RPA- и RPA/Ku-тельца в ядрах, сформированных в системе in vitro Xenopus laevis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Ельцов, Михаил Юрьевич

• Ельцов, Михаил Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ельцов, Михаил Юрьевич

1. Общее введение

2. Обзор литературы

2.1. Репликация ДНК у эукариот В

2.2. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК. Белок Ки

2.3. Обзор экспериментальной системы

2.4. Репликационный белок A. RPA-, RPA/Ku-домены

3. Материалы и методы

3.1. Система in vitro Xenopus laevis

3.2. Индукция двухцепочечных разрывов ДНК в ядрах спермиев

X. laevis

3.3. Непрямая иммунофлуоресцентная микроскопия

3.4. Иммуноэлектронная микроскопия

3.5. Афинная очистка антител и удаление RPA и Ки из экстрактов яйцеклеток при помощи антител

3.6. Мониторинг синтеза ДНК

3.7. Использование ДНК, связанной с магнитными шариками, для сборки хроматина in vitro

4. Основные результаты

4.1. Обработка рестриктазами ядер спермиев вызывает образование RPA/Ku-доменов

4.2. Ультраструктурное исследование RPA-доменов и RPA/Kuдоменов

4.3. В RPA/Ku-тельцах происходит «неплановый» синтез ДНК

4.4. RPA и Ku связываются предпочтительно с последовательностями ДНК, проксимальными к ДЦР

4.5. Белки Ku и RPA необходимы для сшивания концов ДНК

5. Обсуждение

5.1. Анализ ультраструктуры и молекулярного состава RPA-и RPA/Ku-доменов в ядрах, собранных в системе in vitro

X. laevis

5.2. Морфофункциональный анализ RPA/Ku-доменов в ядрах, содержащих ДЦР

6. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «RPA- и RPA/Ku-тельца в ядрах, сформированных в системе in vitro Xenopus laevis»

Репликация и репарация Д1Ж необходимы для сохранения и воспроизводства генетической информации. Изучение этих процессов имеет помимо огромного фундаментального важное прикладное значение. Полученные знания находят применение в медицине, в диагностике и лечении заболеваний, связанных с нарушениями в репликационном и репаративном аппаратах клетки (Freeman et al., 1999). За последние годы достигнут значительный прогресс в изучении молекулярных механизмов репликации и репарации ДНК у эукариот (DePamphilis, 2003; Friedberg, 2003). Тем не менее, в том, как эти процессы организованы на уровне ядра высших эукариот, многое остаётся неясным. «Неклеточная» система X. laevis является единственной широко используемой моделью, позволяющей иззать репликацию и репарацию ДНК у высших эукариот in vitro. Данная экспериментальная система основана на способности экстрактов яйцеклеток X. привнесённой laevis формировать функционально активные ядра на основе ДНК, в качестве которой чаще всего используются демембранизированные ядра спермиев. Повышенный интерес к данной системе объясняется двумя главными методическими преимуществами: во-первых, в ядрах, сформированных in vitro, не обнаруживается транскрипция, а возможны только репликация и репарация ДНК; во-вторых, неклеточность системы, то есть отсутствие цитоплазматических возможностей. Несмотря на интенсивное использование «неклеточной» системы Xenopus, структурная организации репликации и репарации ДНК в ядрах, формирующихся in vitro, оставалась мало изученной. Большинство исследователей в основном мембран, открывает широкий спектр экспериментальных ограничивалось методами световой, флуоресцентной и конфокальной микроскопии, обладающими ограниченной разрешающей способностью (Malinsky et al., 2002). Очевидно, что детальное изучение структуры ядра требует дополнительного применения электронной микроскопии и иммуноцитохимии на ультраструктурном уровне. Именно такие методы структурно-функционального анализа в совокупности с молекулярными подходами и позволили нам обнаружить и охарактеризовать новые структурные домены в ядрах, собранных in vitro. В основу нашего исследования были взяты данные, полученные Адачи и Лэммли (Adachi and Laemmli, 1992, 1994). Они изолировали белок, который обнаруживался в многочисленных точечных доменах перед началом репликации в ядрах, сформированных in vitro. Этот белок оказался гомологом репликационного белка А (RPA) у Xenopus. RPA консервативный белок, который связывается с одноцепочной ДНК с высокой афинностью и участвует в процессах репликации, репарации и рекомбинации (Wold, 1997). Нами было предпринято морфофункциональное исследование доменов RPA на ультраструктурном уровне. В ходе предварительных экспериментов нами было обнаружено, что обработка ядер спермиев рестрикционными ферментами стимул про вал cj формирование RPA- доменов. Однако в этом случае RPA-фокусы содержали ещё и белок Ки и были нами названы RPA/Ku-доменами. Так как белок Ки является необходимым фактором в репарации двухцепочечных разрывов ДДК (ДЦР), мы предположили, что RPA/Kuдомены могут быть связаны с репарацией ДНК. Для проверки данной гипотезы нами была проведена серия экспериментов, результаты которых подтвердили наше предположение об участии RPA/Ku-доменов в репарации ДЦР. Автор благодарен сотрудникам лабораторий клеточной биологии и экспрессии генов Института экспериментальной медицины, Прага, Чешская Республика, Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН за постоянную помощь и поддержку в работе. Особую признательность автор выражает научным руководителям Владимиру Николаевичу Парфёнову и Ивану Рашке. Автор благодарен Паоле Гранд и Ульриху Лэммли (Женевский университет, Швейцария) за помощь в работе, а таюке Дмитрию Сергеевичу Боголюбову и Галине Николаевне Почукалиной за помощь в подготовке рукописи.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Ельцов, Михаил Юрьевич

