Рекомбинантные α-галактозидазы А и С, пектинлиаза и фитаза Penicillium canescens тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Фёдорова, Екатерина Александровна

  • Фёдорова, Екатерина Александровна
  • кандидат химических науккандидат химических наук
  • 2007, Москва
  • Специальность ВАК РФ02.00.15
  • Количество страниц 162
Фёдорова, Екатерина Александровна. Рекомбинантные α-галактозидазы А и С, пектинлиаза и фитаза Penicillium canescens: дис. кандидат химических наук: 02.00.15 - Катализ. Москва. 2007. 162 с.

Оглавление диссертации кандидат химических наук Фёдорова, Екатерина Александровна

Список русских и английских сокращений

Список латинских сокращений названий микроорганизмов

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Катализ», 02.00.15 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантные α-галактозидазы А и С, пектинлиаза и фитаза Penicillium canescens»

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10

ГЛАВА I. а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ 10

1. Природные галактозосодержащие соединения 10

1.1 Галактоолигосахариды 10

1.2 Галактоманнаны, галактоглюкомапнаны 11

2. а-Галактозидазы 14

2.1 Продуценты а-галактозидаз 14

2.2 Гликозил-гидролазные семьи а-галактозидаз 17

2.3 Биохимические свойства а-галактозидаз 17

2.4 Каталитические свойства а-галактозидаз 20

3. Применение а-галактозидаз 25

3.1 Кормовая промышленность 25

3.2 Пищевая промышленность 25

3.3 Целлюлозно-бумажная и текстильная промышленность 26 ГЛАВА II. ПЕКТИНЛИАЗЫ 27

1. Пектин 27

1.1 Основная цепь молекулы пектина 27

1.2 Боковые цепи молекулы пектина 29

1.3 Неуглеводные заместители в молекуле пектина 29

2. Пектин- и пектатлиазы 31

2.1 Структурная характеристика пектин- и пектатлиаз 33

2.2 Каталитические свойства пектин- и пектатлиаз 35

3. Применение пектина и пектинлиаз 37

3.1 Пищевая промышленность 37

3.2 Кормовая промышленность 39

3.3 Текстильная и целлюлозно-бумажная промышленность 39 ГЛАВА III. ФИТАЗЫ 41

1. Фитиевая кислота и её соли 41

1.1 Строение фитиевой кислоты 41

1.2 Содержание лшо-инозит фосфатов в растительном сырье 41

1.3 Физико-химические методы определения содержания фитиевой кислоты в образцах 43

2. Фитазы 44

2.1 Продуценты фитаз 44

2.2 Классификация фитаз 46

2.3 Биохимические свойства фитаз 50

2.4 Каталитические свойства фитаз 53

3. Применение фитаз^58

3.1 Кормовая промышленность 58

3.2 Пищевая промышленность 61

3.3 Медицина 62 ГЛАВА IV. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ PENICILLIUM CANESCENS

КАК ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ 63

ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 66

ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 66

1. Использованные вещества 66

1.1 Ферментные препараты 66

1.2 Субстраты 66

1.3 Прочие реактивы 67

1.4 Хроматографические сорбенты 68

2. Методы 69

2.1. Выделение и очистка индивидуальных ферментов P.canescens 69

2.2 Определение концентрации белка 71

2.3 Определение биохимических характеристик ферментов 71

2.4 Методы определения активности ферментов 71

2.4.1 Определение активности по полисахаридным субстратам 71

2.4.2 Определение активности по и-нитрофенильным производным Сахаров 72

2.4.3 Определение пектинлиазной активности 73

2.4.4 Определение фитазной и фосфатазной активности 75

2.5 Определение температурного и рН-оптимума действия ферментов 76

2.6 Изучение термо- и рН-стабильности ферментов 77

2.7 Определение кинетических параметров действия ферментов (Кт, Vm, К.) 77

2.8 Исчерпывающий гидролиз специфических субстратов 78

2.9 Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) продуктов гидролиза фитата Na 78

2.10 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза ГМ и галактоолигосахаридов 79

2.11 Изучение влияния эффекторов на активность ферментов 79

2.12 Изучении влияния соков желудочно-кишечного тракта свиней на свойства фитазы 80

2.13 Прикладные испытания ферментов 80

2.13.1 Оценка способности пектинлиазы осветлять яблочный сок 80

2.13.2 Изучение способности пектинлиазы увеличивать выход сока из ягод 81

2.13.3 Конверсия вторичного продукта переработки сои а-галактозидазами 81

2.13.4 Оценка способности ферментов увеличивать питательную ценность кормов /V vitro 82

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 83 ГЛАВА VI. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ а-ГАЛАКТО-ЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ НА ОСНОВЕ НОВЫХ

ШТАММОВ P.canescens 83

1. Создание новых конструкций на основе штаммов P.canescens 83

2. Характеристика ферментных препаратов, полученных с помощью штаммов P.canescens, несущих гены гомологичных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы 86 ГЛАВА VII. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ а-ГАЛАКТО

ЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ P.canescens 88

1. Выделение гомогенных ферментов 88

2. Свойства гомогенных ферментов 93

2.1 а-Галактозидазы А и С 94

2.1.1 Субстратная специфичность и классификация 94

2.1.2 рН- и температурные оптимумы активности 98

2.1.3 Стабильность 100

2.1.4 Устойчивость к «термошоку» 102

2.1.5 Кинетические характеристики 104

2.1.6 Влияние эффекторов на активность 1 Об

2.2 Пектинлиаза А 107

2.2.1 Субстратная специфичность 107

2.2.2 рН- и температурные оптимумы активности 109

2.2.3 Стабильность 110

2.2.4 Устойчивость к «термошоку» 110

2.2.5 Кинетические характеристики 112

2.2.6 Влияние эффекторов на активность 112 2.3 Фитаза А 114

2.3.1 Субстратная специфичность 114

2.3.2 рН- и температурные оптимумы активности 116

2.3.3 Стабильность 119

2.3.4 Устойчивость к «термошоку» 121

2.3.5 Кинетические характеристики 122

2.3.6 Влияние эффекторов на активность 122 ГЛАВА VIII. ПРИКЛАДНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ФЕРМЕНТОВ 129

1. Оценка эффективности применения ферментного препарата рекомбинантной

Пел А Р. canescens в процессах получения соков 129

1.1 Получение сока из клюквы 129

1.2 Осветление яблочного сока 131

2. Гидролиз вторичного продукта переработки сои ферментным препаратом рекомбинантной а-Гал С Р.canescens 132

3. Оценка способности ферментов Р.canescens повышать питательную ценность кормов in vitro 135

ВЫВОДЫ 142

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК РУССКИХ СОКРАЩЕНИЙ а.к. - аминокислота

БЦХ - бицинхопинантный реагент

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВС - восстанавливающие сахара

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография а-Гал - а-галактозидаза

-Гал - ß-галактозидаза

ГМ - галактомаппан

ГПХ - гельпропикающая хроматография

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

ИЭФ - изоэлектрофокусировапие

ИОХ - ионообменная хроматография кж - культуральпая жидкость

КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза

Ксил - ксиланаза

К.Ф. - классификация ферментов

ММР - молекулярномассовое распределение o.e. - единицы оптического поглощения

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГК - полигалактуроновая кислота (калиевая соль)

Пел - пектинлиаза и-НФ - и-нитрофенил иНФГ - и-нитрофенил-а-£>-галактопиранозид яНФФ - я-нитрофепил фосфат

САц - степень ацетилирования

СМ - степень метилирования

СП - степень полимеризации

СЭ - степень этерификации

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ТСХ - тонкослойная хроматография

Фит - фитаза

ЭГ - эндо-глюканаза

СПИСОК АНГЛИЙСКИХ СОКРАЩЕНИЙ

Fru - фруктоза

Gal - галактоза

Glc - глюкоза

Man - манноза

P¡ - неорганический фосфат

СПИСОК ЛАТИНСКИХ СОКРАЩЕНИЙ НАЗВАНИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ

A S

Arxula-Arx. Saccharomyces - Sac.

Aspergillus -A. Streptococcus - Str.

B T

Bacillus - B. Thermoanaerobacterium - Ther.

C Thermomyces - Therm.

Candida - Can. Thermologa - Th.

E Trichoderma - Tr.

Emericella - Em. Eschericia - E. K

Klebsiella-Kl. L

Lactobacillus - Lact. M

Mortierella - Mort. P

Pénicillium - P. Pichia - Pich.

Pseudoalteromonas - Pseud. R

Rhizopus - Rh. Rhodothermus - Rhod.

ВВЕДЕНИЕ

Промышленная технология ферментных препаратов начала активно развиваться в последней четверти XX века. К настоящему времени ферментные препараты стали мощным средством трансформации практически любого вида биологического сырья, формирования и контроля качества продуктов [1]. Применение ферментных препаратов в сельском хозяйстве, кормовой и пищевой промышленности позволило существенно повысить усвояемость кормов, расширить сырьевую базу кормопроизводства, увеличить глубину переработки пищевого сырья, а также улучшить органолептические свойства и создать новые виды пищевых продуктов.

Использование промышленных g-галактозидазных препаратов делает возможным более широкое использование различных соевых продуктов в качестве пищи животных и человека [2-4]. а-Галактозидазы применяются для модификации галактомапнанов с целью придания им требуемых в пищевом производстве реологических свойств, а также в процессах конверсии растительных отходов.

Добавка фитаз к кормам животных на основе семян является эффективным способом повышения доступности фосфора и, таким образом, позволяет сэкономить неорганический фосфат при составлении рационов и снизить содержание непереваренного фосфора на 30-60% [1, 5-10]. Применение промышленных фитазных препаратов улучшает костную минерализацию, усвоение белков и аминокислот в организме животных [11].

Пектинлиазные препараты незаменимы при переработке ягод, овощей и фруктов [12]. Пектинлиазы используют на разных стадиях технологических процессов изготовления пюре, соков с мякотью и осветленных соков. Широкое распространение эти ферменты получили в виноделии для стабилизации вин.

Ферментная промышленность выпускает большой ассортимент препаратов микробного происхождения. Значительную часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят с помощью культивирования микроскопических грибов. При этом все более значимое место занимают препараты на основе грибов рода Pénicillium. Рост интереса к этим продуцентам как к промышленно значимым объектам вызван тем, что Pénicillium sp. продуцируют внеклеточные ферменты широкого спектра действия, в том числе ксиланазы, целлюлазы, пектиназы, амилазы, фитазы, протеазы и др. Известны механизмы, с помощью которых можно добиться высокого уровня белковой секреции этими штаммами. Следует отметить безопасность их использования в пищевой и кормовой промышленности и в фармакологии.

В нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучаются состав и свойства внеклеточного ферментного комплекса мицелиалыюго грибного штамма Pénicillium canescens. Среди секретируемых им ферментов нами были обнаружены, в том числе, две а-галактозидазы различной специфичности, пектинлиаза и фитаза, однако уровень секреции этих ферментов оказался низким. Для получения препаратов с высокими содержанием перечисленных выше ферментов, пригодных для промышленного применения, совместными усилиями с нашими коллегами из Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН и из ФГУП ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов были созданы рекомбинантные штаммы P.canescens с повышенной продукцией собственных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы. Новые штаммы P.canescens содержали мультикопированные гены гомологичных ферментов под контролем сильных промоторов.

