Роль белков Asp и Patronin в процессе кинетохор-зависимого роста микротрубочек веретена деления в культуре клеток S2 Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Разуваева Алена Викторовна
Разуваева Алена Викторовна
кандидат наук
2026
- Специальность ВАК РФ00.00.00
- Количество страниц 117
Оглавление диссертации кандидат наук Разуваева Алена Викторовна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Цели и задачи исследования
Научная новизна работы
Теоретическая и практическая значимость исследования
Положение, выносимое на защиту
Апробация работы
Публикации по теме работы
Вклад автора
Структура и объем работы
Благодарности
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Митоз
1.2. Строение веретена деления
1.2.1. Микротрубочки
1.2.2. Центросома
1.2.3. Кинетохор
1.2.4. Контрольная точка сборки веретена деления
1.3. Пути нуклеации микротрубочек во время митоза
1.3.1. Центросом-зависимый путь нуклеации микротрубочек
1.3.2. Хромосом-зависимый путь нуклеации микротрубочек
1.3.2.1. Градиент Ran-ГТФ
1.3.2.2. СРС комплекс
1.3.3. augmin-зависимый путь формирования микротрубочек
1.3.4. Взаимодействие различных путей нуклеации микротрубочек во время формирования веретена деления
1.3.5. Изучение кинетохор- и/или центросом-зависимого роста микротрубочек веретена деления
1.4. Белковые факторы, способствующие сборке веретена деления
1.4.1. Белки, ассоциированные с микротрубочками
1.4.2. Характеристика белка Asp/ASPM
1.4.3. Характеристика белка Patronin/CAMSAP
1.5. Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Список использованных сред для культивирования
2.1.2. Список использованных растворов
2.1.3. Клеточные линии дрозофилы, используемые в работе
2.1.4. Штаммы Escherichia coli, используемые в работе
2.2. Методы
2.2.1. Молекулярно-биологические методы
2.2.1.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.2.1.2. Гель-электрофорез
2.2.1.3. Выделение ДНК из геля
2.2.1.4. Лигирование
2.2.1.5. Очистка лигазной смеси
2.2.1.6. Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli
2.2.1.7. Электрическая трансформация клеток E. coli
2.2.1.8. Выделение плазмидной ДНК
2.2.1.9. Секвенирование по Сэнгеру
2.2.1.10. Получение матрицы для последующей наработки дцРНК
2.2.1.11. Синтез и очистка дцРНК
2.2.1.12. Выделение суммарной РНК
2.2.1.13. Обратная транскрипция
2.2.1.14. Количественная ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени
2.2.2. Методы работы с клеточными культурами
2.2.2.1. Культивирование клеточных линий дрозофилы S2
2.2.2.2. РНК-интерференция
2.2.2.3. Индукция экспрессии трансгенов
2.2.2.4. Деполимеризации тубулина колцемидом
2.2.2.5. Приготовление цитологических препаратов после деполимеризации тубулина колцемидом
2.2.3. Микроскопические методы анализа
2.2.3.1. Эпифлуоресцентная микроскопия
2.2.3.2. Конфокальная микроскопия
2.2.4. Измерение количественных параметров клеток на их микрофотографиях
2.2.4.1. Измерение длины веретена деления
2.2.4.2. Измерение интенсивности сигнала флуоресцентно меченого тубулина, ассоциированного с кинетохорами
2.2.4.3. Статистический анализ данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Локализация белков Asp и Patronin в клеточном цикле
3.1.1. Локализация химерного белка Asp-eGFP
3.1.2. Локализация химерного белка Patronin-eGFP
3.2. Роль белков Asp и Patronin в кинетохор-зависимом росте микротрубочек в культивируемых клетках S2
3.2.1. РНК-интерференция генов, кодирующих белки Asp и Patronin
3.2.2. Митотические фенотипы клеток S2 после снижения уровня транскриптов гена asp, Patronin или двух генов одновременно
3.2.3. Функциональные взаимоотношения белка Patronin с белками Klp10A и Dgt6
3.2.4. Кинетохор-зависимый повторный рост микротрубочек после деполимеризации веретена деления колцемидом
3.2.5. Паттерн кинетохор-зависимого повторного роста микротрубочек после деполимеризации веретена деления
3.2.6. Интенсивность сигнала флуоресцентно меченого тубулина, ассоциированного с хромосомами
3.3. Внутриклеточная локализация химерных белков Asp-eGFP и Patronin-eGFP в ходе восстановления веретена деления
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Локализация белков Asp и Patronin в клеточном цикле
4.2. Роль белков Asp и Patronin в процессе формирования веретена деления
4.3. Участие белков Asp и Patronin в процессе кинетохор-зависимого повторного роста микротрубочек
4.4. Модель кинетохор-управляемого роста микротрубочек в клетках S2
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. - аминокислотный остаток
АТФ - аденозинтрифосфат
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВД - веретено деления
ГДФ - гуанозиндифосфат
ГТФ - гуанозинтрифосфат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дцРНК - двуцепочечная РНК
е.а. - единица активности
кДНК - комплементарная ДНК
КПРМТ - кинотехор-зависимый повторный рост микротрубочек
мРНК - матричная РНК
МТ - микротрубочка
ПАТ - псевдо-ана-телофаза
п.н. - пара нуклеотидов
ПЦМ - перицентриолярный материал
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РНКи - РНК-интерференция
APC/C - комплекс стимуляции анафазы/циклосома (anaphase-promoting complex/cyclosome)
CCAN - комплекс белков, постоянно ассоциированных с центромерой (the constitutive centromere-associated network)
CH - (домен) гомологии с кальпонином (calponin homology)
CPC - комплекс белков-пассажиров хромосом (chromosome passenger complex)
DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол (4,6-diamidino-2-phenylindole)
YTuRC - кольцевой комплекс Y-тубулина (Y-tubulin ring complex)
dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат (deoxyribonucleoside triphosphate)
eGFP - усиленный зелёный флуоресцентный белок (enhanced green fluorescent protein)
FBS - эмбриональная телячья сыворотка (fetal bovine serum)
IQ - изолейцин-глутаминовые мотивы k-волокно - кинетохорное волокно
MAP - белки, ассоциированные с микротрубочками (microtubule associated protein) MCC - комплекс митотической контрольной точки (the mitotic checkpoint complex) MtnA - Metallothionein A
PBS - натрий-фосфатный буфер (phosphate buffered saline)
+TIP - белки, взаимодействующие с плюс-концами микротрубочек (+tip interacting protein) -TIP - белки, взаимодействующие с минус-концами микротрубочек (-tip interacting protein) SAC - контрольная точка сборки веретена деления (spindle assembly checkpoint)
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Митоз является одним из фундаментальных процессов онтогенеза, поскольку клеточное деление необходимо для развития и роста организма. Биологическое значение митоза состоит в строго одинаковом распределении хромосом между дочерними ядрами, что обеспечивает образование генетически идентичных дочерних клеток. При нарушениях митоза может происходить неправильная сегрегация хромосом и, как результат, генетический дисбаланс в дочерних клетках (анеуплоидия) (Baudoin, Cimini, 2018). Анеуплоидия соматических клеток может приводить к возникновению опухолей и геномной нестабильности, тогда как анеуплоидия зародышевых клеток напрямую связана с бесплодием, невынашиванием беременности и возникновением пороков развития (Weaver, Cleveland, 2007; Maiato, Silva, 2023).
Веретено деления (ВД) является динамичной молекулярной машиной, которая обеспечивает правильное прохождение митоза. Движущей частью ВД являются микротрубочки (МТ) и МТ-ассоциированные белки. Процесс сборки митотического ВД является предметом активного изучения. На данный момент известно, что при его сборке нуклеация МТ может происходить от центросом, кинетохоров или уже существующих микротрубочек (Kraus et al., 2023). Наличие нескольких независимых друг от друга способов нуклеации МТ делает сборку веретена деления более надежной и устойчивой к повреждениям. Исследования, выполненные на культивируемых клетках дрозофилы и млекопитающих, показали, что образование МТ только от кинетохоров является необходимым и достаточным для сборки функционального ВД (Meunier, Vernos, 2016). Однако в настоящее время мало известно о молекулярных участниках процесса кинетохор-зависимого роста МТ. В разных модельных системах было показано, что в этом процессе участвует ряд белков и белковых комплексов, которые необходимы для нуклеации МТ (Mei-38/TPX2, Mars/HURP, Aurora A (Tulu et al., 2006; Torosantucci et al., 2008; Koffa et al.,2006; Casanova et al., 2008, Popova et al., 2022), Y-тубулин, Nup107-160 (Mishra et al., 2010)), для полимеризации МТ (Msps/XMAP215 (Bucciarelli et al., 2009), Misato, комплексы TCP-1 и Tubulin prefoldin (Mottier-Pavie et al., 2011; Palumbo et al., 2015), Ensconsin/MAP7 (Gallaud et al., 2014), Eb1, Mast (Popova et al., 2022)), либо необходимы для сборки кинетохора (компоненты комплекса CPC - Aurora B, INCENP (Kallio et al., 2002)). Дополнительно было показано, что кинетохор-зависимый рост МТ нарушается в отсутствие
белкового комплекса MCRS1-KANSL1-KANSL3, который связывается с минус-концами МТ в культивируемых клетках человека (Meunier, Vernos, 2011; Meunier et al., 2015).
Белки, связывающиеся с минус-концами МТ, являются одной из наименее изученных групп белков, ассоциированных с МТ, и довольно малочисленной. К таким белкам относятся, помимо вышеуказанного комплекса MCRS1-KANSL1-KANSL3, кольцевой комплекс Y-тубулина (Y-tubulin ring complex, yturc), белок Asp/ASPM (здесь и далее указано название ортолога у дрозофилы/человека) и белок Patronin/CAMSAP (Akhmanova, Steinmetz, 2019). Участие белка Y-тубулин, ключевого компонента комплекса yturc, в кинетохор-зависимом росте МТ уже была продемонстрирована ранее (Mishra et al., 2010). Участвуют ли белки Asp/ASPM и Patronin/CAMSAP в процессе кинетохор-зависимого роста МТ, неизвестно. Оба белка являются высококонсервативными и снижение их количества или отсутствие у млекопитающих приводит к серьёзным аномалиям развития нервной системы. Так, потеря функции гена ASPM у мыши и человека является одной из основных причин развития первичной микроцефалии (Pulvers et al., 2010; O'Neill et al., 2018). У человека мутации в гене CAMSAP1 приводят к нарушению нейрональной миграции, которая может сопровождаться микроцефалией (Khalaf-Nazzal et al., 2022). У мышей потеря функции гена CAMSAP1 приводит к дефектам миграции кортикальных нейронов (Zhou et al., 2020), а также к бесплодию у самцов (Hu et al., 2023).
Нарушение функции генов, кодирующих белки Asp/ASPM и Patronin/CAMSAP, у дрозофилы приводит к митотическим фенотипам, которые позволяют предполагать участие данных белков в процессе кинетохор-зависимого роста МТ. Так, мутация по гену asp вызывала в эмбриональных нейробластах дрозофилы остановку клеточного цикла на стадии метафазы вследствие активации контрольной точки сборки ВД (spindle assembly checkpoint, SAC) (Ripoll et al., 1985; Gonzalez et al., 1998), что является типичным фенотипом для генов, задействованных в установлении правильного соединения кинетохор-МТ (Somma et al., 2008; Renda et al., 2017). Истощение же белка Patronin - единственного представителя семейства белков CAMSAP у дрозофилы - вызывает фенотип короткого ВД в митозе и увеличивает деполимеризацию МТ в интерфазе за счёт отсоединения микротрубочек от центров их нуклеации (Goshima et al., 2007; Goodwin, Vale, 2010). Подобный фенотип - короткое веретено деления - наблюдался при истощении белков, входящих в состав вышеупомянутого комплекса MCRS1-KANSL1-KANSL3, участвующего в процессе кинетохор-зависимого роста МТ в культивируемых клетках человека (Meunier, Vernos, 2011; Meunier et al., 2015). Таким образом, на момент начала исследования было неизвестно, участвуют ли белки Asp/ASPM и Patronin/CAMSAP в процессе кинетохор-
зависимого роста МТ, что и явилось предметом исследования в данной диссертационной работе на модели культивируемых клеток S2 дрозофилы.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы является исследование роли белков Asp и Patronin в процессе кинетохор-зависимого формирования микротрубочек веретена деления.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить локализацию белков Asp и Patronin в ходе клеточного цикла и их возможную функциональную взаимосвязь при сборке веретена деления в культивируемых клетках S2 дрозофилы.
2. Определить роль белков Asp и Patronin в кинетохор-зависимом росте микротрубочек после их деполимеризации колцемидом в культивируемых клетках S2 дрозофилы.
3. Установить внутриклеточную локализацию химерных белков Asp-eGFP и Patronin-eGFP при деполимеризации микротрубочек веретена деления и в ходе восстановления веретена деления после обработки колцемидом трансгенных линий клеток S2 дрозофилы.
Научная новизна работы
Впервые была изучена роль белков Asp и Patronin, связывающихся с минус-концами МТ, в процессе кинетохор-зависимого роста МТ. Было проанализировано влияние снижения уровня транскриптов генов asp и Patronin на кинетохор-зависимый повторный рост МТ после деполимеризации тубулина колцемидом. Показано, что белки Asp и Patronin необходимы для процесса кинетохор-зависимого роста МТ и их действие различно: белок Asp не принимает участие в нуклеации МТ вблизи кинетохоров и подавляет рост вновь сформированных МТ, а белок Patronin, наоборот, участвует в стабилизации новых МТ, образующихся вблизи кинетохоров, но не оказывает значительного влияния на скорость роста вновь образованных МТ.
В ходе исследования впервые проанализирована локализация химерного белка Asp-eGFP во время кинетохор-зависимого формирования ВД в клетках S2 Drosophila melanogaster. Методом повторного формирования ВД после колцемид-зависимой деполимеризации тубулина впервые показано, что на самых ранних этапах кинетохор-зависимого формирования МТ белок Asp-eGFP локализуется на кинетохорах.
На последующих этапах кинетохор-зависимого роста МТ белок Asp-eGFP связывается с минус-концами МТ и сшивает их между собой с образованием астро-подобных структур, что говорит о роли данного белка в фокусировке МТ на всех этапах формирования ВД, начиная с самых ранних.
В данной работе уточнена локализация белка Patronin на протяжении клеточного цикла в клетках S2. Особое внимание уделено локализации белка в митозе на стадии прометафазы. Впервые продемонстрировано, как прижизненно, так и на фиксированных препаратах клеток, что в митозе белок Patronin-eGFP связывается с кинетохорными волокнами на стадии прометафазы. Проанализирована локализация химерного белка Patronin-eGFP во время кинетохор-зависимого формирования ВД в клетках S2. Впервые показано, что белок связывается с МТ, образованными от кинетохоров, на более поздних стадиях сборки ВД, когда МТ сформировали длинные пучки.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Результаты данной работы расширяют список молекулярных участников процесса кинетохор-зависимой нуклеации МТ в клетках S2, а также позволяют углубить понимание механики самого процесса кинетохор-зависимого роста МТ. Поскольку изучаемые белки являются эволюционно консервативными, полученные данные способствуют формированию более полного представления о протекании митоза у эукариот. Результаты данного исследования могут быть использованы в учебном процессе высшей школы.
Положение, выносимое на защиту
Белки Asp и Patronin участвуют в процессе кинетохор-зависимого роста микротрубочек во время митоза клеток S2 дрозофилы: белок Asp необходим для фокусировки минус-концов микротрубочек с самых ранних стадий их формирования вблизи хромосом, а белок Patronin - для стабилизации минус-концов микротрубочек, начиная со стадии прометафазы.
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Роль белков Eb1, Mars, Non3, Mei-38 и Mast в кинетохор-зависимом формировании микротрубочек веретена деления в культуре клеток S2 Drosophila melanogaster2023 год, кандидат наук Попова Юлия Владимировна
Роль белков RCD1, RCD5 и MBD-R2 комплекса NSL в митозе культивируемых клеток S2 Drosophila melanogaster2020 год, кандидат наук Павлова Гера Алексеевна
Взаимодействие кинезина CENP-E и белкового комплекса Daml с динамическими концами микротрубочек2013 год, кандидат наук Гудимчук, Никита Борисович
Изучение взаимодействия микротрубочек с белками кинетохорного комплекса2015 год, кандидат наук Зайцев, Анатолий Владимирович
Взаимодействие кинетохоров и микротрубочек: новый механизм движения хромосом2009 год, кандидат биологических наук Жуденков, Кирилл Владимирович
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль белков Asp и Patronin в процессе кинетохор-зависимого роста микротрубочек веретена деления в культуре клеток S2 Drosophila melanogaster»
Апробация работы
Результаты работы были представлены на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Перспективы развития фундаментальных наук" (Томск, Новосибирск, 2015), международной конференции «Chromosome and mitosis» (Новосибирск, Россия, 2016, 2019), V Съезде биохимиков России (Сочи, Россия, 2016),
международной конференции «Chromosome» (Новосибирск, Россия, 2015, 2018), 11th International conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology «BGRS\SB-2018» (Новосибирск, Россия, 2018):
1. Razuvaeva A.V., Pavlova G.A., Popova J.V., Andreyeva E.N., Gatti M, Pindyurin A.V.The role of Patronin in the process of kinetochore-driven microtubule formation in Drosophila S2 cells. International mini-conference "Chromosomes and Mitosis - 2019". Abstracts book (ISBN 978-5-4437-0971-0). Novosibirsk, 2019. P.16-17.
2. Razuvaeva A, Pavlova G, Popova J, Yarinich L, Lebedev M, Andreyeva E, Anders A, Gatti M, Pindyurin A. The roles of Asp and Patronin in mitotic spindle formation in Drosophila. (doi: 10.18699/BGRSSB-2018-195) Proceedings of the Eleventh international conference "Bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology" (BGRS\SB-2018), Novosibirsk, 2018, P.225.
3. Разуваева А, Павлова Г, Попова Ю, Яринич Л, Лебедев М, Андреева Е, Андерс А, Гатти М, Пиндюрин А. Роль белков Asp и Patronin в формировании митотического веретена деления у Drosophila. Материалы международной конференции "Хромосома 2018". Новосибирск, 2018. с. 167.
4. Razuvaeva A.V., Pavlova G.A., Munzarova A.F., Popova J.V., Renda F., Somma P., Pindyurin A.V., Gatti M. Analysis of the inVvement of kinesin-like proteins in cell division of Drosophila S2 cells. International mini-conference "Chromosomes and Mitosis - 2016", November 25, 2016, Novosibirsk.
5. Попова Ю.В., Павлова Г.А., Мунзарова А.Ф., Разуваева А.В., Ренда Ф., Сомма М.П., Пиндюрин А.В., Гатти М. Исследование генетического контроля кинетохор-зависимого роста микротрубочек в культуре клеток S2 Drosophila melanogaster при помощи РНК-интерференции // Научные труды V Съезда Биохимиков России. -2016.-с. 71.
6. Павлова Г.А., Попова Ю.В., Мунзарова А.Ф., Галимова Ю.А., Разуваева А.В., Ренда Ф., Сомма М.П., Пиндюрин А.В., Гатти М. Факторы, обусловливающие характер повторного роста микротрубочек веретена деления после деполимеризации тубулина у Drosophila melanogaster // Научные труды V Съезда биохимиков России. - 2016. - с. 70.
7. Разуваева А.В. Изучение роли белков Klp67A и Mast в процессе кинетохор-зависимого роста микротрубочек у Drosophila melanogaster. XII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Перспективы развития фундаментальных наук", 21-24 апреля 2015, Томск.