6. выводы

1. В ядрах, сформированных в системе in vitro X. laevis, можно обнаружить новые неизвестные структуры, которые в соответствии с маркерными белками, были названы RPA- и RPA/Ku-тельцами.

2. RPA- и RPA/Ku-тельца имеют сходную ультраструктуру и являются доменами специфически организованного хроматина.

3. RPA- и RPA/Ku-тельца компартментализированы. Белок RPA расположен в основном на периферии телец. В случае ВСС НСС-ядер места синтеза ДНК также локализируются на периферии RPA-телец.

4. Формирование RPA/Ku-телец вызывается ДЦР и требует гидролиза АТФ.

5. В RPA/Ku-тельцах происходит «неплановый» RPA-зависимый синтез ДНК.

6. Белок RPA концентрируется вблизи концов ДЦР. 7?| Белок Ки и, в меньшей степени, белок RPA необходимы для сшивания концов ДНК в системе in vitro X. laevis.

8. RPA/Ku-тельца являются фабриками репарации, которые собираются на кластерах ДЦР. ^

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации

Grandi, P., Eltsov, М, Neilsen, I., Raska, I. (2001) DNA double-strand breaks induce formation of RP-A/Ku foci on in vitro reconstituted Xenopus sperm nuclei. J. Cell Sci. 114, 3345-3357.

Eltsov, M., Grandi, P., Raska, I. (2000) Ultrastructural characterization of RPA-containing domains in nuclei assembled in Xenopus egg extracts. J. Struct. Biol. 129, 211217.

Ельцов, М.Ю., Гранди, П., Рашка, И. (2000) Исследование ядерных структур формируемых в экстрактах яиц шпорцевой лягушки Xenopus laevis и содержащих репликационный протеин А. Цитология 42: 279-280.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ельцов, Михаил Юрьевич, 2004 год

1. Adachi, Y., Laemmli, U.K. (1992) Identification of nuclear pre-replication centres poised for DNA synthesis in Xenopus egg extracts: immunolocalization study of replication protein A, J. Cell Biol. 119, 1-15.

2. Adachi, Y., Laemmli, U.K. (1994) Study of the cell cycle-dependent assembly of the DNA pre-replication centres in Xenopus egg extracts, EMBO J. 13, 4153-4164.

3. Armbruster, B.L., Garavito, R.M., Kellenberger, E. (1983) Dehydration and embedding temperatures affect the antigenic specificity of tubulin and immunolabeling by the protein A-colloidal gold technique, J. Histochem. Cytochem. 31, 1380-1384.

4. Baumann, P., Benson, F.E., Hajibagheri, N., West, S.C. (1997) Purification of human Rad51 protein by selective spermidine precipitation, Mutat. Res. 384, 65-72

5. Baumann, P., West, S.C. (1997) The human Rad51 protein: polarity of strand transfer and stimulation by hRPA, EMBO J. 16, 5198-5206.