Целью данной работы явилось изучение биохимических, физико-химических характеристик и каталитических свойств рекомбинаптиых а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы, получепных на основе новых штаммов P.canescens, а также оценка эффективности их действия на природные объекты, содержащие галактоолигосахариды, галактоманнапы, пектины и фитаты.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести скрининг новых трапсформаптов P.canescens и выбрать среди них оптимальные для получения промышленных ферментных препаратов с высокими активностями а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы;

- разработать (оптимизировать) схему выделения в гомогенном виде рекомбинантных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы из ферментных комплексов, секретируемых новыми штаммами P.canescens-,

- исследовать свойства выделенных ферментов;

- разработать лабораторные методики оценки эффективности применения а-галактозидаз, пектиплиаз и фитаз в различных процессах переработки и модификации растительного сырья;

- с помощью разработанных методик оцепить эффективность применения а-галактозидаз, пектиплиазы и фитазы P.canescens (а также их смесей и препаратов на их основе) для нужд кормовой и пищевой промышленности, используя в качестве эталонов для сравнения коммерчески доступные промышленные а-галактозидазные, пектинлиазные и фитазные препараты.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА I. а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ 1. Природные галактозосодержащие соединения

Остатки £>-галактозы (см. рис. 1) существуют в природе в виде двух основных форм [13, 14]: во-первых, как звенья боковых цепей различных полисахаридов (р-1,4-маипанов и Р-1,4-глюкомаинанов, занимающих второе место по распространённости в древесине мягких пород деревьев после целлюлозы); во-вторых, как составляющая часть олигосахаридов (мелибиозы, раффинозы, стахиозы, вербаскозы и пр.). Олигосахариды, содержащие а-£)-галактозидные остатки, широко распространены у растений (в составе семян, корней, клубней) [4]. Также Л-галактоза входит в состав углеводной части гликопротеинов и гликолипидов.

Рисунок 1. Строение а-.0-галактозы.

1.1 Галактоолигосахариды

В молекулах олигосахаридов галактоза присоединена к невосстанавливающим концам молекул: мелибиоза (01с(а1,6)-0а1), раффиноза (Рги(а1,2)-01с(а1,6)-0а1), стахиоза (Рги(а1,2)-01с(а1,6)-0а1(а1,6)-0а1) [4, 15]. Самым распространенным галактозосодержащим олигосахаридом растений является раффиноза (см. рис. 2а, [4]). Многие растения содержат также более сложные олигосахариды, например стахиозу и вербаскозу. Последние имеют сходное строение (см. рис. 26).

Раффиноза, стахиоза и вербаскоза являются основными олигосахаридами сои [16]. Необработанные соевые бобы содержат 0.38 и 3.34% сухого веса раффинозы и стахиозы, соответственно [3]. Сухое соевое молоко содержит 10.25, 1.33 и 8.47% по массе сахарозы, раффинозы и стахиозы, соответственно [17]. а) б)

СНгОН

ОН

-а н

ОН О

ОН

-а ноне

О. щон ш он он н он он щ ш4

I/ он

-О н он он он ОН щ

СИзОН он н ноне о. он

НС)\ сцон

ОН он п

Рисунок 2. Строение раффинозы (а), стахиозы и вербаскозы (б); п=1-2.

1.2 Галактоманнаны, галактоглшкоманнаны

Галактоглюкоманнан/О-ацетилгалактоглюкоманнан - преобладающий (до 25% сухого веса) компонент гемицеллюлоз мягких (хвойных) пород деревьев, см. табл. 1. Основная цепь галактоглюкоманнаиа сформирована Р-1,4-связанными остатками £)-маннопиранозы и £>-глюкопиранозы, а боковые цепи -а-1,6-присоедипенными остатками £)-галактозы. Кроме того, в среднем каждое четвёртое звено основной цепи (0-глюкопираноза) ацетилировано по С-2 или С-3 атомам. Выделяют два типа галактоглюкоманнанов: с высоким и низким содержанием галактозы. В первом, составляющем 5-10% сухой массы хвойной древесины, соотношение «галактоза : глюкоза : мапноза» можно представить как 1:1:3; во втором, составляющем 10-15% от сухой массы хвойной древесины, - как 0.1:1:4 [ 18-20].

Таблица 1. Состав галактоглюкоманнанов мягких пород деревьев [19].

Содержание, Состав мономеров

Галактоглнжоманпан % от массы Гликозидныс Соотно- Тип присо- 6 СП6 сухой древесины остатки шение единения

Р-О-Мап ра 3 1->4

Растворим в воде 5-10 р-£М31с р 1 1—+4 >100 сх-0-Са1 р 1 1->6

О- Ас 0.24 р-£>-Мап р 3 1—+4

Растворим в щелочи 10-15 р-£М31с п 1 1—+4 >100 а-Я-ва! р 0.1 1—6

О-Ас 0.24

Подчеркнуто звено основной цепи б«СП» - степень полимеризации

Галактоманнан («ГМ») имеет сходную, но более простую структуру [18, 20, 21]. ГМ представляют собой гетерополисахариды, построенные из остатков D-галактозы и D-маппозы. Основная цепь ГМ состоит из р-1,4-связанпых остатков D-маннозы, а боковые ветви - из единичных звеньев D-галактозы, присоединённых а-1,6-связями (см. рис. 3). Главная цепь макромолекул ГМ построена, как правило, из мапнозных остатков двух типов: C-4-замещённых и С-4,6-дизамещённых. ГМ в изобилии присутствуют в эпдосперме и зрелых семенах растений [21-23]. Например, они обнаружены в семенах растений из 11 семейств: Annonaceae, Compositae, Comolvulaceae, Ebenaceae, Fabaceae, Lagoniaceae, Malvaceae, Palmae, Solanaceae, Tiliceae, Umbelliferae и, возможно, Cuscutaceae. Особое положение занимают ГМ семейства бобовых (Fabaceae), поскольку на их долю приходится более 90% общего числа исследованных ГМ (см. табл. 2) [24]. В семенах растений ГМ выполняют энергетическую (при прорастании), водоудерживающую (при набухании семян) и защитную функции. Энергетическая функция является основной, поэтому ГМ относятся к группе запасных полисахаридов [24]. Важнейшей характеристикой ГМ, определяющей их физико-химические свойства (плотность, растворимость, вязкость растворов и др.), является соотношение числа маннозных и галактозиых остатков («М:Г») в полимерной молекуле [21, 24]. Этот параметр сильно варьирует в зависимости от источника галактоманнаиа. Так, у ГМ бобовых соотношение «М:Г» варьируется от 1:1 до 5.7:1 (т.е. максимальное содержание галактозы - 50%, а минимальное - 15%), а ГМ некоторых пальм описываются соотношением «М:Г» 50(или 90): 1 (их иногда относят к манпапам).

Отсутствие прочной связи с другими полимерами клетки позволяет извлекать ГМ водной экстракцией. Измельчённые тем или иным способом семена бобовых экстрагируют холодной или горячей водой, после чего полисахариды осаждают этиловым спиртом [24]. В настоящее время в промышленном масштабе производятся три ГМ: из эндосперма семян бобового растения, повсеместно выращиваемого в Индии и Пакистане, - Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub, (гуар) - получают гуараи (guar gum); из плодов Ceratonia siliqua (кароб, рожковое дерево) - карубин (locust bean gum), а из плодов Caesalpinia spinosa L. (дерево тара) получают - в меньших объёмах - тарагалактоманпан (tara gum) [24-26]. Карубин является нейтральным, не образующим гелей полисахаридом с соотношением «М:Г» 3.5-3.8:1 [27, 28]. Степень полимеризации («СП») молекул гуарана больше, чем СП тарагалактоманпаиа, и оба они превышают по СП молекулы карубина [29].

D-Гал i 6 a аН| iD-MaHi m n

Рисунок 3. Схема строения галактоманпанов («классическая»); т - число незамещенных остатков маннозы, может принимать значения от 0 до 4; и - степень полимеризации [24].

Таблица 2. ГМ семян некоторых видов семейства Fabaceae Lindl, или Leguminosae Juss [241.

Вид растения, таксон Выход, % Соотношение £>-маннозы и £>-галактозы

Подсемейство 1. Caesalpinioideae - цельзапиниевые

Caesalpinia cacalaco Humb et Bonpl. 23 2.5

Gleditsia amirphoides Taub 30 2.5

Gleditsia ferox Desf. - 3.8

Cassia alata L. - 2.69

Senna multijuga 23 2.3

Подсемейство 2. Mimosoideae - мимозовые

Lagonichium (Prosopis) farctum 14.2 1.97

Mimosa platyphylla Benth 18.5 0.9

Prosopis cineraria (L.) Druce - 4.65

Подсемейство 3. Faboideae - мотыльковые

Clotalaria verrucosa L. 17.2 2

Sesbania aegyptiaca Poiret 23.3 1.66

Indigofera tinctoria L. 21.3 1.66

Galega orientalis Lam. 11.0 1.07

Anthyllis vulneraria L. 1.8 1.32

Triflorium pretense L. 3.5 1.28

2. а-Галактозидазы

В 1895 году из дрожжей был выделен фермент, способный гидролизовать дисахарид мелибиозу, названный мелибиазой [30, 31]. Позднее, изучение специфичности действия этого фермента на различные углеводные субстраты, содержащие концевые а-О-галактозидные группы, дало основание Вайденхагену изменить название «мелибиаза» на «а-галактозидаза» [4]. а-Галактозидазы (а-Л-галактозид галактогидролазы, КФ 3.2.1.22) катализируют реакцию гидролиза а-1,6-присоединённых галактозных остатков во многих субстратах, включая линейные и разветвлённые олигосахариды, полисахариды и синтетические субстраты [18,20,31-33]. Схема реакции гидролиза представлена на рис. 4.

Рисунок 4. Схема реакции гидролиза, катализируемой а-галактозидазами.

2.1 Продуценты а-галактозидаз

К продуцентам а-галактозидаз относятся большое число микроорганизмов (микроскопические грибы, дрожжи, бактерии), множество растений и ряд животных. а-Галактозидазы широко представлены в растительном мире (табл. 3 [17, 18, 32, 34]). Высокая а-галактозидазпая активность наблюдается в прорастающих семенах [35], где а-галактозидазы осуществляют конверсию олигосахаридов раффинозной семьи. Авторами [17] было продемонстрировано, что при прорастании бобов количество олигосахаридов раффинозной группы уменьшается. Одновременно с этим увеличивается содержание фруктозы, что подтверждает гидролиз фруктозо-содержащих олигосахаридов. Другая функция а-галактозидаз растений - это участие в модификации текстуры созревающих плодов. Например, при созревании папайи (Carica papaya L.) существует прямая корреляция между содержанием и активностью собственной а-галактозидазы и потерей фруктом твёрдости [36].

Большое число исследований посвящено а-галактозидазам микроорганизмов. Среди них основная часть работ касается внеклеточных ферментов, в том числе, а-галактозидаз, секретируемых грибными штаммами родов Aspergillus, Penicililum, Thermomyces, Trichodema (см. табл. 3).

Таблица 3. Свойства а-галактозидаз из различных источников.