Публикации по теме работы
По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы в изданиях, индексируемых в научных базах данных «Scopus», «Web of Science» и РИНЦ:
1. Razuvaeva A.V., Graziadio L., Palumbo V., Pavlova G.A., Popova J.V., Pindyurin A.V., Bonaccorsi S., Somma M.P., Gatti M. The multiple mitotic roles of the ASPM orthologous proteins: insight into the etiology of ASPM-dependent microcephaly. (doi: 10.3390/cells12060922) Cells 12:922, 2023.
2. Popova J.V., Pavlova G.A., Razuvaeva A.V., Yarinich L.A., Andreyeva E.N., Anders A.F., Galimova Y.A., Renda F, Somma M.P., Pindyurin A.V., Gatti M. Genetic control of kinetochore-driven microtubule growth in Drosophila mitosis. (doi: 10.3390/cells11142127) Cells 11(14): 2127, 2022.
3. Pavlova G.A., Razuvaeva A.V., Popova J.V., Andreyeva E.N., Yarinich L.A., Lebedev M.O., Pellacani C., Bonaccorsi S., Somma M.P., Gatti M., Pindyurin A.V.The role of Patronin in Drosophila mitosis. (doi: 10.1186/s12860-019-0189-0) BMC Mol Cell Biol 20 (Suppl 1): 7, 2019.
Вклад автора
Автор диссертационной работы самостоятельно выполнила большинство этапов настоящей работы: получение двуцепочечной РНК (дцРНК), специфичных к исследуемым генам, культивирование клеточных линий S2 дрозофилы, проведение процедуры РНК-интерференции, деполимеризация микротрубочек колцемидом, индукция синтеза химерных белков в трансгенных линиях клеток, приготовление цитологических препаратов с их последующим непрямым иммуноокрашиванием, флуоресцентная и конфокальная микроскопия препаратов фиксированных клеток, обработка и анализ полученных результатов. Конфокальная прижизненная микроскопия была проведена самостоятельно либо совместно с Андреевой Е.Н. Трансгенные клеточные линии были получены Яринич Л.А и Лебедевым М.О. Подготовка публикаций осуществлялась автором совместно с Гатти М., Пиндюриным А.В., Павловой Г.А, Поповой Ю.В., Андреевой Е.Н.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, обзора использованных материалов и методов, результатов,
обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 205 наименований. Работа содержит 36 рисунков и 5 таблиц.
Благодарности
Автор диссертационной работы выражает искреннюю благодарность следующим лицам: профессору Маурицио Гатти (университет La Sapienza, Рим, Италия), руководителю проекта «Механизмы кинетохор-зависимого образования микротрубочек у DrosopЫla» (поддержанного в 2014-2016 гг. грантом Правительства РФ, N0 14.Z50.31.0005), в рамках которого выполнялась данная работа, за то, что был идейным вдохновителем работы; к.б.н. А.В. Пиндюрину за научную консультацию при выполнении всех этапов настоящего исследования; к.б.н. Е.Н. Андреевой за обучение методам микроскопии и помощь в проведении экспериментов, а также за руководство при подготовке диссертации; Г.А. Павловой, Ю.В. Поповой, А.Ф. Андерс, Ю.А. Галимовой, Ф. Ренда за помощь в проведении экспериментов и ценные обсуждения, а также всем сотрудникам лаборатории клеточного деления ИМКБ СО РАН за дружескую атмосферу и поддержку во время выполнения исследования. Глубокую благодарность за моральную поддержку автор выражает своей семье.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Митоз
Период существования клетки от момента её образования путём деления материнской клетки до собственного деления или гибели называется клеточным циклом. Канонический клеточный цикл делится на интерфазу и митоз. Во время интерфазы происходит рост клетки (G1 фаза), репликация ДНК и удвоение центриолей (S фаза). После S фазы, во время фазы G2 происходит быстрый клеточный рост и синтез белка (Malumbres, 2020; Milletti et al., 2023).
Митоз - это процесс непрямого деления соматических клеток эукариот, в результате которого из одной диплоидной материнской клетки образуются две дочерние клетки с таким же набором хромосом. Процесс митоза подразделяют на отдельные фазы: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза (анафаза А и В) и телофаза (Рис. 1) (Walczak et al., 2010; Mcintosh, 2016; Malumbres, 2020). В интерфазе большая часть хроматина деконденсирована в ядре, микротрубочки в цитоплазме организованы в радиальный массив, исходящий от центросомы. Во время профазы реплицированные хромосомы, каждая состоящая из двух тесно ассоциированных сестринских хроматид, конденсируются. Во время поздней профазы на центромере каждой хромосомы собирается белковая структура, называемая кинетохором. Снаружи ядра каждая из двух центросом начинает инициировать образование астральных MT, что приводит к расхождению центросом к противоположным полюсам клетки. У большинства многоклеточных организмов прометафаза начинается сразу после распада ядерной оболочки, что позволяет МТ взаимодействовать с конденсированными хромосомами (Walczak et al., 2010). Присоединение сестринских кинетохоров к МТ, растущим от противоположных полюсов ВД, приводит к правильной ориентации хромосом и, в конечном счёте, к их выстраиванию в экваториальной плоскости. Веретено деления при этом приобретает типичную веретенообразную форму (Marques, Pedrosa-Harand, 2016). Процесс выравнивания хромосом в экваториальной плоскости клетки происходит во время метафазы. Специальный белковый комплекс SAC отслеживает присоединение хромосом к митотическому веретену и не позволяет клетке вступить в анафазу до тех пор, пока каждая хромосома не будет симметрично присоединена к обоим полюсам ВД. Вскоре после сборки хромосом в экваториальной плоскости клетка вступает в анафазу, и сестринские хроматиды начинают расходиться к противоположным полюсам. Начальное движение хромосом к полюсам происходит в анафазе А и обеспечивается укорочением кинетохорных МТ,
Рисунок 1. Динамика МТ цитоскелета (обозначены коричневым цветом) во время митоза
((Malumbres, 2020), с изменениями).
которые тянут хромосомы к полюсам ВД (Walczak et al., 2010). Вскоре после того, как наборы дочерних хроматид несколько дистанцировались друг от друга, начинается анафаза В, во время которой происходит удлинение веретена деления либо за счет удлинения межполюсных МТ, либо за счёт кортикальной тянущей силы астральных МТ, в зависимости от организма (Vukusic, Tolic, 2021). В телофазе, дочерние хромосомы, разделенные на две равные группы на противоположных концах клетки, начинают деконденсироваться, и ядерная оболочка вновь собирается вокруг каждой из групп хромосом, образуя два дочерних ядра (Walczak et al., 2010). После разделения ядра (кариокинез) в клетках обычно происходит разделение цитоплазмы (цитокинез) между двумя дочерними клетками. В клетках животных цитокинез опосредован сжатием сократительного актомиозинового кольца. Оно, как правило, формируется непосредственно под цитоплазматической мембраной на экваторе делящейся клетки. При сокращении актомиозинового кольца образуется борозда деления, которая инвагинирует до тех пор, пока две дочерние клетки не останутся соединены тонким цитоплазматическим мостиком, называемым средним телом (the midbody). Наконец, расщепление среднего тела приводит к полному разделению двух дочерних клеток и завершает митоз (Fededa, Gerlich, 2012).
Вариант митоза, при котором разделение хромосом между дочерними клетками происходит в цитоплазме после распада ядерной оболочки, называют открытым. Высшие эукариоты претерпевают открытый митоз, в котором ядерная оболочка полностью разбирается при переходе G2/M и не собирается до тех пор, пока ДНК не будет деконденсирована в телофазе/Gl. Существует и другой вариант митоза, закрытый, при котором разделение генетического материала происходит внутри интактной ядерной оболочки. В таком случае тубулин и митотические киназы перемещаются в ядро только во время митоза через ядерный поровый комплекс (Boettcher, Barral, 2013; Sazer et al., 2014). Закрытый митоз происходит у большинства грибов и дрожжей. В раннем эмбриогенезе дрозофилы встречается промежуточный вариант, когда ядерная оболочка распадается не полностью, но это не мешает МТ проникнуть внутрь (Stafstrom, Staehelin, 1984).
1.2. Строение веретена деления
1.2.1. Микротрубочки
Основу ВД составляют микротрубочки, которые состоят из полимеров белков а- и в-тубулина (Kristensson, 2021). Гетеродимеры а- и в-тубулина уложены по принципу «голова к хвосту» и таким образом формируют протофиламенты. Микротрубочка традиционно состоит из 13 протофиламентов, однако в клетках, in vivo, протофиламентов в составе МТ может быть меньше или больше (Goodson, Jonasson, 2018). Внешний диаметр МТ составляет около 25 нм, внутренний - около 15 нм. Небольшое боковое смещение между гетеродимерами а- и в-тубулина вызывает псевдо-спиральное расположение с нарушением непрерывности полотна МТ, называемого швом (Рис. 2). Полученный полимер (микротрубочка) является полярным: конец МТ, на котором расположен в-тубулин, называется плюс-концом, а противоположный конец с расположенным там а-тубулином -минус-концом. МТ может расти или разбираться за счёт добавления или отсоединения тубулиновых димеров. В экспериментах in vitro в присутствии растворенного тубулина и гуанозинтрифосфата (ГТФ) микротрубочка может расти с обоих концов, но с разной скоростью: плюс-конец растёт быстрее, а минус-конец медленнее (Рис. 2). В живых клетках плюс-конец МТ может и расти, и разбираться, минус же конец МТ преимущественно может лишь деполимеризоваться, так как его способность к росту сильно ограничена (Dammerman et al., 2003).
МТ проявляют так называемую динамическую нестабильность, при которой фазы роста и разборки МТ стохастически сменяются между собой. Взаимодействие между ГТФ-
связанным в-тубулином на конце существующей МТ и а-тубулином в поступающем ав-гетеродимере с некоторой задержкой индуцирует гидролиз ГТФ и высвобождение фосфата, что приводит к формированию ГТФ-богатого района на растущем конце МТ, называемым ГТФ-кэпом. Потеря или уменьшение размера этого кэпа индуцирует переход от роста к разборке МТ, называемый катастрофой. Обратный переход от разборки к росту называется восстановлением (Nogales, 2015).
"ГТФ tan"
I-'-1
+ донец cfi
« é>
Полимеризация
со
Депплимеризацир
ГДФ-1у5улии ГТФ-7у6улин П^||р|р>|ни ми in
ооосоооо
Рисунок 2. Строение МТ и её динамика ((Roostalu, Surrey, 2017), с изменениями).
Имеется несколько моделей, объясняющих, почему ГТФ-связанный тубулин оказывает стабилизирующее действие на структуру МТ. Согласно классической модели (allosteric model) при гидролизе ГТФ конформация тубулинового димера становится изогнутой, что дестабилизирует МТ и способствует её разборке. В альтернативной модели (lattice model) неполимеризованый тубулиновый димер имеет изогнутую конформацию, вне зависимости от того, связан он с ГТФ или ГДФ, а во время полимеризации его конформация становится прямой. В рамках этой модели гидролиз ГТФ влияет не на кривизну димера тубулина, а на гибкость связей между димерами тубулина в одном протофиламенте или на боковые связи между тубулинами (Brouhard, Rice, 2018; Gudimchuk, Mcintosh, 2021).
Модель ГТФ-кэпа (Рис. 2) объясняет большинство особенностей поведения МТ. Однако, появляется всё больше свидетельств того, что динамическая нестабильность МТ дополнительно контролируется ультраструктурой конца МТ. Одним из главных
наблюдений является феномен, названный "старением МТ" - увеличение вероятности катастрофы МТ по мере её удлинения (Odde et al., 1995). Считается, что источником этого является накопление некоторых дефектов или дестабилизирующих событий на конце МТ. Природа этих событий на данный момент неясна и, чтобы её установить, необходимо понять структуру конца МТ. Устройство растущего конца МТ активно изучается на данной момент (Gudimchuk, Mcintosh, 2021) и является очень актуальным, поскольку динамическая нестабильность МТ имеет важное значение для ряда клеточных процессов, таких как разделение хромосом, ремоделирование организации цитоскелета во время митоза и исследование внеклеточной среды (Mitchison, Kirschner, 1984).
В зрелом митотическом веретене на основании набора критериев (положение, организация, функциональность) выделяется три отдельных подкласса МТ: астральные МТ, межполюсные МТ и кинетохорные волокна (k-волокна) (Meunier, Vernos, 2012). Астральные МТ берут своё начало от одной из двух центросом и простираются к клеточному кортексу. Они необходимы для разделения центросом и позиционирования ВД, а также играют важную роль в поляризованных клетках и во время асимметричных делений (Meunier, Vernos, 2012). Межполюсные МТ берут начало от центросом и простираются до центра ВД, где они перекрываются с МТ, растущими от противоположного полюса. Межполюсные МТ являются наиболее представленным классом МТ ВД и составляют основное тело ВД в большинстве систем (например, ВД в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis на 95% состоит из межполюсных МТ). Межполюсные МТ имеют множество функций, в том числе установление и поддержание биполярности ВД, а также играют роль в выравнивании хромосом в экваториальной плоскости (Meunier, Vernos, 2012). k-волокна представляют собой пучки параллельных МТ, основная функция которых - прикрепить хромосомы к двум полюсам ВД и разделить сестринские хроматиды между дочерними клетками. Количество МТ в одном кинетохорном волокне может различаться в зависимости от организма и типа клеток: у Saccharomyces cerevisiae k-волокно состоит из одной МТ (Westermann et al., 2007), в сперматоцитах дрозофилы насчитывается 5-6 МТ (Lin et al., 1981), в клетках S2 дрозофилы - 11-15 МТ (Maiato et al., 2006; Strunov et al., 2018), у человека - 20-40 МТ (McDonald et al., 1992; McEwen et al., 1997). Внутри одного k-волокна МТ удерживаются вместе при помощи специальных белковых комплексов (Booth et al., 2011; Nixon et al., 2015), что обеспечивает его высокую стабильность. Это необходимо для поддержания правильного присоединения хромосом к ВД, а также для поддержания организации ВД (Meunier, Vernos, 2012).
1.2.2. Центросома
Роль полюсов ВД у животных выполняют центросомы - органеллы, которые являются первичными центрами организации МТ и регулируют их нуклеацию и пространственную организацию. Центросомы состоят из пары перпендикулярно расположенных центриолей, окруженных множеством белков - перицентриолярным материалом (ПЦМ). ПЦМ - это ключевая структура, которая заякоривает и инициирует образование МТ во время интерфазы и митоза.
Методами микроскопии сверхвысокого разрешения (в частности, 3D SIM и STORM) было продемонстрировано сложное внутреннее устройство интерфазного ПЦМ в составе центросомы. Так, интерфазные белки ПЦМ, такие как CEP120, CEP192, CEP152, CDK5RAP2, NEDD1 и Y-тубулин, образуют концентрические слои вокруг центриолей, а другой набор белков (Plp и Asl у дрозофилы и PCNT у человека) формирует спицеподобные структуры, простирающиеся от стенки центриоли до внешнего слоя интерфазного ПЦМ (Рис. 3) (Lawo et al., 2012; Mennella et al., 2012). Толщина интерфазного ПЦМ составляет приблизительно 100 нм. Внешние три слоя интерфазного ПЦМ, состоящие из CDK5RAP2, NEDD1 и у-тубулина, необходимы для нуклеации и заякоривания МТ (Rale et al., 2018).
СЕР120
СЕР152
CDK5RAP2
Материнская центрноль
Разрыв ПЦМ
Дистальное направление
Проксимальное направление
PCNT
Дочерняя центриоль
Рисунок 3. Организация интерфазной центросомы ((Ьамго et а1., 2012), с изменениями). «С» и «№> обозначают С- и вконец белка РС№Г.
При переходе от интерфазы к митозу происходит созревание центросомы - процесс, при котором увеличивается размер ПЦМ и его способность инициировать рост МТ. Созревание центросомы начинается на стадии клеточного цикла G2 и характеризуется постепенным расширением ПЦМ посредством усиленного включения его компонентов, в
частности, таких белков как CDK5RAP2 (Cnn у Drosophila), NEDD1 и комплекса yturc. Этот процесс регулируется митотическими киназами Plk (Polo-like kinase) и Aurora A (Woodroof et al., 2014; Rale et al., 2018). В процессе созревания центросомы митотический ПЦМ приобретает аморфный и рыхлый внешний вид, сильно отличающийся от высокоструктурированного интерфазного ПЦМ.
Белок Y-тубулин является одним из основных белков ПЦМ, необходимых для нуклеации МТ. Большинство молекул Y-тубулина является цитоплазматическими и существуют в виде кольцевых комплексов yturc. Однако комплекс yturc лишен значительной МТ-нуклеирующей активности до тех пор, пока не будет привлечен к центросоме (Tovey, Conduit, 2018). Комплекс yturc позвоночных представляет из себя конусообразный каркас, состоящий из субъединиц белков GCP2-6 (gamma-tubulin complex proteins 2-6) в определенной стехиометрии и порядке: (GCP2-3)4-GCP4-GCP5-GCP4-GCP6-(GCP2-3)i. Каждый GCP белок координирует одну молекулу Y-тубулина через свой С-концевой мотив. В просвете комплекса yTuRC находится структурный мостик, образованный двумя молекулами белка MZT1 и молекулой актина (Liu et al., 2021). Считается, что внешнее кольцо из 14 молекул Y-тубулина в yturc обеспечивает матрицу, которая непосредственно взаимодействует с а-субъединицами первого димера тубулиновой решетки MT (Bettencourt-Dias, Glover, 2007).
После завершения митоза МТ-опосредованные кортикальные силы разрывают ПЦМ, и фосфатазы (PP1, PP4 и другие) удаляют опосредованное киназой Plk фосфорилирование со структурных белков ПЦМ. Эти две активности (кортикальные силы и дефосфо-рилирование) запускают быструю разборку митотического ПЦМ (Woodruff et al., 2014).
1.2.3. Кинетохор
МТ соединяют полюса ВД с хромосомами, присоединяясь к последним посредством взаимодействия с кинетохорами, которые являются высококонсервативными мульти-субъединичными белковыми структурами. Кинетохор позвоночных собирается на центромере во время митоза и состоит из более чем ста белков (Cheeseman, 2014). При помощи электронной микроскопии было показано, что кинетохоры позвоночных имеют слоистую структуру с электронно-плотными внутренней и внешней пластинками и электронно-прозрачным средним слоем (Brinkley, Stubblefield, 1966; Rieder, 2005) (Рис. 4). Кинетохоры опосредуют силы для движения хромосом и формирует сигнал SAC, задерживая вход в анафазу до тех пор, пока все хромосомы не будут прикреплены к ВД.
Точное взаимодействия кинетохоров и МТ обеспечивает правильное протекание митоза (O'Connell et al., 2012).
Рисунок 4. Строение кинетохора позвоночных ((Hara, Fukagawa, 2020), с изменениями). А Сегрегация хромосом во время митоза и трехслойная структура кинетохора. Б Модель базовой структуры кинетохора. HIKM - субкомплекс белков CENP-H, CENP-I, CENP-K и CENP-M, LN - субкомплекс белков CENP-L и CENP-N, OPQRU - субкомплекс белков CENP-O, CENP-P, CENP-Q, CENP-R и CENP-U, WSX - субкомплекс белков CENP-W, CENP-S и CENP-X.
Функциональной основой для формирования кинетохоров в митозе у эукариот являются центромерные участки хромосом. Центромеры определяются эпигинетечески и характеризуются наличием варианта гистона H3 - белка CENP-A (Centromere protein A). Гомологи CENP-A были найдены у всех эукариот от дрожжей до человека. Делеция или мутация гена CENP-A приводит к тому, что другие кинетохорные компоненты не привлекаются к центромере (De Wulf, Earnshaw, 2009). У позвоночных вместе с белком
CENP-A в течение всего клеточного цикла колокализуется ряд кинетохорных белков. Эти белки образуют комплекс, постоянно ассоциированный с центромерой (the constitutive centromere-associated network, CCAN) (Рис. 4,5). Комплекс CCAN, состоящий из 16 субъединиц, собирается на центромере до наступления G2 фазы и работает как платформа для сборки МТ-связывающих белков. Когда клетка вступает в митоз, белки внешнего кинетохора быстро собираются на этой платформе, а при выходе из митоза - быстро разбираются (Cheeseman, Desai, 2008; Cheeseman, 2014).
