Синтез и биологическая активность гибридных молекул на основе аналогов ендииновых антибиотиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Хмелевская Екатерина Алексеевна

• Хмелевская Екатерина Алексеевна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Хмелевская Екатерина Алексеевна

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Природные ендиины: представители, классификация, нахождение в природе

2.2. Циклоароматизация Бергмана и ендииновые антибиотики

2.3. Циклизация Бергмана как основа механизма действия природных ендииновых антибиотиков

2.4. Методы получения природных ендиинов

2.5. Синтетические аналоги ендииновых антибиотиков

2.6. Комплексы ендиинов с металлами (металлоендиины)

2.7. Способы модификации ендииновых антибиотиков

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Выбор базовой структуры ендиина

3.1.1 Выбор подходящего гетероцикла, конденсированного с ендииновой системой, и гетероатома, включенного в ендииновый цикл

3.1.2 Выбор подходящего гетероатома в ендииновом коре

3.1.3 Выбор линкерной группы у атома азота для функционализации ^ендиина

3.1.4 Синтез и свойства N-Ts бензотиофен-конденсированного ендиина

3.2 Синтез функционализированных ендиинов

3.2.1. Синтез NN ендиина

3.2.2 Синтез сульфонамидных производных ендиинов, содержащих клик-функции в аренсульфонамидном фрагменте

3.2.3 Синтез ендиина с терминальной тройной связью

3.2.4 Синтез ендиина с изотиоцианатной (NCS) группой

3.2.5 Синтез ендиина с малеимидным фрагментом

3.3 Синтез гибридных молекул 10-членных циклических ендиинов и их биологическая активность

3.3.1 Синтез гибридов типа I через медь-катализируемое азид-алкиновое присоединение

3.3.2 Стратегия получения тиомочевинных гибридов типа II путем взаимодействия NCS-ендиина с аминолигандами

3.3.3 Стратегия получения гибридов с использованием тиол-еновой реакции

3.4 Биологическая активность гибридов ендиинов I и II типа

4. ВЫВОДЫ

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

5.1. Общая информация и методы

5.2. Синтез исходных соединений

5.3. Подходы к синтезу индол-конденсированного 10-членного циклического ендиина

5.4. Подходы к синтезу бензотиофен-конденсированных 10-членных ендиинов

5.5. Синтез гибридов

5.5.1. Синтез гибридов азаендиинов через триазольные линкер

5.5.2. Синтез гибридов через взаимодействие NCS-ендиина с аминами

5.5.3. Синтез гибридов через тиол-еновую реакцию

5.5.4. Синтез модельных гибридов, содержащих MGB-лиганды

5.6. Определение цитотоксичности (MTT-тест)

5.7. Кинетические измерения

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. БЛАГОДАРНОСТИ

9. ПРИЛОЖЕНИЕ А

10. ПРИЛОЖЕНИЕ Б

11. ПРИЛОЖЕНИЕ В

12. ПРИЛОЖЕНИЕ Г

13. ПРИЛОЖЕНИЕ Д

14. ПРИЛОЖЕНИЕ Е

15. ПРИЛОЖЕНИЕ Ж

16. ПРИЛОЖЕНИЕ З

17. ПРИЛОЖЕНИЕ И

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и биологическая активность гибридных молекул на основе аналогов ендииновых антибиотиков»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности в мире, которая каждый год уносит миллионы жизней. По данным «Национального медицинского исследовательского центра радиологии» министерства здравоохранения Российской Федерации смертность населения России от онкологических заболеваний занимает второе место после сердечно-сосудистых болезней.[1]

Одним из ключевых способов лечения онкологических заболеваний является химиотерапия, которая в зависимости от типа и степени заболевания используется либо как монотерапия, либо в составе протоколов комплексной терапии. Мощное развитие таргетной терапии не снижает востребованность в классических цитостатиках. Несмотря на их сопутствующую высокую токсичность, такие препараты как доксорубицин, цисплатин, фторурацил, таксотер, гидроксимочевина, циклофосфан активно используются в качестве «красной» и «желтой» химиотерапии во многих лечебных протоколах. [2-4] Кроме этого, чрезвычайно активно развивается и внедряется в практику снижение токсичности и увеличение селективности действия классических цитостатиков за счет создания на их основе конъюгатов с антителами для адресной доставки в опухолевые клетки (antibody drug conjugates, ADC).[5, 6] Поэтому разработка новых цитостатических и цитотоксичных противоопухолевых агентов, которые, в том числе, можно использовать в качестве нагрузки для антител, является актуальной задачей.

Природные ендииновые антибиотики - семейство ДНК-повреждающих противоопухолевых агентов, выделенных из актиномицетов, обладающих чрезвычайно мощным цитотоксическим эффектом и проявляющих необыкновенно высокую противоопухолевую активность. [7] Специфическим структурным фрагментом ендииновых соединений является (2)-гекс-3-ен-1,5-дииновая система, включённая в 9- или 10-членный цикл. Напряженная ендииновая система способна претерпевать циклоароматизацию Бергмана с приемлемыми скоростями даже при 37 С, образуя 1,4-фенилендирадикалы, которые генерируют 1- и/или 2-нитевые разрывы ДНК, что приводит к гибели клетки. Однако из-за сложной структуры, нестабильности, высокой токсичности и низкой селективности по отношению к раковым клеткам применение природных ендиинов ограничено. Несмотря на отмеченные недостатки, на сегодняшний день существуют два противоопухолевых препарата на основе ADC природного ендиина - калихеамицина - Гемтузумаб озогамицин (Mylotarg®)[8] и Инотузумаб озогамицин (Besponsa®),[9] разрешенных к применению в качестве таргетной комплексной терапии соответствующих лейкемий. Также разрабатывается лекарство на основе унциаломицина.[10]

Однако синтез калихеамицина и унциаломицина, а также их близких аналогов сложен и дорогостоящ. Следовательно, рациональный дизайн и синтез менее сложных ендииновых систем с четко заданными свойствами может быть прекрасной альтернативой разработке противоопухолевых средств на основе природных ендиинов. Данное исследование направлено на рациональный дизайн и разработку эффективных методов синтеза простых и доступных аналогов ендииновых антибиотиков с целью получения оптимальной ендииновой структуры-лидера для последующего создания новых противоопухолевых препаратов.

Степень разработанности темы. На сегодняшний день существуют множество примеров синтетических аналогов природных ендииновых антибиотиков. Среди них известны группы ациклических, а также циклических ендииновых систем. Однако в большинстве работ упор делается именно на синтез таких систем, тогда как изучение их биологической активности осуществляется лишь на уровне оценки эффективности расщепления ДНК. Работы, в которых бы осуществлялись комплексные исследования в области синтетических аналогов ендииновых антибиотиков по следующему алгоритму - выбор оптимальной ендииновой структуры и определение факторов, влияющих на стабильность и активность молекулы - практическая оценка синтетической доступности выбранных ендиинов - разработка методов эффективной функционализации и синтез гибридов ендиинов с увеличенной избирательностью действия на опухолевые клетки - остаются неизвестными.

Цели и задачи работы. Целью диссертации является разработка эффективных методов получения аналогов ендииновых антибиотиков, а также их гибридов с лигандами, позволяющими регулировать цитотоксическую активность ендиинов.

Для достижения поставленной цели в работе были обозначены следующие задачи:

1. Разработка методов синтеза 10-членных гетероендиинов, конденсированных с различными гетероциклами и содержащих функциональные группы для последующей модификации;

2. Определение оптимального сайта и типа функционализации, а также стадии для модификации ендииновых молекул;

3. Отработка методов получения гибридов ендиинов с лигандами на основе этиленгликоля, опухоль-ориентированными лигандами, а также флуоресцентными красителями;

4. Изучение противоопухолевой активности полученных ендииновых гибридов и определение оптимального типа модификации для достижения наилучшей цитотоксичности и селективности в отношении опухолевых клеток.

Научная новизна и практическая значимость. В ходе диссертационного исследования были разработаны эффективные методы синтеза гетероендиинов, конденсированных с бензотиофеновым и индольным гетероциклами, включая индол-аннелированный азаендиин, бензотиофен-аннелированные тиаендиин и оксаендиин с функциональной группой. Было установлено, что азаендиины, конденсированные с бензотиофеном, являются лучшими кандидатами для создания гибридов. Было показано, что оптимальным сайтом функционализации является аренсульфонамидный фрагмент, в который могут быть введены такие функциональные клик-группы, как терминальная тройная связь, изотиоцианатная группа, малеимидный фрагмент. Для полученных функционализированных ендиинов были разработаны методы гибридизации при помощи клик-реакций, а именно через медь-катализируемое азид-алкиновое циклоприсоединение, взаимодействие изотиоцианатов с аминами и тиол-еновую реакцию. Разработанные методы гибридизации были использованы для получения гибридов ендиинов с лигандами на основе этиленгликоля, глюкозы, лигандов к малой бороздке ДНК, флуоресцентными красителями. Было установлено, что лучшими лигандами для гибридизации, позволяющими получить гибриды ендиинов с цитотоксичностью в наномолярном диапазоне, являются лиганды к малой бороздке ДНК, а лучшим типом связывания ендиина и лиганда -триазол-содержащий линкер.

Методология и методы исследования. Реакции проводились общепринятыми методами органического синтеза. Оптимизация целевых реакций проводилась путём варьирования различных реакционных параметров (катализатор, растворитель, температура, концентрация). Изучение границ применимости методов осуществлялось путем проведения реакций с субстратами, имеющими заместители различной электронной и стерической природы. Для очистки соединений использовались методы колоночной хроматографии. Доказательство строения и чистоты полученных соединений основано на данных ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и рентгеноструктурного анализа.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты работы представлены в 1C публикациях (4 статьях и тезисах 6 докладов). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, индексируемых Scopus и Web of Science.

1. Ekaterina A. Khmelevskaya, Natalia A. Danilkina, Sergey A. Silonov, Evgeny V. Tretyakov, Alexander F. Khlebnikov, Vladimir E. Melnikov, Anastasiia V. Nikitina, Andrey M. Rumyantsev, Mariya A. Kryukova, Irina A. Balova. «Synthesis and Biological Study of Benzothiophene-Fused Azaenediyne Hybrids as Potential Anticancer Agents» - Org. Biomol. Chem., 2026, №24, p. 617-629, https.//doi.org/10.1039/D5OB01600B

2. Natalia A. Danilkina, Ekaterina A. Khmelevskaya, Andrey A. Shtyrov, Mikhail N. Ryazantsev, Alexander F. Khlebnikov, Elena Yu. Tupikina, Andrey M. Rumyantsev, Alexander S. D'yachenko, Irina A. Balova. «Filling the Gap within 10-Membered Heteroenediynes: Thiaenediyne -An Experimental and Theoretical Study» - Eur. J. Org. Chem. 2024, №27, e202401127, https://doi.org/10.1002/ejoc.202401127.

3. Alexander V. Ponomarev, Natalia A. Danilkina, Julia S. Okuneva, Aleksandra A. Vidyakina, Ekaterina A. Khmelevskaya, Alexander S. Bunev, Andrey M. Rumyantsev, Anastasia I. Govdi, Thomas Suarez, Igor V. Alabugin and Irina A. Balova. «Facile synthesis of diiodoheteroindenes and understanding their Sonogashira cross-coupling selectivity for the construction of unsymmetrical enediynes» - Org. Biomol. Chem, 2024, №22, p. 4096-4107, https://doi.org/10.1039/d4ob00530a.

4. Natalia A. Danilkina, Ekaterina A. Khmelevskaya, Anna G. Lyapunova, Alexander S. D'yachenko , Alexander S. Bunev, Rovshan E. Gasanov, Maxim A. Gureev and Irina A. Balova. «Functionalized 10-Membered Aza- and Oxaenediynes through the Nicholas Reaction» - Molecules, 2022, №27, p. 6071. doi.org/10.3390/molecules27186071

Материалы работы были представлены на шести конференциях: The VI North Caucasus Organic Chemistry Symposium (Ставрополь, 2022); Всероссийская научно-практическая конференция «Марковниковские чтения: от Марковникова до наших дней» (Сочи, 2022); Восьмая междисциплинарная конференция «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии» (Санкт-Петербург, 2023); Всероссийская конференция с международным участием «Идеи и наследие А.Е. Фаворского в органической химии» (Санкт-Петербург, 2023); междисциплинарная всероссийская молодежная научная школа-конференция с международным участием «Молекулярный дизайн биологически активных веществ: биохимические и медицинские аспекты» (Казань, 2023); Десятая междисциплинарная конференция «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии» (Санкт-Петербург, 2025).

Личный вклад диссертанта. Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в планировании исследований, выполнении синтетической части, установлении строения соединений, анализе полученных результатов, представлении результатов на конференциях, участии в подготовке научных статей к публикации.

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 250 страницах. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, выводов, экспериментальной части, списка сокращений и условных обозначений, списка цитируемой литературы (255 наименований) и девяти приложений. Литобзор состоит из двух основных

частей, посвященных природным ендииновым антибиотикам и их синтетическим аналогам, для которых рассматриваются методы получения, свойства, биологическая активность, а также способы модификации. Обсуждение результатов включает в себя рассмотрение подходов к синтезу индол-аннелированных и бензотиофен-аннелированных ендиинов, а также к синтезу гибридов ендиинов с лигандами, позволяющими регулировать их цитотоксическую активность, и результаты биологических экспериментов для данных соединений. В экспериментальной части представлены методики синтеза соединений, их физическо-химические и спектральные характеристики.

Основные научные результаты

1. Синтезированы новые производные гетероендиинов, конденсированных с бензотиофеном: тиаендиин [11] (личный вклад автора не менее 50%) и функционализированный оксаендиин [12] (личный вклад автора не менее 60%). Продемонстрировано, что оксаендиин является слишком активным для использования в качестве базовой структуры при синтезе ендииновых гибридов, тогда как тиаендиин, наоборот, недостаточно активен в циклизации Бергмана для получения гибридов на его основе.