Источник I Тип, Мг(кДа)" Pl Оптимум Гидр. Лите

1 семья pH Т,°С субстр. ратура

Грибы

Absidia corymbifera 36 82 [37]

A.awamori 4.7 [2]

A.awamori NRRL 4869 36 5.0 60 О6 [3]

A.ficuum NRRL 3135 -/70.8/- 6.0 60 [38]

A.fumigatus IMI 385708 27/36 [39]

A.niger a-Gal I AglC,36 350/94/-80 4.15 4.5 60 О a-Ga! II a-Gal III AglB,27 AglB,27 I17/64/-52 117/64/-52 4.5 1.7 4.5 4.5 60 60 ГМ>0° ГМ>0 [18,14] a-Ga! IV AglB,27 117/64/-52 4.8 4.5 60 ГМ>0

A.niger a-Gal I AglB,27 -/67.5/~54 4.2 4.5 50-55 0>ГМ a-Gal II AglB,27 -/67.5/~54 4.4 4.5 50-55 0>ГМ [2,40] a-Gal III AglB,27 -/66/~54 4.6 4.5 50-55 0>ГМ

Art/gerNRRL 326 27/26 5.0 55-60 [3]

A.niger Novozymes ALPHA-GAL 27/36 4.0 50 [41]

A.niger AglC,36 -/79.7/102.3 4.56(т.)г, 4.15(э.) [20]

A.niger AglB,27 -/54/48.8 4.6(т.), 4.2,4.4, 4.6(э.) [14]

A.oryzae NRRL 447 27/36 4.5-5.0 50-55 [3]

A.tamarii a-Gal I 265 a-Gal II a-Gal III 254 -/56/- 4.8 ГМ,0 [42,43]

Candida guilliermondii H-404 a-Gal I a-Gal II 270/64/270/64/- 6.16 6.21 [44, 45]

Cladosporium cladosporodies (Fres.) de Vr. 7.0/5.0Д О [33]

Mortierella vinacea 27 60/51-62/41.3 ГМ,0 [46,47]

P.purpurogenum 27 -/67/- 4.1 ГМ,0 [48,2]

P.ochrochloron 57.5/60.2/- 4.5 50 [26]

P.simplicissium, a-Gal I a-Gal II a-Gal III 27 ГМ,0 О ГМ,0 [30, 15]

Therm. lanuginosus 27 57 5.2 4.5-5.0 65-70 о,гм [13,49]

Tr.reesei RUT C-30 50/50/- 5.2 4.0 60 ГМ,0 [2, 50]

Бактерии

Bacillus ovatus a-Gal I a-Gal II 255/85/241.5/80.5/- 5.9-6.4 6.3-6.5 [51]

B.stearothermophilus 246/82/- 7.0-7.5 60 [51]

320.9/80.3/- 6.0-7.5 75 [32,51]

Bifidobacterium sp. 27/36 О [521

Eschericia coli 36 -50 6.8 37 [51,53]

E.coli Raf A 36 324.8/81.2/- 7.2 80-85 [51]

E.coli Mel A 36 101.2/50.6/- 8.1 [51]

Lactobacillus salivarius 36 80/80/- 5.5-6.0 50 [51]

Источник Тип, семья Mr (кДа)" Pi Оптимум Гидр, субстр. Литература pH Т,°С

Pseudoal tero monas sp. KMM701 36 195/-/- 6.7-7.7 Í54]

Pseud.fl uorescens AglA,27 46/46/45,9 8.2 50 ГМ>0 [22]

Руспороги.ч cinnabarinus 210/52/- 5.0 75 о [55]

Rhodothermus marinus 200/50/- 8.5 85 ГМ>0 Г31]

Rhizopus oligosporus 27/36 5.0 55 [3]

Streptococcus mutans 36 320/80/82.022 6.5 80-85 [51,56]

Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum 36 176/-80/- 8.0 77.5 0 [51]

Th. maritima 27/36 124/62/63.6 5.0-5.5 90-95 0 [31,32,51,57

Th.neapolitana 5068 36 61/61/- 7.0-7.5 100-105 [51]

Th.neapolitana NS-E 36 61/61/- 7.0 93 [51,58,59]

Thermus sp. T2 36 >400/55/53.5 6.0 75 ГМ,0 [32]

Thermus brockianus 36 Тетрамер/-/53.8 5.5-6.5 90-93 О(только) [31,32,60]

Дрожжи

Sac.carlsbergensis f 300/150/- [45]

Растения

Carica papaya (папайя) ^ а-ОаШ(мажор) 170/52/- 7.3 [36]

Coffea arabica (кофе) f 27 -/41/- [61,62]

Cucumis meló L. (дыня) a-Gal I a-Gal II 36 36 -/83/82.8 -/84/84.6 7.5-8.5 7.5-8.5 40 40 О О [23]

Glycine max L. (соя) PI P2 27/36 33 31 и 33 5.0 5.5 45 50 О О [17,34]

Lens culinaris (чечевица) a-Gal I a-Gal II 160/40/40 8.0 6.1 4.7 [63]

Lycopersicon esculentum (томат) 27 39.8 4.91 [35]

Oryza sativa (рис) 27/36 40 45 [64]

Phaseolus aureus (золотистая фасоль) тетрамер [65]

Phaseolus vulgaris (фасоль) 27 149.3/38.6-39.6/- [17,66]

Sesbania margínala (сесбания) I II 27/36 40 160 [17]

Trifolium repens (белый клевер) a-Gal I a-Gal II a-Gal III a-Gal IV 41-43/41-43/-/41/ /41/ /41/ 5.5 3.6-4.4 4.2-4.8 4.2-4.6 О ГМ,0 ГМ,0 ГМ,0 [21]

Vigna unguiculata (фасоль) 33 Г17]

Vitis labruscana (виноград) J 40-45 7.0 [67]

Человек

Homo sapiens (плацента) А В 27 27 103/57.7/ 117/47.7 4.7 4.4 4.4 4.4 [68] а) Молекулярная масса, определенная по данным гельфильтрации/ДДС-фореза/теоретических расчетов (на основании анализа аминокислотного состава) б) О - олигосахариды в) ГМ>0 - фермент более активен по отношению к полимерным галактоманнанам, чем по отношению к олигосахаридам г) т-теоретические данные (на основании анализа аминокислотного состава), э - экспериментальные данные д) рН-профиль активности определяли по гидролизу иНФ-а-О-галактопиранозида/мелибиозы

2.2 Гликозил-гидполазпые семьи а-галактозидаз

На основании сходства первичной структуры и гидрофобного кластерного анализа большинство а-галактозидаз были отнесены к двум различным семьям гликозил-гидролаз - 27-ой и 36-ой. Практически все а-галактозидазы эукариот, включая AglA и AglB A.niger, принадлежат 27-ой семье. 36-ая семья в основном состоит из бактериальных а-галактозидаз, а также некоторых ферментов грибного происхождения, например AglC A.niger и Agl2 T.reesei [14]. а-Галактозидазы 27-ой семьи проявляют высокую степень гомологии а.к. последовательностей; а ферменты 36-ой семьи - низкую [23, 32] (за исключением AglC A.niger и Agl2 T.reesei, для которых гомология составляет 64% [14]). Сравнение ферментов 27-ой и 36-ой семей показало, что они отдалённо родственны и образуют суперсемью (superfamily) [18,22,23,32].

Сравнительно недавно в литературе стала появляться информация о существовании а-галактозидаз, которые - согласно филогенетическому анализу на основе аминокислотных последовательностей - пе могут быть отнесены ни к одной из двух вышеупомянутых семей гликозил-гидролаз. К таким ферментам относится а-галактозидаза Agl3 Tr.reesei, не содержащая консервативных областей ни 27-ой, ни 36-ой семьи [28]. Другой пример - группа щелочных а-галактозидаз растений, гены которых проявляют низкую гомологию с известными про- и эукариотическими а-галактозидазами, принадлежащими 27-ой и 36-ой семьям, по высоко гомологичны семье т.п. «белков набухания семян» (seed imbibition proteins, «SIP»): степень гомологии внутри кластера «щелочные а-галактозидазы/SIP» составляет порядка 56-76%. Эта, до сих пор практически не охарактеризованная а-галактозидазная семья растительных гликозил-гидролаз с пейтралыю-щелочиым pH-оптимумом, участвует в ключевом процессе метаболизма галактозилолигосахаридов, происходящем во время прорастания семян и транслокации первичных продуктов фотосинтеза олигосахаридов раффинозпой группы [23].

2.3 Биохимические свойства а-галактозидаз

Молекулы бактериальных а-галактозидаз, как правило, обладают большим размером (50-80 кДа), чем молекулы грибных (40-50 кДа) и растительных (30-40 кДа) ферментов (см. табл. 3, [4,13]).

У большинства ферментов 36-ой семьи гликозил-гидролаз (например у а-галактозидаз Str.mutans и Raf A E.coli) молекулярная масса мономера составляет -80 кДа. Они - вместе с другими а-галактозидазами, молекулярная масса которых -80-85 кДа объединены в одну группу бактериальных а-галактозидаз. Молекулы представителей другой группы характеризуются меньшими массами ~50-65 кДа. Большинство ферментов второй группы были выделены из экстремально термофильных бактерий, растущих при Т>80°С, - в основном из родов Thermus и Thermotoga [31, 51]. а-Галактозидазы растительного происхождения обычно представлены двумя формами: высокомолекулярной 120-170 кДа и низкомолекулярной 20-50 кДа (например, a-Gal II Carica papaya [36], a-Gal I Lens culinaris и а-галактозидаза Phaseolus vulgaris), в то время как для микробных а-галактозидаз характерна лишь одна молекулярная форма (как, например в случае ферментов Lact.salivarius [51], P.ochrochloron [26], Mort.vinacea [46, 47], Tr.reesei [50], Thermotoga sp. [32], Ps.fluorescens [22]). Однако существует ряд исключений из этого правила. К таковым относится, например, ферменты грибного происхождения - a-Gal II, III и IV A.niger, гомогенные по данным хроматографии на сефадексе G-200 и ДЭАЭ-целлюлозе, по распадавшиеся на две активные формы при прохождении через колонку с карбоксиметилцеллюлозой [4, 14, 18]. К тетрамерам среди грибных а-галактозидаз относятся a-Gal I A.niger и a-Gal I и II Can.guilliermondii [14, 18, 44, 45]. Результаты исследований бактериальных а-галактозидаз дают основание утверждать, что молекулы а-галактозидаз Mel A E.coli, Th. maritime и Ther.polysaccharolyticum - димеры [31, 51, 57], молекулы a-Gal I и II B.ovatus, а также фермента B.stearothermophilus построены из трёх субъединиц [51], а-галактозидаз E.coli К-12, Raf A E.coli и Str.mutans [51, 56] - из четырех субъединиц, а а-галактозидаза Thermus sp. Т2 - вообще октамер [32]. Олигомерная структура доказана и для дрожжевой а-галактозидазы Sac. carlsbergensis.

Большая часть описанных грибных а-галактозидаз - кислые белки, значения р! которых лежат в слабокислой области pi 4-6 (см. табл. 3). Среди ферментов растительного происхождения встречаются представители с щелочным значением pi: например, a-Gal II Lens culinaris (чечевица) с pi 8.0 [63], а также а-галактозидазы 36-ой семьи гликозил-гидролаз - a-Gal I и II Cucumis meló и Cucumis sativus (дыня), а-галактозидаза Zea mays (кукуруза, [http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/fam/GH36.html], [4]). а-Галактозидазы являются, как правило, гликопротеинами [2]. Степень гликозилирования и состав углеводной части зависит от происхождения фермента. Так, например, а-галактозидаза Sac.carlsbergensis (степень гликозилирования 57%) содержит в составе углеводного компонента маннозу (90-95%), глюкозу (7%) и глюкозамин (~1%) [42]. а-Галактозидаза A.niger также является гликопротеином и содержит маннозу и N-ацетилглюкозамин в соотношении 3:1. Изучение связи между белковой и углеводной

частью молекулы этого фермента указывает на то, что белковая часть молекулы связана с N-ацетилглюкозамином через остаток аспарагина [69]. Фермент из семян чечевицы Lens culinaris - гликопротеин, гликозидная часть которого содержит глюкозу и маннозу и связана с белковой частью также через аспарагин [63]. a-Gal I, II, III из A.tamarii являются гликопротеипами и содержат N-ацетилглюкозамин, маннозу и галактозу в молярной пропорции 1:6:1.5 [45].

Целый ряд исследований указывает па присутствие в молекулах а-галактозидаз дисульфидных S-S связей, образуемых SH-группами. Подтверждением служит тот факт, что ферменты полностью ингибируются ионами Ag+, Hg+ [4, 3, 13, 59], а также хлормеркурибензоатом.

