Состав лейкоцитарного пула и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови доношенных новорожденных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Боякова, Елена Викторовна

• Боякова, Елена Викторовна
• кандидат медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Боякова, Елена Викторовна

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 3. МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ

НОВОРОЖДЕННЫХ.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И РОДОВ АНТРОПОМЕТРИЧЕСКИХ ДАННЫХ, ПОЛА

НОВОРОЖДЕННОГО И СРОКА ГЕСТАЦИИ НА КОЛИЧЕСТВО CD34+

КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДОНОШЕННЫХ

НОВОРОЖДЕННЫХ

ГЛАВА 6. КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ПУПОВИННОЙ

ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕЙКОЦИТОВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ

ГЛАВА 4. КОЛИЧЕСТВО И СУБПОПУЛЯЦИИ CD34+ И CD 133 КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДОНОШЕННЫХ

КРОВИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Состав лейкоцитарного пула и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови доношенных новорожденных»

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является важным компонентом терапии при многих гематологических заболеваниях, врожденных нарушениях иммунной системы, наследственных анемиях, некоторых болезнях обмена и злокачественных новообразованиях [3,44,45,83].

Оптимальным аллогенным донором для трансплантации ГСК является брат или сестра больного, совпадающий по HLA системе. Если среди членов семьи нет HLA-идентичного донора, то можно выполнить трансплантацию ГСК с использованием костного мозга неродственного донора, совместимого по HLA.

Поиск подходящего донора костного мозга - дорогой и длительный путь, и иногда пациент не доживает до трансплантации [1,38,43]. Вероятность того, что для пациентов, принадлежащих к этническим меньшинствам, найдется HLA-идентичный неродственный донор, может быть еще меньше, поскольку встречаемость определенных HLA-типов в различных этнических группах значительно варьирует.

Таким образом, становится понятно, насколько актуален поиск альтернативных источников ГСК для трансплантации. Одним из источников ГСК для трансплантации является пуповинная кровь (ПК).

Сбор ПК не причиняет донору никакого вреда, и эту кровь легко собирать. Криообработанная пуповинная кровь может быть быстро использована для трансплантации. Вероятность заражения вирусными инфекциями низка и может быть заранее исключена. Использование криообработанной пуповинной крови может иметь с иммунологической точки зрения некоторые преимущества перед i трансплантацией костного мозга, так как возможно выполнение иммунологических перекрестных проб с реципиентом.

Традиционно маркером ГСК считается CD34, однако, в последние несколько лет описан маркер CD133, который многие авторы считают более ранним маркером стволовых клеток, а С0133+клетки - обладающими большим гемопоэтическим потенциалом.

Первая в мире трансплантация кроветворных клеток пуповинной крови была осуществлена в 1988 г [30,45], после чего этот источник гемопоэтической ткани стал применяться во многих странах. В дальнейшем в Европе, Америке, Японии стали создаваться банки ПК [49,55,57,98] и к концу 2004 г в Европе было произведено более 3000 пересадок гемопоэтических клеток пуповинной крови у детей и взрослых [43].

Успешность трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК. Важным вопросом при применении пуповинной крови в клинике является оценка трансплантата, в основе которой лежит определение количества ГСК, содержащихся в образце ПК и дозы клеток, необходимой для успешной трансплантации [24,46,91].

Определение количества гемопоэтических стволовых клеток и их пролиферативной активности, а так же учет факторов оказывающих влияние на состав и биологические свойства клеток ПК является актуальной задачей при проведении сбора, заготовки клеток ПК.

Цель и задачи исследования Цель работы: определить состав лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови доношенных новорожденных, влияния на него различных состояний анте- и интранатального периода и технологических этапов сбора и заготовки пуповинной крови для криоконсервирования.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Определить морфологический состав и иммунологическую характеристику лейкоцитов пуповинной крови доношенных новорожденных.

2. Определить количество и субпопуляции CD34+ и CD133+ клеток пуповинной крови доношенных новорожденных.

3. Изучить влияние антропометрических данных, пола новорожденного, срока гестации и особенностей течения беременности и родов на состав лимфоцитов и стволовых гемопоэтических клеток пуповинной крови.