Рисунок 5. Сравнение молекулярного строения внешнего и внутреннего кинетохора человека (слева) и дрозофилы (справа) ((Kyriacou, Heun, 2023), с изменениями). LN - субкомплекс белков CENP-L и CENP-N, HIKM - субкомплекс белков CENP-H, CENP-I, CENP-K и CENP-M, SXTW - субкомплекс белков CENP-S, CENP-X, CENP-T и CENP-W, OPQUR - субкомплекс белков CENP-O, CENP-P, CENP-Q, CENP-U и CENP-R.
Взаимосвязь микротрубочек с комплексом CCAN обеспечивается за счёт комплекса KMN, который в свою очередь состоит из субкомплексов Knll, Mis12 и Ndc80 (Hara, Fukagawa, 2020). Субкомплекс Ndc80 является ключевым консервативным игроком в установлении прочного взаимодействия с МТ. В состав комплекса входит 4 субъединицы: белки Spc24, Spc25, Nuf2 и Ndc80. Субкомплекс формирует протяженные стержнеподобные структуры, где субъединицы Spc24-Spc25 обращены к внутреннему кинетохору, а Nuf2 и Ndc80 формируют димер, который отвечает за непосредственное связывание с МТ через домен CH (calponin homology) (Cheeseman, 2014). Нарушение в клетках функции субкомплекса Ndc80 приводит к значительным дефектам в способности МТ прикрепляться к хромосомам, что ведет к неправильному разделению хромосом и даже к полному сбою их сегрегации (DeLuca et al., 2002; Cheeseman, 2014).
Субкомплекс Mis12, состоящий из 4 субъединиц, связывается с одной стороны с субкомплексом Ndc80, а с другой - с компонентом комплекса CCAN, белком CENP-C, путем прямого взаимодействия (Рис. 4,5) (Cheeseman, 2014). Субкомплекс Knll привлекается к кинетохору через взаимодействие с субкомплексом Mis12. Субкомплекс Knll состоит из двух компонентов - белков Knll и Zwint. Основная роль белка Knll - это регуляция взаимодействия кинетохора с МТ путем привлечения других компонентов внешнего кинетохора, связанных с динамикой МТ и SAC (Cheeseman, 2014).
Помимо трехслойной структуры кинетохора, ультраструктурный анализ позволил выявить наличие волокнистой короны, исходящей от дистальной поверхности внешнего кинетохора и в отсутствии прикрепленных МТ простирающейся более чем на 100 нм в цитоплазму. Волокнистая корона включает в себя моторные белки (CENP-E, динеин), комплекс Rod-Zw10-Zwilch (RZZ), белки SAC и белки, ассоциированные с микротрубочками. При прикреплении МТ к кинетохорам размер волокнистой короны уменьшается, что позволяет предположить, что морфология кинетохоров может динамически изменяться во время митоза (Hara, Fukagawa, 2020).
Строение кинетохора у дрозофилы менее сложное по сравнению с их человеческим аналогом (Рис. 5) (Kyriacou, Heun, 2023). У дрозофилы имеется гомолог CENP-A, который был описан как Н3-подобный белок, специфически локализующийся на центромерах, и названный Cid (centromere identifier) (Henikoff et al., 2000). Внутренний кинетохор дрозофилы состоит из белка dCENP-C, в то время как у человека внутренний кинетохор представлен мультисубъединичным белковым комплексом CCAN, включающим в себя дополнительно 15 белков помимо CENP-C.
В отличие от внутренних кинетохоров, внешние кинетохоры у дрозофилы и человека, представленные комплексом KMN, более сходны по составу белков. Первым к центромере привлекается субкомплекс MIND/Mis12, который присоединяется к основным кинетохорным белкам Cid и dCENP-C. Затем присоединяется субкомплекс Ndc80 (Schittenhelm et al., 2007). У дрожжей и человека субкомплекс Ndc80 содержит четыре белка (Ndc80, Nuf2, Spc24 и Spc25). У дрозофилы идентифицировать канонический гомолог Spc24 не удалось (Cheeseman et al., 2006); по-видимому, субкомплекс dNdc80 связывается с субкомплексами dKnll и dMis-12 только через белок dSpc25. Субкомплекс Knll, представленный у человека белками Knll и Zwint, у дрозофилы состоит из белка Spc105, который закрепляет субкомплекс dMis-l2 на МТ. Гомолог Zwint не был обнаружен (Kyriacou, Heun, 2023). Таким образом, внешний слой кинетохора (комплекс KMN) и часть
кинетохора, непосредственно отвечающая за прикрепление к микротрубочкам, в значительной степени сохранены и напоминают эти комплексы у других видов (Kyriacou, Heun, 2023).
1.2.4. Контрольная точка сборки веретена деления
В клеточном цикле эукариот имеются так называемые «контрольные точки», в которых с помощью сигнальных путей отслеживается успешное завершение событий в одной фазе клеточного цикла перед переходом к следующей фазе (Malumbres, 2020). Функции контрольных точек не ограничиваются мониторингом нормального протекания клеточного цикла; они могут быть активированы как внешними, так и внутренними сигналами стресса. В период «контрольной точки» сенсорные белки обнаруживают повреждения и одновременно запускают два процесса: привлекают дополнительные эффекторные комплексы для устранения проблем и активируют каскад событий, вызывающий временную остановку клеточного цикла. В определенных ситуациях, которые определяются типом клеток и степенью повреждения, временная остановка клеточного цикла в конечном итоге может стать постоянной (процесс, называемый старением) или привести к клеточной гибели. Существуют несколько контрольных точек на различных стадиях клеточного цикла - при переходе G1/S, в S-фазе, при переходе G2/M и в M-фазе (Malumbres, 2020).
Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe2008 год, кандидат биологических наук Федянина, Ольга Сергеевна
Роль кинетохорассоциированного белка CENP-E в митотическом делении клеток млекопитающих2005 год, кандидат биологических наук Ладыгина, Надежда Григорьевна
Индукция патологических митозов и изменение клеточного цикла в первичных фибробластах человека, инфицированных цитомегаловирусом2001 год, кандидат биологических наук Барсукова, Анна Сергеевна
Динамика микротрубочек и механизмы транспорта хромосом при делении клеток2022 год, доктор наук Гудимчук Никита Борисович
Регуляция сборки и разборки микротрубочек в клетках1984 год, доктор биологических наук Гельфанд, Владимир Израилевич
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Разуваева Алена Викторовна, 2026 год
■л -
$ Шь - -
Щ
щшь т
л ч ЩР
Рисунок 25. Локализация белка Patronin-eGFP в клетках S2 на фоне снижения уровня транскриптов генов, кодирующих белки, действующие на минус-концах MT (Klp10A, asp и dgt6), и локализация белка Asp-eGFP в условиях снижения уровня транскриптов гена Patronin (флуоресцентная микроскопия). Клетки, нарабатывающие Patronin-eGFP или Asp-eGFP, были иммуноокрашены антителами к а-тубулину (красный) и eGFP (зелёный), ДНК была окрашена DAPI (синий). Размер шкалы 5 мкм.
Для определения функциональных взаимосвязей между данными белками, мы исследовали митотический фенотип, возникавший в результате РНКи гена dgt6 и двойной РНКи против генов Patronin и dgt6. В соответствии с результатами, полученными ранее (Goshima et al. 2008; Bucciarelli et al., 2009), клетки, истощенные по белку Dgt6, демонстрировали низкую долю клеток на стадиях ана- и телофазы, а также относительно высокую частоту встречаемости ПАТ (Табл. 5). Этот фенотип характерен для клеток, где нарушено взаимодействие кинетохор-МТ, например, в клетках, лишенных центромерного гистона Cid (CENP-A), кинетохорных компонентов Ndc80, Nuf2 и Kmn1 или кинетохор-
ассоциированной деполимеразы МТ Klp67A, а также транскрипционных факторов, влияющих на экспрессию генов, необходимых для сборки центромеры/кинетохора (Somma et al., 2008; Renda et al., 2017; Pavlova et al., 2019). Двойная РНКи против генов Patronin и dgt6 снижала частоту встречаемости ПАТ и увеличивала долю клеток на стадиях ана- и телофазы по сравнению с клетками после РНКи гена dgt6 (Табл. 5). Нужно отметить, что данные показатели по-прежнему достоверно отличались от контроля и «спасение» мутантного фенотипа было неполным. Это говорит о том, что на фоне двойной РНКи против генов Patronin и dgt6 взаимодействие между МТ и кинетохорами все ещё остаётся нарушенным.
Веретена деления в клетках S2 после одновременной РНКи генов Patronin и dgt6 соединяли в себе дефекты, наблюдаемые после РНКи отдельных генов. С одной стороны, плотность МТ ВД после двойной РНКи была ниже, чем в контроле, как и в случае РНКи гена dgt6. С другой стороны, длина ВД после двойной РНКи была ниже, чем в контроле, как в случае РНКи гена Patronin (11.3 мкм по сравнению с 13.7 мкм в контроле, p< 0.05 согласно U-критерию Манна-Уитни, количество проанализированных клеток после одновременной РНКи генов dgt6 и Patronin - 91, в контроле - 365). Таким образом, результаты эксперимента позволяют предположить, что белки Patronin и Dgt6 преимущественно играют независимые роли во время митоза.
3.2.4. Кинетохор-зависимый повторный рост микротрубочек после деполимеризации веретена деления колцемидом
Опубликованные ранее (Ripoll et al., 1985; Gonzalez et al., 1998; Goshima et al., 2007; Somma et al., 2008; Goodwin, Vale, 2010; Renda et al., 2017) и полученные нами данные позволяют предполагать участие белков Asp и Patronin в процессе кинетохор-зависимого формирования МТ. В связи с этим мы изучили эффект РНКи-опосредованного снижения уровня транскриптов генов asp и Patronin на повторный рост микротрубочек после деполимеризации тубулина, индуцированной колцемидом. Предыдущие работы показали, что после обработки колцемидом центросомы не могут нуклеировать астральные МТ и можно непосредственно наблюдать кинетохор-зависимый рост микротрубочек в отсутствии центросомальной активности (Pavlova et al., 2016), что делает такую систему очень удобной для изучения процесса кинетохор-зависимой нуклеации МТ.
Клетки S2 без обработки и после РНКи генов asp и/или Patronin подвергали воздействию колцемидом в течение 3 ч. Затем клетки тщательно промывали для удаления
колцемида. Предварительные эксперименты, выполненные в нашей лаборатории на контрольных клетках S2, показали, что видимый повторный рост после деполимеризации тубулина колцемидом начинается через 20 мин после отмывки митостатика, а через 75 мин после отмывки в 60% клеток уже обнаруживаются частично или полностью повторно сформированные веретена деления. Учитывая эти данные, фиксацию проводили через 20, 30, 45 и 75 мин после удаления колцемида. Часть клеток фиксировали после обработки колцемидом до удаления митостатика, чтобы проверить степень деполимеризации МТ (время 0). Все клетки были иммуноокрашены на а-тубулин и на центросомный маркер Spd-2, дополнительно окрашены DAPI для детекции ДНК. Мы ограничили наши наблюдения клетками на стадии промета- и метафазы, поскольку кинетохоры клеток на этих стадиях митоза обладают способностью стимулировать образование k-волокон и сборку биполярного веретена деления (Pavlova et al., 2016).
В момент времени 0 более чем у 95% как контрольных, так и РНКи-обработанных клеток веретено было полностью деполимеризовано, в то время как в ~5% были обнаружены некоторые слабо флуоресцирующие остатки микротрубочек ВД. Эти результаты указывают на то, что процедура РНКи не влияет на индуцированную колцемидом деполимеризацию микротрубочек. Доля клеток с кинетохор-зависимым повторным ростом микротрубочек (КПРМТ), фиксированных в разное время после удаления колцемида, была различна. Клетками, положительными по КПРМТ, считались те, которые демонстрировали по крайней мере один яркий сигнал тубулина, связанный с кинетохорами.
После РНКи гена asp доля клеток, демонстрирующих КПРМТ, была в целом аналогична контрольной (Рис. 26). Исключение составляли клетки через 30 мин повторного роста, где кинетохор-зависимый повторный рост встречался статистически значимо реже, чем в контроле. Через 75 мин после отмывки колцемида практически все контрольные и подвергшиеся РНКи гена asp клетки демонстрировали КПРМТ (Рис. 26).
Spd-2 а-тубулин ДНК (белый)
20 мин
30 мин
45 мин
75 мин
120
- --Р 1С о"'
° Ь 100 с S к ^
§ X
го 2
I
-О Q.
с; s
Ш Q.
ё ь
U I О О
II
О
80
60
40
20
Patronin РНКи
20мин ЗОмин 45мин 75мин
20мин ЗОмин 45мин 75мин
Рисунок 26. Кинетохор-зависимый повторный рост МТ (КПРМТ) в клетках S2 после деполимеризации колцемидом. А Типичные микрофотографии клеток, демонстрирующих КПРМТ, фиксированных через 20, 30, 45 и 75 мин после удаления колцемида. Клетки были иммуноокрашены антителами к а-тубулину (зелёный) и центросомальному маркеру Spd-2 (красный), ДНК окрашена DAPI (белый). Размер шкалы 5 мкм. Б Относительная доля клеток, демонстрирующих КПРМТ, после РНК-интерференции (РНКи) генов asp или Patronin относительно контроля в разные временные точки после отмывки колцемида. Контроль был взят за 100%. ** обозначают статистически значимые различия со значением p< 0.01 в тесте/2. Числа сверху каждого столбца обозначают актуальную долю клеток (%) на стадии прометафазы, демонстрирующих КПРМТ. Данные получены из трёх независимых экспериментов. Общее число клеток, посчитанных в разные временные точки (число РНКи клеток/число контрольных клеток): для asp РНКи - 20 мин 847/835, 30 мин 630/626, 45 мин 434/420, 75 мин 419/419, для Patronin РНКи - 20 мин 830/865, 30 мин 770/830, 45 мин 579/619, 75 мин 594/638.
В условиях снижения уровня транскриптов гена Patronin доля клеток, показывающих КПРМТ, через 20, 30 и 45 мин после удаления колцемида была статистически значимо ниже, чем в контроле (Рис. 26). Эти результаты говорят о том, что клетки, лишенные белка Patronin, являются дефектными в кинетохор-зависимом формировании МТ. Однако стоит отметить, что белок Patronin, видимо, влияет на способность митотических клеток инициировать процесс кинетохор-зависимого роста МТ, но не ускорять его, поскольку через 75 мин после отмывки колцемида доля клеток с детектируемым КПРМТ практически не отличается от контроля (Рис. 26).
3.2.5. Паттерн кинетохор-зависимого повторного роста микротрубочек после деполимеризации веретена деления
Для того чтобы получить дополнительную информацию о роли изучаемых белков в процессе КПРМТ, был проанализирован паттерн повторного роста микротрубочек после колцемид-опосредованной деполимеризации. После деполимеризации тубулина, индуцированной колцемидом, повторное формирование микротрубочек в контрольных клетках начиналось около кинетохоров, которые становились тесно ассоциированными с маленькими точечными сигналами тубулина (Рис. 27). Эти сигналы тубулина затем увеличивались, формируя пучки тубулина и тубулиновые агрегаты, которые часто представляли из себя астро-подобные структуры (aster-like structures), где пучки МТ с одного конца соединены в единый центр, а другими концами радиально расходятся в стороны. Мы различали три типа фигур повторного роста МТ от кинетохоров: (1) «короткие пучки МТ» - кинетохор-ассоцированные одинарные и двойные точечные сигналы тубулина (или стержне-подобные сигналы размером с двойную точку), соответствующие начальному повторному росту МТ от одного или обоих сестринских кинетохоров; (2) «длинные пучки МТ» - пучки МТ, образованные в результате элонгации двойных точечных сигналов; (3) «кластеры МТ/астры», образованные в результате ассоциации и перекрытия повторно растущих пучков микротрубочек (Рис. 27). Стоит отметить, что в отличие от астр,
тубулин Ty6/flHK/Cid/Spd-2 тубулин Ty6/flHK/Cid/Spd-2
Рисунок 27. Различные паттерны кинетохор-зависимого повторного роста МТ после колцемид-опосредованной деполимеризации тубулина в клетках S2 через 30 мин после отмывки колцемида (конфокальная микроскопия, трёхмерная реконструкция из 10-15 оптических срезов). Клетки были иммуноокрашены антителами к центромерному маркеру Cid (красный), а-тубулину (зелёный) и центросомальному маркеру Spd-2 (белый), ДНК окрашена DAPI (синий). Показаны короткие пучки МТ (1), длинные пучки МТ (2) и кластеры МТ/астры (3,4). Размер шкалы 5 мкм.
формирующихся на полюсах ВД и содержащих в центре центросому, данные кластеры МТ не содержали в своем центре центромер, а, наоборот, были окружены центромерными сигналами (Рис. 27.3,4).
По ходу восстановления веретена деления кластеры МТ/астры объединяются, и из таких объединенных кластеров начинают исходить длинные пучки микротрубочек, что приводит к различным типам промежуточных структур МТ, включая множество так называемых «зонтикообразных» структур, в которых отрастающие пучки сходятся с одной стороны и расходятся с другой. Скорее всего, каждая из этих промежуточных фигур приведет к возникновению биполярного анастрального веретена деления. Например, в предыдущих исследованиях на клетках S2 дрозофилы было показано, что расходящиеся пучки МТ зонтикообразных структур удлиняются и постепенно сливаются, образуя второй полюс веретена (Mahoney et al., 2006; Goshima, Vale, 2003). Данное наблюдение было также подтверждено нами в данном исследовании. Мы проанализировали повторное формирование веретена деления после индуцированной колцемидом деполимеризации МТ не только на фиксированном материале, но и задокументировали это прижизненно. Для этого использовалась трансгенная линия клеток S2 дрозофилы, нарабатывающая химерный белок тубулин-eGFP (Рис. 28). В начале визуализации (~40 мин после отмывки колцемида; время 0:00) имеется всего несколько небольших очагов повторного роста тубулина, связанных с хромосомами. Эти пучки быстро растут, образуя кластеры МТ/астры (время 0:07), которые сливаются, образуя веретено деления, сфокусированное только на одном из полюсов (время 0:22). Пучки МТ на несфокусированном полюсе ВД постепенно сходятся, образуя второй
0:00 !- 0:07 0:17 0:22
0:32 0:41 0:47 0:59
Рисунок 28. Процесс повторного формирования веретена деления после деполимеризации МТ, индуцированной колцемидом (конфокальная микроскопия, оптический срез). Прижизненная микроскопия клетки S2, которая нарабатывает белок тубулин-eGFP, окрашенной красителем ДНК Hoechst 33342 (синий) (показано только для момента времени 0:00). Временной интервал, ч:мин. Размер шкалы 5 мкм.
полюс (время 0:32-0:59) (Рис. 28). Для проверки функциональности сформированного таким образом веретена деления, было выполнено несколько экспериментов с культивированием клеток S2 после обработки колцемидом и без неё. Плотность клеток и их жизнеспособность на протяжении культивирования не отличались в контрольных и опытных клетках, что говорит о том, что повторно сформированное после колцемид-опосредованной деполимеризации веретено деления является функциональным.