Температурный оптимум активности большинства грибных а-галактозидаз лежит в диапазоне 50-60°С, растительных - в диапазоне 40-50°С, в то время как среди бактериальных ферментов, например из Thermoanaerobacterium sp., не редко встречаются термофильные с температурным оптимумом 75-105°С (см. табл. 3). рН-Оптимум активности бактериальных а-галактозидаз лежит в слабощелочной области значений рН 6.0-8.5, а для грибных и дрожжевых ферментов характерен кислый рН-оптимум активности (рН 3.5-5.0). Ферменты растительного происхождения проявляют максимум активности как в кислой, так и в щелочной области (от рН 4.2 до рН 8.5). Интересно, что а-галактозидаза Physarum polycephalum обладает двумя рН-оптимумами активности (при значениях рН 3.5 и рН 6.75 [70]). По предположению авторов это указывает на наличие двух молекулярных форм фермента.

Наибольшую стабильность а-галактозидазы обнаруживают при температурах 30-50°С и рН 4-5. Однако в литературе встречаются примеры более термо- и рН-стабильных ферментов: так, а-галактозидаза термофильного микромицета P.duponti при 60°С сохраняла активность в течение 2 ч [71]. Самыми термотолерантными являются а-галактозидазы бактериального происхождения. Фермент из Th.polysaccharolyticum при рН 7.0 через 36.5 ч сохраняет 88% исходной активности при 65°С, и 84% - при 70°С [51]. а-Галактозидаза Th.neapolitana сохраняет 75% активности после инкубации в течение 4 ч при 80°С [58]. Период полуинактивации а-галактозидазы Thermus .brockianus ITI360 при 80°С оказался равным 17 ч, а при 92°С - 1.5 ч, для ферментов Th.maritime и Th.neapolitana 5068 этот показатель при 85°С составил 6.5 и 9 ч, соответственно [57, 59].

2.4 Каталитические свойства а-галактозидаз

Установлено, что для проявления активности а-галактозидазой субстрат должен удовлетворять двум основным требованиям: наличию пиранозного кольца и соответствию расположения -Н и -ОН групп при С-1, С-2, С-3 и С-4 атомах a-D-галактозной конфигурации (см. рис.4). Этим требованиям отвечают такие соединения, как, например: синтетические производные D-галактозы (метил-, этил-, фенил-, о/л/лмштрофенил- и 4-метилумбеллиферил-а-/)-галактопирапозиды), галакто-олигосахариды (мелибиоза, раффиноза, галакипол, стахиоза, лихиоза, вербаскоза), а также галактомапнаны, галактолипиды, вещество крови В [4,13, 61, 72] и пр.

Существуют две схожие системы классификации a-галактозидаз в соответствии с субстратной специфичностью. Согласно первой системе, a-галактозидазы могут быть разделены на две группы. В первую группу входят ферменты, проявляющие активность только по отношению к олигосахаридам с низкой СП (мелибиоза, раффиноза, стахиоза и фрагменты прогидролизованпых галактоглюкомапнанов). К ним относятся а-галактозидазы 36-ой семьи гликозил-гидролаз. Ко второй группе относят ферменты, активные по отношению к полимерным субстратам (при гидролизе которых может выпадать полимерный осадок [13,21, 49]). При этом они, как и a-галактозидазы из первой группы, могут гидролизовать «короткие» олигосахариды. Это ферменты 27-ой семьи гликозил-гидролаз [13, 18, 31]. По другой системе классификации эукариотические а-галактозидазы могут быть разделены на три группы. В первую группу входят ферменты (например, бактериальная a-галактозидаза Thermus sp., a-Gal I Morí.vinacea и a-галактозидазы дрожжей), действующие только па «концевые» a-галактозидные группы (присоединённые с невосстанавливающего конца молекулы ГМ). Ферменты из второй группы (например, a-галактозидазы P.purpurogenum и A.niger) гидролизуют только «внутренние» a-галактозидные остатки [32]. Последняя группа содержит ферменты (например, AGL I P.simplicissium, a-Gal II M.vinaceä), действующие па оба типа галакгозных групп [15, 32, 46]. В целом, на специфичность а-галактозидаз, гидролизующих полимерный субстрат, влияют два фактора: соотношение мопомерных звеньев «М:Г» в полисахариде и распределение остатков галактозы вдоль главной (маннозной) цепи ГМ [24]. Добавим, также, что различия в субстратной специфичности и активности ферментов из разных гликозил-гидролазных семей могут быть обусловлены особенностями третичной и четвертичной структуры их молекул. Так, большинство ферментов 36-ой семьи (например, AGLII Tr.reesei) - преимущественно крупные белки с тетрамерной структурой, а а-галактозидазы 27-ой семьи, как правило - мономеры небольшого размера [18],

Для определения активности а-галактозидаз используют как природные (мелибиоза, раффиноза и стахиоза), так и синтетические (и-нитрофенил- и 4-метилумеллиферил-а-О-галактопиранозиды) субстраты. Однако наиболее часто используемым («модельным») субстратом для определения а-галактозидазной активности является л-нитрофенил-а-Д-галактопиранозид («гсНФГ»). Как правило, гидролиз лНФГ протекает по простой кинетической схеме, описываемой уравнением Михаэлиса-Ментен (Кт по иНФГ для а-галактозидаз из различных источников варьируют в пределах 0.05-10 мМ, а значения Ут -в пределах 0.1-30 мкМ/с, см. табл. 4). Однако отмечались случаи более сложной кинетики, не подчиняющейся классическому уравнению (например, в случае а-галактозидаз из A.niger и АЛатаги, для которых наблюдалось ингибирование субстратом при концентрациях выше 1.26 мМ) [45].

Помимо гидролазной а-галактозидазы могут обладать трансферазной активностью, т.е. способностью осуществлять реакцию переноса галактозного остатка на молекулу акцептора, которыми могут быть как углеводы, так и другие соединения (спирты, фенолы). Следует отметить, что трансгликозилирование обычно проявляется в заметной л | степени при достаточно высоких (10" -10' Ми выше) концентрациях акцептора. В 1979 г. Дей предложил следующую схему трансгалактозилазной активности а-галактозидазы сладкого миндаля [4]:

Гликозил—О-И + Е-Н ->■ Гликозил—Е + Я-ОН

Донор Фермент Промежуточный продукт

Гликозил—Е + Я'-ОН-*- Гликозил-О-Я' + Е-Н

Акцептор Продукт

Дейем также была высказана мысль о возможности катализа реакций переноса тем же центром фермента, который отвечает за его основную (гидролазную) активность, и по тому же механизму действия. Это подразумевает соответствующую модель активного центра фермента: он должен иметь два галактозо-связывающих сайта, а так же гидрофобный сайт [73].

Приведем некоторые известные из литературы примеры трансгликозидазной активности а-галактозидаз. а-Галактозидаза дрожжей, действующая на

Продуцент иНФ-a-D-Gal p оНФ-a-D-Gal p ГМ" Мелпбпоза Раффиноза Стахноза Лнтее

A'm, MM Vm Km, мМ vm A'm vm Km, мМ Ут Кт, мМ vm Кт, мМ У,п ратура

Грибы

A.ficitum 1.462 0.839 [381

A.niger a-Gal I 1.4 1800 6 1 1600 6 a-Gal II 0.22 3600 6 0.39 65 6 [18] a-Gal III 0.27 3000 6 Н.о н.о. a-Gal IV 0.24 2000 6 Н.о н.о.

A. tam art i a-Gal III 1.3 505" 26.3 80' 33.3 1.1° [45]

Therm, lanuginosus 0.5 49.8 r 2.4 2.3 г 11.3 32.4г [13]

Бактер in

В. ovatus a-Gal I a-Gal II 0.2 0.4 20.8 2.3 98.1 5.9

B.stearothermophilus 0.38 12 16.4

E.coli 1.07*10"4 2.33*10"3 3.65*10"4 [51]

E.coli Raf A 0.14 60

E. coli Mel A o j 10

Lact, sal ivarius 0.25 193°

Pseudoalteromonas sp. KMM701 0.29 [54]

Str. mutans 4.4 9.1 197

Ther.polysaccharolyticum 0.29-0.345 200-232B [51]

Th.maritima 0.075 2.1

Thermus sp. T2 4.7 [32]

Thermus brockianus 4.1 11 [60]

Растения

Cucumis meló L. a-Gal I 6 1.8 1.9 [23]

Glycine max L. Pl 1.55 2.43 д [17]

P2 0.76 1.76д 5.34 0.13 д 5.53 0.43 д

Trifolium repens a-Gal II 1.1 212в 7 435" 1/5/10 59/235/333 67 48 в 83 8е a-Gal III 2.7 196в 1/7/1.4 60/250/38 1000 100° [21] a-Gal IV 11.1 476' 5/5/10 125/167/17 120 29°

Человек

Homo sapiens (плацента) A В 1.55 13.1 [68] а) галактоманнаны с соотношением «М:Г» 1:1/1.1:1/1.4:1, Кт — г/100мл, Ут — в мкмоль/(мг*мин) б) Ут - нкат/мг; в) Ут — мкмоль/(мг*мин); г) Ут - ед/мг д) Ут — мкмоль/(мл*мин) концентрированный раствор .D-галактозы, дает олигомерные продукты, 60% которых представлено 6-0-а-/)-галактозил-/)-галактозой. Среди других продуктов обнаружены а-1,3-, а-1,4- и а-1,5-галактобиозы [4]. Во многих работах в качестве донора и акцептора D-галактозной группы используют субстрат яНФГ [2, 21, 39, 43, 45, 49], при этом a-Gal I Trifolium repens и а-галактозидаза A.fumigatus в качестве продукта образуют яНФ-a-Gah (галактобиозид), а ферменты A.niger и Tr.reesei помимо галактобиозида синтезируют еще и «НФ-a-Gab (галактотриозид) [2, 21, 39, 73]. Помимо D-галактозы и яНФГ в качестве акцептора могут выступать другие мопо- и олигосахариды. Например, а-галактозидаза из Can.guilliermondii, используя мелибиозу как акцептор, образует 0-a-D-Gal(l ,6)-0-a-D-Gal(l,6)-D-Glc. Роль акцепторов в реакциях трансгликозилирования для этого фермента могут играть также: D-глюкоза, .D-галактоза, мальтоза, мальтит, 1,4-бутандиол. Кроме того, эта а-галактозидаза способна переносить D-галактозные группы на пентозы (L-арабипозу, D-ксилозу и D-рибозу) и метилпептозы (D-фукозу и Z-рамнозу). Основными продуктами переноса на лактозу, мальтозу и сахарозу являются 0-a-D-Gal(l,6)-0-ß-D-Gal(l,4)-D-Glc, 0-a-D-Gal(l,6)-0-a-D-Glc(l,4)-D-Glc и 0-a-D-Gal(l,6)-0-a-D-Glc(l,2)-ß-D-Fru (раффиноза) [45]. а-Галактозидаза Mort.vinaceae также способна переносить D-галактозильную группу от молекулы мелибиозы-допора на вторую молекулу мелибиозы-акцептора с образованием вербаксотетраозы; если же вместо мелибиозы использовать раффинозу, то образуются стахиоза и вербаскоза [72]. а-Галактозидаза A.fumigatus в качестве акцепторов эффективно использует не только ди-, три- и тетрасахариды, но и олигосахариды с более высокой СП: а-1,4-глюко(мальтоолигосахариды), р-1,4-глюко-(целлоолигосахариды) и Р-1,4-манноолигосахариды, причем последние участвовали в двух последовательных реакциях переноса донора. Для манноолигосахаридов выход продукта достигал 50% при степени полимеризации акцептора 4-6. У олигосахаридов с большей СП галактозилировались внутренние звенья углеводной цепи. Все галактозпые остатки эффективно переносились на первую гидроксильную группу(ы) в С-6 положении олигосахаридного акцептора (это находится в соответствии с неспособностью фермента переносить галактозу на р-1,4-присоединённые ксилоолигосахариды) [39]. Акцептором D-галактозы для а-галактозидазы Tr.reesei могут быть алифатические спирты. Продуктами в этом случае являются алкил-галактозиды [73]. Аналогично, обнаруженный в клубнях Stachey affinis метил^-галактопираиозид, по предположению Като [4], может синтезироваться за счет трансферазпой активности собственной а-галактозидазы.