4. Оценить колониеобразующую активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

5. Определить степень и характер влияния процедуры лейкоконцентрации на состав лейкоцитов и предшественников гемопоэза пуповинной крови.

В работе получены данные, содержащие научную новизну. Показано, что количество СОЭ4+клеток в ПК составило 0,83±0,023% от общего числа ядросодержащих клеток. Количество наиболее ранних клеток-предшественников - CD34 CD133 клеток составило 0,46±0,05%. Количество мезенхимальных стволовых клеток - CD133+CD106+ составило 0,48±0,07%, а эндотелиальных клеток-предшественников - CD133+CD31+ - 0,88±0,11% от общего числа ядросодержащих клеток.

При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков CD34+ клеток больше, чем у девочек, как в процентном соотношении, так и в абсолютном количестве. Также у мальчиков выше и эффективность клонирования ПК.

Количество CD34+ клеток имеет тенденцшо к повышению при увеличении массы новорожденного, зависит от массы плаценты, статистически значимо меньше при сборе пуповинной крови во время 4-х родов по сравнению 1 - 3-ми родами. Показано, что количество CD34+ клеток в ПК статистически значимо выше при острой гипоксии плода во время родов и статистически значимо ниже при хронической гипоксии плода в период беременности.

Колониеобразующая активность ПК зависит от количества CD34+ клеток. Эффективность клонирования пуповинной крови доношенных новорожденных наибольшая при гестационном возрасте 39 недель, за счет большего количества смешанных колоний - наиболее ранних клеток-предшественников гемопоэза (KOE-mix).

Научно-практическая значимость

При проведении процедуры концентрации пуповинной крови, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается за счет снижения доли моноцитов, эозинофилов и базофилов.

Процедура лейкоконцентрации не влияет на количество С1)3+клеток, в том числе CD3+CD4+icieTOK и CD3+CD8+icieTOK и активированных лимфоцитов -С025+клеток. В результате процедуры лейкоконцентрации статистически значимо увеличилась доля СЭ19+клеток и натуральных киллеров (NK) CD 16+С056+клеток.

Количество миелоидных предшественников (КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М), также как и количество CD34+ клеток зависит от количества нормобластов в ПК. У новорожденных с большим количеством нормобластов в ПК количество CD34+ клеток и миелоидных клеток-предшественников статистически значимо выше.

Практическое значение работы заключается в получении значений, характеризующих состав лейкоцитов пуповинной крови, которые рекомендуется использовать в качестве факторов определяющих показания и противопоказания к сбору пуповинной крови для безвозмездного донорства ГСК. Кроме того, полученные данные имеют важное практическое значение при проведении технологических расчетов в работе банков стволовых клеток.

Результаты исследования внедрены в работу ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы».

Результаты работы доложены на X Съезде педиатров России (февраль 2006).

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава и ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы».

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев), на базе лаборатории контроля количества и жизнеспособности стволовых клеток (зав. - к.м.н. С.А.Румянцев) ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы» (директор -доктор медицинских наук, профессор О.А.Майорова).

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Боякова, Елена Викторовна

выводы

1. Средние показатели абсолютного количества лейкоцитов и лейкоцитарных субпопуляций пуповинной крови доношенных новорожденных получены следующие: лейкоциты: 17,24±5,24х109/л, нейтрофилы: 8,41±3,02х109/л, лимфоциты: 5,54±1,99х109/л, моноциты: 2,42±1,01х109/л, эозинофилы: 0,64±0,34х109/л, базофилы: 0,23±0,18х109/л.

2. Показано, что количество CD34+KJieTOK в пуповинной крови составило 0,83±0,023 % от общего числа ядросодержащих клеток. Количество наиболее ранних клеток-предшественников - CD34+CD133+KneTOK составило 0,46 ± 0,05%. Количество мезенхимальных стволовых клеток - CD133+CD106+ составило 0,48 ± 0,07%, а эндотелиальных клеток-предшественников -CD133 CD3 Г - 0,88 ± 0,11% от общего числа ядросодержащих клеток.

