонда H2DCFDA, а также его контрольной, АФК-нечувствительной версии DCFDA: образование флуоресцентного продукта DCF. (Б) -культуры эМСК, окрашенные H2DCFDA (10 мкМ, 30 мин); метод: флуоресцентная микроскопия, масш. отрезок 20 мкм. (В) - доля жизнеспособных клеток в культурах эМСК, окрашенных H2DCFDA (10 мкМ, 30 мин) через 4 ч после окраски; метод: проточная цитометрия, витальный краситель - йодистый пропидий. (Г) - интенсивность флуоресценции H2DCFDA-окрашенных клеток в культурах ЭСК, предобработанных Н2О2 (100 мкМ, 5 мин) или антиоксидантами (Темпол 0.5-5 мМ, 4ч; NAC 10мМ, 4ч); метод: проточная цитометрия. (Д) - интенсивность флуоресценции H2DCFDA- и DCFDA-окрашенных клеток в культурах ЭСК в зависимости от времени, прошедшего после окраски; метод: проточная цитометрия; снижение сигналов обоих красителей свидетельствует об активной откачке их флуоресцентных продуктов из стволовых клеток. Б, Д: эксперименты проведены не менее 3 раз, на рисунках представлены результаты репрезентативного опыта. В, Г: на графиках представлены средние