Продукт реакции (D-галактоза) является ингибитором некоторых а-галактозидаз, причем возможны различные типы ингибирования. Например, конкурентный тип ингибироваиия продуктом реакции был обнаружен для а-галактозидаз A. a\v amor i, A.ficuum, A.ficuum NRRL 3135, Ther.polysaccharolyticum и Tr.reesei, для a-Gal I, II, III и IV A.niger, а также для а-галактозидазы фракции Р2 Glycine max L (K¡=0.65 мМ) [2, 17, 18, 38, 50, 51]. Неконкурентный механизм ингибироваиия продуктом описан для a-Gal I и a-Gal

II A.tamarii, а смешанный - для a-Gal III из того же источника и для а-галактозидазы Mort.vinace [45]. Кроме ингибироваиия продуктом реакции описано ингибирование а-галактозидаз субстратом. Например, иНФГ ингибирует ферменты A.niger (при концентрации иНФГ> 1.26 мМ) [2], Ps.fluorescem subsp. cellulose и Ph.chrysosporium [22], а мелибиоза - а-галактозидазу Glycine max L (ÁT¡ 10 мМ, [45]). Также известны случаи ингибироваиия а-галактозидаз моно- и олигосахаридами, не содержащими в своем составе D-галактозидной группы: а-галактозидаза A.ficuum NRRL 3135 ингибировалась фруктозой (по конкурентному типу), глюкозой и мапнозой (по неконкурентному типу); а-Gal I A.niger ингибировалась в присутствии всех этих моносахаридов, а активность a-Gal

III A.tamarii падала в присутствии фукозы и арабинозы [18,2, 38, 45].

Многими исследователями отмечалась зависимость а-галактозидазпой активности от присутствия ионов металлов. Так, сильный ингибирующий эффект па а-галактозидазы из различных источников оказывают Cu2+, Cd2+, Со2+, Hg2+, Zn2+ и Ag+ (в концентрации от

3+ 2+

0.02 до 10 мМ, [17, 32, 38, 45, 51, 74]). К слабым ингибиторам можно отнести FeJT Fe Mn2+, Ni2+, Ca2+ и Mg2+ [51,44, 74]. Интересно отметить, что в ряде случаев металлы могут служить активаторами а-галактозидазной активности. Например, показано, что а-галактозидазам бактерий для проявления активности необходимо присутствия в л, реакционной среде ионов Мп [4]. Ингибирование некоторых а-галактозидаз органическими соединениями (как, например, SDS) и солями переходных металлов (HgCl2, CdCh и т.п.) объясняется тем, что перечисленные соединения взаимодействуют с сульфгидрильпыми группами молекулы фермента [51, 54]. Например, а-галактозидаза Thermus sp. Т2 ингибировалась и-хлорбензоатом ртути, однако, в результате точечной замены цистеина па аланин эффект ингибироваиия пропал [32]. Наряду с этим, известны случаи ингибироваиия а-галактозидаз органическими соединениями по иному механизму. Было обнаружено, что специфичными ингибиторами а-галактозидаз могут быть N-метилкалистегины (выделены из корней Lucium chínense) - соединения, относящиеся к группе норпсевдотропиповых алкалоидов. Калистегин В2 и N-метилкалистегин В2 конкурентно ингибировали а-галактозидазу Coffea arabica с .£¡=0.86 и 0.47 мкМ, a N-метилкалистегины A3 и В4 - с Кг5.2 и 36 мкМ, соответственно [75].

3. Применение сс-галактозидаз

3.1 Кормовая промышленность

Введение ферментных препаратов в корма преследует две основные цели -повышение их усвояемости и включение в корма трудно усвояемых компонентов [4].

Применение а-галактозидазных препаратов делает возможным более широкое использование различных соевых продуктов в качестве пищи животных и человека. Соя -наиболее часто используемый источник растительного белка в кормах [16, 76] - содержит 55% процентов белка, причем по составу аминокислот соевый белок близок к животному и усваивается на 90% [4]. Одним из недостатков питания бобовыми является присутствие галактозосодержащих олигосахаридов (раффинозы, стахиозы, вербаскозы) [3, 17, 34]. Из-за отсутствия а-галактозидаз в пищеварительной системе млекопитающих галактоолигосахариды сбраживаются анаэробными микроорганизмами кишечника, что приводит к интенсивному газообразованию [3, 13, 17, 31, 41, 51]. Предобработка соевой муки и соевого молока сс-галактозидазами вызывает расщепление раффинозы и стахиозы до усвояемых пищевой системой сахарозы и галактозы и тем самым устраняет этот недостаток соевых продуктов [2-4].

В ряде работ [3, 17, 41, 77, 78] сравнивали эффективность удаления олигосахаридов раффинозной группы в ходе процессов проращивания, замачивания, варки, автоклавирования и ферментативной обработки бобов. Худшие результаты дало замачивание (10-30% гидролиза). Более эффективными было кипячение и автоклавирование (удалялось от 50 до 60% олигосахаридов в зависимости от сорта бобов). Самыми эффективными способами оказались ферментативная обработка сс-галактозидазами (50-100%) и проращивание (60-70%). Проращивание осуществлялось во влажной, тёплой среде. При этом происходила активация ряда собственных ферментов бобов (в том числе и а-галактозидазы), принимающих участие в разрушении олигосахаридов. Для коммерческих целей оптимальной является ферментативная обработка, т.к. она по сравнению с проращиванием требует меньших затрат времени и энергии [41].

3.2 Пищевая промышленность а-Галактозидазы находят применение в пищевой промышленности, например при утилизации отходов производства. Отходом производства сахара из сахарной свеклы является меласса. Расщепляя присутствующую в мелассе раффинозу, а-галактозидаза не только увеличивает выход сахара, но и одновременно способствует формированию

25 кристаллов сахара (небольшие количества олигосахаридов ингибируют процесс кристаллизации сахарозы) [2, 13, 18, 31, 47, 51]. Во многих странах для этой цели используются препараты а-галактозидаз из АЬх1сИа ьрр., ОгстеНа $рр., МоММпасеае [4]. Другой пример использования а-галактозидаз для трансформации отходов пищевой промышленности - гидролиз побочного продукта производства тофу (соевого творога). Ферментативная деструкция сыворотки соевого творога позволяет избежать загрязнения воды, что является критическим фактором для производства тофу [3].

Как упоминалось в начале текущей главы (см. раздел 1.2), в настоящее время в промышленном масштабе производятся три ГМ, используемых в качестве пищевых добавок и гелеобразователей (загустителей): гуараи, карубин и тарагалактоманнап [18, 23, 24, 28, 31, 79]. Изменение реологических свойств таких загустителей осуществляется с помощью галактоманнап-деградирующих ферментов [2, 24, 31, 80-82]. Частично гидролизовапные ГМ (например, гуаровая смола [83]) представляют собой растворимые в воде пищевые волокна, которые включены в группу биологически активных пищевых добавок (БАД) и имеют множество применений в питании. Известно, что Р-манпаиазная цепь не подвержена действию ферментов человека и расщепляется лишь бактериальной флорой толстого кишечника. Набухший ГМ, обволакивая стенки и ворсинки верхних отделов кишечника, замедляет всасывание компонентов пищи, уменьшает последствия диареи, снижает раздражимость пищеварительного тракта, а также увеличивает образование бифидобактерий в кишечнике. Замедленное всасывание липидов в кишечнике снижает и поступление предшественников холестерина в печень, а вследствие этого снижается синтез холестерина [24].

3.3 Целлюлозно-бумажная и текстильная промышленность

Применения а-галактозидаз в целлюлозно-бумажной промышленности обусловлено тем, что они могут усиливать отбеливающий эффект, достигаемый с помощью эпдо-1,4-Р-маннаназ на небелёной сульфатной хвойной целлюлозе [13]. Эффект био-отбеливания может быть повышен также за счёт комбинирования а-галактозидаз с ксиланазами [24, 31]. В текстилыюй промышленности производные ГМ, полученные путем модификации а-галактозидазами, используют как компоненты паст для придания стойкости цветной печати на тканях [24, 84].

Похожие диссертационные работы по специальности «Катализ», 02.00.15 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Катализ», Фёдорова, Екатерина Александровна

выводы

1. Исследована активность и состав ферментных препаратов, полученных с помощью новых штаммов P.canescens, созданных иа основе гомологичной экспрессии амплифицированпых генов а-галактозидаз Л и С, пектиплиазы А и фитазы А, находящихся под контролем промоторов р-галактозидазы (рbgaS) и ксилапазы (рxylÁ) P.canescens. Доказан высокий уровень экспрессии рекомбииантных ферментов и найдены наиболее активные штаммы продуценты соответствующих ферментов: AGL(A)-4-20, AGL(C)-4-6, Pec 23-10 и Phy-215.

2. Впервые выделены гомогенные рекомбннантные а-галактозидазы P.canescens: а-галактозидаза А (61 кДа, pi 5.1, 27-ая семья гликозил-гидролаз), специфичная по отношению к полимерным галактоманнанам; а-галактозидаза С (80 кДа, pi 4.8, 36-ая семья гликозил-гидролаз), специфичная по отношению к галактоолигосахаридам.

3. Впервые выделена гомогенная рекомбинантная пектинлиаза А (38 кДа, pi 6.7) P.canescens, относящаяся к 1-ой семье полисахаридлиаз. Определены кинетические параметры гидролиза различных пектинов и показано, что пектинлиаза А наиболее специфична по отношению к высоко-этерифицированным пектинам.

4. Впервые выделена гомогенная рекомбинантная фитаза А (63 кДа, pi 6.3) P.canescens. Показано, что фитаза А имеет широкую субстратную специфичность и обладает при этом высокой удельной активностью по отношению к фитатам, в которых способна осуществлять гидролиз пяти из шести имеющихся фосфатных групп.

5. С помощью кормовых тестов in vitro продемонстрирована высокая эффективность использования ферментных препаратов рекомбинаптных а-галактозидазы А и фитазы A P.canescens для повышения питательной ценности растительных кормов. Показано, что применение этих ферментных препаратов в сочетании с препаратом рекомбинантной Пел A P.canescens позволяет значительно улучшить результаты кормовых тестов in vitro.

6. Показана высокая эффективность применения ферментного препарата рекомбинантной а-галактозидазы С для конверсии в моносахариды вторичного продукта переработки сои, содержащего галактоолигосахариды («Soy Solubles»), Максимальная степень конверсии галактоолигосахаридов достигается при совместном действии а-галактозидазы С и ипвертазы P.canescens.

7. На примерах получения сока из клюквы и осветления яблочного сока продемонстрирована возможность эффективного использования ферментного препарата рекомбинантной пектинлиазы А в пищевой промышленности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Фёдорова, Екатерина Александровна, 2007 год

1. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. John Wiley & Sons, Inc, 1998, 123137, 192-193,396.

2. Manzanares P., Graaff L.H., Visser J. Characterization of galactosidases from Aspergillus niger. purification of a novel a-galactosidase activity. Enzyme and Microbial Technology, 22,1998,383-390.