3. При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков CD34+ клеток больше, чем у девочек как в процентном соотношении (0,88±0,03 -мальчики; 0,77±0,03 - девочки; р=0,01), так и в абсолютном количестве (0,106±0,005 - мальчики; 0,095±0,005 - девочки; р=0,002). Количество CD34+KneTOK имеет тенденцию к увеличению при повышении массы тела новорожденного, зависит от веса плаценты, статистически значимо меньше при сборе пуповинной крови во время 4 родов по сравнению 1-3 родами. Статистически значимо выше при острой гипоксии плода и ниже при хронической гипоксии плода.

4. Увеличение абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов статистически значимо повышало эффективность клонирования пуповинной крови, за счет клеток предшественников всех ростков гемопоэза.

5. Получена сильная статистически значимая положительная корреляционная взаимосвязь между количеством нормобластов в пуповинной крови и количеством КОЕ-ГМ (г-0.6778; р=0,0004), КОЕ-Г (г=0,7833; р=0,00001) и КОЕМ (г=0,7811; р=0,00001), а также суммарным количеством КОЕ (i=0,6367; р=0,0011). В группе новорожденных с большим количеством нормобластов, количество CD34+KneTOK в пуповинной крови статистически значимо выше. Имеется достоверная положительная средняя корреляционная взаимосвязь абсолютного количества CD34+ клеток в пуповинной крови и KOE-mix в мл образца (г=0,3888; /?=0,001), КОЕ-ГМ (г=0,4285; р=0,001), КОЕ-Г (г=0,2887; р=0,0018), КОЕ-М (г=0,3197; р=0,0005) и общим количеством КОЕ в мл образца (г=0,4187; р=0,001).

6. Выявлено, что у мальчиков достоверно больше количество КОЕ-ГМ на 1 мл образца (745,71±65,11 - девочки; 1216,7±185,45 - мальчики; р=0,022), и имеется тенденция к увеличению (недостоверно) количества КОЕ-М (691,64±78,6 -девочки; 1052,1±252,09 - мальчики; р=0,19) и общего количества колоний (4883,13±455 - девочки; 6070,8±691 - мальчики; р=0,16) на 1 мл образца пуповинной крови. При подсчете на 105 MNC у мальчиков также больше КОЕ-Г (18,44±1,31 - девочки; 22,42±1,6 - мальчики; р=0,058). В процентном соотношении имеется тенденция к увеличению количества KOE-mix (р=0,11) у девочек, и уменьшению у них КОЕ-ГМ (р=0,13) и КОЕ-Эр (р=0,14).

7. Эффективность клонирования пуповинной крови доношенных новорожденных наибольшая при гестационном возрасте 39 недель, за счет большего количества смешанных колоний - KOE-mix.

8. Показано, что при проведении процедуры концентрации пуповинной крови, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов достоверно повышается за счет того, что доля моноцитов, эозинофилов и базофилов достоверно снижается. Процедура лейкоконцентрации не влияла на количество СБЗ+клеток, в том числе CD3+CD4+khctok и CD3+CD8+i0ieT0K и активированных лимфоцитов - СБ25+клеток. В результате процедуры лейкоконцентрации статистически значимо увеличилась доля СБ19+клеток и натуральных киллеров (NK) CD 16+СВ56+клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученное значение количества CD34+ рекомендуется использовать в качестве референтных значений при сборе и заготовке клеток пуповинной крови для трансплантации.

2. Полученные данные о влиянии особенностей течения беременности и родов на количество CD34+ клеток пуповинной крови рекомендуется использовать при определении показаний и противопоказаний к сбору клеток пуповинной крови для безвозмездного донорства.

3. Количество нормобластов статистически значимо взаимосвязанное с количеством CD34+ клеток и колониеобразующей активностью рекомендуется учитывать, как дополнительный, благоприятный признак при проведении отбраковки пуповинной крови на этапе первичного тестирования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Боякова, Елена Викторовна, 2006 год

1. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови// Вопросы онкологии.- 2000.- Т. 46.- №5.- С.513-520.

2. Алексеев И.В., Волынец М.Д., Владимирская Е.Б. и др.// Гематол. и трансфузиол.- 1996.- Т.41.- №2.- С.16-18.