2. Получен ряд ациклических ендиинов, для которых изучена цитотоксичность на клетках карциномы легких N0^460 и эпителиальных клетках легких WI-26VA4 с помощью колориметрического теста МТТ [13] (личный вклад автора не менее 30%).

3. Разработаны методы синтеза функционализированных азаендиинов, конденсированных с бензотиофеном, а именно ендиинов с терминальной тройной связью, изотиоционатной группой и малеимидным фрагментом. Показано, что азаендиин, конденсированный с бензотиофеном, является лучшим выбором в качестве базовой структуры для синтеза ендииновых гибридов [14] (личный вклад автора не менее 80%).

4. Разработаны методы синтеза гибридов 10-членных азаендиинов, основанные на клик-реакциях: медь-катализируемом азид-алкиновом присоединении, взаимодействии изотиоцианатов с аминами и тиол-еновой реакции [14] (личный вклад автора не менее 80%).

5. Выбраны оптимальный типа линкера (триазол) и лиганда (MGB-лиганд) для конструирования ендииновых гибридов, обладающих цитотоксичностью в наномолярном диапазоне и селективностью в отношении опухолевых клеток [14] (личный вклад автора не менее 80%).

Положения, выносимые на защиту

1. Метод синтеза 10-членного азаендиина, конденсированного с индолом; природа заместителя при атоме азота в индольным цикле как ключевой фактор, позволяющий изменять направление циклизации индол-аннелированных ендиинов с электрофил-промотируемой нуклеофильной циклизации по тройной связи при С3 на замыкание 10-членного азаендиинового цикла через реакцию Николаса;

2. Синтез новых производных гетероендиинов, конденсированных с бензотиофеном - тиаендиина и функционализированного оксаендиина, как этап выбора базовой структуры для получения ендииновых гибридов;

3. Разработка методов синтеза функционализированных азаендиинов, конденсированных с бензотиофеном, как этап синтеза ендииновых гибридов;

4. Методы синтеза гибридов 10-членных азаендиинов, основанные на клик-реакциях: медь-катализируемом азид-алкиновом присоединении, взаимодействии изотиоцианатов с аминами и тиол-еновой реакции;

5. Сравнение цитотоксической активности ендииновых гибридов с лигандами различного типа, полученных через триазольный и тиомочевинный линкеры, в экспериментах in vitro; выбор оптимального типа линкера и лиганда для достижения наибольшего цитотоксического эффекта и селективности к опухолевым клеткам.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР1

Алкины являются одним из важных классов органических соединений ввиду широкого разнообразия методов функциональных превращений тройной связи. [15 -18] Многие природные соединения содержат одну или несколько тройных связей и проявляют широкий спектр биологической активности: противовоспалительную, антикоагулянтную, антибактериальную, противотуберкулезную, противогрибковую, противовирусную, нейропротекторную и др.[19 - 23]

Среди многообразия природных ацетиленовых соединений наибольшее внимание привлекают ендииновые антибиотики (природные ендиины) - сложные полифункциональные молекулы, содержащие систему сопряженных тройных и двойной связей -(2)-гекс-3-ен-1,5-дииновый фрагмент, включенный в 9- или 10-членный цикл. Ендиины обладают чрезвычайно мощным цитотоксическим действием. [24, 25] С момента своего открытия и по настоящее время они привлекают значительное внимание из-за сочетания исключительной биологической активности и уникальной структуры. Природные ендиины послужили богатым источником для развития медицинской химии и энзимологии. Биомедицинское применение ендиинов обусловлено их высокой цитотоксичностью. Четыре природных ендиновых антибиотика из четырнадцати известных на сегодняшний день были допущены к доклиническим и клиническим исследованиям. [9, 10, 25, 26] Ендииновый антибиотик калихеамицин можно встретить на фармацевтических рынках в виде ADC в качестве одобренных для применения противоопухолевых препаратов. [8, 9]

Однако биомедицинская область не ограничивает применение ендииновых антибиотиков и их аналогов. Эти соединения являются плодотворным ресурсом для получения новых материалов и используются в синтезе олигомеров[27 - 29] и полимеров различного строения, [30 - 32] а также выступают уникальными исходными соединениями для получения полиароматических и полигетероциклических структур.[33 - 36]

1 В главе 2 (Литературный обзор) и главах 3,5 (Обсуждение результатов и Экспериментальная часть) используется отдельная нумерация соединений

В данном литературном обзоре будут рассмотрены различные аспекты химии ендииновых антибиотиков: циклизация Бергмана, как основа механизма действия ендииновых антибиотиков; основные представители природных ендиинов и их применение; подходы к замыканию напряженных циклов при полном синтезе (total synthesis) природных ендиинов. Отдельное внимание будет уделено неприродным ендиинам как циклического, так и ациклического строения. Будут рассмотрены методы их получения и модификации, свойства, биологическая активность и применение.

2.1. Природные ендиины: представители, классификация, нахождение в природе

Природные ендиины были выделены из штаммов различных бактерий. [7, 25] В настоящее время известно 14 структурно охарактеризованных природных ендиинов, и четыре ендиина, выделенных в форме продуктов циклоароматизации.[25, 37] В целом, природные ендиины можно разделить на два подсемейства: 9-членные ендиины и 10-членные ендиины (Рисунок 1).[25] Семейство 9-членных ендиинов, в настоящее время, включает неокарциностатин (NCS),[38] C-1027 (лидамицин), [39] кедарцидин,[40] мадуропептин,[41] N1999A2,[42] и циклоароматизированные продукты: споролиды,[43] цианоспоразиды,[44] фиджиолиды[45] и амиколамицины.[46] Семейство 10-членных ендиинов включает калихеамицин,[47, 48] эсперамицин,[49] наменамицин,[50] шишиджимицин,[51] динемицин,[52] унциаламицин,[53] тианцимицин,[54] янпумицин,[55] силутомицин А и циклоароматизированные продукты силутомицина[37] (Рисунок 1).

Споропид А (I?1- Н, Я2- С1)

Споролид В (1*1= С1, Н) Цианоелоролид А (2006)

Фиджиолид В (2010)

Цианоспораэид Р {2013}

Амикопамицин А (I?1" Н, Г!2- ОН) Аииколамицин В (Р1= ОН, 112= Н) 12017)

т ; оме он

МвО Т Дг-

Ас' МвО Калихвамицин (1987)

1-Рг-И^р /

Шишиджимицин (200Э)

ОН О ОН Динвмицин (1989)

О ОН О ОН

Унциаламицин (2005) Силутомицин А (2021)

О ОН Силутомицин В (2021)

| ме _ ни,

5 Ч-2-о г* к о«

оТ о

Наменамицин (199В)

Янпумицин А (2017)

Тианцимицин А (2016) Силутомицин С (2021) Силутомицин О (2021)

Рисунок 1. Природные 9- и 10-членные ендииновые антибиотики.

Природные 9-членные ендиины

Девятичленные ендиины также называются хромопротеинами, поскольку они нековалентно связанны с полипептидами для стабилизации и защиты ендиинового ядра; без белковой оболочки хромофоры нестабильны. [25, 56]

Неокарциностатин (NCS) (Рисунок 1А), первый выделенный представитель семейства ендииновых антибиотиков, первоначально был обнаружен как макромолекулярный противоопухолевый антибиотик из штамма бактерии Б^ерЮтусез carzinostaticus в 1965 году. [38] Вскоре после его открытия стало ясно, что биологическая активность NCS заключается в небелковом хромофоре, структура которого была выяснена только в 1985 году с применением развивающихся в то время спектральных методов и рентгеновской кристаллографии. [38] Было обнаружено, что в основе небелкового компонента лежит неизвестная ранее бицикло[7.3.0]додекаендииновая система. Апопротеин играет неоценимую роль в стабилизации и защите хромофора: в отсутствии белкового комплекса хромофор неокарциностатина нестабилен. [56] Препарат на основе неокарциностатина, а именно неокарциностатин-хромофор, привитый на сшитый сополимер стирола и малеинового ангидрида (SMANCS) был одобрен для

использования в Японии в качестве противоопухолевого препарата для лечения рака печени в 1993 году. [26] Всемирного одобрения этот препарат не получил.

9-Членный ендиин C-1027 (Рисунок 1А), также известный как лидамицин, был выделен из продуктов ферментации Streptomycesglobisporus C-1027, которые были получены из образцов почвы в уезде Цяньцзян провинции Хубэй, Китай.[57] C-1027 обладает противомикробной активностью в отношении большинства грамположительных бактерий и некоторых штаммов грамотрицательных бактерий, [57] демонстрирует высокую цитотоксичность в отношении клеток карциномы [39], а также потенциальную эффективность против гипоксических опухолей. [58]

Кедарцидин (Рисунок 1А) — это 9-членный ендиин, впервые выделенный из бактерий Actinomyces в 1992 году. Он состоит из хромофора - ендиина, а также апопротеина, который стабилизирует ендиин в актиномицете. Исследования показывают, что эта молекула чрезвычайно активна в отношении лейкемии и меланомы. [40]

Мадуропептин (Рисунок 1А) является метаболитом Actinomadura madurae H710-49, выделен из образцов почвы в Германии. Данный антибиотик активен в отношении грамположительных бактерий и обладает высокой цитотоксичностью.[41]

N1999A2 (Рисунок 1А) - 9-членный ендииновый хромофор, выделенный из бактерий Streptomyces sp. AJ9493, по строению он схож с неокарциностатином. Особый интерес представляет тот факт, что стабильный N1999A2 существует как ендииновый хромофор сам по себе без апопротеина, в отличии от неокарциностатина. N1999A2 сильно подавлял рост бактерий, а также обладает высокой цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам. [42]

Споролиды (Рисунок 1А) - это полициклические макролиды - производные ендиинов, производимые морскими актиномицетами Salinispora tropica.[43] Предполагается, что споролиды происходят из кластера генов, кодирующих фермент поликетидсинтазу (PKS), которая участвует в образовании ендииновых предшественников споролидов.[43] Как и ожидалось, из-за отсутсвия ендииновой системы, споролиды не проявляют ни противоопухолевой, ни антибактериальной активности.[43]

Природные 10-членные ендиины

10-членные ендиины можно классифицировать на две подкатегории: калихеамицин (САЬ)-подобные ендиины и антрахинон-конденсированные ендиины. CAL-подобные ендиины, которые включают калихеамицин,[47, 59] эсперамицин,[49] наменамицин[50] и шишиджимицин,[51] содержат ендииновую систему, включенную в бициклический каркас,

соединенный с уникальным аллилтрисульфидным фрагментом, а также с углеводной частью (Рисунок 1B). Антрахинон-конденсированные ендиины, которые включают динемицин,[52] унциаламицин,[53] тианцимицин,[60] янпумицин[55] и силутомицин А,[37] содержат эпоксидированный дигидропиридиновый цикл, конденсированный с антрахиноновым фрагментом, имеющий три общих атома углерода с ендииновым циклом. Аллилтрисульфидный фрагмент в ендиинах типа CAL и эпоксидный цикл в антрахинон-конденсированных ендиинах являются триггерами для циклоароматизации этих ендиинов.[25]

Калихеамицины (Таблица 1) представляют собой группу ендиинов, которые были выделены из Micromonospora echinospora calichensis.[47, 59] Вся группа калихеамицинов демонстрирует высокую антимикробную активность против грамположительных и грамотрицательных организмов.[47, 59] Калихеамицин у1 проявляет высокую противоопухолевую активность против клеток лейкемии и меланомы in vivo.[47, 59] Конъюгаты на основе калихеамицина - Гемтузумаб озогамицин (Mylotarg®)[8] и Инотузумаб озогамицин (Besponsa®)[9] являются лекарственными препаратами, одобренными FDA (Рисунок 2).

Таблица 1. Природные ендиины группы калихеамицина

/О

_у=<КЛ Rha= HoMeZrV

MeSSS / || Me0 T

О Mev /О п Ме п ОН

~ д . 4~

т НО^ О Ami = r3__

, Л>ОМе ОН |2 »bJ^Sj

R О А R МеО ОМе

Калихеамицин X R1 R2 R3

Калихеамицин ß1Br Br Rha Ami CHMe2

Калихеамицин y1Br Br Rha Ami Et

Калихеамицин a2I I H Ami Et

Калихеамицин a3I I Rha H -

Калихеамицин ß1I I Rha Ami CHMe2

Калихеамицин у^ I Rha Ami Et

Калихеамицин Ö1I I Rha Ami Me

anti - CD33 (Mylotarg)

anti - CD22 (Besponsa) линкер

OH

Рисунок 2. Структуры одобренных к применению противоопухолевых препаратов на основе калихеамицина yi1.

Ендиины из группы эсперамицина (Таблица 2) считаются одними из самых мощных обнаруженных противоопухолевых антибиотиков. [49] Впервые выделенные из Actinomadura verrucosospora, члены этого семейства ендиинов включают эсперамицины A1, A2, P, X и другие, некоторые из них приведены в таблице 2. Эсперамицин X — это неактивный эсперамицин, естественным образом вырабатываемый A. Verrucosospora. [61]

Таблица 2. Природные ендиины группы эсперамицина

Me, Me.

ОН

R3HN

МеО

АгО

0^NH ОН ОМе Эсперамицин X

>=/ Ьо

МеО МеО—^

Эсперамицин R1 R2 R3

Эсперамицин A1 H Ar CHMe2

Эсперамицин A1b H Ar Et

Эсперамицин A1c H Ar Me

Эсперамицин P H Ar CHMe2

Эсперамицин A2 Ar H CHMe2

Эсперамицин A2b Ar H Et

Эсперамицин A2c Ar H Me

Морскими асцидиями Polysyncraton lithostrotum (ascidian) и Didemnum proliferum (ascidian) приписывали продуцирование наменамицина и шишиджимицина (рисунок 1B).[50, 51] Однако позднее было обнаружено, что асцидия, которая производила наменамицин, сосуществует в симбиозе с несколькими видами бактерии Micromonospora, что привело к предположению, что на самом деле ендиины продуцирует один из видов Micromonospora sp., а не асцидия. [50, 51]

Динемицин,[52] унциаламицин,[53] тианцимицин,[62] янпумицин,[55] силутомицин А и циклоароматизированные продукты силутомицина[37] относятся к

антрахинон-конденсированным ендиинам.