3. Song D., Chang S.K.C. Enzymatic Degradation of Oligosaccharides in Pinto Bean Flour. J ournal of Agricultural and Food Chemistry, 54,2006, 1296-1301.

4. Вакар И.М. Изучение свойств пативной и рекомбипантной а-галактозидазы А Penicillium canescens. Диплом, МГУ, 2005.

5. Pandey A., Szakacs G., Soccol C.R., Rodriguez-Leon J.A., Soccol V.T. Production, purification and properties of microbal phytases. Bioresource Technology, 77,2001, 203-214.

6. Zyla K. Mould phytases and their application in the food industry. World of Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, 42-1-1992,467-472.

7. Cromwell G.L., Coffey R.D., Moneguc H.J., Randolph J.II. Efficacy of Low-Activity, Microbal Phytase in Improving the Bioavailability of Phosphorus in Corn-Soybean Meal Diets for Pigs. J. Anim. Sci., 73,1995,449-456.

8. Соболев A.M. Энзиматичсский гидролиз фитина in vitro и в прорастающих семенах. Физиология растений, 9, выпуск 3, 1962, 334-341.

9. Edited by Whitaker J.R., Voragen A.G.J., Wong D.W.S. Handbook of Food Enzymology. 2003. Marcel Dekker, Inc. 687-707, 829-866, 1029-1041.

10. Zyla K. Phytase applications in poultry feeding: Selected issues. Journal of Animal and Feed Sciences, 10, 2001,247-258.

11. Grassin C., Fauquembergue P. Applications of pectinases in beverages. In: Visser J., Voragen A.G.J. Pectin and pectinases. Elsevier, Amsterdam, 1996, 453-462.

12. Puchart V., Vrsanska M., Bhat M.K., Bicly P. Purification and characterization of a-galactosidase from thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Biochimica et Biophysica Acta, 1524, 2000, 27-37.

13. Vries R.P., Broeck H.C., Dekkers E., Manzanares P., Graaff L.H., Visser J. Differential Expression of Three a-Galactosidase Genes and a Single P-Galactosidase Gene from Aspergillus niger. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 2453-2460.

14. Luonteri E., Tenkanen M., Viikari L. Substrate specifities of Pénicillium simplicissium alpha-galactosidases. Enzyme and Microbial Technology, 22(3), 1998, 192-198.

15. Guimaraes V.M., Rezende S.T., Morcira M.A., Barros E.G., Felix C.R. Characterization of a-galactosidases from germinating soybean seed and their use for hydrolysis of oligosaccharides. Phytochemistry 58,2001, 67-73.

16. Ademark P., Larsson M., Tjerneld F., Stalband H. Multiple a-galactosidases from Aspergillus niger: purification, characterization and substrate specificities. Enzyme and Microbial Technology, 29,2001, 441-448.

17. Сипицина О.А. Свойства рекомбинантпых эндоглюкопазы и ксилаиаза пенициллов. Дисс. канд. хим. наук, МГУ, 2002.

18. Ademark P., de Vries R.P., Hagglund P., Stalbrand H., Visser J. Cloning and characterization of Aspergillus niger genes encoding an a-galactosidase and P-mannosidase involved in galactomannan degradation. FEBS. Eur. J. Biochem. 268, 2001, 2982-2990.

19. Williams J., Villarroya H., Petck F. a-Galactosidases II, III and IV from Seeds of Trifolium repens. Biochem J., 175,1978, 1069-1077.

20. Щербухин В.Д., Анулов O.B. Галактоманнапы семян бобовых (обзор). Прикладная биохимия и микробиология, 35(3), 1999,257-274.

21. Patel M.B., McGinnis J. The Effect of Autoclaving and Enzyme Supplementation of Guar Meal on the Performance of Chicks and Laying Hens. Poultry Science, 64, 1985, 11481156.

22. Dey P.M., Patel S., Brownleader M.D. Induction of alpha-galactosidase in Pénicillium ochrochloron by guar (Cyamopsis tetragonobola) gum. Biotechnology and Applied Biochemistry, 17(Pt3), 1993,361-371.

23. Goycoolea F.M., Milas M., Rinaudo M. Associative phenomena in galactomannan-deacetylated xanthan systems. International Journal of Biological Macromolecules, 29, Issue 3, 2001,181-192.

24. Tavares C., da Silva J.A.L. Rheology of galactomannans-vvhey protein mixed systems. International Diary Journal, 13,2003, 699-706.

25. Funami T., Kataoka Y., Omoto T., Goto Y., Asai I., Nishinari K. Effects of non-ionic polysaccharides on the gelatinization and rétrogradation behavior of wheat starch. Food Hydrocolloids, 19, Issue 1,2005,1-13.

26. Ulezlo I.V., Zaprometova O.M., Ozerskaya S.M., Bezborodov A.M. Microorganisms that produce alpha-galactosidase, alpha-mannosidase, alpha-fucosidase and beta-acetylglucosaminidase. Mikrobiologia, 49(2), 1980, 265-268.

27. Blucher A., Karlsson E.N., Hoist O. Substrate-dependent production and some properties of a thermostable, a-galactosidase from Rhodolhermus marinus. Biotecnology Letters, 22,2000, 663-669.

28. Cruz R., Batistela J.C., Wosiacki G. Microbal alpha-Galactosidase for Soymilk Processing. Journal of Food Science, 46(4), 1981, 1196-1200.

29. Falco A.L.P., Durrant L.R., Franco T.T. Purification of a-galactosidase from seeds of Sesbania marginata. Braz. J. Chem. Eng., Vol.17, No.4-7, 2000,4-7.

30. Feurtado J.A., Banik M., Bewley J.D. The cloning and characterization of a-galactosidase present during and following germination of tomato (Lycopersicon escidentum Mill.) seed. Journal of Experimental Botany, 52(356), 2001, 1239-1249.

31. Soh C.-P., Ali Z.M., Lazan H. Characterization of an a-galactosidase with potential relevance to ripening related texture changes. Phytochemistry, 67, Issue 3, 2006,242-254.

32. Baik S., Saito K., Yokota A., Asano K. Molecular cloning and high-level expression in E. coli of fungal a-galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, Issue 2,2000, 16-173.

33. Zapater I.G., Ullah A.H., Wodzinski R.J. Extracellular alpha galactosidase (E.C. 3.2.1.22) from Aspergillus ficuum NRRL 3135 purification and characterization. Preparative Biochemistry, 20(3-4), 1990, 263-296.

34. Puchart V., Biely P. Glycosylation of internal sugar residues of oligosaccharides catalyzed by a-galactosidase from Aspergillus fumigatus. Biochimica et Biophysica Acta, 1726, Issue 2,2005,206-216.

35. Manzanares P., de Graaff L.H., Visser J. Characterization of galactosidases from Aspergillus niger: purification of a novel alpha-galactosidasc activity. Enzyme and Microbal Technology, 22(5), 1998, 383-390.

36. Matella N.J., Dolan K.D., Stoeckle A. W„ Bennink M.R., Lec Y.S., Uebersax M.A. Use of Hydration, Germination, and a-Galactosidasc Treatments to Reduce Oligosaccharides in Dry Beans. Journal of Food Science, 70(3), 2005, 203-207.

37. Lazo P.S., Ochoa A.G., Gascon S. A-Galactosidase from Saccharomyces carlsbergensis. Cellular Localization, and Purification of the External Enzyme. Eur. J. Biochem., 77,1997,375-382.

38. Civas A., Eberhard R., Le Dizet P., Pctek F. Glycosidases induced in Aspergillus tamarii. Biochem J., 219,1984, 857-863.

39. Hashimoto H., Katayama C., Goto M., Kitahata S. Purification and some properties of alpha-galactosidase from Candida guilliemondii II-404. Bioscicnce, Biotechnology, and Biochemistry, 57(3), 1993,372-378.

40. Hashimoto H., Katayama C., Goto M., Okinaga T., Kitahata S. Transglalactosylation catalyzed by alpha-galactosidase from Candida guilliermondii H-404.Bioscicnce, Biotecnology, and Biochemistry, 59(4), 1995, 619-623.

41. Kaneco R., Kusakabe I., Sakai Y., Murakami K. Substrate specifity of alpha-galactosidase from Mortierella vinacea. Agricultural and Biological Chemistry, 54(1), 1990, 237-238.

42. Shibuya H., Kobayashi H., Park G.G., Komatsu Y., Sato T., Kaneko R., Nagasaki H. Purification and some properties of alpha-galactosidase from Penicillium purpurogenum. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 59(12), 1995, 2333-2335.

43. Puchart V., Vranska M., Bhat M.K., Bicly P. Purification and characterization of alpha-galactosidase from a thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Biochimica et Biophysica Acta, 1524(1), 2001,27-37.

44. Zeilinger S., Kristufek D., Arisan-Atac I., Hodits R., Kubicek C.P. Conditions of formation, purification, and characterization of an alpha-galactosidase og Trichoderma reesei RUT C-30. Applied and Environmental Microbiology, 59(5), 1993, 1347-1353.

45. Scalabrini P., Rossi M., Spettoli P., Mattcuzzi D. Characterization of Bifidobacterium strains for use in soymilk fermentation. International Journal of Food Micribiology, 39, Issue 3, 1998,213-219.

46. Nagao Y., Nakada T., Imoto M., Shimamoto T., Sakai S., Tsuda M., Tsuchiya T. Purification and analysis of the structure of alpha-galactosidase from Eschericia coli. Biochemical and Biophysical Research Communication, 151(1), 1988,236-241.

47. Bakunina I.Y., Sova V.V., Ncdashkovskaya O.I., Kuhlmann R.A., Likhosherstov L.M., Martynova M.D., Mihailov V.V., Elyakova L.A. Alpha-galactosidase of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. KMM 701. Biochemistry, 63(10), 1998, 1209-1215.

48. Ohtakara A., Mitsutomi M., Uchida Y. Purification and enzymatic properties of alpha-galactosidase from Pycnoporus cinnabarinus. Agricultural and Biological Chemistry, 48(5), 1984,1319-1327.

49. Aduse-Opoku J., Tao L., Ferretti J.J., Russell R.R. Biochemical and genetic analysis of Streptococcus mutants alpha-galactosidase. J Gen Micribiol., 137(4), 1991, 757-764.

50. King M.R., Yemool D.A., Eveleigh D.E., Chassy B.M. Thermostable a-galactosidase from Thermotoga neapolitana: cloning, sequencing and expression. FEMS Microbiology Letters, 163, 1998,37.

51. Fridjonsson O., Watzlawick H., Gehweiler A., Rohrhirsch T., Mattes R. Cloning of the Gene Enciding a Novel Thermostable a-Galaclosidase from Thermus brockianus ITI360. Applied and Environmental Microbiology, 65(9), 1999, 3955-3963.

52. Zhu A., Monahan C., Zhang Z., Hurst R., Leng L., Goldstein J. High-Level Expression and Purification of Coffee Bean a-Galactosidase Produced in the Yeast Pichia pastoris. Archives of Biochemistry and Biophysics, 324(1), 1995, 65-70.

53. Zhu A., Wang Z.K., Goldstrein J. Identification of tyrosine 108 in coffee bean alpha-galactosidase as an essential residue for the enzyme activity. Biochimica et Biophysica Acta, 1247(2), 1995, 260-264.

54. Dey P.M., Del Campillo E.M., Lezica R.P. Characterization of a glycoprotein alpha-galactosidase from lentil seeds (Lens culinaris). J. Biol. Chcm, 258, Issue 2, 1983,923-929.

55. Kobayashi 0., Kaneco S., Tanaka II. a-Galactosidase from cultured rise cells. Phytochemistry, 61, Issue 6, 2001, 621-630.

56. Dey P.M. Characteristics of an alpha-galactosidase from mung beans. European Journal of Biochemistry, 140,1984, 385-390.