6. Blow, J. J., Laskey, R.A. (1986) Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs, Cell 47, 577-587.

7. Boubnov, N.V., Weaver, D.T. (1995) scid cells are deficient in Ku and replication protein A phosphorylation by the DNA-dependent protein kinase, Mol. Cell. Biol. 15, 57005706.

8. Brush, G.S., Anderson, C.W., Kelly, TJ. (1994) The DNA-activated protein kinase is required for the phosphorylation of replication protein A during simian virus 40 DNA replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12520-12524.

9. Brill, S.J., Stillman, B. (1991) Replication factor-A from Saccharomyces cerevisiae is encoded by three essential genes coordinately expressed at S phase, Genes Dev.5, 1589-1600.

10. Coleman, T.R., Carpenter, P.B., Dunphy, W.G. (1996) The Xenopus Cdc6 protein is essential for the initiation of a single round of DNA replication in cell-free extracts, Cell 87,53.63.

11. Coue, M., Kearsey, S.E., Mechali, M. (1997) Chromatin binding, nuclear localization and phosphorylation of Xenopus cdc21 are cell-cycle dependent and associated with the control of initiation of DNA replication, EMBOJ. 15, 1085-1097.

12. Cox, L.S. (1992) DNA replication in cell-free extracts from Xenopus eggs is prevented by disrupting nuclear envelope function, J. CellSci. 101, 43-53.

13. DePamphilis, M.L. (2000) Review: nuclear structure and DNA replication, J. Struct. Biol. 129, 186-197.

14. DePamphilis M.L. (2003) The 'ORC cycle': a novel pathway for regulating eukaryotic DNA replication. Gene. 310, 1-15.

15. Donovan, S., Harwood, J., Drury, L.S., Diffley, J.F. (1997) Cdc6p-dependent loading of Mem proteins onto pre-replicative chromatin in budding yeast, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5611-5616.

16. Dynan, W.S., Yoo, S. (1998) Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids, Nucl. Acids Res. 26, 1551-1559.

17. Ellis, D.J., Jenkins, H., Whitfield, W.G., Hutchison, C.J. (1997) GST-lamin fusion proteins act as dominant negative mutants in Xenopus egg extract and reveal the function of the lamina in DNA replication, J. Cell Sci. 110, 2507-2518.

18. Erdile, L.F., Wold, M.S., Kelly, T.J. (1990) The primary structure of the 32-kDa subunit of human replication protein A. J. Biol Chem. 265, 3177-3182.

19. Fairman, M., Prelich, G., Tsurimoto, Т., Stillman, B. (1988) Identification of cellular components required for SV40 DNA replication in vitro, Biochim. Biophys. Acta. 951, 382387.

20. Fakan, S., Hancock, R. (1974) Localization of newly-synthesized DNA in a mammalian cell as visualized by high resolution autoradiography, Exp. Cell Res. 83, 95-102.

21. Freeman, A., Morris, L.S., Mills, A.D., Stoeber, K., Laskey, R.A., Williams, G.H., Coleman, N. (1999) Minichromosome maintenance proteins as biological markers of dysplasia and malignancy, Clin. Cancer. Res. 5, 2121-2132.

22. Firmenich, A. A., Elias-Arnanz, M., Berg, P. (1995). A novel allele of Saccharomyces cerevisiae RFA1 that is deficient in recombination and repair and suppressible by RAD52, Mol. Cell. Biol. 15, 1620-1631.

23. Francon, P., Maiorano, D., Mechali, M. (1999) Initiation of DNA replication in eukaryotes: questioning the origin. FEBS Lett. 452,87-91.

24. Friedberg, E.C. (2003) DNA damage and repair. Nature. 421, 436-440.

25. Fugmann, S.D., Lee, A.I., Shockett, P.E., Villey, I.J., Schatz, D.G. (2000) The RAG proteins and V(D)J recombination: complexes, ends, and transposition, Annu Rev Immunol. 18, 495-527.

26. Goldberg, M., Jenkins, H., Allen, Т., Whitfield, W.G., Hutchison, C.J. (1995) Xenopus lamin B3 has a direct role in the assembly of a replication competent nucleus: evidence from cell-free egg extracts, J. Cell Sci. 108, 3451-3461

27. Gottlieb, T.M., Jackson, S.P. (1993) The DNA-dependent protein kinase: requirement for DNA ends and association with Ku antigen, Cell. 72, 131-142.