Динемицины (рисунок 1B) — это ендиины, продуцируемые бактериями Micromonospora chersina.[52] Динемицины А были первыми обнаруженными представителями этого подсемейства. Они были выделены из M. chersina в образце почвы, взятом в штате Гуджарат в Индии. Динемицины имеют фиолетовый цвет, поскольку содержат антрахинон в качестве группы, присоединенной к ядру ендиина.[52] Динемицины демонстрируют сильную противоопухолевую активность против лейкемии и меланомы.[63]

Унциаламицин (Рисунок 1В) представляет собой 10-членный циклический ендиин, похожий на динемицин. Он был выделен из стрептомицетов (Streptomyces from lichen), обнаруженных на поверхности лишайника из Британской Колумбии.[53] Унциаламицин проявляет мощную антибактериальную активность in vitro против грамположительных и грамотрицательных патогенов человека, включая Burkholderia cepacia, основную причину заболевания и смертности у пациентов с муковисцидозом. [53]

Тианимицины (Рисунок 3) были выделены из штаммов бактерий дикого типа Streptomyces globisporus в 2016 году, [62] и проявляют мощную цитотоксичность в отношении многих линий раковых клеток.

о он

о он

о он

о он

Тианимицин А

Тианимицин В

Тианимицин С

Тианимицин D

Рисунок 3. Природные ендиины группы тианимицина.

Янпумицин A (Рисунки 1 и 4), вместе с четырьмя продуктами циклоароматизации Бергмана, были выделены из Micromonosporayangpuensis DSM45577 в 2017 году. Янпумицин A, также, как и тианимицины цитотоксичен для разнообразных линий раковых клеток человека. [55]

Янпумицин В R = Н Янпумицин С R = ОН

Янпумицин D R = Н Янпумицин Е R = ОН

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Хмелевская Екатерина Алексеевна, 2026 год

® - - - -

®

BnN3 (6 equv) acetone, 24 h

-Ts

стабильно

NMR 1H BnN3, 6 equv Cul(PPh3)3,

15 mol%

acetone, 24 h

нестабильно

NMR 1H

©

BnN3

CuS04x5H20

ascorbate Na,

thf/h2o,

i пг/пги,

30 min, then isolation

неразделимая смесь

58a

Рисунок 33. Оптимизированная геометрия ендиина 46 (DFT, B3LYP 6-3Ш++^,р)) с приведенными величинами среднего «алкинового изгибания», рассчитанного как [180-(Евалентный алкиновый угол/4)] (A); тест на устойчивость исходного ендиина 46 в присутствии Вп№, а также при одновременном присутствии Вп№ и комплекса Си(1) (Б); иллюстрация неприменимости СиААС для незащищенного ендиина 58а (О).

Мониторинг методом ЯМР ^ показал, что N-ендиин 46 действительно не реагирует с BnNз при комнатной температуре в течение 24 ч.

Однако Си(1) может способствовать азид-алкиновому циклоприсоединению даже для слабо изогнутых циклических алкинов, [221 ] что хорошо согласуется с наблюдаемой медленной деградацией ендиина 46 в присутствии как Вп№, так и CuI(PPhз)з в качестве органического растворимого источника Си(1). Неприменимость СиААС в качестве стратегии гибридизации для незащищенных ендиинов была доказана с использованием тестовой реакции ендиина 46 и Вп№ в обычных условиях СиААС (рисунок 33B).

Для преодоления этого ограничения мы решили использовать Со-защищенные ендиины 55а,Ь, которые являются синтетическими предшественниками ендиинов после циклизации Николаса (схема 73), в качестве исходных соединений для синтеза гибридов через СиААС (схема 77). Следует особенно подчеркнуть, что СиААС для Со-[221] или ^-комплексов [222] напряженных циклоалкинов использовали для различных модификаций без затрагивания изогнутой тройной связи, в то время как о модификации Со-защищенных ендиинов ранее не сообщалось.

Со-комплекс 55Ь был введен в реакцию СиЛЛС с бензилазидом 65а в условиях, описанных для Со-защищенного циклооктина DBCO - использование сульфата ^(П) и аскорбата натрия в двухфазной системе растворителей DCM/H2O.[223] Данные условия позволили синтезировать Со-защищенный гибрид 66a' с высоким ЯМР-выходом. Из-за медленной декомплексации комплекса 66a' при выделении, очистке и хранении, полученный на первой стадии Со-комплекс 66a' подвергали декомплексации с использованием ТВЛБ в водном ацетоне непосредственно после флэш-хроматографии Со-комплекс 66a'. Данная методика позволила получить модельный бензил-ендииновый гибрид 66а через триазольный линкер с выходом 56% на две стадии (схема 77).

в :i>

(С0)ЗС)РЬ0(С0)3

55Ь

[ Модельный Вп лиганд ] N3\/Ph

Гибрид 66а (56%)

PEG-лиганд

Гибрид 66Ь (51%)

N3—о'

Гибрид 66с (23%)

RN3< CuS04x5H20, ascorbate Na,

dcm/h2o

(СО)3Со-^С°(СО)з

66a'-g'

Лиганды на основе глюкозы

HN3

нОАс

АсО Ас

Н-О

АсО

ОАс

ОАс

Ас

TBAF, acetone/

н2о

(15:1)

НОН

-n3

ОАс

Гибрид 66d (32%)

Гибрид 66е (41%)

ОН

Гибрид 66f (25%)

NHFmoc

Лиганд к малой бороздке ДНК (Hoecst-лиганд)

Гибрид 66h (53%)

Гибрид 66a-h

НОАс Xм ОАс

о-Х^о,

66'g (88%); Гибрид 66g (71%) Выход на 2 стадии - 62%

Схема 77. Синтез гибридов ендиинов 66a-h с использованием CuAAC.

Эти же условия, а именно использование CuSO4/аскорбата натрия в системе DCM/H2O для клик-реакции и TBAF для последующего снятия кобальтовой защиты, были применены для синтеза различных гибридов N-ендиина типа I (через триазольный линкер). Были использованы различные лиганды, содержащие №-группу: PEG-линкерные лиганды 65b,c, ацилированные 65d,e,g и деацилированное 65f производные глюкозы, лиганд к малой бороздке ДНК (MGB) 65h из семейства Hoechst. PEG-линкеры вводились в качестве структурной части, которая будет регулировать гидрофильные свойства гибридов и может быть использована в качестве дополнительного линкера в будущем синтезе ADC (antibody-drug conjugate).[223] Ацилированный фрагмент глюкозы использовался для реализации известного эффекта Варбурга - увеличения цитотоксичности гибридов с помощью введения глюкозного лиганда. [224] Следует отметить, что три типа производных ацилированной глюкозы - C1-N3, C6-N3 без

дополнительного линкера и глюкоза C6-(PEG)3-N с азидогруппой, разделенной PEG-линкером были выбраны для выяснения наилучшего сайта и типа связывания глюкозы для более высокой цитотоксичности гибридов. [225] Деацилированное производное глюкозы CI-N3 также было протестировано в качестве углеводного лиганда, поскольку использование деацилированных производных углеводов обычно обеспечивает более сильный биологический эффект из-за отсутствия необходимости в деацилировании внутриклеточными эстеразами. [224] Для синтеза такого гибрида крайне важно использование азида деацилированной глюкозы, так как в случае ендиина деацилирование для конечного гибрида, как это обычно реализуется для других классов соединений, [226 - 228] не может быть проведено, поскольку ни Со-комплекс, ни свободный от кобальта ендиин не стабильны в основных условиях (проверено на модельном N-Ts-ендиине 46). Наконец, MGB-лиганд семейства Hoechst[229] использовался для достижения высокого уровня цитотоксичности ендиинов путем улучшения связывания N-ендиинового каркаса с ДНК -потенциальной биомишенью ендиина (данные представлены в статье Org. Biomol. Chem., 2026, 24, 617-629 [14] опубликованной по теме данной диссертации).

Подводя итог синтетической полезности CuAAC в качестве стратегии получения ендииновых гибридов, можно сделать вывод, что, несмотря на то, что для получения конечных продуктов требуются два синтетических этапа - CuAAC и удаление Co-защитной группы в каждом случае, все применяемые условия реакции являются достаточно мягкими для синтеза библиотеки стабильных гибридов ендиинов с лигандами различной химической и биологической природы.

3.3.2 Стратегия получения тиомочевинных гибридов типа II путем взаимодействия NCS-ендиина с аминолигандами

Для получения гибридов через фрагмент тиомочевины мы решили проверить два альтернативах подхода: получение тиомочевиных гибридов на стадии Со-комплекса 59 с последующей декомплексацией (последовательность 1) и получение тиомочевинных гибридов через клик-реакцию NCS-ендиина 60 с аминами (последовательность 2).

Проверка последовательности 1 показала, что из циклического Со-комплекса NCS-ендиина 59 получить модельный гибрид с бутиламином 67a нельзя. Было установлено, что соответствующий Со-комплекс 68a', содержащий тиомочевину, разлагается при хранении.

Удаление Со-защиты сразу после выделения соответствующего Со-производного тиомочевины также не приводит к стабильному гибриду 68a: данное соединение разлагается в условиях снятия Со-защиты (схема 78).

NCS

\А?Со(СО)з (CO)3Co

59

-s |7>Со(СО)з (СО)зСо ^

68а' (50%)

TBAFx3H20 acetone/H20 (15:1)

-V

Гибрид 68а

Схема 78. Попытка двухстадийного синтеза тиомочевинного гибрида 68а

Также была протестирована синтетическая последовательность 2 - взаимодействие свободного от кобальта NCS-ендиина 60 c аминами. Этот подход кажется более предпочтительным, потому что он должен позволить получать серию гибридов ендиинов на последней стадии синтеза в отсутствии каких-либо катализаторов или дополнительных реагентов. Действительно, мы показали сперва на модельном амине - бутиламине, а затем и на серии других лигандов-аминов, что этот способ является рабочим методом получения серии ендииновых гибридов через тиомочевинный линкер.

Синтез тиомочевин-содержащих гибридов типа II был выполнен с использованием нескольких модельных КЫН2-лигандов, NH2-PEG лиганда, BODIPY красителя, аминоциклоалкина семейства BCN и MGB-лиганда семейства Hoechst, содержащего КШ-группу. Лиганд 67d был получен из азидопроизводного 65h путем восстановления водородом с использованием Pd/C в качестве каталитической системы. Все реакции, за исключением 4-метоксибензиламина, протекали с хорошими выходами. Этот подход к синтезу гибридов в большинстве случаев давал более высокие выходы, чем в случае двухстадийного синтеза гибридов через триазольный линкер. Однако, к нашему удивлению, оказалось, что этот метод не пригоден для получения тиомочевинных гибридов, содержащих лиганды на основе глюкозы, вероятно, из-за стерических затруднений (схема 79) (данные представлены в статье Org. Biomol. Chem., 2026, 24, 617-629 [14] опубликованной по теме данной диссертации).

О.

I

о р-мн2 Ъ7а-1

ОСМ

60

Модельные лиганды

ЭРААС реагент

-мн2 | V О

О М'

н

Гибрид 68а (86%) Гибрид 68Ь (33%)

Гибрид 68е (90%)

РЕв-лиганд

Лиганд к малой бороздке ДНК (Ноес^-лиганд)

о

Гибрид 68а-Г

ВОО!РУ краситель

Гибрид 68f (62%) ¿V

МН2-глюкоза

нОАс

1ЧН,

О Н

нмн2

1ЧН3+С|-

Xй ОАс 1п ОАс

н н

ОАс

Гибрид 68с (20%)

Гибрид 68с! (96%)

Гибрид 68д (-)

Гибрид 68И (-)

Схема 79. Синтез гибридов ендиинов через тиомочевинный линкер 68а-Г (гибриды типа

II).

Таким образом, синтетический подход на основе взаимодействия лигандов-аминов с NCS-ендиином является более удобным, чем получение гибридов через СиЛЛС, поскольку он требует только одностадийной модификации ендиина на последнем этапе синтеза. Этот метод дает более высокие выходы и позволяет вводить более сложные (BODIPY) и реактивные лиганды для дальнейшей мягкой дериватизации (ВС^. Однако эта стратегия не может быть применена для синтеза углеводсодержащих тиомочевинных гибридов.

3.3.3 Стратегия получения гибридов с использованием тиол-еновой реакции Не смотря на низкий выход малеимид-функционализированного ендиина 64, мы проверили возможность протекания тиол-еновой реакции с модельным лигандом -трет-бутилмеркаптаном. Реакция протекала гладко и быстро при комнатной температуре и приводила к ендииновому гибриду-тиоэфиру 69а, содержащему сукцинимидный линкер, с выходом 85% (Схема 80). Однако ввиду низкого выхода исходного ендиина и ограниченного круга доступных тиолов, данный тип модификации для получения ендииновых гибридов далее не использовали.

О

О

HS-f-Bu DCM, rt

64

Гибрид 69a (85%)

Схема 80. Получение модельного гибрида ендиина через тиол-еновую реакцию.

3.4 Биологическая активность гибридов ендиинов I и II типа

Влияние гибридов обоих типов на жизнеспособность клеток HeLa (линия клеток аденокарциномы шейки матки человека) и HEK293 (линия эмбриональных клеток почки человека) изучалось с помощью теста МТТ.[230] Для всех соединений, включая немодифицированные ендиины NTs-ED 46 и NH2-ED 60, были определены значения IC50 (inhibitory concentration) при проведении экспериментов на обеих клеточных линиях после обработки клеток растворами ендиинов в диапазоне концентраций от 0.0005 до 100 цМ в течение 72 часов. Эксперименты выполнялись к.б.н. Силоновым С.А. на базе РЦ СПбГУ «Оптические и лазерные методы исследования». Полученные данные представлены в Таблице 1 (данные представлены в статье Org. Biomol. Chem., 2026, 24, 617-629 [14] опубликованной по теме данной диссертации).