57. Dhar M., Mitra M., Hata J., Butnariu O., Smith D. Purification and characterization of Phaseolus vulgaris alpha-D-galactosidase isomers. Biochemistry and Molecular Biology International, 34(5), 1994,1055-1062.

58. Kang H., Lee S. Characteristics of an ra-galactosidase associated with grape flesh. Phytochemistry, 58, Issue 2, 2001,213-219.

59. Kusiak J.W., Quirk J. M., Brady R.O., Mook G.E. Purification and Properties of the Two Major Isozymes of a-Galactosidase from Human Placenta. The Journal of Biological Chemistry, 253(1), 1998,184-190.

60. Surekha A., Elbein A. Glycoprotein enzymes secrctcd by Asp.niger. Purification and characterisation of a-galactosidases. J. Bacteriol., 129, 1977, 850.

61. Dey P. M., Pridham J. B. Biochemistry of a-galactosidases. Adv. Enzymol., 15, 1977,91.

62. Arnaud N., Bush D. A. Study of intracellular cx-galactosidase from the thermophilic fungus Penicillium duponli. Biotechnol. Bioeng., 8, 1976, 581.

63. Suzuki H., Li Y. a-Galactosidase from Mortierella vinaceae. Crystallization and properties. J. Biol. Chem., 245, 1970, 781.

64. Eneskaya E.V., Golubev A.M., Kachurin A.M., Savel'ev A.N., Neustroev K.N. Transglycosylation activity of alpha-D-galactosidase from Trichodcrma reesei. An investigation of the active site. Carbohydrate Research, 305(1), 1997, 83-91.

65. Eivazi F., Tabatabai M.A. Factors affecting glucosidase and galactosidase activities in soils. Soil Biology and Biochemistry, 22(7), 1990, 891-897.

66. Edited by Godfrey T.& West S. Industrial enzymology. Second edition. 1996. 71-80, 84-85.

67. Mulimani V.H., Devendrá S. Effect of soaking, cooking and crude a-galactosidase treatment on the oligosaccharide content of red gram flour. Food Chemistry, 61, Issue 4, 1998, 475-479.

68. Goncalves M.P., Torres D., Andrade C.T., Azero E.G., Lefebvre J. Rheological study of the effect of Cassia javanica galactomannans on the heat-set gelation of a whey protein isolate atpH 7. Food Hydrocolloids, 18, Issue 2, 2004, 181-189.

69. Pai V.B., Khan S.A. Gelation and rheology of xanthan/enzyme-modified guar blends. Carbohydrate Polymers, 49, Issue 2, 2002, 207-216.

70. McCleary B.V. Enzymatic modification of plant polysaccharides. International Journal of Biological Macromolecules, Vol. 8, Issue 6,1986, 349-354.

71. Daas P.J., Grolle K., Van Vliet Т., Schols H.A., De Jongh H.H. Towards the recognition of structure-function relationships in galactomannans. J Agrie Food Chem, 50(15), 2002,4282-4289.

72. Slavin J.L., Greenberg N. A. Partially hydrolyzed guar gum. Nutrition, 19, Issue 6, 2003,549-552.

73. Whitney S.E.C., Brigham J.E., Darke A.H., Reid J.S.G., Gidley M.J. Structural aspects of the interaction of mannan-based polysaccharides with bacterial cellulose. Carbohydrate Research, 307, Issues 3-4,1998,299-309.

74. Оводова Р.Г., Бушпева O.A., Шашков A.C., Чижов А.О., Оводов. Ю.С. Структурное изучение пектина сабельника болотного Comarum palustre L. Биохимия, 70, вып. 8,2005,1051-1062.

75. Пищевая химия, ГИОРД, Спб, 2004, 182-185, 385-391.

76. Stephen A.M. Food Polysaccharides and Their Applications. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong, 1995, 654.

77. McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. The pectic polysaccharides of primary cell walls. Methods Plant Biochem., 2,1990, 415.

78. Schols H.A., Bakx E.J., Schipper D., Voragen A.G.J. A xylogalacturonan subunit present in the modified hairy regions of apple pectin. Carbohydr. Res., 279, 1995,265-279.

79. Бушпева O.A., Оводова P.Г., Шашков А.С., Чижов А.О., Оводов Ю.С. Строение силенаиа, пектина из смолёвки обыкновенной Silene vulgaris (Moench) Garcke. Биохимия, 68, вып. 12,1687-1696.

80. Thakur B.R., Singh R.K., Handa A.K. Chemistry and uses of pectin a review. Critical Reviews in Food Science and Nitrition, 37, 1997,47-73.

81. Семёнова M.B. Свойства внеклеточных пектиназ грибов рода Aspergillus. Дисс. канд. хим. паук, МГУ, 2005.93. de Vries J.A., Hansen М., Soderberg J., Glahn P.E., Pedersen J.K. Distribution of methoxyl groups in pectins. Carbohydr. Polym., 6, 1986,165.

82. Oosterveld A., Grabber J.H., Beldman G.J.R., Voragen A.G.J. Formation of ferulic acid dehydrodimers through oxidative cross-linking of sugar beet pectin. Carbohydr. Res., 300, 1997, 179-189.

83. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Нестеренко Е.А. Разделение и характеристика ферментного комплекса культуры Bacillus macerans. Биотехнология, 1, 2002,21-27.

84. Mikhailova R.V., Sapunova L.I., Lobanok A.G. Biosynthesis of pectinlyases in Penicillium adametzii, P. citrinum and P. janthinellum. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 10,1994,457-461.

85. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Нестеренко Е.А. Свойства пектинолитических лиаз Bacillus macerans. Биохимия, 2,2002,20-29.

86. Семёнова М.В., Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Сипицын А.П. Выделение и свойства иектиназ из гриба Aspergillus japonicus. Биохимия, 68, вып. 5, 2003, 686-397.

87. Alana A., Alkorta I., Dominguez J.B., Llama M.J., Serra J.L. Pectil Lyase Activity in a Penicillium italicum Strain. Applied and Environmental Microbiology, 56(12), 1990, 37553759.

88. Kashyap D.R., Vohra P.K., Chopra S., Tewari R. Applications of pectinases in the commercial sector: a review. Bioresource Technology, 77, Issue 3,2001,215-227.

89. Abelson J.N., Simon M.I. Editors-in-chief. Methods in Enzymology, Volume 161, 1988, Academic Press, Inc, 350-354.

90. Vitali J., Schick В., Kester H.C.M., Visser J., Jurnak F. The three-dimensional structure of Aspergillus niger pectin lyase В at 1.7-A resolution. Plant Physiol, 116, 1998, 6980.

91. Pickersgill R., Jenkins J., Harris G., Nasser W., Robert-Baudouy J. The structure of Bacillus subtilis pectate lyase in complex with calcium. Nat. Struct. Biol., 1, 1994, 717-723.

92. Kusters-van Someren M.A., Flipphi M.J.A., de Graaff L.H., van den Broek H.C., Kester H.C.M., Hinnen A., Visser J. Characterization of the Aspergillus niger pelB gene: structure and regulation of expression. Mol. Gen. Genet., 234, 1992,113-120.

93. Kester H.C.M., Visser J. Purification and characterization of pectin lyase B, a novel pectinolytic enzyme (ют Aspergillus niger. FEMSMicrobiol. Lett., 120, 1994, 63-68.

94. Mutenda K.E., Korner R., Christensen T.M.I.E., Mikkelsen J., Roepstorff P. Application of mass spectrometry to determine the activity and specificity of pectin lyase A. Carbohydr. Res., 337, 2002,1213-1223.

95. Williams P.A., Sayers C., Viebke C., Scnan C., Mazoyer J., Boulenguer P. Elucidation of the Emulsification Properties of Sugar Beet Pectin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53,2005, 3592-3597.

96. Румянцева Г.Н., Варфоломеева О.А. Влияние карбогидраз и лиаз микробного происхождения на субстраты пектиисодержащего сырья. Храпение и переработка сельхозсырья, 8,2004, 30-32.

97. Румянцева Г.Н., Варфоломеева О.А. Технологические режимы биокатализа в процессе выделения пищевого пектина. Храпение и переработка сельхозсырья, 4, 2004, 30-33.

98. Will F., Schulz К., Ludvvig М., Otto К., Dietrich Н. The influence of enzymatic treatment of mash on the analytical composition of apple juice. International Journal of Food Science and Technology, 37, 2002, 653-660.

99. Ceci L., Lozano J. Determination of enzymatic activities of commercial pectinases for the clarification of apple juice. Food Chemistry, 61, Issues 1-2, 1998,237-241.

100. Alana A., Gabilondo A., Hernando F., Moragues M.D., Dominguez J.B., Llama M.J., Serra J.L. Pectil Lyase Production by a Penicilliitm italicum Strain. Applied and Environmental Microbiology, 55(6), 1989,1612-1616.

101. Vaillant F., Millan P., O'Brien G., Dornier M., Decloux M., Reynes M. Crossflow microfiltration of passion fruit juice after partial enzymatic liquefaction. Journal of Food Engineering, 42, Issue 4,1999, 215-224.

102. Fundira M., Blom M., Pretorius I.S., Van Rensburg P. Comparison of Commercial Enzymes for the Processing of Marula Pulp, Wine, and Spirits. Journal of Food Science, 67(6), 2002,2346-2351.

103. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Нестеренко Е.А. Использование мембранной технологии для концентрирования и очистки ферментных растворов пектинлиазы. Биотехнология, 5,2001,45-50.

104. Revilla I., Gonzalez-San Jose M.L. Addition of pectolytic enzymes: an enological practice which improves the chromaticity and stability of red wines. International Journal of Food Science and Technology, 38,2003,29-36.

105. Rogerson F.S.S., Vale E., Grande H.J., Silva M.C.M. Alternative processing of port-wine using pectolytic enzymes. Cienc. Tecnol. Aliment, 2(5), 2000, 222-227.

106. Ranalli A., Gomes Т., Delcuratolo D., Contento S., Lucerna L. Improving Virgin Olive Oil Quality by Means of Innovative Extraction Biotechnologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 2003,2597-2602.

107. Angayarkanni J., Palaniswamy M., Murugesan S., Swaminathan K. Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp. pectinases. Journal of Bioscience and Bioengineering, 94, Issue 4,2002, 299-303.

108. Murugesan G.S., Angayarkanni J., Swaminathan K. Effect of tea fungal enzymes on the quality of black tea. Food Chemistry, 79, Issue 4,2002,411-417.

109. Antier P., Minjares A., Roussos S., Riambault M., Viniegra-Gonzalez G. Pectinase-hyperproducting mutants of Aspergillus niger C28B25 for solid-state fermentation of coffee pulp. Enzyme Microb. Technol., 15,1993,254-260.

110. Colombatto D., Mould F.L., Bhat M.K., Owen E. Use of fibrolytic enzymes to improve the nutritive value of ruminant diets. A biochemical and in vitro rumen degradation assessment. Animal Feed Science and Technology, 107, Issues 1-4, 2003,201-209.

111. Tripodo M.M., Lanuzza F., Micali G., Coppolino R., Nucita F. Citrus waste recovery: a new environmentally friendly procedure to obtain animal feed. Bioresource Technology, 91, 2004,111-115.

112. Ossola M., Galante Y.M. Scouring of flax rove with the aid of enzymes. Enzyme and Microbial Technology, 34, Issue 2,2004,177-186.

113. Wodzinski R.J., Ullah A.H.J. Phytase. Advances in Applied Microbiology, 42, 1996, 263-302.

114. Hou H.J., Chang K.C. Yield and Tcxtural Properties of Tofu as Affected by the Changes of Phytate Content During Soybean Storage. Journal of Food Science, 68(4), 2003, 1185-1191.