Как упоминалось выше, нами было выделено три класса фигур КПРМТ: короткие пучки микротрубочек, длинные пучки микротрубочек и кластеры МТ/астры. При фиксации контрольных клеток в различные временные точки после удаления колцемида клетки демонстрировали различную частоту встречаемости вышеописанных фигур. Через 20 мин клеток с КПРМТ было относительно немного, и они демонстрировали слабые сигналы тубулина (в основном короткие пучки микротрубочек). Через 30 и 45 мин от начала повторного роста появлялись короткие и длинные пучки микротрубочек и кластеры МТ/астры. Через 45 мин кластеры МТ/астры были более частыми и крупными, чем через 30 мин, и имели сложную морфологию. Через 75 мин у 60% клеток были обнаружены частично или полностью повторно сформированные веретена, в то время как у остальных 40% хромосомы были связаны с большими кластерами МТ/астрами (Рис. 27). Таким образом, для количественного определения КПРМТ в контрольных клетках и клетках, подвергшихся РНКи, было выбрано время через 30 мин после удаления колцемида, поскольку клетки в данной временной точке демонстрируют четкие кинетохор-ассоциированные сигналы тубулина, которые можно дифференцировать и исследовать на морфологию. Важно отметить, что контрольные и РНКи-обработанные клетки имеют очень схожий паттерн КПРМТ, который различается именно по частоте встречаемости различных фигур повторного роста на стадии прометафазы и метафазы (Рис. 29).
Клетки после РНКи гена asp показали значительное увеличение количества кластеров МТ/астр по сравнению с контролем (Рис. 30). В соответствии с этим доля коротких пучков МТ в условиях снижения уровня транскриптов гена asp была достоверно ниже, чем в контроле. В клетках, в которых был снижен уровень транскриптов гена Patronin, частота встречаемости коротких пучков МТ была выше, а длинных пучков МТ и кластеров МТ/астер - снижена, однако все выявленные различия статистически незначимы (Рис. 30).
А) Короткие и длинные пучки МТ Б) Кластеры МТ/астры
тубулин ДНК/5рс1-2/тубулин тубулин ДНК/5рс1-2/тубулин
Рисунок 29. Паттерн кинетохор-зависимого повторного роста МТ после колцемид-опосредованной деполимеризации тубулина в контрольных клетках и клетках после РНКи генов asp или Patronin (флуоресцентная микроскопия). Клетки S2 фиксировали через 30 мин после отмывки колцемида и окрашивали антителами к а-тубулину (зелёный) и центросомальному маркеру Spd-2 (красный), ДНК окрашена DAPI (синий). На панели А показаны короткие пучки МТ (короткая стрелка) и длинные пучки МТ (длинная стрелка). На панели Б показаны кластеры МТ/астры. Размер шкалы 5 мкм.
Рисунок 30. Среднее число различных фигур кинетохор-зависимого повторного роста МТ (КПРМТ) (короткие пучки МТ, длинные пучки МТ и кластеры МТ/астры), наблюдаемых через 30 мин после отмывки колцемида. Средние значения различных показателей КПРМТ были определены путем изучения только тех клеток, которые демонстрируют КПРМТ. Максимальное количество кластеров МТ/астр в одной клетке составляло три штуки. Данные получены по меньшей мере из трех независимых экспериментов. Пределы погрешностей отражают стандартную ошибку (SEM). Общее число проанализированных клеток следующее (число РНКи клеток/число контрольных клеток): для asp РНКи - 123/143, для гена Patronin РНКи - 113/124. Данные были проанализированы с помощью U-критерия Манна-Уитни; **, *** значимо при p< 0.01 и 0.001, соответственно.
3.2.6. Интенсивность сигнала флуоресцентно меченого тубулина, ассоциированного с хромосомами
Для более полной характеристики влияния белков Asp и Patronin на кинетохор-зависимый рост МТ в клетках, мы измерили флуоресценцию тубулина, ассоциированного с хромосомами в контрольных клетках и клетках, подвергшихся РНКи. Этот анализ был проведен только на клетках, которые демонстрировали КПРМТ, а именно, в анализе использовались клетки, демонстрирующие по крайней мере один кинетохор-ассоциированный сигнал тубулина, в то время как клетки без четких сигналов КПРМТ не анализировались (доли клеток, показывающих кинетохор-зависимый повторный рост МТ, после РНКи обозначены на Рис. 26). Клетки после РНКи гена asp показали значительное увеличение интенсивности флуоресценции (Рис. 31), что согласуется с увеличением частоты встречаемости в клетках кластеров MT/астр по сравнению с контролем (Рис. 30). В клетках, подвергшихся РНКи гена Patronin, которые демонстрировали характер повторного роста MT, сравнимый с контролем (Рис. 30), среднее значение сигнала интенсивности флуоресценции было достоверно ниже, чем в контрольных клетках (Рис. 31). Это может говорить о том, что в клетках, истощенных по белку Patronin, содержится меньше кинетохор-ассоциированных фокусов нуклеации МТ, чем в контрольных клетках. Также возможно, что эти фокусы нуклеации содержат в себе меньшее число микротрубочек или более короткие микротрубочки.
4.0-,
asp Patronin 93/78 109/122
Рисунок 31. Относительная интенсивность сигнала флуоресцентно меченого тубулина, ассоциированного с хромосомами, в клетках, демонстрирующих кинетохор-зависимый повторный рост микротрубочек. Данные получены из трех независимых экспериментов и нормированы на медианное значение в контрольных клетках (значение равно 1; обозначено красной линией). Общее число проанализированных клеток (число РНКи клеток/число контрольных клеток) указано в нижней части графика. Данные были проанализированы с помощью Ц-критерия Манна-Уитни; *, ** значимо при р< 0.05 и 0.01, соответственно.
3.3. Внутриклеточная локализация химерных белков Asp-eGFP и Patronin-eGFP в ходе восстановления веретена деления
Для того чтобы лучше разобраться в роли белков Asp и Patronin в процессе кинетохор-зависимого формирования МТ, эксперименты по повторному росту микротрубочек были выполнены в клетках, нарабатывающих а-тубулин и изучаемый белок (Asp или Patronin), слитые с mCherry и eGFP, соответственно. В этой системе была проанализирована локализация белков Asp и Patronin в течение КПРМТ. Клеточные линии, экспрессирующие оба трансгена под контролем индуцируемого медью промотора гена MtnA, обрабатывали 250 мМ раствором сульфата меди в течение 16-20 ч, подвергали воздействию колцемида в течение 3 ч и промывали. Часть клеток была зафиксирована в конце обработки колцемидом перед удалением митостатика для контроля степени деполимеризации тубулина (время 0). Фиксация на разных временных точках с момента удаления колцемида (через 30, 45, 90 и 120 мин) позволила нам проанализировать локализацию изучаемых белков на различных стадиях повторного формирования веретена деления, начиная с ранних, состоящих в основном из коротких пучков МТ, и заканчивая поздними стадиями, содержащими удлиненные пучки МТ, часто сходящиеся в полностью сформированное биполярное веретено деления.
Следуя этому плану эксперимента, сначала была исследована локализация белка Asp-eGFP при помощи непрямого иммуноокрашивания (Рис. 32 (нижняя панель), 33) и прижизненно (Рис. 32 (верхняя панель), Рис. 34). В момент времени 0 белок Asp-eGFP был сконцентрирован на кинетохорах или вблизи них в 50% клеток (n = 200; Рис. 32). На самых ранних стадиях КПРМТ белок Asp-eGFP продолжал оставаться на кинетохорах/ хромосомах, демонстрируя частичную колокализацию с начальными очагами полимеризации тубулина (Рис. 33 А1, А2, Б1). Затем белок Asp-eGFP обнаруживался в центре тубулиновых кластеров/астр (Рис. 33 А3, Б2-4, Рис. 34, время 0:00-0:18). При этом важно напомнить, что центромерные сигналы Cid (CENP-A) находились не в центре этих структур, как уже отмечалось выше (см.раздел 3.2.5.), а вместо этого окружали их (Рис. 33Б). Вероятно, что кластеры микротрубочек, формирующиеся в ходе повторного роста, образуются в результате сшивания минус-концов MT, исходящих от кинетохоров. Таким образом, эти кластеры МТ/астры имеют общие черты с полюсами веретена деления и могут рассматриваться как «мини-полюса ВД». По мере прогрессирования повторного роста микротрубочек белок Asp-eGFP ассоциировал с удлиненными пучками МТ и накапливался на их минус-концах (Рис. 33 A4, Рис. 34, время 0:24-0:55). Полученные
результаты позволяют предположить, что белок Asp локализуется на минус-концах MT на всех стадиях формирования веретена деления.
ДНК Asp-eGFP Asp/ДНК mCherry-тубулин Asp/тубулин
ДНК/Cid {белый ) Asp-eGFP Asp/Cid (белый)тС11еггу-тубулин Asp/тубулин
Рисунок 32. Локализация химерного белка Asp-eGFP после колцемид-опосредованной деполимеризации тубулина в трансгенной линии клеток S2, нарабатывающей Asp-eGFP (зелёный) и mCherry-тубулин (красный) (конфокальная микроскопия, трёхмерная реконструкция из 10-15 оптических срезов). На верхней панели показаны живые клетки S2, окрашенные прижизненным красителем ДНК Hoechst 33342 (синий). На нижней панели показаны клетки S2, которые были фиксированы перед отмывкой колцемида и иммуноокрашены антителами к eGFP (зелёный), центромерному маркеру Cid (белый) и а-тубулину (красный), ДНК окрашена DAPI (синий). Размер шкалы 5 мкм.
А тубулин Asp-eGFP туб/Asp/flHK тубулин Asp-eGFP туб/Азр/ДНК
Б
Рисунок 33. Локализация белка Asp-eGFP во время кинетохор-зависимого повторного роста МТ (КПРМТ) после деполимеризации тубулина, индуцированной колцемидом, в трансгенной линии клеток S2, нарабатывающей Asp-eGFP и mCherry-тубулин (конфокальная микроскопия, трёхмерная реконструкция из 10-15 оптических срезов). Клетки были иммуноокрашены антителами к а-тубулину (красный) и eGFP (зелёный), ДНК окрашена DAPI (синий). Размер шкалы 5 мкм. А Представлены характерные примеры ранней стадии КПРМТ (А1), более продвинутых стадий КПРМТ, характеризующихся присутствием кластеров МТ/астер (А2, А3) и различные варианты восстановления ВД после колцемид-опосредованной деполимеризации тубулина (А4-А6). Б Представлены характерные примеры ранних (Б1, Б2) и поздних (Б3, Б4) стадий восстановления веретена деления после деполимеризации МТ, вызванной колцемидом. Клетки были дополнительно окрашены антителами к маркеру центромер Cid (белый).
0:00 0:10 0:18
ф • » *«•
• р *
11 1» IX 11 1 I IV Asp
тубулин
024 » & Г 0:39 м w % 0:55 яг Jt Т*
Рисунок 34. Повторное формирование веретена деления после индуцированной колцемидом деполимеризации МТ в живой клетке S2, нарабатывающей Asp-eGFP (зелёный) и mCherry-тубулин (красный). ДНК окрашена прижизненным красителем Hoechst 33342 (синий) (показано только в момент времени 0:00). Конфокальная микроскопия, оптический срез. Временной интервал ч:мин. Размер шкалы 5 мкм.
Далее была исследована локализация белка Patronin-eGFP в ходе восстановления ВД после деполимеризации колцемидом. В момент времени 0 или на самых ранних стадиях КПРМТ клетки трансгенной линии S2, нарабатывающей химерный белок Patronin-eGFP, на стадии прометафазы и метафазы не имели яркого сигнала Patronin-eGFP. Сигналы Patronin-eGFP были детектированы во многих кластерах микротрубочках/астрах, но паттерн локализации сильно отличался от паттерна локализации белка Asp-eGFP: белок Patronin-eGFP локализовался в виде коротких Patronin-eGFP-позитивных фрагментов внутри кластеров МТ и часто был ассоциирован с удлиненными пучками микротрубочек, исходящими из тубулиновых кластеров/астр (Рис. 35). Эти наблюдения позволяют предположить, что белок Patronin-eGFP появляется на МТ, образованных кинетохор-зависимым образом, когда они представляют из себя уже длинные пучки, и перемещается вдоль этих пучков по мере их дальнейшего роста.
тСИегту-тубулин Ра^отп-еСРР туб/Ра1:готп/ДНК
1 4
2
3 х / / "'.*] р /
4 / » | ' ^ Д ' в
Рисунок 35. Локализация белка Patronin-eGFP в ходе повторного формирования ВД после деполимеризации тубулина, индуцированной колцемидом, в трансгенной линии клеток S2, нарабатывающей белок Райопт-eGFP и тО^пу-тубулин (конфокальная микроскопия, трёхмерная реконструкция из 10-15 оптических срезов). Клетки были иммуноокрашены антителами к а-тубулину (красный) и eGFP (зелёный), ДНК окрашена DAPI (синий). Размер шкалы 5 мкм.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Локализация белков Asp и Patronin в клеточном цикле
В данной работе была изучена локализация химерного белка Asp-eGFP во время митоза в живых и фиксированных клетках S2. Было показано, что с прометафазы до анафазы белок локализован на полюсах ВД, а во время телофазы находится на центральном веретене деления. Выявленный нами паттерн локализации белка Asp-eGFP согласуется с ранее опубликованными данными о локализации белка Asp в клетках S2, детектированной при помощи антител (Morales-Mulia, Scholey, 2005). Это говорит о том, что подобранные условия экспрессии трансгена физиологичны и не приводят к нарушению процесса клеточного деления. Кроме того, нами было обнаружено, что в интерфазе белок Asp-eGFP локализуется в ядре, за исключением зоны плотного фибриллярного компонента ядрышка. Ранее у самцов дрозофилы отмечалась ядерная локализация белка Asp в интерфазе I мейоза (Wakefield et al., 2001). Ядерная локализация была также показана для ортологов Asp -белка Aspm в клетках нейронных предшественников постнатального мозжечка мыши (Williams et al., 2015) и белка человека ASPM в клетках HeLa и U2OS (Zhong et al., 2005; Higgins et al., 2010; Xu et al., 2021). Однако об отсутствии белка Aspm/ASPM в ядрышке в вышеуказанных статьях не сообщалось.
Известно, что во время интерфазы в ядрах клеток человека белок ASPM взаимодействует с белками, участвующими в процессах репликации и репарации ДНК, что предполагает его роль в данных процессах (Xu et al., 2021; Wu et al., 2022). Имеет ли белок Asp у дрозофилы специфическую роль в интерфазе - неизвестно. Молекулярный вес белка - свыше 230 кДа, поэтому он может быть доставлен в ядро только путём активного транспорта (Timney et al., 2016). В соответствии с этим белок Asp имеет предположительный сигнал ядерной локализации (Nguyen Ba et al., 2009), благодаря которому направляется в интерфазе в ядро, возможно, для предотвращения взаимодействия с тубулином. Не исключено, что белок Asp выполняет в интерфазе специфическую функцию, а не просто изолирован в ядре от тубулина. Известны примеры других МТ-ассоциированных белков, которые являются многофункциональными и в разных клеточных компартментах выполняют различные функции в ходе клеточного цикла. Так, например, белок человека TPX2, который в митозе связывается с МТ веретена деления, в интерфазе локализуется в ядре, где накапливается в местах двуцепочечных разрывов ДНК и играет роль в ответе на повреждения ДНК (Neumayer et al., 2012). Другой пример - белок Rcd1/KANSL3, который во время интерфазы локализован в ядре и входит в состав
консервативного комплекса NSL, регулирующего экспрессию множества генов у дрозофилы и человека (Meunier et al., 2015; Pavlova et al., 2019). При входе в митоз белок KANSL3 релоцируется на микротрубочки веретена деления, где выступает регулятором минус-конца МТ (Meunier et al., 2015). Определение роли Asp в интерфазе у дрозофилы требует дальнейших исследований.
В ходе данной диссертационной работы была подробно проанализирована локализация химерного белка Patronin-eGFP (изоформа I) на протяжении клеточного цикла в линии клеток S2, экспрессирующей трансген MtnA-Patronin-eGFP. Ранее была описана локализация эндогенного белка Patronin в клетках S2, визуализированная при помощи антител, способных распознавать любую из 13 описанных для белка Patronin изоформ (Goodwin, Vale, 2010). Так, было показано, что эндогенный белок колокализуется с центросомами в профазе, в метафазе локализован по всему веретену деления и в телофазе - в центральном веретене деления. Однако в литературе не было данных о локализации белка Patronin в других фазах митоза клеток S2, а именно в прометафазе и анафазе. Этот пробел был закрыт в данной работе путём детального анализа паттерна локализации белка Patronin-eGFP в фиксированных и живых клетках S2.
На стадии прометафазы мы увидели большую вариабельность локализации белка Patronin-eGFP в фиксированных клетках. При прижизненном наблюдении нам удалось задокументировать связывание белка Patronin-eGFP с вновь образованными МТ. Природу наблюдаемой вариабельности локализации Patronin-eGFP на стадии прометафазы можно объяснить тем, что именно во время прометафазы происходит активная нуклеация новых микротрубочек несколькими способами - к центросом-зависимой нуклеации, которая активна ещё до распада ядерной оболочки, добавляются хромосом- и augmin-зависимая. Прометафазные и метафазные пучки микротрубочек, которые в клетках S2 в основном представляют собой k-волокна, состоящие из 11-15 МТ (Strunov et al., 2018), могут содержать минус-концы двух типов микротрубочек: МТ с их полимеризующимися плюс-концами, встроенными в кинетохоры, и МТ, образовавшиеся augmin-зависимым образом и берущие начало от стенок ранее существовавших МТ. Минус-концы МТ, нуклеированные по augmin-зависимому пути, могут также отделяться от мест их зарождения и перемещаться в другую точку веретена деления (Kamasaki et al., 2013). Можно предположить, что Patronin связывает минус-концы свободных микротрубочек, растущих либо от кинетохор, либо от боковых стенок MT. Измеренная скорость роста Patronin-eGFP-позитивного участка k-волокна (1,44±0,16 мкм/мин) говорит в пользу того, что наблюдаемое нами удлинение Patronin-eGFP-позитивных пучков МТ происходит за счёт тубулинового потока, т.е.
добавления субъединиц тубулина на плюс-конце МТ. Возможно, что в результирующую скорость роста Patronin-eGFP-позитивного участка k-волокна также вносит вклад полимеризация минус-конца МТ. Ранее на культивируемых клетках млекопитающих было показано, что такое явление имеет место, но его скорость очень низка - 0.2±0.1 мкм/мин (Hendershott et al., 2014). Скорость полимеризации минус-конца МТ в клетках S2 в настоящее время неизвестна. Можно заключить, что Patronin связывается с вновь образующимися минус-концами МТ в прометафазных пучках, стабилизируя их, либо способствуя их полимеризации.
Наши данные демонстрируют, что белки Asp и Patronin независимо друг от друга связываются с разными популяциями минус-концов МТ, что выражается в различной результирующей внутриклеточной локализации этих белков. Так в митозе, белок Asp связан с минус-концами МТ на полюсах ВД начиная с прометафазы (после распада ядерной оболочки) (Рис. 13, 15). А белок Patronin (изоформа I) с прометафазы до анафазы колокализуется с минус-концами МТ, которые расположены внутри ВД, а в профазе и телофазе связан с минус-концами МТ, исходящими от центросом (Рис. 18). Также можно отметить различную локализацию данных белков в интерфазе: Asp локализуется в ядре, а Patronin колокализуется с интерфазными МТ. Таким образом, существует чёткое разделение областей локализации белков Asp и Patronin, не перекрывающееся в клетках S2 на протяжении всего клеточного цикла.