28. Gottlich, В., Reichenberger, S., Feldmann, E., Pfeiffer, P. (1998) Rejoining of DNA double-strand breaks in vitro by single-strand annealing, Eur. J. Biochem. 258, 387-395.

29. Griffiths, G., McDowal, A., Back, R., and Dubochet, J. (1984) The preparation of cry о sections for immunocytochemistry, J. Ultrastruc. Res. 89, 65-78.

30. Hand, R. (1978) Eucaryotic DNA: organization of the genome for replication. Cell. 15, 317325.

31. Hartl, P., Olson, E., Dang, Т., Forbes, D.J. (1994) Nuclear assembly with lambda

32. DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate, J. Cell Biol. 124, 235-248.

33. Heald, R., Tournebize, R., Blank, Т., Sandaltzopoulos, R., Becker, P., Hyman, A., Karsenti, E. (1996) Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts, Nature 382, 420-425.

34. Herrick, J., Stanislawski, P., Hyrien, O., Bensimon, A. (2000) Replication fork density increases during DNA synthesis in X. laevis egg extracts, J. Mol. Biol. 300, 1133-1142.

35. Hofferer, L., Winterhalter, K.H., Althaus, F.R. (1995) Xenopus egg lysates repair heat-generated DNA nicks with an average patch size of 36 nucleotides, Nucleic Acids Res. 23, 1396-1397.

36. Jeggo, P.A. (1998) DNA breakage and repair. Adv Genet. 38:185-218.

37. Johnson, R.D., Jasin, M. (2000) Sister chromatid gene conversion is a prominent double-strand break repair pathway in mammalian cells. EMBOJ. 19, 3398-3407.

38. Karran, P. (2000) DNA double strand break repair in mammalian cells, Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 144-150.

39. Kitazawa, S., Takenaka, A., Abe, N., Maeda, S., Horio, M., Sugiyama, T. (1989) Insitu DNA-RNA hybridization using in vivo bromodeoxyuridine-labeled DNA probe, Histochemistry 92, 195-199.

40. Ma, H., Samarabandu, J., Devdhar, R.S., Acharya, R., Cheng, P.C., Meng, C., Berezney, R. (1998) Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells, J. Cell Biol. 143, 1415-1425.

41. Malinsky, J., Koberna, K., Bednar, J., Stulik, J., Raska, I. (2002) Searching for active ribosomal genes in situ: light microscopy in light of the electron beam, J. Struct. Biol. 140, 227-231.

42. Martensson, S., Hammarsten, O. (2002) DNA-dependent protein kinase catalytic subunit. Structural requirements for kinase activation by DNA ends. J Biol Chem. 277, 30203029.

43. Meier, J., Campbell, K.H., Ford, C.C., Stick, R., Hutchison, C.J. (1991) The role of lamin LIII in nuclear assembly and DNA replication, in cell-free extracts of Xenopus eggs, J.1. Cell Sci. 98, 271-279.

44. Murray, A.W., Kirschner, M.W. (1989) Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280.

45. Murray, A.W. (1991) Cell cycle extracts, Meth. Cell Biol. 36, 581-604.

46. Nakamura, H., Morita, Т., Sato, C. (1986) Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus, Exp. Cell Res. 165, 291297.

47. Newmeyer, D.D., Lucocq, J.M., Burglin, T.R., De Robertis, E.M. (1986) Assembly in vitro of nuclei active in nuclear protein transport: ATP is required for nucleoplasmin accumulation, EMBO J. 5, 501-510.

48. Newport, J. (1987) Nuclear reconstitution in vitro: stages of assembly around protein-free DNA, Cell 48, 205-217.

49. O'Keefe, R.T., Henderson, S.C., Spector, D.L. (1992) Dynamic organization of DNA replication in mammalian cell nuclei: spatially and temporally defined replication of chromosome-specific alpha-satellite DNA sequences, J. Cell Biol. 116, 1095-1110.

50. Palzkill, T.G., Newlon, C.S. (1988) A yeast replication origin consists of multiple copies of a small conserved sequence. Cell. 53, 441-450.