Таблица 1. Оценка влияния ендиинов на жизнеспособность клеточных линий HeLa и HEK293 после 72-часовой инкубации с изучаемыми веществами

Ендиин/Гибрид Структура лиганда HeLa, IC50 (цМ) HEK293, IC50 (ЦМ)

Не модифицированные ендиины

NTs-ED 46 - 9.76 ± 2.13 8.67 ± 1.69

NH2-ED 60 - 11.35 ± 2.80 9.18 ± 2.84

Гибриды через триазольный линкер (тип I)

Гибрид 66а СХ>с 10.09 ± 2.90 9.11 ± 1.71

Гибрид 66Ь 12.63 ± 2.76 7.98 ± 1.91

Гибрид 66с FmocH N > 100 16.73 ± 1.98

Гибрид 66d ACO^W-^WQAC 1 OAc H 13.51 ± 1.57 5.80 ± 0.78

Гибрид 66е H OAc H > 100 16.57 ± 2.08

Гибрид 66f нон H 8.98± 0.88 8.27 ± 0.75

Гибрид 66g HOAc H 2.39±0.58 2.18± 0.09

Гибрид 66h Me 0.072±0.010 0.630±0.074

Гибриды через тиомочевинный линкер (тип II)

Гибрид 68a Me^4 ^s^ > 100 6.91 ± 2.20

Гибрид 68b > 100 11.00± 1.32

Гибрид 68c 25.77 ± 7.89 13.59 ± 2.74

Гибрид 68d Me 0.034 ± 0.006 0.113 ± 0.017

Гибрид 68e Л F F Г/3 с/ н > 100 > 100

Контроль

Цисплатин - 1.72±0.123 3.43±0.28

Также была проверена цитотоксичность некоторых ациклических ендиинов на клетках карциномы легких NCI-H460 и эпителиальных клетках легких WI-26VA4 с помощью колориметрического теста MTT.[231] Все ендиины были изучены в концентрации 75 цМ. Большинство несимметрично замещенных ендиинов 23,конденсированных с бензотиофеном, показали слабую цитотоксическую активность в отношении клеток карциномы легких NCI-H460 (данные представлены в статье Org. Biomol. Chem., 2024, 22, 4096-4107,[13] опубликованной по теме данной диссертации).

Полученные данные из таблицы 1 по циклическим гибридам и модельным ендиинам показали, что существенная разница в способности ингибировать рост клеток HeLa и HEK293 для не модифицированных ендиинов 46 и 63 и триазольных гибридов типа I, содержащих Bn (66a), PEG (66b) и глюкозный фрагмент (66d,f), отсутствует. Более того, цитотоксичность Fmoc-PEG-ендиина 66c и гибрида ендиина с С1-Ыэ-глюкозой 66e на клеточной линии HeLa существенно снизилась (ICso> 100 цМ). Увеличение цитотоксичности для обеих клеточных линий (IC50 ~ 2 цМ) наблюдалось у гибрида глюкоза-PEG-ендиин 66g. Однако существенных различий между ингибированием роста опухолевых (HeLa) и нормальных (Hek293) клеток не наблюдалось.

Ситуация существенно изменилась в положительную сторону для гибрида ендиина с MGB-лигандом 66h. Для гибрида 66h в этом случае значения IC50 снизились до наномолярного уровня (IC50 для HeLa = 72 нМ) при наличии индекса селективности SI ~ 9 (SI = IC50(HeLa)/IC50(HEK293).

Схожая тенденция по способности влиять на выживаемость клеток обоих линий наблюдалась и для гибридов тиомочевинного типа II. Однако величины IC50 для PEG (68c) и модельных гибридов (68a,b) были ниже для эмбриональных клеток почек человека HEK293, по сравнению с опухолевыми клетками HeLa. Гибрид 68e, содержащий краситель типа BODIPY не показал токсичности в тестируемых микромолярных концентрациях (IC50 >200 цМ). Причина столь резкого падения токсичности гибрида ендиина с BODIPY красителем не ясна. Поэтому этот

тип модификации вряд ли может быть использован для отслеживания молекулы ендиина в клетке. Гибрид ендиина с MGB-лигандом 68d через тиомочевинный линкер показал наиболее перспективные результаты в этом ряду соединений: значение 1С 50 для клеток HeLa (34 нМ) было даже вдвое ниже, чем для гибрида MGB-триазол-ендиин 66И. Однако индекс селективности для линий клеток HeLa/HEK293 был ниже ^ ~ 3).

Таким образом, из всей серии соединений были выбраны два основных соединения-лидера, а именно: гибриды ендиин-Hoechst обоих типов 66И и 68d, которые ингибировали рост клеток в наномолярных концентрациях и проявляли селективность в отношении клеток HeLa по сравнению с клетками линии HEK293.

Однако принцип действия обоих гибридов на клетки различен, что видно из характера кривых титрования, используемых для вычисления ГС50. Гибрид ендиин-Tr-Hoechst 66И проявляет токсический эффект на обеих линиях клеток, что аналогично поведению препарата сравнения - цисплатину (рисунок 34). Тиомочевинный аналог - гибрид ендиин-TU-Hoechst 68d, проявляет цитостатический эффект (останавливают рост клеток, но не приводят к их полной гибели). Следующий по шкале активности гибрид ендиин-триазол-глюкоза 66g также проявил только цитостатический эффект (рисунок 34).

Рисунок 34. Кривые титрования, полученные для гибридов 66h, 66g, 68d и препарата сравнения цисплатина на двух типах клеточных линий HeLa и HEK293.

Хорошо известно, что MGB лиганды семейства Hoechst обычно проявляют низкую токсичность. [229] Однако модификация Hoechst лигандов алкилирующими группами, [232] переход от моно-лигандов к симметричным производным бисбензимидазола[233] или введение в структуру лигандов Hoechst дополнительных биоактивных фрагментов [234] приводит к увеличению цитотоксической активности этой группы веществ. В нашем случае мы использовали производное монобензимидазола на основе Hoechst 33258, которое проявляет ингибирующую активность в отношении ДНК топоизомеразы I бактерии Escherichia coli.[235]

Для того, чтобы доказать, что наблюдаемая способность гибридов 66h и 68d эффективно ингибировать рост клеток является результатом наличия обеих частей в полученных гибридах -ендиинового фрагмента и лиганда типа Hoechst - нами были синтезированы и изучены на предмет цитотоксичности два модельных соединения, содержащих фрагмент моноимидазольного Hoechst-лиганда, связанного через триазольный или тиомочевинный линкер с пиперидиновым кольцом, которое заменяет ендииновое ядро (Схема 81).

71 (98%)

Модельный Tr-Hoechst гибрид

73 (69%) |С50 = 28.63 ± 6.32 рМ (HeLa) IC50 = 12.22 ± 2.75рМ (Hek 293)

CSCI2i ТЕА, DCM

N „> S

MGB- 67d DCM/MeOH (6:1)

NCS

72 (80%)

Модельный TU-Hoechst гибрид

74 (87%) IC» = 4.78 ± 0.74 pM (HeLa) ICso = 4.33 ± 0.87 pM (Hek 293)

Схема 81. Синтез модельных гибридов, содержащих Hoechst лиганд, линкер и пиперидиновый фрагмент вместо ендииновой части и определенные величины IC50 для клеток линий HeLa и HEK293.

Было показано, что модельный триазольный гибрид 73 в ~ 400 раз менее токсичен для клеток HeLa и в ~ 20 раз менее токсичен для клеток HEK293, чем его ендииновый триазольный аналог 66h. Такая же тенденция снижения токсичности наблюдалась для модельного тиомочевинного гибрида 74 по сравнению с его ендииновым аналогом 68d. Однако абсолютные величины IC50 для модельного тиомочевинного гибрида 74 были ~ в 3-5 раз ниже, чем для модельного триазольного гибрида 73. Характер кривых титрования указывает на цитотоксический механизм действия обоих модельных гибридов 73, 74 (рисунок 35). Таким образом, мы показали, что в гибридах ендиинов с MGB лигандами обоих типов - триазольном 66h и тиомочевинном 68d обе части гибрида являются обязательными для проявления ими ингибирования роста клеток в наномолярном диапазоне.

Рисунок 35. Кривые титрования, полученные для гибридов 73, 74 и препарата сравнения цисплатина на двух типах клеточных линий HeLa и HEK293.

Принимая во внимание, что лиганды MGB типа Hoechst, связываясь с малой бороздкой ДНК, приобретают флуоресцентные свойства, [229] мы решили использовать это свойство, чтобы доказать, что полученные нами гибриды ендиинов с MGB-лигандами локализуются в ядрах клеток, и, поэтому, их способность ингибировать клеточный рост связана с разрушением ядерной ДНК как основной биологической мишени. Для этого клетки HeLa инкубировали с каждым MGB-гибридом 66h, 68d, 73, 74 (1 цМ, 3 ч), а затем подвергали визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии (рисунок 36). Оказалось, что только гибрид MGB-триазол-ендиин 66h локализован главным образом в ядрах клеток, в то время как остальные три гибрида были в основном распределены в цитоплазме. Эту локализацию можно рассматривать как доказательство выдвинутого нами предположения - нацеливание триазольного ендиинового гибрида Hoechst 66h с на ДНК, а также связанный с этим высокий цитотоксический эффекта в наномолярном диапазоне концентраций (данные представлены в статье Org. Biomol. Chem., 2026, 24, 617-629 [14] опубликованной по теме данной диссертации).

В дополнение к локализации других гибридов в цитоплазме мы наблюдали, что для всех соединений спектр флуоресценции имеет заметное красное смещение, что может быть доказательством наличия для изучаемых гибридов альтернативных биомишеней и механизмов, что является темой отдельного дальнейшего исследования.

DAPI channel FITC channel TRITC channel (425-475 nm) (500-550 nm) (570-620 nm)

66h

73

74

* scalebar 20 цт

Рисунок 36. Визуализация при помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HeLa после обработки гибридами 66h, 68d, 73, 74 (1 цМ, 3 ч) в трех каналах: DAPI (425475 нм), FITC (500-550 нм) и TRITC (570-620 нм). Колонка 4 (Merge) соответствует наложению изображений, полученных в трех каналах. Колонка 5 (DIC) соответствует изображениям, полученным световой оптической микроскопией.

Результаты работы: разработаны методы получения гибридов ендиинов, конденсированных с бензотиофеном, с лигандами на основе этиленгликоля, опухоль-ориентированными лигандами, а также флуоресцентными красителями с помощью клик-подхода. В данной работе лучшими лигандами для гибридизации, позволяющими получить гибриды ендиинов с цитотоксичностью в наномолярном диапазоне, являются лиганды к малой бороздке ДНК из семейства Hoechst, а лучшим типом связывания ендиина и лиганда -триазол-содержащий линкер (рисунок 37D).

При сравнении биологической активности известных природных и полусинтетических аналогов ендиинов (рисунок 37A, B) и гибридов 66h и 68d (рисунок 37D) видно, что соединения, полученные в данной работе, на три порядка, уступают в активности калихеамицину и в несколько раз менее активны, чем унциаламицин, тианцимицин А и их полусинтетические аналоги. [47, 53, 54] К сожалению, сравнить активность гибридов 66h и 68d с известными литературными данными очень сложно, так как до нашей работы исследователи не проводили биологических исследований на клеточных линиях HeLa/HEK293. Однако гибриды, разработанные в данной работе, намного превосходят по синтетической доступности как

природные ендиины (например, полный синтез калихеамицина составляет 70 стадий с суммарным выходом около 0.1%), [98, 104] так и их известные синтетические аналоги. [151]

Природные ендиины - А |

7 I ОМе ОН

MeO I АС меО

ОН

Калихеамицин у|1

Total synthesis - 70 стадий Суммарный выход ~ 0.1% 1С» <1 рМ (широкий спектр клеточных линий) Acta Pharmaceutics Sínica В, 2023,13(10), 4025-4059

Унциаламицин

Total synthesis - 22 стадии Суммарный выход -11% 1СМ = 0.002 рМ (Н226)

Тианцимицин А

Total synthesis - 22 стадии Суммарный выход - 6.8% 1СЮ = 0.04 ± 0.03 nM (А549)

J. Arn. Cham. Soc. 2016,138,8235-8246 J. Med. Cham. 2024, 67,4624-4640

Полусинтетические аналоги природных ендиинов ■ в|

tW HN > \ OH T oJ \ TÍT1 (l Le HN V\ OH t o)\\ ifYi

ОМе О о

он MeHN^A^L/ он

О OH О OH

Аналог Тианцимицина А Total synthesis - 23 стадии Суммарный выход - 5.4% ICgo = 1.3 ±0.2 ПМ(А549) Аналог Унциаламицина Total synthesis - 25 стадий Суммарный выход - 6% ICÏB = 0.010nM(H226)

J. Med, Chem, 2024, 67,4624-4640 J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 8235-8246

I Синтетические аналоги природных ендиинов - С)

Гибрид 10-членного ендиина с камптотецином

Total synthesis -16 стадий Суммарный выход - 2.5% CS„ = 15 цМ (DNA pBR 322)

Гибрид 10-членного ендиина в нетроп си ном

Total synthesis -16 стадий Суммарный выход -2.8% С8Ы = 10 jiM (DNA pBR 322)

Bioorg. Med. Chem., 16, 2008, 3501-3518

Tr-Hoechst гибрид 68h IC^ = 0.072±0.010 pM (HeLa) Total synthesis - 7 стадий IC» = 0.630±0.074 pM (HEK293) Суммарный выход - 17% SI (HeLa/Hek) - 9

TU-Hoechst гибрид 6gd IC«, = 0.034 ± 0.006 pM (HeLa) Total synthesis - 8 стадий IC» = 0.113 ± 0.017 pM (HEK293) Суммарный выход - 21% SI (HeLa/Hek) - 3

Рисунок 37. Сравнение суммарных выходов и биологической активности некоторых природных, полусинтетических и синтетических аналогов ендиинов и аналогов ендиинов 66Н и 68й, полученных в данной работе.