4.2. Роль белков Asp и Patronin в процессе формирования веретена деления
В данной работе был проанализирован митотический фенотип клеток S2 после РНКи гена asp. В условиях снижения уровня транскриптов гена asp были отмечены изменения в распределении клеток по стадиям митоза (накопление клеток в метафазе и увеличение доли клеток с ПАТ), а также нарушения морфологии ВД (увеличение длины ВД, нарушение морфологии полюсов веретена деления, увеличение доли клеток с одной центросомой). На фоне РНКи гена asp мы не обнаружили увеличение частоты встречаемости веретен с более чем двумя центросомами (Табл. 5). Нужно отметить, что ранее у куколок дрозофилы, несущих мутации гена asp, в некоторых эпителиальных клетках нотума выявляли дополнительные центросомы (Bosveld et al., 2017). Наблюдение, сделанное в данной диссертационной работе, согласуется с результатами, полученными на нейробластах личинок дрозофилы, мутантных по гену asp (Wakefield et al., 2001), и предполагает, что центросомы разных типов клеток по-разному реагируют на истощение белка Asp.
Увеличение доли клеток в метафазе и увеличение частоты встречаемости ПАТ после РНКи гена asp может говорить о непрохождении контрольной точки SAC. Ранее в другой системе - в нейробластах личинок дрозофилы, мутантных по гену asp - было отмечено увеличение митотического индекса от трех до шести раз по сравнению с нейробластами мух дикого типа (Buffin et al., 2007). Однако, митотический индекс восстанавливался до контрольного уровня у двойных мутантов - по гену asp и гену, кодирующему один из компонентов контрольной точки сборки ВД SAC (rod или mad2). В чем конкретно состоит причина активации контрольной точки SAC в условиях снижения уровня транскрипта гена asp в нейробластах личинок дрозофилы и клетках S2 дрозофилы, остаётся неясным. Полученные нами данные о временной локализации белка Asp на кинетохорах во время КПРМТ (Рис. 32) предполагают, что этот белок может играть роль в установлении правильного прикрепления кинетохора к МТ. Это бы объяснило, почему клетки, истощенные по белку Asp, претерпевают блок митоза на стадии метафазы, зависящий от контрольной точки SAC (Buffin et al., 2007).
Мы подтвердили, что белок Asp играет важную роль в регуляции длины ВД в клетках S2 дрозофилы (Morales-Mulia, Scholey, 2005). Увеличение длины ВД на фоне РНКи гена asp позволяет предполагать, что белок Asp в норме подавляет полимеризацию МТ либо ускоряет их деполимеризацию. Это согласуется с экспериментами in vitro, выполненными для ортолога белка Asp, белка человека ASPM (Jiang et al., 2017). Было показано, что белок накапливается на растущих минус-концах МТ и в зависимости от концентрации тубулина замедляет либо практически полностью подавляет их рост.
Удлинение веретена деления, наблюдаемое в условиях снижения уровня транскриптов гена asp, может быть объяснено активностью не только белка Asp, но и других MAP белков. Так, было показано, что деполимераза семейства кинезин-13 MCAK (Klp10A у дрозофилы), которая управляет тубулиновым потоком на полюсах веретена деления, эффективно накапливается на концах стабильных микротрубочек (Desai et al., 1999), но требует дополнительных факторов для связывания и дестабилизации минус-концов растущих микротрубочек (Tanenbaum et al., 2011). Была выдвинута гипотеза, что ASPM-зависимое подавление роста минус-концов МТ (Jiang et al., 2017), может сделать минус-концы микротрубочек более подходящими субстратами для деполимераз семейства кинезинов-13 (Jiang et al., 2017). Если взаимодействие белков Asp и Klp10A имеет место и у дрозофилы, то выявляемое удлинение веретена деления в условиях снижения числа транскриптов гена asp может быть объяснено нарушением взаимодействия Asp с Klp10A. Кроме того, удлиненное веретено деления может возникать в результате взаимодействия
между белками Asp и katanin. Katanin - это консервативный МТ-разрезающий комплекс, который состоит из двух субъединиц - ферментативной субъединицы р60 и регуляторной субъединицы р80 (McNally, Vale, 1993). Имеет ли место взаимодействие Asp-katanin в клетках дрозофилы - неизвестно, однако было показано, что в клетках человека ASPM и katanin колокализуются на минус-концах MT на полюсах веретена деления, где разрезают МТ и таким образом напрямую содействуют их разборке на полюсах (Jiang et al., 2017).
Помимо увеличения длины ВД после РНКи гена asp, нами были выявлены нарушения формирования полюсов веретена деления: наблюдали широкие, плохо сфокусированные полюса и полюса, отсоединенные от центросом. Если плохо сфокусированные полюса веретена деления можно объяснить МТ-сшивающей активность белка Asp за счет наличия нескольких МТ-связывающих доменов (Ito, Goshima, 2015), то молекулярные основы второго нарушения - полюса ВД, отсоединенные от центросом - остаются не выяснены. Предполагается, что белок участвует в установлении/поддержании связи МТ-центросома и в его отсутствии МТ нуклеируются нормальным образом, но не могут удерживаться вблизи центросомы.
В условиях значительного снижения уровня транскрипта гена Patronin формируется укороченное веретено деления, что говорит о роли белка Patronin в стабилизации минус-концов МТ и их защите от деполимеризации кинезином-13 (Goodwin, Vale, 2010). О фенотипе множественных центросом ранее в литературе не сообщалось и причины его неясны. Однако было показано, что Patronin может взаимодействовать напрямую или опосредованно с центросомальными белками Sas-4 и SAK (Goodwin, Vale, 2010). Так, одновременная экспрессия белка mCherry-Patronin с белками GFP-Sas-4 или GFP-SAK в клетках S2 приводила к тому, что центросомальные белки GFP-Sas-4 и GFP-SAK вместе с mCherry-Patronin колокализовались вдоль микротрубочек (Goodwin, Vale, 2010). Авторы сделали вывод, что белок Patronin может выступать как белок скэффолда для центров нуклеации МТ в клетках S2.
Причинами чрезмерной амплификации центросом могут быть генетические нарушения, дефекты в контроле клеточного цикла, неудачный цитокинез, фрагментация ПЦМ (Nigg, 2002). В данной диссертационной работе количество центросом в клетках S2 после РНКи гена Patronin было подсчитано при помощи непрямого иммуноокрашивания против белка Spd-2, который входит в состав как центриолей, так и ПЦМ. Поэтому мы не можем сказать, являются ли наблюдаемые нами множественные сигналы Spd-2 полноценными центросомами, либо фрагментами ПЦМ. Однако тот факт, что после РНКи
гена Patronin увеличивается и доля клеток с одной центросомой (Табл. 5) позволяет предполагать, что в отсутствии белка Patronin нарушается сегрегации центросом между дочерними клетками. В свою очередь, нарушение сегрегации центросом может быть вызвано нарушением морфологии ВД.
В данной работе проведен анализ функциональных взаимодействий между белками Patronin и Asp, а также между Patronin и другими белками, связывающими с минус-концами МТ - Klp10A и Dgt6. Нами было обнаружено, что белок Patronin играет независимую от белков Asp и Klp10A роль в сборке и функционировании веретена деления (Рис. 24, Рис. 25, Табл. 5). Так, клетки после двойной РНКи против генов asp и Patronin демонстрировали фенотипы, являющиеся комбинациями фенотипов, выявленных при индивидуальной РНКи-обработке. Двойная РНКи против генов Patronin и Klp10A приводила к восстановлению фенотипа множественных центросом, возникающего при отдельных РНКи, как против гена Patronin, так и против гена Klp10A. Однако в отношении длины веретена деления и истощение белка Klp10A, и истощение белка Asp оказывало превалирующее влияние. Действительно, клетки, в которых был одновременно снижен уровень транскриптов генов Patronin и Klp10A, и клетки, в которых был снижен уровень транскриптов только гена Klp10A, демонстрировали веретена одинаковой длины, а не промежуточной между клетками Patronin РНКи и Klp10A РНКи ((Rogers et al., 2004), Рис. 23). Так же клетки, истощенные по белку Asp, демонстрировали веретена той же длины, что и те, которые наблюдаются в клетках, совместно истощенных Patronin и Asp (Рис. 23). Белки Patronin и Dgt6 также могут играть независимые роли во время митоза, хотя наши наблюдения допускают вероятность того, что истощение Dgt6 влияет на ассоциацию белка Patronin с метафазными пучками MT. Однозначный вывод сделать невозможно, поскольку истощение компонента комплекса augmin приводит к образованию веретен со сниженной плотностью МТ и дефектным кинетохорным волокнам (Goshima et al., 2008; Bucciarelli et al., 2009) - двум состояниям, которые сами по себе могут изменить характер локализации белка Patronin вдоль микротрубочек веретена деления.
4.3. Участие белков Asp и Patronin в процессе кинетохор-зависимого
повторного роста микротрубочек
При изучении механизма кинетохор-зависимого роста МТ один из главных вопросов заключается в том, воспроизводит ли и в какой степени кинетохор-зависимый повторный рост микротрубочек после деполимеризации тубулина колцемидом рост МТ, который происходит вблизи кинетохоров во время нормального клеточного деления. В данной
работе были прижизненно проанализированы клетки S2, экспрессирующие трансген тубулин-eGFP, после колцемидной обработки. Нами было показано, что такие деполимеризованные клетки собирают не только морфологически правильное биполярное веретено деления, но и функциональное, поскольку обработка колцемидом не влияет на такие показатели роста, как плотность и жизнеспособность клеток, в сравнении с контролем. Несмотря на то, что метод деполимеризации веретена деления широко использовался при изучении нуклеации МТ (Tulu et al., 2006; Torosantucci et al., 2008; Mishra et al., 2010; Sikirzhytski et al., 2018), отсутствие отрицательного воздействия процедуры колцемидной деполимеризации продемонстрирована впервые.
В данной работе был подробно изучен и охарактеризован паттерн повторного роста МТ после деполимеризации колцемидом, и все возникающие тубулиновые фигуры были разделены на три типа: короткие пучки, длинные пучки и кластеры МТ. Было показано, что РНК-интерференция генов asp или Patronin не влияет на вид фигур кинетохор-зависимого повторного роста, а влияет на частоту их встречаемости в разные временные этапы, то есть задерживает, либо стимулирует КПРМТ. Это наблюдение указывает на особую генетическую устойчивость процесса кинетохор-зависимого роста МТ и предполагает, что он находится под контролем многих генов, которые, по крайней мере частично, функционально избыточны. Это неудивительно, учитывая, что эффективное клеточное деление лежит в основе жизни и что управляемый кинетохорами путь образования МТ не только необходим, но и достаточен для сборки веретена деления в большинстве эукариотических клеток.
Роль белков Asp и Patronin в процессе кинетохор-зависимого роста МТ была изучена в условиях колцемид-опосредованной деполимеризации тубулина в клетках S2 после РНКи гена asp или Patronin соответственно. Мы предполагаем, что белок Asp не влияет на нуклеацию МТ, поскольку по нашим данным РНКи гена asp практически не влияет на долю клеток с кинетохор-зависимым повторным ростом МТ. Интересно, что в культивируемых клетках человека существенное снижение уровня белка ASPM не влияет на число минус-концов МТ на полюсах веретена деления: при нокауте гена ASPM интенсивность локализации двух других белков, связывающихся с минус-концами микротрубочек - NuMA и субъединицы динактина p150Glued - не была нарушена (Jiang et al., 2017). Исходя из этих и наших данных и, беря во внимание высокую консервативность белка Asp/ASPM, можно предположить, что белок Asp не участвует в процессе нуклеации микротрубочек, а связывается с уже образованными минус-концами микротрубочек.
Анализ паттерна КПРМТ в условиях снижения транскриптов гена asp обнаружил более высокую долю клеток на продвинутых стадиях формирования микротрубочек (Рис. 30), демонстрирующих такие фигуры как длинные пучки МТ и кластеры МТ/астры. Это коррелирует с возросшей более чем в два раза интенсивностью сигнала флуоресцентно меченого тубулина, ассоциированного с кинетохорами, при КПРМТ после РНКи гена asp по сравнению с контролем (Рис. 31). Это приводит нас к выводу о том, что белок Asp дрозофилы во время кинетохор-зависимого роста МТ подавляет полимеризацию МТ и ограничивает их рост. Показано, что белок человека ASPM in vitro способствует деполимеризации микротрубочек кинезином-13 (Jiang et al., 2017). Долгое время считалось, что кинезин-13 у дрозофилы - Klp10A - действует главным образом на полюсах веретена деления, дестабилизируя минус-концы МТ и способствуя созданию тубулинового потока (Rogers et al., 2004; Goshima, Vale, 2005). Однако, поскольку белок Klp10A был выявлен также и на кинетохорах (Rogers et al., 2004), то можно предположить, что он действует и там, способствуя деполимеризации пучков МТ, образованных вблизи кинетохоров.
РНКи-опосредованное снижение уровня транскриптов гена Patronin достоверно уменьшало долю клеток с повторным ростом микротрубочек (на 14% по сравнению с контролем через 20 мин повторного роста МТ), что говорит о том, что в процессе кинетохор-зависимого формирования микротрубочек белок Patronin участвует в стабилизации новых МТ, образующихся вблизи кинетохоров (Рис. 26). Этот вывод подтверждается нашими измерениями интенсивности сигнала флуоресцентно меченого тубулина, ассоциированной с кинетохорами, которая после РНКи гена Patronin была значительно ниже, чем в контроле (Рис. 31), что является следствием ускоренной деполимеризации МТ деполимеразой Klp10A. В отношении паттерна КПРМТ не было отмечено статистически достоверных различий с контролем (Рис. 30). Это может говорить о том, что первостепенная роль белка Patronin в процессе кинетохор-зависимого роста МТ заключается в стабилизации микротрубочек, нуклеированных от хромосом или augmin-зависимым образом. При этом на скорость полимеризации этих МТ белок не оказывает заметного влияния.
Стоит ещё раз отметить, что эффективность РНКи против гена Patronin была невысокой: в наших экспериментальных условиях клетки после РНКи гена Patronin показали 28% остаточной мРНК, в то время как остаточный уровень мРНК для гена asp после РНКи составлял 6,4% от контрольного. Возможно ли достичь более эффективного снижения уровня транскриптов гена Patronin при помощи РНКи в клетках S2, неизвестно, так как в других опубликованных работах, где применялась РНКи гена Patronin
эффективность её не указывалась ни на уровне мРНК, ни на уровне белка (Goodwin, Vale, 2011; Gillard et al., 2021). Нельзя исключать, что причиной отсутствия значительного влияния белка Patronin на паттерн КПРМТ является недостаточная эффективность РНКи.
В представленной работе нами было сделано интересное наблюдение, что длина митотического веретена деления после РНКи исследуемых генов коррелирует с эффективностью КПРМТ в клетках на фоне истощения соответствующих белков. Так, длина веретена деления в клетках после РНКи гена asp была достоверно больше, чем в контроле, а после РНКи гена Patronin - достоверно меньше (Рис. 23). Эффективность КПРМТ в условиях снижения транскриптов гена asp возрастала по сравнению с контролем, а после РНКи гена Patronin, наоборот, снижалась (Рис. 26, 30, 31). Помимо белка Asp, к увеличению длины ВД в клетках S2 приводит дефицит белка Klp10A; увеличение кинетохор-зависимого роста МТ и длины ВД в этих клетках, вероятно, является следствием снижения деполимеризации MT, опосредованной Klp10A (Goshima et al., 2005; Buster et al., 2007). Другими белками дрозофилы, потеря которых приводит к образованию коротких веретен и которые стимулируют КПРМТ, являются белок Misato (Mst) и его взаимодействующие партнеры по комплексам TCP-1 и Prefoldin (Mottier-Pavie et al., 2011; Palumbo et al., 2015), Ensconsin, который имеет общую гомологию с человеческим MAP7 (Gallaud et al., 2014), МТ-полимеразы Msps (TOGp) (Bucciarelli et al., 2009; Goshima et al., 2005) и Mast (Popova et al., 2022), связывающийся с плюс-концом белок Eb1, а также такие MAP белки, как Mei-38 (человеческий гомолог TPX-2) и Mars (человеческий гомолог HURP) (Popova et al., 2022). Таким образом, по крайней мере, в клетках S2 дрозофилы на стадиях промета- и метафазы эффективность КПРМТ сильно коррелирует с длиной веретен деления. Скрининг на основе РНКи в клетках S2 выявил около 20 дополнительных генов, связанных с фенотипом короткого веретена, и около 30 генов, РНКи которых приводит к фенотипу длинного веретена (Goshima et al., 2007; Somma et al., 2008). Приводит ли потеря функции данных генов к изменению КПРМТ, в настоящее время неизвестно. Однако исходя из обнаруженной нами корреляции, можно сделать вывод, что они могут быть перспективными кандидатами на участие в процессе кинетохор-зависимого роста микротрубочек.
4.4. Модель кинетохор-управляемого роста микротрубочек в клетках S2
На данный момент считается, что механизм формирования и созревания кинетохорных волокон в митозе начинается с того, что на стадии ранней прометафазы вблизи хромосом происходит образование большого количества коротких микротрубочек,
ориентированных случайным образом, которые присоединены к кинетохору как латерально, так и плюс-концом (Maiato et al., 2004; Sikirzhytski et al., 2018). Затем за счёт присутствия на кинетохоре моторных белков, движущихся к минус-концу МТ (CenpE), эти короткие микротрубочки ориентируются одинаковым образом (Sikirzhytski et al., 2018) -плюс-конец МТ обращен к кинетохору, а минус-конец - наружу. Далее за счёт добавления новых субъединиц тубулина на плюс-конце, такая образованная вблизи кинетохора МТ начинает расти по направлению к полюсу веретена деления. В это же время микротрубочки, нуклеированные центросомами, удлиняются за счёт полимеризации плюс-конца в поисках кинетохоров. После установления первого правильного соединения кинетохор-микротрубочка (за счёт центросом- или кинетохор-зависимого пути) происходит амплификация микротрубочек внутри кинетохорного волокна за счёт augmin-опосредованной нуклеации.
Одним из аспектов этой модели, который был предметом дискуссий, является механизм, лежащий в основе первоначального возникновения МТ. Ранее Mishra с соавторами (2010) обнаружили, что Y-тубулин и комплекс нуклеопоринов Nup107-160 локализуются рядом с кинетохорами в клетках человека HeLa на ранних стадиях нуклеации МТ после деполимеризации МТ, индуцированной нокодазолом. На основании этих наблюдений было выдвинуто предположение, что на начальных стадиях кинетохор-зависимого роста MT прикрепляются к кинетохорам через их минус-концы и полимеризуются на дистальных плюс-концах, образуя промежуточное звено сборки кинетохорного волокна, которое впоследствии исчезает (Mishra et al., 2010). Аналогичная временная инверсия полярности кинетохорных микротрубочек была описана в митозе у почкующихся дрожжей, где, как полагают, кинетохоры генерируют MT с минус-концами, встроенными в кинетохоры, и плюс-концами, направленными наружу (Kitamura et al., 2010). Однако эти микротрубочки не способствуют образованию метафазного веретена деления, поскольку исчезают, когда плюс-концы МТ, исходящие от полюсов веретена, захватываются кинетохорами.
В представленной работе нами впервые было показано, что белок Asp-eGFP накапливается на кинетохорах на самых ранних этапах, когда КПРМТ ещё не обнаруживается, и затем частично колокализуется с первыми небольшими очагами возникающих микротрубочек, ассоциированными с кинетохорами. По мере восстановления ВД от кинетохоров белок Asp-eGFP обнаруживается в центре кластеров микротрубочек/астр независимо от их размера. Эти структуры не имеют кинетохоров в своих центрах, а вместо этого окружены кинетохорами. Это говорит о том, что белок Asp-
eGFP связывает минус-концы формирующихся пучков микротрубочек с самого начала их формирования и минус-концы этих пучков в конечном итоге сходятся, образуя своего рода мини-полюса веретена деления с Asp-eGFP в их центре. На более поздних стадиях повторного роста микротрубочек белок Asp-eGFP ассоциировал с удлиненными пучками МТ и накапливался на их минус-концах (Рис. 33 A4, Рис. 34, время 0:24-0:55). Этот вывод согласуется с предыдущей работой, показывающей, что в норме белок Asp перемещается вдоль MT по направлению к полюсам веретена деления (Ito, Goshima, 2015; Schoborg et al., 2015). Таким образом, наши данные свидетельствуют против возможности временной инверсии полярности МТ на ранних стадиях повторного роста МТ после деполимеризации, индуцированной колцемидом.