51. Pasero, P., Gasser, S.M. (1998) New systems for replicating DNA in vitro, Curr. Opin. Cell Biol. 10,304-310.

52. Philpott, A., Leno, G.H. (1992) Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts, Cell 69, 759-767.

53. Raska, I., Dundr, M., Koberna, K., Melcak, I., Risueno, M.C., Тбгбк, I. (1995) Does the synthesis of ribosomal RNA take place within nucleolar fibrillar centers or dense fibrillar components? A critical appraisal, J. Struct. Biol. 114, 1-22.

54. Romanowski, P., Madine, M.A., Rowles, A., Blow, J.J., Laskey, R.A. (1996) The

55. Xenopus origin recognition complex is essential for DNA replication and MCM binding to chromatin, Curr. Biol. 6, 1416-1425.

56. Sancar, A. (1996) DNA excision repair, Ann.Rev.Biochem. 65, 43-81.

57. Schar, P. (2001) Spontaneous DNA damage, genome instability, and cancer—when DNA replication escapes control, Cell 104, 329-32.

58. Sharova, N.P., Abramova, E. B. (2002) Initiation of DNA replication in eukaryotes is an intriguing cascade of protein interactions. Biochemistry (Mosc). 67, 1217-1223.

59. Sheehan, M.A., Mills, A.D., Sleeman, A.M., Laskey, R.A., Blow, J.J. (1988) Steps in the assembly of replication-competent nuclei in a cell-free system from Xenopus eggs, J.Cell Biol. 106, 1-12.

60. Smith, G.C., Jackson, S.P. (1999) The DNA-dependent protein kinase, Genes Dev. 13, 916-934.

61. Smith, J. Rothstein, R. (1995) A mutation in the gene encoding the Saccharomyces cerevisiae single-stranded DNA-binding protein Rfal stimulates a RAD52-independent pathway for direct-repeat recombination, Mol. Cell Biol. 15, 1632-1641.

62. Spann, T.P., Moir, R.D., Goldman, A.E., Stick, R., Goldman, R.D. (1997) Disruption of nuclear lamin organization alters the distribution of replication factors and inhibits DNA synthesis, J. Cell Biol. 136, 1201-1212.

63. Strick, R., Laemmli, U.K. (1995) SARs are cis DNA elements of chromosome dynamics: synthesis of a SAR repressor protein, Cell 83, 1137-1148.

64. Sugiyama, Т., Zaitseva, E.M., Kowalczykowski, S.C. (1997) A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein, J. Biol. Chem. 272, 7940-7945.

65. Thiry, M. (1992) Ultrastructural detection of DNA within the nucleolus by sensitive molecular immunocytochemistry, Exp. Cell. Res. 200, 135-144.

66. Thode, S., Schafer, A., Pfeiffer, P., Vielmetter, W. (1990) A novel pathway of DNA end-to-end joining, Cell 60, 921-928.

67. Tokuyasu, K.T. (1989) Use of polyvinylpyrrolidone) and poly(vinyIalcohol) for cryoultramicrotomy, Histochem J. 21, 163-171.

68. Tomilin, N.V., Solovjeva, L.V., Svetlova, M.P., Pleskach, N.M., Zalenskaya, I.A., Yau, P.M., Bradbury, E.M. (2001) Visualization of focal nuclear sites of DNA repair synthesis induced by bleomycin in human cells. Radiat Res. 156, 347-354.

69. Varlet, I., Canard, В., Brooks, P., Cerovic, G., Radman, M. (1996) Mismatch repair in Xenopus egg extracts: DNA strand breaks act as signals rather than excision points, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10156-10161.

70. Walker, J.R., Corpina, R.A., Goldberg, J. (2001) Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double-strand break repair, Nature 412 (6847),607-614.

71. Wold, M.S. (1997) Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism, Ann.Rev.Biochem. 66, 61-92.

72. Yan, H., Chen, C.Y., Kobayashi, R., Newport, J. (1998) Replication focus-forming activity 1 and the Werner syndrome gene product, Nat. Genet. 19, 375-378.

73. Yan, H., Newport, J. (1995) FFA-1, a protein that promotes the formation of replication centers within nuclei, Sciene 269, 1883-1885.

74. Zyskind, J.W., Smith, D.W. (1986) The bacterial origin of replication, oriC. Cell 46, 489-90.