125

4. ВЫВОДЫ

1. Принципиальным моментом для синтеза 10-членных азаендиинов, конденсированных с индолом, являются электронные эффекты атома азота индольного цикла. Сместить реакцию в нужное направление - циклизацию по Николасу, возможно введением акцепторного (нозильного) заместителя к атому азота, тогда как наличие донорной метильной группы приводит к реализации альтернативной реакции - электрофил-промотируемой нуклеофильной циклизации по тройной связи при С3 с образованием индол-пирролиновых диад.

2. Наилучшим вариантом базовой структуры ендиина для получения гибридов аналогов ендииновых антибиотиков является азаендиин, конденсированный с бензотиофеном, а лучшим сайтом функционализации - аренсульфонамидный фрагмент. Оксаендиин, хотя и может быть модифицирован сложноэфирной группой, слишком активен для последующих превращений, тогда как тиаендиин, наоборот, слишком инертен в циклизации Бергмана для разработки гибридов на его основе.

3. Азаендиины, конденсированные с бензотиофеном, могут быть модифицированы при помощи различных функциональных групп (терминальная тройная связь, изотиоцианатная, малеимидная) для последующего синтеза гибридов ендиинов через клик-реакции. Наиболее удобной в точки зрения синтеза гибридов является NCS группа, тогда как терминальная тройная связь имеет преимущество для структурного разнообразия гибридов.

4. Среди исследуемых соединений, лучшим типом модификации базовой ендииновой структуры для получения аналогов ендииновых антибиотиков с относительной специфической цитотоксичностью для клеточной линии HeLa в наномолярном диапазоне является гибридизация с участием лиганда к малой бороздке ДНК семейства Hoechst, тогда как лучшей линкерной группой, дающей ядерную локализацию гибридов и максимальный индекс селективности, является триазольный фрагмент.

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

5.1. Общая информация и методы

Растворители и реагенты, используемые для реакций, были приобретены у коммерческих поставщиков. Реактивы использовались без дополнительной очистки. Катализаторы Pd(PPh3)4 и Co2(CO)8 были приобретены у Sigma-Aldrich. BCN-амин 67e и BDP 630/650 амин гидрохлорид 67f были приобретены у Lumoprobe®. Гидрохлорид 2-(2-(2-гидроксиэтокси)этокси)этан-1-аммония 67c,[236] бензилазид 65a,[237] 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-ол 65b,[238] 1,2,3,4-тетра-O-ацетил-a,ß-D-глюкопиранозилазид 65d,[239] 2,3,4,6-тетра-O-ацетил-ß-D-

глюкопиранозилазид 65e,[240] 2,3,4,6-тетрагидрокси-ß-D-глюкопиранозилазид азид 65f,[241] 6-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)-2,3,4,6-тетра-O-ацетил-ß-D-глюкопиранозид 65g,[242] 2-(4-(2-азидоэтокси)фенил)-6-(4-метилпиперазин-1 -ил)- Ш-бензоИ имидазол 65h,[235] 4-(пиперидин-1-илсульфонил)анилин 70,[243] 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-амин 67c,[244] 3-иод-2-(3 -метоксипроп-1 -ин-1 -ил)бензо[£]тиофен 23, [ 124] метил-3 -гидрокси-6-

(триметилсилил)гекс-5-иноат 30,[213] #-(бут-3-ин-1-ил)-2-нитробензолсульфонамид 52,[245] N-бензилбут-3-ин-1 -амин 39a,[246] N-(бут-3-ин-1-ил)бензамид 39b,[247] i-BuS-алкин 24a,[248] S-(Бут-3-ин-1-ил) этантиоат 24b,[249] Co-комплексы 34[124] и 44,[149] амино глюкозы 68g[250] and 68h[251], гекс-5-иноилхлорид[252] и пент-4-иноилхлорид[253] синтезированы по известным методикам без каких-либо модификаций.

Растворители подвергались абсолютизации по стандартным методикам. Очистка и абсолютизация DCM были проведены в соответствии с литературной процедурой с использованием CaH2.[254] Реакция Соногаширы, синтез Со-комплексов, циклизация Николаса и циклизация Бергмана проводились в атмосфере аргона в oven-dried посуде. Другие реакции проводились на воздухе, если не указано иное. При нагревании для проведения реакции использовался либо vial-блок, либо масляная баня. Если объем реакции был меньше 15 мл, реакцию проводили в виале с использованием vial-блока для нагрева. Все реакции, объем которых превышал 15 мл, проводились в круглодонных колбах с использованием масляной бани в качестве источника нагрева. Отгонка растворителей и концентрирование реакционных смесей проводились в вакууме при 20 °С (для ендиинов 22, 29, 35, 36, 46, 50, 56a, 56b, 60, 63, 64 и гибридов 66a-h, 68a-f и 70a), при 27 °С (для ациклических ендиинов 4a-e, 4d', 14, 19 и всех Co-комплексов) и при 35 °С (для других соединений) на роторном испарителе. ТСХ выполняли на пластинах, покрытых силикагелем (Silica gel 60, UV 254) с УФ детектированием или проявлением щелочным водным раствором KMnO4. Для препаративной колоночной хроматографии использовали нормальнофазовый силикагель (Silica gel 60, 230-400 меш). Температуры плавления веществ определяли при помощи прибора для определения температуры плавления

Reach Devices RD-MP. Спектры ЯМР 1H и 13C{1H} регистрировали при 400 и 100 (или 125) МГц на приборе Bruker AVANCE 400, соответственно при 25 °C в CDCI3, ацетоне-^б, CD3CN или DMSO-d6 без внутреннего стандарта. Данные ЯМР 1H представлены в виде химических сдвигов (5), мультиплетности (с, синглет; д, дублет; т, триплет; кв, квартет; м, мультиплет; уш, уширенный), констант спин-спинового взаимодействия (J, Гц) и числа протонов. Данные ЯМР 13C{1H} представлены в виде химических сдвигов (5). Химические сдвиги для 1H и 13C представлены в виде значений 5 (м.д.) относительно сигналов остаточных растворителей в дейтерорастворителях: CDCI3 (5 = 7.26 м.д. для 1H; 5 = 77.16 м.д. для 13C спектров); ацетон-^б (5 = 2.05 м.д. для 1H; 5 = 29.84 м.д. для 13C для спектров); CD3CN (5 = 1.94 м.д. для 1H; 5 = 1.32 м.д. для 13C для спектров); DMSO-d6 (5 = 2.50 м.д. для 1H; 5 = 39.52 м.д. для 13C для спектров). Копии спектров ЯМР для некоторых представителей серий веществ (6a, 22, 55b, 60, 66g', 66g, 68d) см. в разделе «Приложения». Масс-спектры высокого разрешения с использованием ионизации методом электроспрея (ESI) и регистрации ионов с помощью времяпролетного детектора TOF были получены на приборе "Bruker maXis HRMS-ESI-QTOF" в режиме регистрации положительных ионов для растворов всех соединений в MeOH. Копии спектров HMRS для некоторых представителей серий веществ (гибриды 66h, 66g, 68d) см. в разделе «Приложения». Дифференциально-сканирующая калориметрия (ДСК) была проведена с использованием ДСК-калориметра DSC 204 F1 Phoenix. Образцы ДСК £-ендиина\^-№-ендиина (0.14 мг) исследовались в алюминиевых тиглях объемом 40 цл с проколотыми крышками при скорости нагрева/охлаждения 15 К/мин в потоке азота (50 мл/мин) от 20 до 300 °C. ДСК-термограммы S-ендиина 29 представлены в статье Eur. J. Org. Chem. 2024, 27, e202401127,[11] опубликованной по теме данной диссертации. ДСК-термограмма N-Ns-ендиина 22 представлена в приложении И.

5.2. Синтез исходных соединений

Синтез исходных алкинилсульфонамидов 1с и 1е

Общая методика (A) синтеза шреш-бутилсульфонилкарбаматов

К продутому аргоном раствору сульфонамида (1.00 экв.) в смеси абсолютных DCM/THF (с = 0.3 мМ) последовательно добавляли Et3N (1.70 экв.), DMAP (0.10 экв.) и B0C2O (1.20 экв.) в абсолютном DCM при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении на ротационном испарителе, остаток разбавляли ледяной водой, охлаждали до 0 °C и обрабатывали 1М HCl. К полученной двухфазной системе добавляли этилацетат (~100 мл) и перемешивали до образования двух прозрачных слоев. Смесь переносили в делительную воронку, органический слой отделяли, а водный слой экстрагировали этилацетатом (~100 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором NaCl до нейтрального значения pH (1-2 раза). Органический слой

сушили над безводным Na2SO4, фильтровали, растворитель отгоняли при пониженном давлении, а полученный белый осадок сушили в вакууме.

Общая методика (B) синтеза трет-бутил бут-3-ин-1-илсульфонилкарбаматов (реакция Мицунобу)

Продутый аргоном раствор #-Бое-сульфонамида 1.2c,e (1.00 экв.), бут-3-ин-1-ола (1.10 экв.), трифенилфосфина (1.10 экв.) в абсолютном THF (c=0.4M) перемешивали в течение 10 минут. Затем медленно добавляли диизопропилазодикарбоксилат (DIAD) (1.10 экв.) при 0 °C. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи (мониторинг ТСХ). Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и продукт реакции очищали методом колоночной хроматографией.

Общая методика (C) синтеза ^-(бут-3-ин-1-ил)бензолсульфонамидов

К продутому аргоном раствору #-Бое-#-бутинилсульфонамида 1.3c,e (1.00 экв.) в DCM (c=0.35M) добавляли трифторуксусную кислоту (TFA) (10.0 экв.) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором NaHCO3. Водный слой экстрагировали DCM. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором NaCl, сушили над Na2SO4. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, а полученный желтый осадок сушили в вакууме.

трет-Бутил((3-нитрофенил)сульфонил)карбамат (1.2c)

трет-Бутил((3-нитрофенил)сульфонил)карбамат 1.2c был синтезирован в соответствии с общей процедурой А. К продутому аргоном раствору ж-нозиламида (4.07 г, 23.2 ммоль, 1.00 экв.) в смеси абсолютных DCM / THF (2.4:1 об./об., 85 мл, c = 0.3 мМ) последовательно добавляли Et3N (5.35 мл, 0.039 моль, 1.70 экв.), DMAP (290 мг, 2.32 ммоль, 0.10 экв.) и B0C2O (6.03 г, 27.8 ммоль, 1.20 экв.) в абсолютном DCM (15 мл) при комнатной температуре. Время реакции - 2 ч. Карбамат 1.2c получали с количественным выходом (5.65 г).

Т пл. 124-125 °C.

1H ЯМР (400 МГц, CDCI3, 5): 8.85 (т, J = 1.9 Гц, 1H), 8.51 - 8.49 (м, 1H), 8.39 - 8.37 (м, 1H), 7.83 (уш. с, 1H), 7.79 (т, J = 8.1 Гц, 1H), 1.41 (с, 9H).

13C ЯМР (101 МГц, CDCI3, 5): 149.0, 148.2, 141.0, 134.1, 130.5, 128.3, 123.7, 85.2, 28.0.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Calcd for CnH14N2O6SNa+ 325.0465; Found, 325.0471.

O-f im

H

Метил 3-(^-(трет-бутоксикарбонил)сульфамоил)бензоат (1.2e)

МеООС

Метил 3-(К-(дареда-бутоксикарбонил)сульфамоил)бензоат 1.2е был синтезирован в соответствии с общей процедурой А. К продутому аргоном раствору сульфонамида 1.1е (3.51 г, 16.31 ммоль, 1.00 экв.) в смеси абсолютных DMC/THF (1.6:1, об./об., 81 мл, с = 0.2 М) добавляли EtзN (3.80 мл, 27.2 ммоль, 1.70 экв.), DMAP (200.0 мг, 1.63 ммоль, 0.1 экв.) и В0С2О (4.27 г, 1.57 ммоль, 1.20 экв.) в абсолютном DCM (10 мл) при комнатной температуре. Время реакции - 2 ч. Продукт 1.2е был получен с выходом 98% (5.04 г).

Т пл. 143-144 °C.

1H ЯМР (400 МГц, CDCI3, 5): 8.65 (т, J = 1.5 Гц, 1H), 8.36 - 8.28 (м, 1H), 8.23 - 8.20 (м, 1H), 7.76 (уш с, 1H), 7.64 (т, J = 7.9 Гц, 1H), 3.96 (с, 3H), 1.38 (с, 9H).

13C ЯМР (101 МГц, CDCI3, 5): 165.5, 149.1, 139.7, 134.7, 132.5, 131.3, 129.4, 129.3, 84.7, 52.8, 27.9.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для CoHnNO6SNa+ 338.0669; Найдено, 338.0668. трет-Бутил бут-3-ин-1-ил((3-нитрофенил)сульфонил)карбамат (1.3c)

трет-Бутил бут-3-ин-1-ил((3-нитрофенил)сульфонил)карбамат 1.3c был синтезирован в соответствии с общей процедурой B. Раствор #-Бое-сульфонамида 1.2c (2.33 г, 7.70 ммоль, 1.00 экв.), бут-3-ин-1-ола (0.64 мл, 8.47 ммоль, 1.10 экв.), трифенилфосфина (2.22 г, 8.47 ммоль, 1.10 экв.) в абсолютном THF (20 мл, c=0.4M), (DIAD) (1.67 мл, 8.47 ммоль, 1.10 экв.). Продукт реакции очищали колоночной хроматографией с использованием гексан/этилацетат (3:1) в качестве элюента, получая продукт карбамат 1.3c (1.59 г, 77%) в виде светло-желтого твердого вещества.

Т пл. 79-81 °C.

1H ЯМР (400 МГц, CDCI3, 5): 8.83 (т, J = 1.9 Гц, 1H), 8.47 (м, 1H), 8.31 (м, 1H), 7.75 (т, J = 8.1 Гц, 1H), 4.03 (т, J = 7.1 Гц, 2H), 2.68 (тд, J = 7.1, 2.6 Гц, 2H), 2.05 (т, J = 2.6 Гц, 1H), 1.39 (с, 9H).