В рамках данной работы продемонстрировано, что КПРМТ после деполимеризации тубулина колцемидом воспроизводит естественный процесс образования МТ, управляемый кинетохорами, в необработанных клетках. Полученные нами результаты хорошо интегрируются в существующую модель кинетохор-зависимого образования МТ в клетках Drosophila S2 (Maiato et al., 2004) и дополняют её. С учётом наших данных формирование веретена деления происходит следующим образом: на начальных этапах кинетохор-зависимого роста микротрубочек белок Asp связывается с МТ, нуклеированными от хромосом, и объединяет их в пучки за счёт наличия нескольких МТ-связывающих доменов (Рис. 36А). Помимо этого Asp подавляет динамику минус-концов МТ, что делает их более предпочтительным субстратом для связывания деполимеразы Klp10A. Активность обоих белков (Asp и Klp10A) на данном этапе направлена на то, чтобы подавлять чрезмерный и неорганизованный кинетохор-зависимый рост МТ. На более поздних этапах формирования веретена деления МТ начинают представлять из себя более развитые кластеры/астры не только за счёт добавления на плюс-конец микротрубочек субъединиц тубулина, но и за счёт амплификации МТ augmin-зависимым образом (Рис. 36Б). С минус-концами МТ в составе таких структур, формирующихся вблизи кинетохоров, начинает связываться белок Patronin (Рис. 36Б, В). Patronin защищает минус-концы МТ от деполимеризации белком Klp10A, что способствует последующему удлинению и стабилизации растущих пучков МТ/к-волокон. Описанное действие белков Asp (объединение минус-концов МТ в пучки) и Patronin (стабилизация минус-концов МТ) продолжает сохраняться на протяжении всего кинетохор-зависимого роста, вплоть до полного формирования веретена деления (Рис. 36Г).
Рисунок 36. Схема, демонстрирующая взаимодействие белков Asp и Patronin с микротрубочками веретена деления во время кинетохор-зависимого формирования микротрубочек, а также с деполимеразой МТ, белком Klp10A.
ВЫВОДЫ
1. В клетках S2 дрозофилы белок Asp-eGFP в митозе связан с минус-концами микротрубочек на полюсах веретена деления с прометафазы и до телофазы, а в интерфазе белок Asp-eGFP находится в ядре, за исключением зоны плотного фибриллярного компонента ядрышка.
2. В клетках S2 дрозофилы в интерфазе и на стадии профазы митоза формируются Patronin-eGFP-позитивные пучки микротрубочек разной длины. На минус-концы кинетохорных волокон белок Patronin-eGFP загружается во время прометафазы и остаётся связанным с ними вплоть до телофазы.
3. Белки Asp и Patronin необходимы для сборки веретена деления и функционируют независимо друг от друга, связываясь с минус-концами микротрубочек разных классов и на разных стадиях клеточного цикла.
4. Белки Asp и Patronin необходимы для процесса кинетохор-зависимого роста микротрубочек и их действие различно. Белок Asp не принимает участие в нуклеации микротрубочек вблизи кинетохоров, но подавляет их полимеризацию. Белок Patronin участвует в стабилизации микротрубочек, образующихся вблизи кинетохоров, но не оказывает значительного влияния на скорость их полимеризации.
5. В условиях деполимеризации микротрубочек колцемидом белок Asp-eGFP локализуется на кинетохорах. Начиная с ранних этапов кинетохор-зависимого роста микротрубочек и до полного восстановления веретена деления белок Asp-eGFP локализован на минус-концах микротрубочек и фокусирует микротрубочки в пучки/астро-подобные структуры.
6. При полной деполимеризации микротрубочек колцемидом белок Patronin-eGFP локализован в клетках диффузно и связывается с минус-концами микротрубочек только на поздних стадиях кинетохор-зависимого восстановления веретена деления.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Akhmanova A., Hoogenraad C.C. Microtubule minus-end-targeting proteins // Current Biology.
- 2015. - V.25, №4. - P.R162-71. doi: 10.1016/j.cub.2014.12.027.
Akhmanova A., Steinmetz M.O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2008. - V.9, №4. - P.309-22. doi: 10.1038/nrm2369.
Akhmanova A., Steinmetz M.O. Control of microtubule organization and dynamics: Two ends in the limelight // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2015. - V.16, №12. - P.711-26. doi: 10.1038/nrm4084.
Akhmanova A., Steinmetz M.O. Microtubule minus-end regulation at a glance // Journal of Cell Science. - 2019. - V.132, №11:jcs227850. doi: 10.1242/jcs.227850.
Baines A.J., Bignone P.A., King M.D.A., Maggs A.M., Bennett P.M., Pinder J.C., Phillips J.W. The CKK domain (DUF1781) binds microtubules and defines the CAMSAP/ssp4 family of animal proteins // Molecular biology and eVution. - 2009. - V.26, №9. - P.2005-14. doi: 10.1093/molbev/msp115.
Basto R., Lau J., Vinogradova T., Gardiol A., Woods C.G., Khodjakov A., Raff J.W. Flies without Centrioles // Cell. - 2006. - V.125, №7. - P.1375-86. doi: 10.1016/j.cell.2006.05.025.
Baudoin N.C., Cimini D. A guide to classifying mitotic stages and mitotic defects in fixed cells // Chromosoma. - 2018. - V.127, №2. - P.215-27. doi: 10.1007/s00412-018-0660-2.
Bettencourt-Dias M., Glover D.M. Centrosome biogenesis and function: Centrosomics brings new understanding // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2007. - V.8, №6. - P.451-63. doi: 10.1038/nrm2180.
Blower M.D., Nachury M., Heald R., Weis K. A Rae1-containing ribonucleoprotein complex is required for mitotic spindle assembly // Cell. - 2005. - V.121, №2. - P.223-34. doi: 10.1016/j.cell.2005.02.016.
Boettcher B., Barral Y. The cell biology of open and closed mitosis // Nucleus. - 2013. - V.4, №3.
- P.160-5. doi: 10.4161/nucl.24676.
Booth D.G., Hood F.E., Prior I.A., Royle S.J. A TACC3/ch-TOG/clathrin complex stabilises kinetochore fibres by inter-microtubule bridging // The EMBO Journal. - 2011. - V.30, №5. -P.906-19. doi: 10.1038/emboj.2011.15.
Bosveld F., Ainslie A., Bellaiche Y. Sequential activities of dynein, Mud and Asp in centrosome-spindle coupling maintain centrosome number upon mitosis // Journal of Cell Science. - 2017. -V.130, №20. -P.3557-67. doi: 10.1242/jcs.201350.
Brinkley B.R., Stubblefield E. The fine structure of the kinetochore of a mammalian cell in vitro // Chromosoma. - 1966. - V.19, №1. - P.28-43. doi: 10.1007/BF00332792.
Brinkley B.R., Zinkowski R.P., Mollon W.L., Davis F.M., Pisegna M.A., Pershouse M., Rao P.N. Movement and segregation of kinetochores experimentally detached from mammalian chromosomes // Nature. - 1988. - V.336. - P.251-4. doi: 10.1038/336251a0.
Brouhard G.J., Rice L.M. The contribution of aß-tubulin curvature to microtubule dynamics // Journal of Cell Biology. - 2014. - V.207, №3. - P.323-34. doi: 10.1083/jcb.201407095.
Brouhard G.J., Rice L.M. Microtubule dynamics: an interplay of biochemistry and mechanics // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2018. - V.19, №7. - P.451-63. doi: 10.1038/s41580-018-0009-y.
Brouhard G.J., Stear J.H., Noetzel T.L., Al-Bassam J., Kinoshita K., Harrison S.C., Howard J., Hyman A.A. XMAP215 Is a Processive Microtubule Polymerase // Cell. - 2008. - V.32, №1. -P.79-88. doi: 10.1016/j.cell.2007.11.043.
Brust-Mascher I., Sommi P., Cherambathur D.K., Scholey J.M. Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis // Molecular Biology of the Cell. -2009. - V.20, №6. - P.1749-62. doi: 10.1091/mbc.e08-10-1033.
Bucciarelli E., Pellacani C., Naim V., Palena A., Gatti M., Somma M.P.Drosophila Dgt6 Interacts with Ndc80, Msps/XMAP215, and Y-Tubulin to Promote Kinetochore-Driven MT Formation // Current Biology. - 2009. - V.19, №21. - P.1839-1845. doi: 10.1016/j.cub.2009.09.036.
Buffin E., Emre D., Karess R.E. Flies without a spindle checkpoint// Nature Cell Biology. - 2007.
- V.9, №5. - P.565-72. doi: 10.1038/ncb1570.
Buster D., Zhang D., Sharp D. Poleward Tubulin Flux in Spindles: Regulation and Function in Mitotic Cells // Molecular Biology of the Cell. - 2007. - V.18. - P.3094-104. doi: 10.1091/mbc.e06-11-0994.
Calarco-Gillam P.D., Siebert M.C., Hubble R., Mitchison T., Kirschner M. Centrosome development in early mouse embryos as defined by an autoantibody against pericentriolar material // Cell. - 1983. - V.35, №3 PART 2. - P.621-9. doi: 10.1016/0092-8674(83)90094-6.
Carazo-Salas R.E., Guarguaglini G., Gruss O.J., Segref A., Karsenti E., Mattaj I.W. Generation of GTP-bound Ran by RCC1 is required for chromatin-induced mitotic spindle formation // Nature.
- 1999. - V.400. - P.178-81. doi: 10.1038/22133.
Carmena M., Wheelock M., Funabiki H., Earnshaw W.C. The chromosomal passenger complex (CPC): from easy rider to the godfather of mitosis // Nature Reviews Molecular Cell Biology. -2012. - V.13, №12. - P.789-803. doi: 10.1038/nrm3474.
Casanova C.M., Rybina S., Yokoyama H., Karsenti E., Mattaj I.W. Hepatoma Up-Regulated protein is required for chromatin-induced microtubule assembly independently of TPX2 // Molecular Biology of the Cell. - 2008. - V.19, №11. - P.4900-8. doi: 10.1091/mbc.e08-06-0624.
Cavazza T., Malgaretti P., Vernos I. The sequential activation of the mitotic microtubule assembly pathways favors bipolar spindle formation // Molecular Biology of the Cell. - 2016. - V.27, №19.
- P.2935-45. doi: 10.1091/mbc.E16-05-0322.
Cheeseman I.M. The Kinetochore // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2014. - V.6.
- P.1-18. doi: 10.1101/cshperspect.a015826.
Cheeseman I.M., Chappie J.S., Wilson-Kubalek E.M., Desai A. The conserved KMN network constitutes the core microtubule-binding site of the kinetochore // Cell. - 2006. - V.127, №5. -P.983-97. doi: 10.1016/j.cell.2006.09.039.
Cheeseman I.M., Desai A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2008. - V.9, №1. - P.33-46. doi: 10.1038/nrm2310.
Clarke P.R., Zhang C. Spatial and temporal coordination of mitosis by Ran GTPase // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2008. - V.9, №6. - P.464-77. doi: 10.1038/nrm2410.
Dammermann A., Desai A., Oegema K. The minus end in sight// Current Biology. - 2003. - V.13, №15. - P.R614-24. doi: 10.1016/S0960-9822(03)00530-x.
DeLuca J.G., More B., Hickey J.M., Kilmartin J.V., Salmon E.D. hNuf2 inhibition blocks stable kinetochore-microtubule attachment and induces mitotic cell death in HeLa cells // Journal of Cell Biology. - 2002. - V.159, №4. - P.549-55. doi: 10.1083/jcb.200208159.
Derivery E., Seum C., Daeden A., Loubery S., Holtzer L., Jülicher F., Gonzalez-Gaitan M. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division // Nature. -2015. - V.528, №7581. - P.280-285. doi: 10.1038/nature16443.
Desai A., Verma S., Mitchison T.J., Walczak C.E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes // Cell. - 1999. - V.96, №1. - P.69-78. doi: 10.1016/s0092-8674(00)80960-5.
De Wulf P., Earnshaw W.C. The Kinetochore: From Molecular Discoveries to Cancer Therapy.
- Springer, 2009. - 516 p. doi: 10.1007/978-0-387-69076-6.
Dix C.I., Raff J.W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication // Current Biology. - 2007. - V.17, №20. - P.1759-1764. doi: 10.1016/j.cub.2007.08.065.
do Carmo Avides M., Glover D.M. Abnormal spindle protein, Asp, and the integrity of mitotic centrosomal microtubule organizing centers // Science. - 1999. - V.283. - P.1733-5. doi: 10.1126/science.283.5408.1733.
Dogterom M., Surrey T. Microtubule organization in vitro // Current Opinion in Cell Biology. -2013. - V.25. - P.23-9. doi: 10.1016/j.ceb.2012.12.002.
Fededa J.P., Gerlich D.W. Molecular control of animal cell cytokinesis // Nature Cell Biology. -2012. - V.14, №5. - P.440-7. doi: 10.1038/ncb2482.
Fish J.L., Kosodo Y., Enard W., Pääbo S., Huttner W.B. Aspm specifically maintains symmetric proliferative divisions of neuroepithelial cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2006. - V.103, №27. - P.10438-43. doi: 10.1073/pnas.0604066103.
Fujimori A., Itoh K., Goto S., Hirakawa H., Wang B., Kokubo T., Kito S., Tsukamoto S., Fushiki S. Disruption of Aspm causes microcephaly with abnormal neuronal differentiation // Brain and Development. - 2014. - V.36, №8. - P.661-9. doi: 10.1016/j.braindev.2013.10.006.
Gai M., Bianchi F.T., Vagnoni C., Verni F., Bonaccorsi S., Pasquero S., Berto G.E., Sgro F., Chiotto A.M., Annaratone L., Sapino A., Bergo A., Landsberger N., Bond J., Huttner W.B., Di Cunto F. ASPM and CITK regulate spindle orientation by affecting the dynamics of astral microtubules // EMBO Reports. - 2016. - V.17, №10. - P.1396-409. doi: 10.15252/embr.201541823.
Gallaud E., Caous R., Pascal A., Bazile F., Gagné J.-P., Huet S., Poirier G.G., Chrétien D., Richard-Parpaillon L., Giet R. Ensconsin/Map7 promotes microtubule growth and centrosome separation in Drosophila neural stem cells // Journal of Cell Biology. - 2014. - V.204. - P.1111-21. doi: 10.1083/jcb.201311094.
Garrett L., Chang Y.J., Niedermeier K.M., Heermann T., Enard W., Fuchs H., Gailus-Durner V., Hrabe de Angelis M., Huttner W.B., Wurst W., Hölter S.M. A truncating Aspm allele leads to a complex cognitive phenotype and region-specific reductions in parvalbuminergic neurons // Translational Psychiatry. - 2020. - V.10, №1. - P.66. doi: 10.1038/s41398-020-0686-0.
Giansanti M.G., Bucciarelli E., Bonaccorsi S., Gatti M. Drosophila SPD-2 is an essential centriole component required for PCM recruitment and astral-microtubule nucleation // Current Biology. -2008. - V.18, №4. - P.303-9. doi: 10.1016/j.cub.2008.01.058.
Gillard G., Girdler G., Röper K. A release-and-capture mechanism generates an essential non-centrosomal microtubule array during tube budding // Nature Communications. - 2021. - V.12, №1. - P.4096. doi: 10.1038/s41467-021-24332-0.
Gonzalez C., Sunkel C.E., Glover D.M. Interactions between Mgr, Asp, and Polo: Asp function modulated by Polo and needed to maintain the poles of monopolar and bipolar spindles // Chromosoma. - 1998. - V.107. - P.452-60. doi: 10.1007/s004120050329.
Goodson H.V., Jonasson E.M. Microtubules and Microtubule-Associated Proteins // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2018. - V.10, №6. - P.a022608. doi: 10.1101/cshperspect.a022608.
Goodwin S.S., Vale R.D. Patronin regulates the microtubule network by protecting microtubule minus ends // Cell. - 2010. - V.143, №2. - P.263-74. doi: 10.1016/j.cell.2010.09.022.
Goshima G., Vale R.D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: Comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line // Journal of Cell Biology. - 2003. - V.162. - P.1003-16. doi: 10.1083/jcb.200303022.
Goshima G., Wollman R., Stuurman N., Scholey J.M., Vale R.D. Length control of the metaphase spindle // Current Biology. - 2005. - V.15, №21. - P.1979-88. doi: 10.1016/j.cub.2005.09.054.
Goshima G., Wollman R., Goodwin S.S., Zhang N., Scholey J.M., Vale R.D., Stuurman N. Genes Required for Mitotic Spindle Assembly in Drosophila S2 Cells // Science. - 2007. - V.316, №5823. -P.417-21. doi: 10.1126/science.1141314.
Goshima G., Mayer M., Zhang N., Stuurman N., Vale R.D. Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle // Journal of Cell Biology.
- 2008. - V.181, №3. - P.421-29. doi: 10.1083/jcb.200711053.
Gramates L.S., Marygold S.J., Dos Santos G., Urbano J.-M., Antonazzo G., Matthews B.B., Rey A.J., Tabone C.J., Crosby M.A., Emmert D.B., Falls K., Goodman J.L., Hu Y., Ponting L., Schroeder A.J., Strelets V.B., Thurmond J., Zhou P.; the FlyBase Consortium. FlyBase at 25: looking to the future // Nucleic Acids Research. - 2017. - V.45, №D1. - P.D663-71. doi: 10.1093/nar/gkw1016.
Gudimchuk N.B., Mcintosh J.R. Regulation of microtubule dynamics, mechanics and function through the growing tip // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2021 - V.22, №12. -P.777-95. doi: 10.1038/s41580-021-00399-x.
Hara M., Fukagawa T. Dynamics of kinetochore structure and its regulations during mitotic progression // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2020. - V.77, №15. -P.2981-95. doi: 10.1007/s00018-020-03472-4.
Hayward D., Metz J., Pellacani C., Wakefield J.G. Synergy between multiple microtubule-generating pathways confers robustness to centrosome-driven mitotic spindle formation // Developmental Cell. - 2014. - V.28, №1. - P.81-93. doi: 10.1016/j.devcel.2013.12.001.
Hayward D., Alfonso-Pérez T., Gruneberg U. Orchestration of the spindle assembly checkpoint by CDK 1-cyclin B1 // FEBS Letters. - 2019. - V.593, №20. - P.2889-907. doi: 10.1002/18733468.13591.
Heald R., Tournebize R., Blank T., Sandaltzopoulos R., Becker P., Hyman A., Karsenti E. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts // Nature. - 1996. - V.382, №6590. - P.420-5. doi: 10.1038/382420a0.
Hendershott M.C., Vale R.D. Regulation of microtubule minus-end dynamics by CAMSAPs and Patronin // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2014. - V.111, №16.
- P.5860-5. doi: 10.1073/pnas.1404133111.
Henikoff S., Ahmad K., Platero J.S., Van Steensel B., Rubin G.M. Heterochromatic deposition of centromeric histone H3-like proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2000. - V.97, №2. - P.716-21. doi: 10.1073/pnas.97.2.716.