115. Соболев A.M. Распространение, образование и использование фитина у высших растений. Успехи биологической химии, IV, 1962, 248-260.

116. Vohra A., Satyanarayana Т. Phytases: Microbal Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications. Critical Reviews in Biotechnology, 23(1), 2003,29-60.

117. Туе A.J., Siu F.K.Y., Leung T.Y.C., Lim B.L. Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases from B. subtiilis 168 and B. licheniformis. Appl Microbiol Biotechnol, 59,2002, 190-197.

118. Rasmussen S.K., Hatzack F. Identification of two low-phytate barley (Hordeum vulgare L.) grain mutants by TLC and genetic analysis. Hereditas, 129,1998,107-112.

119. Carlsson N.-G., Bergmann E.-L., Skoglund E., Hasselband K., Sandberg A.-S. Rapid Analysis of inositol Phosphates. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2001, 16951701.

120. Phillippy B. Q., Bland J.M., Evens T.J. Ion Chromatography of Phytate in Roots and Tubers. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 2003, 350-353.

121. Phillippy B.Q., Wyatt C.J. Degradation of Phytate in Foods by Phytases in Fruit and Vegetable Extracts. Journal of Food Science, 66(4), 2001, 535-539.

122. Fruhbeck G., Alonso R., Marzo F., Santidrian S. A Modified Method for the Inderect Quantitative Analysis of Phytate in Foodstuffs. Analytical Biochemistry, 225,1995,206-212.

123. Greiner R. Purification and Characterization of Three Phytases from Germinated Lupine Seeds (Lupinus albas Var. Amiga). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2002,6858-6864.

124. Greiner R., Alminger M.L., Carlsson N.-G. Stereospecificity of myoinositol Hexakisphosphate Dephosphorylation by a Phytate-Degrading Enzyme of Baker's Yeast. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2001, 2228-2233.

125. Casey A., Walsh G. Identification and characterization of a phytase of potential commercial interest. Journal of Biotechnology, 110,2004, 313-322.

126. March J.G., Simonet B.M., Grases F. Determination of phytic acid by gas chromatography-mass spectroscopy: application to biological samples. Journal of Chromatography B, 757,2001,247-255.

127. Isiguro T., Ono T., Nakasato K., Tsukamoto C. Rapid measurement of Phytate in Soy Products by Mid-infrared Spectroscopy. Journal of Food Science, 70(1), 2005, 63-66.

128. Hatzack F., Rasmussen S.K. High-performance thin-layer chromatography method for inositol phosphate analysis. Journal of Chromatography B, 736, 1999,221-229.

129. Shin S., Ha N.-C., Oh B.-C., Oh T.-K., Oh B.-H. Enzyme Mechanism and Catalytic Property of p Propeller Phytase. Structure, 9, 2001, 851-858.

130. Vohra A., Satyanarayana T. Purification and characterization of a thermostable and acid-stable phytase from Phichia anomala. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 18, 2002,687-691.

131. Bryant R.J., Dorsch J.A., Peterson K.L., Rutger J.N., Raboy V. Phosphorus and Mineral Concentrations in Whole Grain and Milled Low Phytic Acid (Ipa) 1-1 Rice. Cereal Chemistry, 82(5), 2005, 517-521.

132. Peers F.G. The Phytase of Wheat. The Biochemical Journal, 53(1), 1953, 102-110.

133. Ullah A.H J., Phillippy B.Q. Substrate Selectivity in Aspergillus ficuum Phytase and Acid Phosphatases Using wyo-Inositol Phosphates. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42, 1994,423-425.

134. Casey A., Walsh G. Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142. Bioresource Technology, 86,2003, 183-188.

135. Zini N.V., Serkina A.V., Gelfand M.S., Shevelev A.B., Sineoky S.P. Gene cloning, expression and characterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus. FEMS Microbiology Letters, 236, Issue 2, 2004,283-290.

136. Sajidan A., Farouk A., Greiner R., Jungblut P., Muller E.C., Borriss R. Molecular and physiological characterization of a 3-phytase from soil bacterium Klebsiella sp. ASR1. Appl Microbiol Biotechnol., 65(1), 2004, 110-118.

137. Shah V., Parekh L.J. Phytase from Klebsiella Sp. No. PG-2: Purification and properties. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 27,1990, 98-102.

138. Berka R.M., Rey M.W., Brown K.M., Byun T., Klotz A.V. Molecular Characterization and Expression of a Phytase Gene from the Thermophilic Fungus Thermomyces lanuginosus. Applied and Environmental Microbiology, 64(11), 1998, 4423-4427.

139. Ullah A.H.J., Sethumadhavan K., Lei X.G., Mullaney E.J. Biochemical Characterization of Cloned Aspergillus fumigalus Phytase (phyA). Biochemical and Biophysical Research Communicatios, 275, Issue 2, 2000,279-285.

140. Tomschy A., Brugger R., Lehmann M., Svendsen A., Vogel K., Kostrewa D., Lassen S.F., Burger D., Kronanberg A., van Loon A.P.G.M., Pasamontes L., Wyss. M. Engineering of

141. Phytase for Improved Activity at Low pH. Applied and Environmental Microbiology, 68(4), 2002,1907-1913.

142. Rogriguez E., Mullaney E.J., Lei X.G. Expression of the Aspergillus fumigatus Phytase Gene in Pichia pastoris and Characterization of the Recombinant Enzyme. Biochemical and Biophysical Research Communications, 268, Issue 2, 2000, 373-378.

143. Peng R.H., Xiong A.S., Li X., Fan H.Q., Yao Q.H., Guo M.J., Zhang S.L. Article in Chinese. High expression of a heat-stable phytase in Pichia pastoris. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai), 34(6), 2002, 725-730.

144. Pasamontes L., Haiker M., Wyss M., Tessier M., van Loon A.P. Gene cloning, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol., 63(5), 1997, 1696-1700.

145. Xiang Т., Liu Q., Deacon A.M., Koshy M., Kriksunov I.A., Lei X.G., Hao Q., Thiel D.J. Crystal structure of a heat-rcsilient phytase from Aspergillus fumigatus, earring a phosphorylated histidine. J Mol Biol, 339(2), 2004,437-445.

146. Skowronski T. Some Properties of Partially Purified Phytase from Aspergillus niger. Acta Microbiologica Polonica, 27(1), 41-48.

147. Glahn R.P., Wortley G.M., South P.K., Miller D.D. Inhibition of Iron Uptake by Phytic Acid, Tannic Acid, and ZnCh: Studies Using an In Vitro Digestion/Caco-2 Cell Model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2002, 390-395.

148. Bio Times 3/99 Novo Nordisk. New phytase could make a world of difference.

149. Авт. свидетельство СССР 1065476,1984.

150. Авт. свидетельство СССР 1120700, 1982.

151. Николаев И.В., Ходова О.М., Тимохииа Е.А., Алексепко АЛО., Винецкий Ю.П. Молекулярные характеристики секретируемой |3-галактозидазы Penicillium canescens. Биохимия, т.54, № 8, 1989,1294-1299.

152. Корнеева О.С., Жеребцов НА., Черемушкина И.В.: Идентификация каталитически активных групп |3-галактозидазы Penicillium canescens F-436. Биохимия. т.66,№ 3,2001,412-418.

153. Абелян В.А. Ферментативная обработка молочной сыворотки с получением галактоолигосахаридного сиропа. Прикл. Биохим. Микробнол. т.34, №4,1998, 365-369

154. Патент РФ 2126049,10.02.1999.

155. Николаев И.В., Беккер О.Б., Серебряный В.А., Чулкин A.M., Винецкий Ю.П.: Суперпродукция секретируемой бета-галактозидазы мицелиальным грибом Penicillium canescens: структура гена и конструкция мультикопийного продуцента. Биотехнология,. 3, 1999,3-13.

156. Coughlan М.Р., Hazlewood G.P., Hemicellulose and Hemicellulases. Portland Press Research Monograph. London and Chapel Hill, Vol. IV, 1993, 120p.

157. US Patent 60,001,639. December 14, 1999.

158. Suominen P., Reinikainen Т., Trichoderma reesei cellulase and other Hydrolases. Proceedings of The TRICEL93 Symposium, Espoo, Finland. June 2-5,1993, 314p.

159. Bhat M.K., Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnol. Advances. 18,2000, 355-383.

160. Jeffries T.W., Viikari L., Enzymes for pulp and paper processing. ACS Symp. Ser. № 655, 1996,326p.

161. Harman G.F., Kubicek C.P., Trichoderma and Gliocladium enzymes, biological control and commercial applications. Taylor @ Francis, London. Vol.2, 1998, 201p.

162. Rosenber I.M., Protein Analysis and Purification, Benchtop Technics. Birkhauser, Boston, 1996,434p.

163. Alexander R.R., Griffiths J.M., Basic Biochemical Methods, 2nd ed., Wiley-Liss, Inc. 1993, 353p.187. Лабораторная методика.

164. Досон P., Эллиот Д., Джойс К., Справочник биохимика. М: Мир, 1991,466с.

165. Сипицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. В: Варфоломеев С.Д. Итоги пауки и техники, сер. Биотехнология. ВИНИТИ, 1993,25, 152с.

166. Garcia Е., Johnson D.,Whitaker J.R., Shoemaker S.P. Assesement of endo-l,4-beta glucanase activity by a rapid colorimctric assay using disodium-2,2'-bicinchoninate. J. Food Biochem., 17, 1993, 135-145.

167. Collmer A., Reid J. Assay methods for peetie enzymes. In. Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 161(B), 1988, 329-335.

168. Pitt D. In. Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 161(B), 1988, 353.

169. Гусаков A.B., Марков A.B., Гришутип С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискознметрическнй метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. Биохимия, 67(6), 2002, 815-822.

170. Engelen A.J., van der Heeft F., Randsdorp P.H., Smit E.L., J. AOAC Int., 77, 1994, 760-764.

171. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.:- Высш. шк., 1976, 278с.

172. Desjobert A., Petek F., Bull. Soc. Chim. Biol., 1956, 38, 871-883.

173. Синицын А.П., Гусаков A.B., Чсриоглазов B.M., Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов: Учеб. Пособие, М: Изд-со МГУ. 1995,224с.

174. Chaplin M.F., Kennedy J.F., Carbohydrate Analysis: A Practical Approach, 2nd ed. IRL PRESS, Oxford University Press, 1994, 324p.

175. Донченко JI.B. Технология пектина и пектипопродуктов. ДеЛи, Москва, 2000, 256 с.

176. Pectinase assay. Dyadic International, Inc.

177. Берлин X.A., Исследование тополитичсских эпдоглюканаз и ксилапаз ферментных комплексов Pénicillium verrucidosum и Trichoderma reesei. Дисс. канд. хим. наук, МГУ, 1999.

178. Кислухипа О.В., Кюдулас И. Биотехпологические основы переработки растительного сырья, Технология, Каунас, 1997, 184с.1. Алр225

179. Пространственная модель а-галактозидазы А Р. сапезсет

180. Пространственная модель пектинлиазы А Р. сипенсет

181. Пространственная модель фитазы А P.canescensа) карта плазмиды PAglAlполилинкер

182. КАХ ^И А 1\ с И КИ И И 1 1 1 1ху1А промотор а%1А -> ху!А терм.рШиееспр! ^б) карта плазмиды pAglCполилинкер

183. А Ара\; АХ - АаШ; В - ВатШ; В^ - II; С - СМ; Н - НтсПП; К - КрпI; N0 - МтЛ: N1) - №еI; N - ЫоЛ\ К - ЕсоЯЛ; $ - &еП; 8с - БасЬ, 8т - £/ж/1; ХЪ-ХЬа1; Х- Х1ю\.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.