13C ЯМР (101 МГц, CDCl3, 5): 150.4, 148.1, 142.2, 133.9, 130.2, 127.9, 123.7, 85.8, 80.3, 71.1, 45.5, 28.0, 20.0.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C15H18№O6SNa+ 377.0778; Найдено, 377.0780. Метил 3-(^-(бут-3-ин-1-ил)-^-(трет-бутоксикарбонил)сульфамоил)бензоат (1.3e)

Метил 3-(#-(бут-3-ин-1-ил)-#-(дареда-бутоксикарбонил)сульфамоил)бензоат 1.3e был синтезирован в соответствии с общей процедурой B. Раствор метил карбамата 1.2e (2.50 г, 7.93 ммоль, 1.00 экв.), бут-3-ин-1-ола (0.72 мл, 9.51 ммоль, 1.20 экв.), трифенилфосфина (3.95 г, 15.06 ммоль, 1.90 экв.), DIAD (1.86 мл, 9.51 ммоль, 1.20 экв.) при 0 °C. Продукт очищали с помощью колоночной хроматографии с использованием гексан/этилацетата (5:1) в качестве элюента, что давало продукт реакции 1.3e (2.85 г, 98%) в виде белого твердого вещества.

Т пл. 49-51 °C.

1H ЯМР (400 МГц, CDCI3, 5): 8.51 (т, J = 1.5 Гц, 1H), 8.25 - 8.15 (м, 1H), 8.08 - 8.05 (м, 1H), 7.57 (т, J = 7.9 Гц, 1H), 3.96 (т, J = 7.3, 2H), 3.88 (с, 3H), 2.60 (тд, J = 7.3, 2.6 Гц, 2H), 2.00 (т, J = 2.6 Гц, 1H), 1.28 (с, 9H).

13C ЯМР (101 МГц, CDCI3, 5): 165.1, 150.4, 140.7, 134.1, 131.9, 131.0, 129.0, 128.97, 85.0, 80.2, 70.7, 52.6, 45.2, 27.7, 19.9.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для CnH21NO6SNa+ 390.0982; Найдено, 390.0992.

^-(бут-3-ин-1-ил)-3-нитробеюолсульфонамид (1c)

#-(бут-3-ин-1-ил)-3-нитробензолсульфонамид 1с был синтезирован в соответствии с общей процедурой С. К продутому аргоном раствору #-Бос-#-бутинилсульфонамида 1.3с (2.70 г, 7.62 ммоль, 1.00 экв.) в DCM (22 мл, с=0.35М) добавляли TFA (5.68 мл, 76.19 ммоль, 10.0 экв.). Время реакции - 3 ч. Получили #-(бут-3-ин-1-ил)-3-нитробензолсульфонамид 1с (1.82 г, 94%).

н

Т пл. 89-91 °C.

1H ЯМР (400 МГц, CDCl3, 5): 8.71 (т, J = 1.8 Гц, 1H), 8.45 - 8.42 (м, 1H), 8.22 (д, J = 7.8 Гц, 1H), 7.76 (т, J = 8.0 Гц, 1H), 5.25 (т, J = 5.9 Гц, 1H), 3.20 (кв, J = 6.4 Гц, 2H), 2.40 (тд, J = 6.4, 2.6 Гц, 2H), 2.00 (т, J = 2.6 Гц, 1H).

13C ЯМР (101 МГц, CDCI3, 5): 148.5, 142.5, 132.7, 130.8, 127.4, 122.4, 80.0, 71.4, 41.9, 20.0.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C15H18№O6SNa+ 377.0778; Найдено, 377.0791.

Метил 3-(^-(бут-3-ин-1-ил)сульфамоил)бензоат (1e)

Метил 3-(#-(бут-3-ин-1-ил)сульфамоил)бензоат 1e был синтезирован в соответствии с общей процедурой C. К продутому аргоном раствору 1.3e (2.20 г, 5.99 ммоль, 1.00 экв.) в DCM (17 мл, c=0.35M) добавили TFA (3.57 мл, 47.9 ммоль, 8.00 экв.). Время реакции - 3 ч. Продукт 1e был получен с выходом 94% (1.82 г).

Т пл. 107-109 °C.

1H ЯМР (400 МГц, CDCI3, 5): 8.52 (с, 1H), 8.24 (д, J = 7.8 Гц, 1H), 8.06 (д, J = 7.8 Гц, 1H), 7.61 (т, J = 7.8 Гц, 1H), 5.20 - 5.03 (м, 1H), 3.96 (с, 3H), 3.17 - 3.12 (м, 2H), 2.37 (тд, J = 6.5, 2.5 Гц, 2H), 1.99 (т, J = 2.5 Гц, 1H).

13C ЯМР (101 МГц, CDCI3, 5): 165.6, 140.9, 133.7, 131.5, 131.2, 129.6, 128.3, 80.2, 71.2, 52.8, 41.8, 20.0.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C12HoNO4SNa+ 290.0457; Найдено, 290.0465.

Синтез пиперидиновых производных 73 и 74 для получения модельных гибридов с MGB лигандом

2.2.1 Синтез ^-(4-(пиперидин-1-илсульфонил)фенил)пент-4-инамида (71)

К перемешиваемому раствору анилина 70 (100 мг, 0.417 ммоль, 1.00 экв.) в абсолютном DCM (42 мл, с=0.01М) в атмосфере аргона добавляли абсолютный пиридин (0.116 мл, 1.46 ммоль, 3.50 экв.). Реакционную смесь охлаждали до 0 °С, после чего к перемешиваемой смеси добавляли пент-4-иноилхлорид (169.73 мг, 1.46 ммоль, 3.50 экв.). Охлаждающую баню убирали, полученному раствору давали нагреться до комнатной температуры и продолжали

МеООС

перемешивание при этой температуре в течение 1.5 ч (ТСХ-контроль (бензол/этилацетат 15:1). После завершения реакции реакционную смесь выливали в 5%-водный раствор №ОН (40 мл) и экстрагировали DCM (3*20 мл). Объединенные органические слои промывали два раза водой и насыщенным раствором №С1, сушили над безводным №2804, растворитель отгоняли при пониженном давлении. Очистку продукта реакции проводили методом колоночной хроматографии с использованием системы гексан/этилацетат (3:2—>1:1) в качестве элюента. Амид 73 получали в виде белого твердого вещества (131 мг, 98 %).

1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-^б, 5): 10.39 (с, 1Н), 7.82 (д, J = 8.8 Гц, 2Н), 7.66 (д, J = 8.8 Гц, 2Н), 2.89 - 2.82 (м, 4Н), 2.81 (т, J = 2.5 Гц, 1Н), 2.57 (т, J = 6.9 Гц, 2Н), 2.47 - 2.45 (м, 2Н, перекрывается с сигналом от ДМСО-<^), 1.58 - 1.47 (м, 4Н), 1.42 - 1.29 (м, 2Н).

13С ЯМР (100 МГц, ДМСО-^б, 5): 170.1, 143.1, 129.1, 128.6, 118.7, 83.4, 71.5, 46.6, 35.3, 24.7, 22.9, 13.9.

К перемешиваемому раствору анилина 70 (300 мг, 1.25 ммоль, 1.00 экв.) в абсолютном DCM (25 мл, с=0.05М) в атмосфере аргона добавляли триэтиламин (0.347 мл, 2.50 ммоль, 2.00 экв.). Полученную смесь охлаждали до 0 °С, после чего к ней в одну порцию добавляли тиофосген (0.135 мл, 1.50 ммоль, 1.20 экв.). Охлаждающую баню немедленно убирали, давали полученному раствору нагреться до комнатной температуры и перемешивали смесь при этой температуре в течение 30 минут. Затем к реакционной смеси добавляли воду (25 мл), органический слой отделяли, промывали насыщенным раствором №С1, сушили над безводным №2804 и концентрировали при пониженном давлении. Полученный продукт очищали методом колоночной хроматографии с использованием смеси гексан/ацетон (10:1) в качестве элюента. Пиперидин 75 получали в виде желтоватого твердого вещества (283 мг, 80%).

1H ЯМР (400 МГц, CDCI3, 5): 7.73 (д, J = 8.6 Гц, 1H), 7.33 (д, J = 8.6 Гц, 1H), 3.06 - 2.89 (м, 4H), 1.71 - 1.54 (м, 4H), 1.45 - 1.39 (м, 2H).

13C ЯМР (101 МГц, CDCI3, 5): 139.1, 135.8, 135.1, 129.3, 126.2, 47.0, 25.2, 23.5.

HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ Вычислено для C16H21N2O3S+, 321.1267; Найдено, 321.1266.

Синтез 1-((4-изотиоцианатофенил)сульфонил)пиперидина (72).

1-((4-изотиоцианатофенил)сульфонил)пиперидин (72)

HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ Вычислено для Ci2Hi5N2Ö2S2+ 283.0569; Найдено, 283.0573.

Синтез NH2-MGB лиганда 67d

Pd/C, Н2 МеОН

NH2

65h

67d (quant)

2-(4-(6-(4-метилпиперазин-1-ил)-1#-бензо[^]имидазол-2-ил)фенокси)этан-1-амин

(67d)

NH2

• Атомы, сигналы которых

не видны в спектрах 13С / DEPT

К примешиваемому раствору азид-содержащего имидазола 65h[255] (250 мг, 0.662 ммоль, 1.00 экв.) в метаноле (13 мл, c=0.051M) добавляли Pd/C (148 мг, 19 мол.%). Через реакционную массу в течение 4 ч интенсивно пропускали водород. После завершения реакции смесь фильтровали через слой целита. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, продукт реакции сушили в вакууме. Амин 67d получали в виде светло-персикового твердого вещества с количественным выходом (233 мг).

1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-^б, 5): 8.05 (д, J = 8.7 Гц, 2H), 7.40 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 7.08 (д, J = 8.8 Гц, 2H), 6.97 (уш с, 1H), 6.91 (дд, J = 8.8, 2.1 Гц, 1H), 4.00 (т, J = 5.7 Гц, 2H), 3.14 - 3.08 (м, 4H, перекрывается с сигналом от воды), 2.91 (т, J = 5.7 Гц, 2H, перекрывается с сигналом от воды), 2.49 - 2.48 (m, 4H, перекрывается с сигналом от DMSO-Je), 2.23 (с, 3H).

13C ЯМР (101 МГц, ДМСО-^б, 5): 159.7, 150.5, 147.7, 127.6, 123.0, 114.8, 113.6, 70.2, 54.9, 50.0, 45.8, 40.8. Ввиду таутомерных процессов четыре сигнала (см. обозначение выше) бензимидазольного цикла уширены и не видны в спектрах 13C ЯМР и/или DEPT. Отнесение сигналов проводилось на основе литературных данных. [255]

HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ Вычислено для C20H26N5O+, 352.2132; Найдено, 352.2129.

Синтез Fmoc-PEG-N3 лиганда 65с

FmocCI/Py(abs)

65с'

65с

(9#-флуорен-9-ил)метил (2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этил)карбамат (65c)

К охлажденному (0 °С) перемешиваемому раствору 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-амина 65с' (50 мг, 0.287 ммоль, 1.00 экв.) в абсолютном DCM (2.87 мл, с=0.01М) в токе аргона добавляли абсолютный пиридин (33.6 мг, 0.0342 мл, 0.431 ммоль, 1.50 экв.) и затем присыпали FmocCl (111 мг, 0.431 ммоль, 1.50 экв.). Полученной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре до завершения реакции (контроль ТСХ). Время реакции составило 1.5 ч. Затем реакционную смесь выливали в насыщенный раствор №С1, экстрагировали DCM (3*15 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором №С1, сушили над безводным Na2SO4, растворитель удаляли при пониженном давлении. Продукт очищали методом колоночной хроматографии с использованием в качестве элюента смеси гексан/этилацетат (3:1). Азид 65с получали в виде желтоватого масла (76 мг, 67%).

^ ЯМР (400 МГц, CDCI3, 5): 7.79 (д, J = 7.5 Гц, 2H), 7.63 (д, J = 7.4 Гц, 2H), 7.44 - 7.41 (м, 2H), 7.36 - 7.32 (м, 2H), 5.34 (уш с, 1H), 4.43 (д, J = 6.8 Гц, 2H), 4.25 (т, J = 6.8 Гц, 1H), 3.75 - 3.64 (м, 6H), 3.60 - 3.59 (м, 2H), 3.44 - 3.39 (м, 4H).

13C ЯМР (101 МГц, CDCI3, 5): 156.6, 144.1, 141.4, 127.8, 127.1, 125.2, 120.1, 70.7, 70.4, 70.3, 70.2, 66.7, 50.8, 47.4, 41.0.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C21H24N4O4Na+, 419.1690; Найдено, 419.1695.

5.3. Подходы к синтезу индол - конденсированного 10 - членного циклического ендиина

Синтез ^-метилиндол-пирролиновых диад

Этил 3-иод-2-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-1-метил-1#-индол-5-карбоксилат 3

Ме

Соединение 3 было получено по методу [126] с небольшими изменениями. К раствору диацетилена 2 (390 мг, 1.37 ммоль, 1.00 экв.) в DCM (200 мл) последовательно добавляли #-иодсукцинимид (569 мг, 2.53 ммоль, 1.85 экв.) и PPhз (36.0 мг, 0.137 ммоль, 10 мол.%). Полученный раствор кипятили с обратным холодильником в течение 3.5 ч, охлаждали до комнатной температуры и разбавляли 5% водным раствором №28203 (150 мл). Органический слой отделяли, а водный слой экстрагировали DCM (100 мл). Объединенные органические слои промывали Н2О, сушили над безводным №2804 и концентрировали при пониженном давлении. Очистку продукта реакции проводили методом колоночной хроматографией с использованием смеси гексан/этилацетат (3:1) в качестве элюента. 3-Иодиндол 3 был получен в виде белого твердого вещества (463 мг, 85%).

Т пл. 62-63 °С.