Higgins J., Midgley C., Bergh A.-M., Bell S.M., Askham J.M., Roberts E., Binns R.K., Sharif S.M., Bennett C., Glover D.M., Woods C.G., Morrison E.E., Bond J. Human ASPM participates in spindle organisation, spindle orientation and cytokinesis // BMC Cell Biology. - 2010. - V.11. -P.85. doi: 10.1186/1471-2121-11-85.
Hinchcliffe E.H., Miller F.J., Cham M., Khodjakov A., Sluder G. Requirement of a centrosomal activity for cell cycle progression through G1 into S phase // Science. - 2001. - V.291, №5508. -P.1547-50. doi: 10.1126/science.1056866.
Hu W., Zhang R., Xu H., Li Y., Yang X., Zhou Z., Huang X., Wang Y. Ji W., Gao F., Meng W. CAMSAP1 role in orchestrating structure and dynamics of manchette microtubule minus-ends
impacts male fertility during spermiogenesis // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2023. V.291, №5508.:e2313787120. doi: 10.1073/pnas.2313787120.
Hueschen C.L., Kenny S.J., Xu K., Dumont S. NuMA recruits dynein activity to microtubule minus-ends at mitosis // eLife. 2017. V.6. - P.e29328. doi: 10.7554/eLife.29328.
Ito A., Goshima G. Microcephaly protein Asp focuses the minus ends of spindle microtubules at the pole and within the spindle // Journal of Cell Biology. - 2015. - V.211, №5. - P.999-1009. doi: 10.1083/jcb.201507001.
Jiang K., Hua S., Mohan R., Grigoriev I., Yau K.W., Liu Q., Katrukha E.A., Altelaar A. F.M., Heck A.J.R., Hoogenraad C.C., Akhmanova A. Microtubule minus-end stabilization by polymerization-driven CAMSAP deposition // Developmental Cell. - 2014. - V.28, №3. -P.295-309. doi: 10.1016/j.devcel.2014.01.001.
Jiang K., Rezabkova L., Hua S., Liu Q., Capitani G., Altelaar A.F.M., Heck A.J.R., Kammerer R.A., Steinmetz M.O., Akhmanova A. Microtubule minus-end regulation at spindle poles by an ASPM-katanin complex // Nature Cell Biology. - 2017. - V.19. - P.480-492.doi: 10.1038/ncb3511.
Jiang K., Faltova L., Hua S., Capitani G., Prota A.E., Landgraf C., Vkmer R., Kammerer R.A., Steinmetz M.O., Akhmanova A. Structural basis of formation of the microtubule minus-end-regulating CAMSAP-Katanin complex // Structure. - 2018. - V.26. - P.375-382.doi: 10.1016/j.str.2017.12.017.
Jordan M., Wilson L. The use and action of drugs in analyzing mitosis // Methods in Cell Biology.
- 1999. - V.61. - P.267-95.doi: 10.1016/s0091-679x(08)61986-x.
Kalab P., Pu R.T., Dasso M. The ran GTPase regulates mitotic spindle assembly // Current Biology. - 1999. - V.9. - P.481-484. doi: 10.1016/s0960-9822(99)80213-9.
Kalab P., Weis K., Heald R. Visualization of a Ran-GTP gradient in interphase and mitotic Xenopus egg extracts // Science. - 2002. - V.295, №5564. - P.2452-6.doi: 10.1126/science.1068798.
Kalab P., Pralle A., Isacoff E.Y., Heald R., Weis K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells // Nature. - 2006. - V.440, №7084. - P.697-701. doi: 10.1038/nature04589.
Kallio M.J., Mc Cleland M.L., Stukenberg P.T., Gorbsky G.J. Inhibition of aurora B kinase blocks chromosome segregation, overrides the spindle checkpoint, and perturbs microtubule dynamics in mitosis // Current Biology. - 2002. - V.12, №11. - P.900-5. doi: 10.1016/s0960-9822(02)00887-4.
Kamasaki T., O'Toole E., Kita S., Osumi M., Usukura J., Mcintosh J.R., Goshima G. Augmin-dependent microtubule nucleation at microtubule walls in the spindle // Journal of Cell Biology.
- 2013. - V.202, №1. - P.25-33. doi: 10.1083/jcb.201304031.
Kaur R., Kaur G., Gill R.K., Soni R., Bariwal J. Recent developments in tubulin polymerization inhibitors: An overview // European Journal of Medicinal Chemistry. - 2014. - V.87. - P.89-124. doi: 10.1016/j.ejmech.2014.09.051.
Kelly A.E., Ghenoiu C., Xue J.Z., Zierhut C., Kimura H., Funabiki H. Survivin Reads Phosphorylated Histone H3 Threonine 3 to Activate the Mitotic Kinase Aurora B // Science. -2010. - V.330, №6001. - P.235-9. doi: 10.1126/science.1189505.
Khalaf-Nazzal R., Fasham J., Inskeep K.A., Blizzard L.E., Leslie J.S., Wakeling M.N., Ubeyratna N., Mitani T., Griffith J.L., Baker W., Al-Hijawi F., Keough K.C., Gezdirici A., Pena L., Spaeth C.G., Turnpenny P.D., Walsh J.R., Ray R., Neilson A., Kouranova E., Cui X., Curiel D.T., Pehlivan D., Akdemir Z.C., Posey J.E., Lupski J.R., Dobyns W.B., Stottmann R.W., Crosby A.H., Baple E.L. Bi-allelic CAMSAP1 variants cause a clinically recognizable neuronal migration disorder // The American Journal of Human Genetics - 2022. - V.109, №11. - P.2068-79. doi: 10.1016/j.ajhg.2022.09.012.
Khodjakov A., Cole R.W., Oakley B.R., Rieder C.L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates // Current Biology. - 2000. - V.10, №2. - P.59-67. doi: 10.1016/s0960-9822(99)00276-6.
Kirschner M., Mitchison T. Beyond self-assembly: From microtubules to morphogenesis // Cell.
- 1986. - V.45. -P.329. doi: 10.1016/0092-8674(86)90318-1.
Kitamura E., Tanaka K., Komoto S., Kitamura Y., Antony C., Tanaka T.U. Kinetochores generate microtubules with distal plus ends: their roles and limited lifetime in mitosis // Developmental Cell. - 2010. - V.18. - P.248-59. doi: 10.1016/j.devcel.2009.12.018.
Koffa M.D., Casanova C.M., Santarella R., Köcher T., Wilm M., Mattaj I.W. HURP Is Part of a Ran-Dependent Complex InVved in Spindle Formation // Current Biology. - 2006. - V.16, №8.
- P.743-54. doi: 10.1016/j.cub.2006.03.056.
Kraus J., Alfaro-Aco R., Gouveia B., Petry S. Microtubule nucleation for spindle assembly: One molecule at a time // Trends in Biochemical Sciences. - 2023. - V.48, №9. - P.761-75. doi: 10.1016/j.tibs.2023.06.004.
Kristensson M.A. The Game of Tubulins // Cells. - 2021. - V.10, №4. - P.745. doi: 10.3390/cells10040745.
Kufer T.A., Sillje H.H.W., Körner R., Gruss O.J., Meraldi P., Nigg E.A. Human TPX2 is required for targeting Aurora-A kinase to the spindle // Journal of Cell Biology. - 2002. - V.158, №4. -P.617-23. doi: 10.1083/jcb.200204155.
Kyriacou E., Heun P.Centromere structure and function: lessons from Drosophila // GENETICS.
- 2023. - V.225, №4. doi: 10.1093/genetics/iyad170.
Lara-Gonzalez P., Pines J., Desai A. Spindle assembly checkpoint activation and silencing at kinetochores // Seminars in Cell and Developmental Biology. - 2021. - V.117. - P.86-98. doi: 10.1016/j.semcdb.2021.06.009.
Lawo S., Bashkurov M., Mullin M., Ferreria M.G., Kittler R., Habermann B., Tagliaferro A., Poser I., Hutchins J.R.A., Hegemann B., Pinchev D., Buchholz F., Peters J.-M., Hyman A.A., Gingras A.-C., Pelletier L. HAUS, the 8-subunit human Augmin complex, regulates centrosome
and spindle integrity // Current Biology. - 2009. - V.19, №10. - P.816-26. doi: 10.1016/j.cub.2009.04.033.
Lawo S., Hasegan M., Gupta G.D., Pelletier L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material // Nature Cell Biology. - 2012. -V.14, №11. -P.1148-58. doi: 10.1038/ncb2591.
Laycock J.E., Savoian M.S., Glover D.M. Antagonistic activities of Klp10A and Orbit regulate spindle length, bipolarity and function in vivo // Journal of Cell Science. - 2006. - V.119, Pt 11.
- P.2354-2361. doi: 10.1242/jcs.02957.
Lin H., Ault J., Church K. Meiosis in Drosophila melanogaster. I. Chromosome identification and kinetochore microtubule numbers during the first and second meiotic divisions in males // Chromosoma. - 1981. - V.83, №4. - P.507-21. doi: 10.1007/BF00328276.
Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-AACT method // Methods. - 2001. - V.25, №4. - P.402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262.
Liu P., Wurtz M., Zupa E., Pfeffer S., Schiebel E. Microtubule nucleation: The waltz between y-tubulin ring complex and associated proteins // Current Opinion in Cell Biology. - 2021. - V.68
- P.124-31. - doi: 10.1016/j.ceb.2020.10.004.
Luders J., Patel U.K., Stearns T. GCP-WD is a y-tubulin targeting factor required for centrosomal and chromatin-mediated microtubule nucleation // Nature Cell Biology. - 2006. - V.8, №2. -P.137-47. doi: 10.1038/ncb1349.
Mahoney N.M., Goshima G., Douglass A.D., Vale R.D. Making microtubules and mitotic spindles in cells without functional centrosomes // Current Biology. - 2006. - V.16, №6. - P.564-9. doi: 10.1016/j.cub.2006.01.053.
Maiato H., Rieder C.L., Khodjakov A. Kinetochore-driven formation of kinetochore fibers contributes to spindle assembly during animal mitosis // Journal of Cell Biology. - 2004. - V.167.
- P.831-40. doi: 10.1083/jcb.200407090.
Maiato H., Hergert P.J., Moutinho-Pereira S., Dong Y., Vandenbeldt K.J., Rieder C.L., McEwen B.F. The ultrastructure of the kinetochore and kinetochore fiber in Drosophila somatic cells // Chromosoma. - 2006. - V.115, №6. - P.469-80. doi: 10.1007/s00412-006-0076-2.
Maiato H., Silva S. Double-checking chromosome segregation // Journal of Cell Biology. - 2023.
- V.222, №5. - e202301106. doi: 10.1083/jcb.202301106.
Malumbres M. Control of the cell cycle // Abeloff's Clinical Oncology. - 2020. - P.56-73. doi: 10.1016/B978-0-323-47674-4.00004-9. Chapter 4.
Maresca T.J., Niederstrasser H., Weis K., Heald R. Xnf7 contributes to spindle integrity through its microtubule-bundling activity // Current Biology. - 2005. - V.15, №19. - P.1755-61. doi: 10.1016/j.cub.2005.08.049.
Marques A., Pedrosa-Harand A. Holocentromere identity: from the typical mitotic linear structure to the great plasticity of meiotic holocentromeres // Chromosoma. - 2016. - V.125. - P.669-81. doi: 10.1007/s00412-016-0612-7.
Matthies H.J.G., McDonald H.B., Goldstein L.S.B., Theurkauf W.E. Anastral meiotic spindle morphogenesis: Role of the non-claret disjunctional kinesin-like protein // Journal of Cell Biology. - 1996. - V.134, №2. - P.455-64. doi: 10.1083/jcb.134.2.455.
McDonald K.L., O'Toole E., Mastronarde D.N., Mcintosh J.R. Kinetochore Microtubules in PTK Cells // Journal of Cell Biology. - 1992. - V.118, №2. - P.369-83. doi: 10.1083/jcb.118.2.369.
McEwen B.F., Heagle A.B., Cassels G.O., Buttle K.F., Rieder C.L. Kinetochore fiber maturation in PtK1 cells and its implications for the mechanisms of chromosome congression and anaphase onset// Journal of Cell Biology. - 1997. - V.137. - P.1567-80. doi: 10.1083/jcb.137.7.1567.
Mcintosh J.R. Mitosis // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2016. - V.8, №9. -P.a023218. doi: 10.1101/cshperspect.a023218.
McKenney R.J., Huynh W., Tanenbaum M.E., Bhabha G., Vale R.D. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes // Science. - 2014. - V.345. - P.337-41. doi: 10.1126/science.1254198.
McNally F.J., Vale R.D. Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules// Cell. - 1993. - 75, 419-29. doi: 10.1016/0092-8674(93)90377-3.
Megraw T.L., Kao L.R., Kaufman T.C. Zygotic development without functional mitotic centrosomes // Current Biology. - 2001. - V.11, №2. - P.116-20. doi: 10.1016/s0960-9822(01)00017-3.
Meng W., Mushika Y., Ichii T., Takeichi M. Anchorage of Microtubule Minus Ends to Adherens Junctions Regulates Epithelial Cell-Cell Contacts // Cell. - 2008. - V.135, №5. - P.948-59. doi: 10.1016/j.cell.2008.09.040.
Mennella V., Keszthelyi B., McDonald K.L., Chhun B., Kan F., Rogers G.C., Huang B., Agard D.A. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization // Nature Cell Biology. - 2012. - V.14. - P.1159-68. doi: 10.1038/ncb2597.
Meunier S., Vernos I. K-fibre minus ends are stabilized by a RanGTP-dependent mechanism essential for functional spindle assembly // Nature Cell Biology. - 2011. - V.13, №12. - P.1406-14. doi: 10.1038/ncb2372.
Meunier S., Vernos I. Microtubule assembly during mitosis - from distinct origins to distinct functions? //Journal of Cell Science. -2012. - V.125, №12. -P.2805-14. doi: 10.1242/jcs.092429.
Meunier S., Shvedunova M., Van Nguyen N., Avila L., Vernos I., Akhtar A. An epigenetic regulator emerges as microtubule minus-end binding and stabilizing factor in mitosis // Nature Communications. - 2015. - V.6. - P.1-10. doi: 10.1038/ncomms8889.
Meunier S., Vernos I. Acentrosomal Microtubule Assembly in Mitosis: The Where, When, and How // Trends in Cell Biology. - 2016. - V.26, №2. - P.80-7. doi: 10.1016/j.tcb.2015.09.001.
Milletti G., Colicchia V., Cecconi F. Cyclers' kinases in cell division: from molecules to cancer therapy // Cell Death and Differentiation. - 2023. - V.30, №9. - P.2035-52. doi: 10.1038/s41418-023-01196-z.
Mishra R.K., Chakraborty P., Arnaoutov A., Fontoura B.M.A., Dasso M. The Nup107-160 complex and Y-TuRC regulate microtubule polymerization at kinetochores // Nature Cell Biology.
- 2010. - V.12. - P.164-9. doi: 10.1038/ncb2016.
Mitchison T., Kirschner M. Dynamic instability of microtubule growth // Nature. - 1984. - V.312, №5991. - P.237-42. doi: 10.1038/312237a0.
Morales-Mulia S., Scholey J.M. Spindle Pole Organization in Drosophila S2 Cells by Dynein, Abnormal Spindle Protein (Asp), and KLP10A // Molecular Biology of the Cell. - 2005. - V.16.
- P.3176-86. doi: 10.1091/mbc.e04-12-1110.
Mottier-Pavie V., Cenci G., Verni F., Gatti M., Bonaccorsi S. Phenotypic analysis of misato function reveals roles of noncentrosomal microtubules in Drosophila spindle formation // Journal of Cell Science. - 2011. - V.124, №5. - P.706-17. doi: 10.1242/jcs.072348.
Moutinho-Pereira S., Stuurman N., Afonso O., Hornsveld M., Aguiar P., Goshima G., Vale R.D., Maiato H. Genes inVved in centrosome-independent mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2013. - V.110, №49. -P.19808-13. doi: 10.1073/pnas.1320013110.
Munzarova A.F., Popova J.V., Razuvaeva A.V., Shloma V.V., Gatti M., Omelyanchuk L.V.Accurate measurement of poleward microtubule flux in the spindle of Drosophila S2 cells // Cell Biology International. - 2016. - V.40. - P.1-18. doi: 10.1002/cbin.10638.
Musacchio A., Salmon E.D. The spindle-assembly checkpoint in space and time // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2007. - V.8, №5. - P.379-93. doi: 10.1038/nrm2163.
Musacchio A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics // Current Biology. - 2015. - V.25, №20. - P.R1002-18. doi: 10.1016/j.cub.2015.08.051.
Nachury M.V., Maresca T.J., Salmon W.C., Waterman-Storer C.M., Heald R., Weis K. Importin P is a mitotic target of the small GTPase ran in spindle assembly // Cell. - 2001. - V.104, №1. -P.95-106. doi: 10.1016/s0092-8674(01)00194-5.
Nashchekin D., Fernandes A.R., St Johnston D. Patronin/Shot cortical foci assemble the noncentrosomal microtubule array that specifies the Drosophila anterior-posterior axis // Developmental Cell. - 2016. - V.38, №1. - P.61-72. doi: 10.1016/j.devcel.2016.06.010.
Neumayer G., Helfricht A., Shim S.Y., Le H.T., Lundin C., Belzil C., Chansard M., YuY., LeesMiller S.P., Gruss O.J., van Attikum H., Helleday T., Nguyen M.D. Targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2 (TPX2) regulates y-histone 2AX (y-H2AX) levels upon ionizing radiation // Journal of Biological Chemistry. - 2012. - V.287, №50. - P.42206-22. doi: 10.1074/jbc.M112.385674.
Nguyen Ba A.N., Pogoutse A., Provart N., Moses A.M. NLStradamus: a simple Hidden Markov Model for nuclear localization signal prediction // BMC Bioinformatics. - 2009. - V.10. - P.202. doi: 10.1186/1471-2105-10-202.
Nigg E.A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? // Nature Reviews Cancer. - 2002. - V.2, №11. - P.815-25. doi: 10.1038/nrc924.
Nixon F.M., Gutiérrez-Caballero C., Hood F.E., Booth D.G., Prior I.A., Royle S.J. The mesh is a network of microtubule connectors that stabilizes individual kinetochore fibers of the mitotic spindle // eLife. - 2015. - V.4. - P.1-21. doi: 10.7554/eLife.07635.
Nogales E. An electron microscopy journey in the study of microtubule structure and dynamics // Protein Science. - 2015. - V.24, №12. - P.1912-9. doi: 10.1002/pro.2808.
O'Connell C.B., Loncarek J., Kalab P., Khodjakov A. Relative contributions of chromatin and kinetochores to mitotic spindle assembly // Journal of Cell Biology. - 2009. - V.187, №1. - P.43-51. doi: 10.1083/jcb.200903076.
O'Connell C.B., Khodjakov A., McEwen B.F. Kinetochore flexibility: Creating a dynamic chromosome-spindle interface // Current Opinion in Cell Biology. - 2012. - V.24, №1. - P.40-7. doi: 10.1016/j.ceb.2011.12.008.
Odde D.J., Cassimeris L., Buettner H.M. Kinetics of microtubule catastrophe assessed by probabilistic analysis // Biophysical Journal. - 1995. - V.69, №3. - P.796-802. doi: 10.1016/S0006-3495(95)79953-2.
O'Neill R.S., Schoborg T.A., Rusan N.M. Same but different: pleiotropy in centrosome-related microcephaly // Molecular Biology of the Cell. - 2018. - V.29, №3. - P.241-6. doi: 10.1091/mbc.E17-03-0192.
Palumbo V., Pellacani C., Heesom K.J., Rogala K.B., Deane C.M., Mottier-Pavie V., Gatti M., Bonaccorsi S., Wakefield J.G. Misato Controls Mitotic Microtubule Generation by Stabilizing the TCP-1 Tubulin Chaperone Complex (corrected) // Current Biology. - 2015. - V.25, №13. -P.1777-83. doi: 10.1016/j.cub.2015.05.033.
Pavlova G.A., Galimova Yu.A., Popova Yu.V., Munzarova A.F., Razuvaeva A.V., Alekseeva A.L., Berkaeva M.B., Pindyurin A.V., Somma M.P., Gatti M., Renda F. FACTORS GOVERNING THE PATTERN OF SPINDLE MICROTUBULE REGROWTH AFTER TUBULIN DEPOLYMERIZATION // Tsitologiia. - 2016. - V.58, №4. - P.299-303.
Pavlova G.A., Popova J.V., Andreyeva E.N., Yarinich L.A., Lebedev M.O., Razuvaeva A.V., Dubatolova T.D., Oshchepkova A.L., Pellacani C., Somma M.P., Pindyurin A.V., Gatti M. RNAi-mediated depletion of the NSL complex subunits leads to abnormal chromosome segregation and defective centrosome duplication in Drosophila mitosis // PLoS Genetics. - 2019. - V.15, №9. -P.e1008371. doi: 10.1371/journal.pgen.1008371.
Paweletz N. Walther Flemming: Pioneer of mitosis research // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2001. - V.2, №1. - P.72-5. doi: 10.1038/35048077.
Petry S., Groen A.C., Ishihara K., Mitchison T.J., Vale R.D. Branching microtubule nucleation in xenopus egg extracts mediated by augmin and TPX2 // Cell. - 2013. - V.152, №4. - P.768-77. doi: 10.1016/j.cell.2012.12.044.
Petry S. Mechanisms of mitotic spindle assembly // Annual Review of Biochemistry. - 2016. -V.85. - P.659-83. doi: 10.1146/annurev-biochem-060815-014528.
Pinyol R., Scrofani J., Vernos I. The role of NEDD1 phosphorylation by aurora a in chromosomal microtubule nucleation and spindle function // Current Biology. - 2013. - V.23, №2. - P.143-9. doi: 10.1016/j.cub.2012.11.046.
Popova J.V., Pavlova G.A., Razuvaeva A.V., Yarinich L.A., Andreyeva E.N., Anders A.F., Galimova Y.A., Renda F., Somma M.P., Pindyurin A.V., Gatti M. Genetic control of kinetochore-driven microtubule growth in Drosophila mitosis // Cells. - 2022. - V.11, №14. - P.2127. doi: 10.3390/cells11142127.
Prosser S.L., Pelletier L. Mitotic spindle assembly in animal cells: A fine balancing act // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2017. - V.18, №3. - P.187-201. doi: 10.1038/nrm.2016.162.
Pulvers J.N., Bryk J., Fish J.L., Wilsch-Brauninger M., Arai Y., Schreier D., Naumann R., Helppi J., Habermann B., Vogt J., Nitsch R., Toth A., Enard W., Paabo S., Huttner W.B. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2010. - V.107, №38. - P.16595-600. doi: 10.1073/pnas.1010494107.
Rale M.J., Kadzik R.S., Petry S. Phase transitioning the centrosome into a microtubule nucleator // Biochemistry. - 2018. - V.57, №1. - P.30-7. doi: 10.1021/acs.biochem.7b01064.
Rath U., Rogers G.C., Tan D., Gomez-Ferreria M.A., Buster D.W., Sosa H.J., Sharp D.J. The Drosophila kinesin-13, KLP59D, impacts Pacman- and flux-based chromosome movement // Molecular Biology of the Cell. - 2009. - V.20. - P.4696-705. doi: 10.1091/mbc.e09-07-0557.
Renda F., Pellacani C., Strunov A., Bucciarelli E., Naim V., Bosso G., Kiseleva E., Bonaccorsi S., Sharp D.J., Khodjakov A., Gatti M., Somma M.P.The Drosophila orthologue of the INT6 oncoprotein regulates mitotic microtubule growth and kinetochore structure // PLoS Genetics. - 2017. - V.13, №5. - P.e1006784. doi: 10.1371/journal.pgen.1006784.
Rieder C.L. Kinetochore fiber formation in animal somatic cells: Dueling mechanisms come to a draw // Chromosoma. - 2005. - V.114, №5. - P.310-8. doi: 10.1007/s00412-005-0028-2.
Riparbelli M.G., Callaini G., Glover D.M., do Carmo Avides M. A Requirement for the abnormal spindle protein to organise microtubules of the central spindle for cytokinesis in Drosophila // Journal of Cell Science. - 2002. - V.115. - P.913-22. doi: 10.1242/jcs.115.5.913.
Ripoll P., Pimpinelli S., Valdivia M.M., Avila J. A cell division mutant of drosophila with a functionally abnormal spindle // Cell. - 1985. - V.41, №3. - P.907-12. doi: 10.1016/s0092-8674(85)80071-4.
Rogers G.C., Rogers S.L., Schwimmer T.A., Ems-McClung S.C., Walczak C.E., Vale R.D., Scholey J.M., Sharp D.J. Two mitotic kinesins cooperate to drive sister chromatid separation during anaphase // Nature. - 2004. - V.427, №6972. - P.364-70. - doi: 10.1038/nature02256.
Roostalu J., Surrey T. Microtubule nucleation: Beyond the template // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2017. - V.18, №11. - P.702-10. doi: 10.1038/nrm.2017.75.
Rujano M.A., Sanchez-Pulido L., Pennetier C., Dez G., Basto R. The microcephaly protein Asp regulates neuroepithelium morphogenesis by controlling the spatial distribution of myosin II // Nature Cell Biology. - 2013. - V.15, №11. - P.1294-1306. doi: 10.1038/ncb2858.
Sampath S.C., Leismann O., Ohi R., Pozniakovski A., Funabiki H., Salic A. The chromosomal passenger complex is required for chromatin-induced microtubule stabilization and spindle assembly // Cell. - 2004. - V.118, №2. - P.187-202. doi: 10.1016/j.cell.2004.06.026.
Sardon T., Peset I., Petrova B., Vernos I. Dissecting the role of Aurora A during spindle assembly // The EMBO Journal. - 2008. - V.27, №19. - P.2567-79. doi: 10.1038/emboj.2008.173.
Sarkar S., Sahoo P.K., Mahata S., Pal R., Ghosh D., Mistry T., Nasare V.D. Mitotic checkpoint defects: En route to cancer and drug resistance // Chromosome Research. - 2021. - V.29, №2. -P.131-144.doi: 10.1007/s10577-020-09646-x.
Saunders R.D., Avides M.C., Howard T., Gonzalez C., Glover D.M. The Drosophila gene abnormal spindle encodes a novel microtubule-associated protein that associates with the polar regions of the mitotic spindle // Journal of Cell Biology. - 1997. - V.137, №4. - P.881-90. doi: 10.1083/jcb.137.4.881.
Sazer S., Lynch M., Nedleman D. Deciphering the eVutionary history of open and closed mitosis // Current Biology. - 2014. - V.24, №22. - P.R1099-103. doi: 10.1016/j.cub.2014.10.011.
Schittenhelm R.B., Heeger S., Althoff F., Walter A., Heidmann S., Mechtler K., Lehner C.F. Spatial organization of a ubiquitous eukaryotic kinetochore protein network in Drosophila chromosomes // Chromosoma. - 2007. - V.116, №4. - P.385-402. - doi: 10.1007/s00412-007-0103-y.
Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nature Methods. - 2012. - V.9, №7. - P.671-5. doi: 10.1038/nmeth.2089.
Schoborg T., Zajac A.L., Fagerstrom C.J., Guillen R.X., Rusan N.M. An Asp-CaM complex is required for centrosome-pole cohesion and centrosome inheritance in neural stem cells // Journal of Cell Biology. - 2015. - V.211. - P.987-98. doi: 10.1083/jcb.201509054.
Schuh M., Ellenberg J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes // Cell. - 2007. - V.130, №3. - P.484-98. doi: 10.1016/j.cell.2007.06.025.
Sikirzhytski V., Renda F., Tikhonenko I., Magidson V., McEwen B.F., Khodjakov A. Microtubules assemble near most kinetochores during early prometaphase in human cells // Journal of Cell Biology. - 2018. - V.217. - P.2647-59. doi: 10.1083/jcb.201710094.
Sillje H.H.W., Nagel S., Körner R., Nigg E. A. HURP is a Ran-importin ß-regulated protein that stabilizes kinetochore microtubules in the vicinity of chromosomes // Current Biology. - 2006. -V.16, №8. -P.731-42. doi: 10.1016/j.cub.2006.02.070.
Somma M.P., Ceprani F., Bucciarelli E., Naim V., De Arcangelis V., Piergentili R., Palena A., Ciapponi L., Giansanti M.G., Pellacani C., Petrucci R., Cenci G., Verni F., Fasulo B., Goldberg M.L., Di Cunto F., Gatti M. Identification of Drosophila mitotic genes by combining co-expression analysis and RNA interference // PLoS Genetics. - 2008. - V.4, №7. - P.e1000126. doi: 10.1371/journal.pgen.1000126.
Song J.-G., King M.R., Zhang R., Kadzik R.S., Thawani A., Petry S. Mechanism of how augmin directly targets the Y-tubulin ring complex to microtubules // Journal of Cell Biology. - 2018. -V.217, №7. - P.2417-28. doi: 10.1083/jcb.201711090.
Spitzer M., Wildenhain J., Rappsilber J., Tyers M. BoxPlotR: a web tool for generation of box plots // Nature Methods. - 2014. - V.11, №2. - P.121-2. doi: 10.1038/nmeth.2811.
Stafstrom J.P., Staehelin L.A. Dynamics of the nuclear envelope and of nuclear pore complexes during mitosis in the Drosophila embryo // European Journal of Cell Biology. - 1984. - V.34. -P.179-89.
Strunov A., Boldyreva L.V., Andreyeva E.N., Pavlova G.A., Popova J.V., Razuvaeva A.V., Anders A.F., Renda F., Pindyurin A.V., Gatti M., Kiseleva E. Ultrastructural analysis of mitotic Drosophila S2 cells identifies distinctive microtubule and intracellular membrane behaviors // BMC Biology. - 2018. - V.16, №1. - P.68. doi: 10.1186/s12915-018-0528-1.
Subramanian R., Kapoor T.M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures // Developmental Cell. - 2012. - V.23, №5. - P.874-85. doi: 10.1016/j.devcel.2012.10.011.
Syred H.M., Welburn J., Rappsilber J., Ohkura H. Cell cycle regulation of microtubule interactomes: multi-layered regulation is critical for the interphase/mitosis transition // Molecular & Cellular Proteomics. - 2013. - V.12, №11. - P.3135-47. doi: 10.1074/mcp.M113.028563.
Tanaka N., Meng W., Nagae S., Takeichi M. Nezha/CAMSAP3 and CAMSAP2 cooperate in epithelial-specific organization of noncentrosomal microtubules // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2012. - V.109, №49. - P.20029-34. doi: 10.1073/pnas.1218017109.
Tanaka T.U., Zhang T. SWAP, SWITCH, and STABILIZE: mechanisms of kinetochore-microtubule error correction // Cells. - 2022. - V.11, №9. - P.1462. doi: 10.3390/cells11091462.
Tanenbaum M.E., Macurek L., van der Vaart B., Galli M., Akhmanova A., Medema R.H. A complex of Kif18b and MCAK promotes microtubule depolymerization and is negatively regulated by Aurora kinases // Current Biology. - 2011. - V.21, №16. - P.1356-65. doi: 10.1016/j.cub.2011.07.017.
Tanenbaum M.E., Vale R.D., McKenney R.J. Cytoplasmic dynein crosslinks and slides antiparallel microtubules using its two motor domains // eLife. - 2013. - V.2. - P.e00943. doi: 10.7554/eLife.00943.
Taverna E., Götz M., Huttner W.B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and eVution of the neocortex // Annual Review of Cell and Developmental Biology. - 2014. - V.30. - P.465-502. doi: 10.1146/annurev-cellbio-101011-155801.
Thornton G.K., Woods C.G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? // Trends in Genetics. - 2009. - V.25. - P.501-10. doi: 10.1016/j.tig.2009.09.011.
Timney B.L., Raveh B., Mironska R., Trivedi J.M., Kim S.J., Russel D., Wente S.R., Sali A., Rout M.P.Simple rules for passive diffusion through the nuclear pore complex // Journal of Cell Biology. - 2016. - V.215, №1. - P.57-76. doi: 10.1083/jcb.201601004.
Torosantucci L., De Luca M., Guarguaglini G., Lavia P., Degrassi F. Localized RanGTP Accumulation Promotes Microtubule Nucleation at Kinetochores in Somatic Mammalian Cells // Molecular Biology of the Cell. - 2008. - V.19, №5. - P.1873-82. doi: 10.1091/mbc.e07-10-1050.
Tovey C.A., Conduit P.T. Microtubule nucleation by Y-tubulin complexes and beyond // Essays in Biochemistry. - 2018. - V.62, №6. - P.765-80. doi: 10.1042/ebc20180028.
Tulu U.S., Fagerstrom C., Ferenz N.P., Wadsworth P.Molecular requirements for kinetochore-associated microtubule formation in mammalian cells // Current Biology. - 2006. - V.16, №5. -P.536-41. doi: 10.1016/j.cub.2006.01.060.
Tungadi E.A., Ito A., Kiyomitsu T., Goshima G. Human microcephaly ASPM protein is a spindle pole-focusing factor that functions redundantly with CDK5RAP2 // Journal of Cell Science. -2017. - V.130, №21. - P.3676-84. doi: 10.1242/jcs.203703.
Uehara R., Nozawa R.S., Tomioka A., Petry S., Vale R.D., Obuse C., Goshima G. The augmin complex plays a critical role in spindle microtubule generation for mitotic progression and cytokinesis in human cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. -2009. - V.106, №17. - P.6998-7003. doi: 10.1073/pnas.0901587106.
Vukusic K., Buda R., Bosilj A., Milas A., Pavin N., Tolic I.M. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes // Developmental Cell. - 2017. - V.43, №1. - P.11-23. doi: 10.1016/j.devcel.2017.09.010.
Vukusic K., Tolic I.M. Anaphase B: Long-standing models met new concepts // Seminars in Cell and Developmental Biology. - 2021. - V.117. - P.127-39. doi: 10.1016/j.semcdb.2021.03.023.
Wadsworth P., Khodjakov A. E pluribus unum: towards a universal mechanism for spindle assembly // Trends Cell Biol. - 2004. - V.14, №8. - P.413-9. doi: 10.1016/j.tcb.2004.07.004.
Wakefield J.G., Bonaccorsi S., Gatti M. The Drosophila protein Asp is inVved in microtubule organization during spindle formation and cytokinesis // Journal of Cell Biology. - 2001. - V.153, №4. - P.637-47. doi: 10.1083/jcb.153.4.637.
Walczak C.E., Cai S., Khodjakov A. Mechanisms of chromosome behaviour during mitosis // Nature Reviews Molecular Cell Biology. -2010. -V.11, №2. -P.91-102. doi: 10.1038/nrm2832.
Wang H., Brust-Mascher I., Civelekoglu-Scholey G., Scholey J.M. Patronin mediates a switch from kinesin-13-dependent poleward flux to anaphase b spindle elongation // Journal of Cell Biology. - 2013. - V.203, №1. - P.35-46. doi: 10.1083/jcb.201306001.
Wang S., Wu D., Quintin S., Green R.A., Cheerambathur D.K., Ochoa S.D., Desai A., Oegema K. NOCA-1 functions with Y-tubulin and in parallel to Patronin to assemble non-centrosomal microtubule arrays in C. elegans // eLife. - 2015. - V.4. - P.e08649. doi: 10.7554/eLife.08649.
Weaver B.A.A., Cleveland D.W. Aneuploidy: Instigator and inhibitor of tumorigenesis // Cancer Research. - 2007. - V.67, №21. - P.10103-5. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-07-2266.
Weaver L.N., Ems-McClung S.C., Chen S.H.R., Yang G., Shaw S.L., Walczak C.E. The Ran-GTP gradient spatially regulates XCTK2 in the spindle // Current Biology. - 2015. - V.25, №11.
- P.1509-14. doi: 10.1016/j.cub.2015.04.015.
Welburn J.P.The molecular basis for kinesin functional specificity during mitosis // Cytoskeleton.
- 2013. - V.70. - P.476-93. doi: 10.1002/cm.21135.
Westermann S., Drubin D.G., Barnes G. Structures and Functions of Yeast Kinetochore Complexes // Annual Review of Biochemistry. - 2007. - V.76, №1. - P.563-91. doi: 10.1146/annurev.biochem.76.052705.160607.
Wiese C., Zheng Y. A new function for the Y-tubulin ring complex as a microtubule minus-end cap // Nature Cell Biology. - 2000. - V.2, №6. - P.358-64. doi: 10.1038/35014051.
Wiese C., Wilde A., Moore M.S., Adam S.A., Merdes A., Zheng Y. Role of importin-ß in coupling ran to downstream targets in microtubule assembly // Science. - 2001. - V.291, №5504. - P.653-6. doi: 10.1126/science.1057661.
Williams S.E., Garcia I., Crowther A.J., Li S., Stewart A., Liu H., Lough K.J., O'Neill S., Veleta K., Oyarzabal E.A., Merrill J.R., Shih Y.-Y.I., Gershon T.R. Aspm sustains postnatal cerebellar neurogenesis and medulloblastoma growth in mice // Development. - 2015. - V.142, №22. -P.3921-32. doi: 10.1242/dev.124271.
Woodruff J.B., Wueseke O., Hyman A.A. Pericentriolar material structure and dynamics // Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. - 2014. - V.369, №1650.
- P.20130459. doi: 10.1098/rstb.2013.0459.
Wu X., Xu S., Wang P., Wang Z.-Q., Chen H., Xu X., Peng B. ASPM promotes ATR-CHK1 activation and stabilizes stalled replication forks in response to replication stress // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2022. - V.119. - P.e2203783119. doi: 10.1073/pnas.2203783119.
Xu S., Wu X., Wang P., Cao S.-L., Peng B., Xu X. ASPM promotes homologous recombination-mediated DNA repair by safeguarding BRCA1 stability // iScience. - 2021. - V.24, №6. -P.102534. doi: 10.1016/j.isci.2021.102534.
Yokoyama H., Rybina S., Santarella-Mellwig R., Mattaj I.W., Karsenti E. ISWI is a RanGTP-dependent MAP required for chromosome segregation // Journal of Cell Biology. - 2009. - V.187, №6. - P.813-29. doi: 10.1083/jcb.200906020.
Zhang C., Hughes M., Clarke P.R. Ran-GTP stabilises microtubule asters and inhibits nuclear assembly in Xenopus egg extracts // Journal of Cell Science. - 1999. - V.112, №14. - P.2453-61. doi: 10.1242/jcs.112.14.2453.
Zhang H., Dawe R.K. Mechanisms of plant spindle formation // Chromosome Research. - 2011. - V.19, №3. - P.335-44. doi: 10.1007/s10577-011-9190-y.
Zhong X., Liu L., Zhao A., Pfeifer G.P., Xu X. The abnormal spindle-like, microcephaly-associated (ASPM) gene encodes a centrosomal protein // Cell Cycle. - 2005. - V.4, №9. - P.1227-9. doi: 10.4161/cc.4.9.2029.
Zhou Z., Xu H., Li Y., Yang M., Zhang R., Shiraishi A., Kiyonari H., Liang X., Huang X., Wang Y., Xie Q., Liu S., Chen R., Bao L., Guo W., Wang Y., Meng W. CAMSAP1 breaks the homeostatic microtubule network to instruct neuronal polarity // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. - 2020. - V.117, №36. - P.22193-203. doi: 10.1073/pnas.1913177117.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.