1Н ЯМР (400 МГц, CDaз, 5): 8.16 (д, 3 = 1.5 Гц, 1Н), 8.00 (дд, 3 = 8.7 Гц, 1.5 Гц, 1Н), 7.25 (д, 3 = 8.7 Гц, 1Н, сигнал перекрывается с сигналом СНС1з), 4.48 (с, 2Н), 4.42 (кв, 3 = 7.1 Гц, 2Н), 3.88 (с, 3Н), 3.54 (с, 3Н), 1.43 (т, 3 = 7.1 Гц, 3Н). Спектр 1Н ЯМР соответствует данным, опубликованным ранее. [126]

Общая методика (Б) синтеза индол-конденсированных ациклических ендиинов 4а-e, 4а' (реакция Соногаширы)

К перемешиваемому раствору иодиндола 3 (1.00 экв.) и соответствующего алкина 1а-е, 1.3а (1.15 - 1.5 экв.) в виале в DMF (с=0.06М) добавляли Pd(PPhз)4 (5 мол. %) и КБ (5.00 экв.). Смесь дегазировали три раза путем вакуумирования и продувания аргоном. После этого добавляли Си1 (15 мол. %), виалу герметично закрывали и снова повторяли дегазацию. Реакционную смесь перемешивали при 60 - 65 °С в течение соответствующего времени (контроль ТСХ). После завершения реакции реакционную смесь охлаждали, выливали в насыщенный водный раствор N^0 и экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором ЫНдО и дважды насыщенным раствором

№С1, сушили над безводным Na2SO4 и концентрировали при пониженном давлении, получая продукт реакции, который очищали с помощью колоночной хроматографии.

Этил 1-метил-2-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-3-(4-((4-метилфенил)сульфонамидо)бут-1-ин-1-ил)-1#-индол-5-карбоксилат (4a)

Ациклический ендиин 4a был синтезирован в соответствии с общей методикой (D) для реакции Соногаширы из этинилиодиндола 3 (40.0 мг, 0.101 ммоль, 1.00 экв.), #-(бут-3-ин-1-ил)-4-метилбензолсульфонамида 1a (33.7 мг, 0.151 ммоль, 1.50 экв.), Pd(PPh3)4 (5.82 мг, 0.00504 ммоль, 5 моль %), KF (29.3 мг, 0.504 ммоль, 5.00 экв.), CuI (2.88 мг, 0.0151 ммоль, 15 моль %) в ДМФА (1.7 мл, c=0.06M) при 60 °C. Время реакции составило 12 ч. Очистка продукта реакции методом колоночной хроматографией с использованием смеси бензол/этилацетат (15:1) в качестве элюента давала ациклический ендиин 4a (34.0 мг, 69%) в виде светло-коричневого твердого вещества.

Т пл. 127-129 °C.

1H ЯМР (400 МГц, Ацетон-^, 5): 8.29 - 8.25 (м, 1H), 7.94 (дд, J = 8.7, 1.5 Гц, 1H), 7.80 (д, J = 8.2 Гц, 2H), 7.50 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 7.39 (д, J = 8.2 Гц, 2H), 6.69 (т, J = 5.8 Гц, 1H), 4.49 (с, 2H), 4.37 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 3.87 (с, 3H), 3.45 (с, 3H), 3.25 - 3.20 (м, 2H), 2.74 (т, J = 7.2 Гц, 2H), 1.39 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-^, 5): 167.2, 143.9, 139.4, 139.2, 130.5, 128.0, 127.8, 127.2, 125.7, 124.1, 123.0, 110.9, 105.3, 97.3, 92.9, 76.7, 74.6, 61.2, 60.6, 57.8, 43.3, 31.6, 21.9, 21.4, 14.7.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C2?H28№O5SNa+ 515.1611; Найдено, 515.1622.

Этил 1-метил-2-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-3-(4-((4-нитрофенил)сульфонамидо)бут-1-ин-1-ил)-1#-индол-5-карбоксилат (4b)

Ms

Me

Ациклический ендиин 4b был синтезирован в соответствии с общей методикой (D) для реакции Соногаширы из этинилиодиндола 3 (90.0 мг, 0.227 ммоль, 1.00 экв.), #-(бут-3-ин-1-ил)-4-нитробензолсульфонамида 3b (66.3 мг, 0.261 ммоль, 1.15 экв.), Pd(PPh3)4 (13.1 мг, 0.0113 ммоль, 5 моль %), KF (65.8 мг, 1.13 ммоль, 5.00 экв), CuI (6.47 мг, 0.0340 ммоль, 15 моль %) в DMF (3.8 мл, c=0.06M) при 60 °C. Время реакции составило 12 ч. Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием смеси бензол/этилацетат (15:1) в качестве элюента давала ациклический ендиин 4b (72.0 мг, 61%) в виде желтоватого масла.

1H ЯМР (400 МГц, Ацетон-^, 5): 8.30 (д, J = 8.8 Гц, 2H), 8.22 (с, 1H), 8.16 (д, J = 8.8 Гц, 2H), 7.94 (дд, J = 8.7, 1.4 Гц, 1H), 7.48 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 7.20 (т, J = 5.0 Гц, 1H), 4.49 (с, 2H), 4.37 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 3.85 (с, 3H), 3.46 (с, 2H), 3.39 - 3.35 (м, 2H), 2.78 (т, J = 6.8 Гц, 2H), 1.39 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-^, 5): 167.2, 150.7, 147.9, 139.4, 129.1, 128.0, 127.1, 125.7, 125.1, 124.1, 123.0, 110.9, 105.2, 97.3, 92.9, 76.6, 74.6, 61.2, 60.6, 57.8, 43.4, 31.6, 21.8, 14.7.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C26H25N3O?SNa+ 546.1305; Найдено, 546.1299.

Этил 1-метил-2-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-3-(4-((3-нитрофенил)сульфонамидо)бут-1-ин-1-ил)-1#-индол-5-карбоксилат (4c)

Ациклический ендиин 4с был синтезирован в соответствии с общей методикой (Б) для реакции Соногаширы из этинилиодиндола 3 (50.0 мг, 0.126 ммоль, 1.00 экв), #-(бут-3-ин-1-ил)-3-нитробензолсульфонамида 1с (38.4 мг, 0.151 ммоль, 1.20 экв), Pd(PPhз)4 (7.27 мг, 0.00629 ммоль, 5 моль %), ^ (36.6 мг, 0.629 ммоль, 5.00 экв.), Си1 (3.60 мг, 0.0189 ммоль, 15 моль %) в DMF (2.1 мл, с=0.06М) при 65 °С. Время реакции составило 18ч. Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием смеси бензол/этилацетат (10:1) в качестве элюента давала ациклический ендиин 4с (31.5 мг, 48%) в виде светло-коричневого масла.

1H ЯМР (400 МГц, Ацетон-^, 5): 8.66 - 8.65 (м, 1H), 8.40 - 8.30 (м, 2H), 8.22 (д, J = 1.0 Гц, 1H), 7.95 (дд, J = 8.7, 1.0 Гц, 1H), 7.86 - 7.82 (м, 1H), 7.52 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 7.20 (т, J = 5.6 Гц, 1H), 4.48 (с, 2H), 4.37 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 3.88 (с, 3H), 3.46 (с, 3H), 2.79 (т, J = 6.8 Гц, 2H, данный сигнал перекрывается с сигналом от воды), 1.39 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

Me

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-^, 5): 167.2, 149.3, 144.1, 139.5, 133.5, 131.8, 128.0, 127.6, 127.3, 125.7, 124.2, 123.0, 122.6, 111.0, 105.2, 97.3, 92.8, 76.6, 74.7, 61.2, 60.7, 57.8, 43.4, 31.7, 21.9, 14.8.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C26H25№O?SNa+ 546.1305; Найдено, 546.1301.

Этил 1-метил-2-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-3-(4-((2-нитрофенил)сульфонамидо)бут-1-ин-1-ил)-1#-индол-5-карбоксилат (4d)

0,N

Метод 1. Ациклический ендиин 4d был синтезирован в соответствии с общей методикой (Б) для реакции Соногаширы из этинилиодиндола 3 (150 мг, 0.378 ммоль, 1.00 экв.), #-(бут-3-ин-1-ил)-2-нитробензолсульфонамида Ы (115 мг, 0.453 ммоль, 1.20 экв.), Pd(PPhз)4 (21.8 мг, 0.0189 ммоль, 5 моль %), К1 (109.70 мг, 1.89 ммоль, 5.00 экв.), Си1 (10.8 мг, 0.0566 ммоль, 15 моль %) в DMF (6.3 мл, с=0.06М) при 65 °С. Время реакции составило 18ч. Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием смеси бензол/этилацетат (20:1) в качестве элюента давала ациклический ендиин 4d (123 мг, 62%) в виде светло-коричневого масла.

Метод 2. К перемешиваемому раствору #-Boc-сульфонамида 4d' (51.0 мг, 0.0818 ммоль, 1.00 экв.) в абсолютном DCM (0.500 мл, с=0.16М) добавили в одну порцию TFA (30.5 мкл, 0.409 ммоль, 5.00 экв.). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2.5 ч. Затем в реакционную смесь добавляли насыщенный водный раствор №НС03 (10.0 мл) и экстрагировали DCM (3*10 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором №С1, сушили над безводным Na2SO4. Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием системы бензол/этилацетат (20:1) в качестве элюента давала ациклический ендиин 4d (6.00 мг, 14%) в виде светло-коричневого масла.

1H ЯМР (400 МГц, Ацетон-^, 5): 8.29 - 8.24 (м, 1H), 8.21 - 8.18 (м, 1H), 7.95 (дд, J = 8.7, 1.6 Гц, 1H), 7.91 - 7.79 (м, 3H), 7.53 (д, J = 8.8 Гц, 1H), 6.93 (т, J = 5.9 Гц, 1H), 4.49 (с, 2H), 4.37 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 3.89 (с, 3H), 3.54 - 3.38 (м, 5H, сигнала OCH3 группы и NH-CH2-

Ме

перекрываются, четко видно в HSQC спектре), 2.84 (т, J = 7.0 Гц, 3H, перекрывается с сигналом от воды), 1.38 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-^б, 5): 167.2, 149.1, 139.4, 134.8, 134.6, 133.6, 131.3, 128.0, 127.3, 125.8, 125.7, 124.1, 123.0, 111.0, 105.1, 97.3, 92.6, 76.6, 74.8, 61.2, 60.6, 57.8, 43.7, 31.7, 21.9, 14.7.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C26H25NsO?SNa+ 546.1305; Найдено, 546.1316.

Этил 1-метил-3-(4-((3-(метоксикарбонил)фенил)сульфонамидо)бут-1-ин-1-ил)-2-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-1#-индол-5-карбоксилат (4e)

Ациклический ендиин 4e был синтезирован в соответствии с общей методикой (D) для реакции Соногаширы из этинилиодиндола 3 (100 мг, 0.252 ммоль, 1.00 экв.), метил 3-(#-(бут-3-ин-1-ил)сульфамоил)бензоата 1e (101 мг, 0.378 ммоль, 1.50 экв.), Pd(PPh3)4 (14.6 мг, 0.0126 мкмоль, 5 моль %), KF (73.1 мг, 1.26 ммоль, 5.00 экв.), CuI (7.19 мг, 0.378 ммоль, 15 мол. %) в DMF (4.2 мл, c=0.06M) при 60 °C. Время реакции - 12 ч. Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием смеси бензол/этилацетат (10:1) в качестве элюента давала ациклический ендиин 4e (64.9 мг, 48%) в виде светло-коричневого масла.

1H ЯМР (400 МГц, Ацетон-^б, 5): 8.47 (с, 1H), 8.25 (с, 1H), 8.17 - 8.15 (м, 2H), 7.95 (дд, J = 8.7, 1.5 Гц, 1H), 7.71 (т, J = 7.8 Гц, 1H), 7.52 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 7.02 (т, J = 5.8 Гц, 1H), 4.48 (с, 2H), 4.37 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 3.88 (с, два перекрывающихся сигнала 3Н и 3Н), 3.45 (с, 3H), 3.33 - 3.25 (м, 2H), 2.77 (т, J = 7.0 Гц, 2H, данный сигнал перекрывается с сигналом от воды), 1.38 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-^б, 5): 167.2, 166.0, 142.9, 139.4, 133.7, 132.1, 131.9, 130.6, 128.4, 128.1, 127.3, 125.7, 124.1, 123.0, 111.0, 105.3, 97.3, 92.8, 76.7, 74.6, 61.2, 60.7, 57.8, 52.8, 43.4, 31.7, 21.9, 14.7.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C28H28№O?SNa+ 559.1509; Найдено 559.1512.

Этил 3-(4-((^-(шрет-бутоксикарбонил)-2-нитрофенил)сульфонамидо)бут-1-ин-1-ил)-1-метил-2-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-1#-индол-5-карбоксилат (4d')

СООМе

Me

Ациклический ендиин 4d' был синтезирован в соответствии с общей методикой (D) для реакции Соногаширы из этинилиодиндола 3 (100 мг, 0.252 мкмоль, 1.00 экв.), алкина 1.3d (89.6 мг, 0.352 ммоль, 1.40 экв.), Pd(PPh3> (14.6 мг, 0.126 ммоль, 5 моль %), KF (73.1 мг, 1.26 ммоль, 5.00 экв.), CuI (7.19 мг, 0.0378 ммоль, 15 моль %) в DMF (4.2 мл, c=0.06M) при 65 °C. Время реакции - 12 ч. Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием системы бензол/этилацетат (10:1) в качестве элюента давала ациклический ендиин 4d' (51.0 мг, 22%) в виде темно-красного масла.

^ ЯМР (400 МГц, Ацетон-^б, 5): 8.42 (д, J = 1.1 Гц, 1H), 8.35 (д, J = 7.4 Гц, 1H), 8.04 - 7.93 (м, 4H), 7.52 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 4.52 (с, 2H), 4.36 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 4.10 (т, J = 7.3 Гц, 3H), 3.89 (с, 3H), 3.49 (с, 3H), 3.03 (т, J = 7.3 Гц, 3H), 1.37 (т, J = 7.1 Гц, 3H), 1.35 (с, 9H, перекрывается с предыдущим сигналом СН3 группы).

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-^б, 5): 167.3, 151.0, 148.7, 139.5, 136.0, 133.8, 133.3, 133.1, 128.2, 127.4, 125.8, 125.6, 124.2, 123.2, 111.0, 105.3, 97.4, 92.0, 86.0, 76.7, 75.4, 61.2, 60.7, 57.8, 47.1, 31.7, 27.9, 21.9, 14.7.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C31H33№O9SNa+ 646.1830; Найдено, 646.1815.

Общая методика (E) синтеза Co2(CO)6-комплексов индол-пирролиновых диад 6a-e в условиях реакции Николаса

К раствору ациклического ендиина 4a-e в абсолютном DCM (c=0.005M) в токе аргона при комнатной температуре добавляли октакарбонилдикобальт (1.10-1.20 экв.). Полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 ч (контроль ТСХ). После завершения реакции реакционную смесь разбавляли абсолютным DCM в 5 раз (c=0.001M) и охлаждали до 0 °C. К охлажденного раствору Со-комплекса добавляли BF3^Et2O (1.5-4.5 экв.) в одну порцию. Полученную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре до завершения реакции (контроль ТСХ). Затем реакционную смесь разбавляли равным объёмом насыщенного водного раствора NaHCO3. Органический слой отделяли, промывали насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4 и концентрировали при пониженном давлении, получая продукт реакции, который очищали с помощью колоночной хроматографии.

Общая методика (Е) получения Со2(СО)б-комплексов ациклических ендиинов ряда индола и бензотиофена

К 0.005 М раствору ациклического ендиина (1.00 экв.) в абсолютном толуоле в токе аргона добавляли октакарбонилдикобальт (1.10-1.15 экв.). Полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение соответствующего времени (контроль ТСХ). Растворитель удаляли при пониженном давлении, а остаток очищали с помощью колоночной хроматографии.

Гексакарбонил(этил 1-метил-2-(^2-(п2,П2)"3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-3-(4-((4-

метилфенил)сульфонамидо)бут-1-ин-1-ил)-1#-индол-5-карбоксилат) дикобальт (8)

Со-комплекс 8 был синтезирован в соответствии с общей процедурой (Б) из ендиина 4а (148 мг, 0.300 ммоль, 1.00 экв.) и октакарбонилдикобальта (113 мг, 0.330 ммоль, 1.10 экв.) в абсолютном толуоле (60.1 мл, с = 0.005М). Время реакции - 1 час. Очистка продукта реакции методом колоночной хроматографии с использованием системы бензол / этилацетат (15:1) в качестве элюента давала Со-комплекс 8 (90.0 мг, 38%) в виде темно-зеленого твердого вещества.

1H ЯМР (400 МГц, Ацетон-^б, 5): 8.30 (д, J = 1.0 Гц, 1H), 7.95 (дд, J = 8.7, 1.0 Гц, 1H), 7.80 (д, J = 8.2 Гц, 2H) 7.55 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 7.39 (д, J = 8.2 Гц, 2H), 6.74 (т, J = 6.0 Гц, 1H), 5.06 (с, 2H), 4.37 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 4.00 (с, 3H), 3.60 (с, 3H), 3.30 - 3.25 (м, 2H), 2.82 (т, J = 7.4 Гц, 2H, перекрывается с сигналом воды), 2.39 (с, 3H), 1.39 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-^б, 5): 200.2, 167.3, 144.0, 141.0, 139.8, 139.2, 139.2, 130.5, 129.6, 127.8, 125.5, 124.1, 122.7, 110.6, 102.4, 100.0, 96.4, 76.4, 75.0, 61.2, 59.2, 43.1, 31.5, 22.5, 21.4, 14.8.

HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ Вычислено для C33H29C02N2O11S+ 779.0151; Найдено, 779.0146.

Гексакарбонил(этил 2-(^2-(п2,'Л2)-3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-1-метил-3-(1-тозил-4,5-дигидро-1#-пиррол-2-ил)-1#-индол-5-карбоксилат)дикобальт (6a)

ЕЮОС

Me

С-Ме 2° 19

1Ч-Ме

Метод 1. Комплекс 6а получали из ациклического ендиина 4а (30.0 мг, 0.0610 ммоль, 1.00 экв.) в соответствии с общей методикой (Е) в два этапа. Этап (1) - использовали раствор ендиина 4а в абсолютном DCM (12.2 мл, с=0.005М) и октакарбонилдикобальта (24.0 мг, 0.0700 ммоль, 1.15 экв.). Время реакции составило 1 ч (контроль ТСХ). Этап (2) - реакционную смесь разбавляли абсолютным DCM (60.9 мл, с=0.001М), затем добавляли BFзxEt2O (11.3 мкл, 0.0914 ммоль, 1.50 экв.). Время реакции составило 1 ч (контроль ТСХ). Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием системы гексан/ацетон (7:1) в качестве элюента давала Со-комплекс пирролина 6а (18.5 мг, 39%) в виде болотно-зеленого твердого вещества.

Метод 2. К раствору ациклического ендиина 4а (20.0 мг, 0.0406 ммоль, 1.00 экв.) в абсолютном DCM (8.2 мл, с=0.005М) в токе аргона добавляли октакарбонилдикобальт (16.7 мг, 0.0487 ммоль, 1.20 экв.), и смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 ч (контроль ТСХ). После завершения реакции реакционную смесь разбавили абсолютным DCM (40.6 мл, с=0.001М), к смеси добавляли DIPEA (21.2 мкл, 0.122 ммоль, 3.00 экв.), смесь охлаждали до -20 °С, и, затем, к перемешиваемой смеси в одну порцию добавили TMSOTf (20.5 мкл, 0.122 ммоль, 3.00 экв.). Полученную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 1 ч (контроль ТСХ). Затем реакционную смесь разбавляли насыщенным водным раствором №НСОз (50 мл). Органический слой отделили, промыли насыщенным раствором №С1, высушили над безводным №2804 и растворитель удаляли при пониженном давлении. Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием системы гексан/ацетон (7:1) в качестве элюента давала Со-комплекс пирролина 6а (11.5 мг, 38%) в виде болотно-зеленого твердого вещества.

Метод 3. К раствору Со-комплекса 8 (50.0 мг, 0.0642 ммоль, 1.00 экв.) в абсолютном DCM (64.2 мл, с=0.001М), охлажденному до 0 °С, в токе аргона добавляли в одну порцию BFз•Et20 (10.3 мкл, 0.0835 ммоль, 1.30 экв.). Охлаждающую баню немедленно убирали, давая реакционной смеси нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивали при этой температуре 1 ч (контроль ТСХ). Затем реакционную смесь разбавляли насыщенным водным раствором №НСОз (50 мл) и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали дихлорметаном (2*20). Органические слои объединяли, промывали насыщенным раствором №С1, сушили над безводным №2804 и концентрировали при пониженном давлении. Очистка

продукта реакции колоночной хроматографией с использованием системы бензол/этилацетат (20:1) в качестве элюента давала Со-комплекс пирролина ба (13.0 мг, 26%) в виде болотно-зеленого твердого вещества.

1H ЯМР (400 МГц, A^to^^, 5): 7.84 (дд, J = 8.7, 1.1 Гц, 1H, H6), 7.53 (с, 1Н, Н4), 7.50 (д, J = 8.7 Гц, 1H, H7), 7.17 (д, J = 8.1 Гц, 2H, H19), 6.94 (д, J = 8.1 Гц, 2H, H20), 5.20 (т, J = 2.4 Гц, 1H, Н9), 5.15 (д, J = 13.3 Гц, 1H, H14a ), 4.90 (д, J = 13.3 Гц, 1H, H14b), 4.44 - 4.38 (м, 1Н, Н11а), 4.35 (кв, J = 7.1 Гц, 2H, H16), 4.19 - 4.14 (м, 1H, Н11Ь), 4.10 (с, 3H, NMe), 3.66 (с, 3H, OMe), 2.92 - 2.82 (м, 1H, Н10а перекрывается с сигналом воды), 2.78 - 2.69 (м, 1H, Н10Ь перекрывается с сигналом от воды), 2.24 (с, 3H, C-Me), 1.39 (т, J = 7.1 Гц, 3H, H17). Отнесение сигналов выполнено на основании COSY и NOESY ЯМР спектров.

13C ЯМР (101 МГц, Aцетон-J<5, 5): 200.6 (6CO лиганды), 167.2 (C15), 144.2 (С21), 141.2 (С2 или 7a), 136.9 (С18), 136.7 (С2 или 7a), 136.5, 129.9 (2C, C20), 128.2 (С3 или С8) 128.2 (2C, С19), 124.3 (С6), 123.5 (C3a или 5), 122.9 (C4), 116.6 (С9), 110.0 (С7), 109.0 (С3 или С8), 102.0 (С12/13), 75.2 (C14j, 71.3 (С12/13), 61.0 (С16), 59.1 (OMej, 50.9 (С11), 31.2 (N-Mej, 28.6 (С10), 21.3 (C-Mej, 14.9 (C17). Отнесение сигналов выполнено на основании HSQC ЯМР спектра.

HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ Вычислено для C33H29C02N2O11S+ 779.0151; Найдено, 779.0163.

Гексакарбонил(этил 1-метил-2-(^2-(п2,П2)-3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-3-(1-((4-

нитрофенил)сульфонил)-4,5-дигидро-1#-пиррол-2-ил)-1#-индол-5-карбоксилат)дикобальт (6b)

Комплекс 6Ь получали из ациклического ендиина 4Ь (30.0 мг, 0.0688 ммоль, 1.00 экв.) в соответствии с общей методикой (Е) в два этапа. Этап (1) - использовали раствор ендиина 4Ь в абсолютном DCM (14.0 мл, с=0.005М) и октакарбонилдикобальта (28.2 мг, 0.0700 ммоль, 1.15 экв.). Время реакции составило 1 ч (контроль ТСХ). Этап (2) - реакционную смесь разбавляли абсолютным DCM (60.9 мл, с=0.001М), затем добавляли BFз•Et2O (12.7 мкл, 0.103 ммоль, 1.50

экв.). Время реакции составило 1 ч (контроль ТСХ). Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием системы гексан/этилацетат (5:1) в качестве элюента давала Со-комплекс пирролина 6b (24.0 мг, 43%) в виде болотно-зеленого масла.

1H ЯМР (400 МГц, Ацетон-^б, 5): 7.89 (д, J = 8.8 Гц, 2H), 7.75 (дд, J = 8.7, 1.5 Гц, 1H), 7.51 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 7.47 (д, J = 8.8 Гц, 2H), 7.21 (с, 1H), 5.28 (т, J = 2.6 Гц, 1H), 5.15 (д, J = 13.2 Гц, 1H), 4.93 (д, J = 13.2 Гц, 1H), 4.62 - 4.51 (м, 1H), 4.42 - 4.18 (м, 3H), 4.11 (с, 3H), 3.68 (с, 3H), 3.07 - 2.88 (м, 2H, данный сигнал перекрывается с сигналом воды), 1.35 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-^б, 5): 200.6, 166.8, 150.6, 145.6, 141.0, 137.4, 135.7, 129.3, 128.3, 124.6, 124.3, 123.7, 121.9, 117.6, 110.3, 107.7, 101.8, 75.1, 70.8, 61.2, 59.2, 51.4, 31.3, 28.7, 14.6.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C32H25Co2N3Ö13SNa+ 831.9664; Найдено, 831.9673.

Гексакарбонил(этил 1-метил-2-(^2-(п2,'Л2)-3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-3-(1-((3-

нитрофенил)сульфонил)-4,5-дигидро-1#-пиррол-2-ил)-1#-индол-5-карбоксилат)дикобальт

Комплекс 6c получали из ациклического ендиина 4c (25.0 мг, 0.0478 ммоль, 1.00 экв.) в соответствии с общей методикой ф) в два этапа. Этап (1) - использовали раствор ендиина 4c в абсолютном DCM (9.60 мл, с=0.005М) и октакарбонилдикобальта (18.0 мг, 0.0525 ммоль, 1.10 экв.). Время реакции составило 1 ч (контроль ТСХ). Этап (2) - реакционную смесь разбавляли абсолютным DCM (48.0 мл, с=0.001М), затем добавляли BFз•Et2O (10.2 мкл, 0.0716 ммоль, 1.50 экв.). Время реакции составило 1.5 ч (контроль ТСХ). Очистка продукта реакции колоночной хроматографией с использованием системы гексан/ацетон (3:1) в качестве элюента давала Со-комплекс пирролина 6c (16.0 мг, 41%) в виде болотно-зеленого твердого вещества.

1H ЯМР (400 МГц, Ацетон-дб, 5): 8.12 - 8.06 (м, 1H), 7.90 - 7.88 (м, 1H), 7.74 - 7.66 (м, 2H), 7.52 (т, J = 8.0 Гц, 1H), 7.41 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 7.31 - 7.23 (м, 1H), 5.30 (т, J = 2.6 Гц, 1H), 5.17 (д, J = 13.2 Гц, 1H), 4.92 (д, J = 13.2 Гц, 1H), 4.62 - 4.55 (м, 1H), 4.38 - 4.21 (м, 3H), 4.09 (с, 3H), 3.68 (с, 3H), 3.05 - 2.81 (м, 2H, данный сигнал перекрывается сигналом от воды), 1.36 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

(6c)

Me

13C ЯМР (101 МГц, Ацетон-дб, 5): 200.6, 166.8, 148.1, 141.9, 140.9, 137.3, 135.7, 133.6, 131.3, 128.1, 127.7, 124.4, 123.9, 123.2, 121.5, 117.8, 110.1, 107.8, 102.0, 75.2, 70.7, 61.1, 59.2, 51.0, 31.3, 28.8, 14.8.

HRMS (ESI) m/z: [M+Na]+ Вычислено для C32H25Co2N3Ö13SNa+ 831.9664; Найдено, 831.9672.

Гексакарбонил (этил 1-метил-2-(^2-(п2,'Л2)-3-метоксипроп-1-ин-1-ил)-3-(1-((2-нитрофенил)сульфонил)-4,5-дигидро-1Н-пиррол-2-ил)-1Н-индол-5-карбоксилат) дикобальт (6d)

NO,