3. Алексеев И.В., Клеточный состав пуповинной крови при неосложненной и патологической беременности. Автореф. дисс. канд. мед. наук. М. 1995.

4. Афанасьев Б. В., Туранова С.А., Кулибаба Т.Г. и др. Клонирование кроветворных предшественников человека в системе '"агаровая капля жидкая среда". Тер. архив. 1983, 8, 114-121.

5. Балашова В.А., Абдулкадыров К.М. Клеточный состав гемопоэтической ткани печени и селезенки у плодов человека. Арх. анат. 1984, 4, 61-63.

6. Владимирская Е.Б., Волынец М.Д., Замараева Н.В. и др. Стволовые кроветворные клетки в гемопоэтических органах плода человека. Новосибирск. Издание СО РАМН, 1998.

7. Глузман Д.Ф., Бебешко В.Г., Надгорная В.А., Скляренко Л.М. Дроздова В.Д.

8. Эмбриональное кроветворение и гамобластозы у детей (иммуноцитология и цитохимия). Киев. Наукова думка. 1988. 198 с.

9. Каргин В.Д. . Абдулкадыров К.М. Применение трансплантаций эмбриональных гемопоэтических клеток при лечении заболеваний системы крови. Гематология и трансфуэиология. 1983,7, 16-22.

10. Митюрова Л.Б. Становление кроветворения у плода и новорожденного. Автореф. дисс. канд. мед. наук. М. 1988.

11. Торубарова Н.А., Кошель И.В., Яцык Г.В. Кроветворение плода и новорожденного. М. Медицина, 1983.

12. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. М. Медицина, 1980.

13. Чертков И. Л., Фриденштейн А .Я. Клеточные основы микроокружения. М. Медицина 1977.

14. Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение. М., Медицина. 1984.

15. Alfani Е, Migliaccio AR, Sanchez М, et al. Characterization of the T cell receptor repertoire of neonatal T cells by RT-PCR and single strand conformation polymorphism analysis. Bone Marrow Transplant. 2000;26:83-89.

16. Banerjee D, Zhao SC, Li MX, Schweitzer BI, Mineishi S, Bertino JR. Gene therapy utilizing drug resistance genes: a review. Review. Stem Cells 1994;12(4):378-85.

17. Barcena A, Galy AH, Punnonen J, et al. Lyniphoid and myeloid differentiation of fetal liver CD34+ lineage- cells in human thymic organ culture. JExpMed. 1994,180:123-132.

18. Barcena A, Muench MO, Galy AH, et al. Phenotypic and functional analysis of T-cell precursors in the human fetal liver and thymus: CD7 expression in the early stages of T- and myeloid-cell development. Blood. 1993;82:3401-3414.

19. Barday A., Birkeland M., Brown M. et al. The leucocyte antigen facts book., London, Acad. Press, 1993.

20. Beecher MS, Baiocchi RA, Linett ML, et al. Expression-of the zeta protein subunit in CD3- NK effectors derived from human, thymus. Cell Immunol 1994; 155:508516.

21. Bender J.G., Unverzagt K., Walker D.E. et al.// Clin. Immunol. Immunopathol.-1994.-Vol.70.-P.'10- 18.

22. Berthou G, Legros-Maida S, Soulic A, et al. Cord- blood T lymphocytes lack constitutive perform expression in contrast to adult peripheral blood T lymphocytes. Blood. 1995;85:1540-1546.

23. Blazar BR, Taylor PA, Bluestone JA, et al. Murine gamma/delta-expressing T cells affect alloengraftment via the recognition of non-classical major histocompatibility complex class lb antigens. Blood. 1996;87:4463-4472.

24. Brent R., Fawcett L. Nutritional-studies of the embrio during-early organogenesis withnormal embryos and embryos exhibiting yolk sac dysfunction:! Pediatr., 1998; 132, S6.

25. Broxmeyer HE, Hangoc G, Cooper S, et ah Growth characteristics and expansion of human umbilical cord blood'and estimation of-its potential for transplantation in adults. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89(9):4109-13.

26. Broxmeyer HE. Questions to be answered regarding umbilical cord blood' hematopoietic stem and progenitor cells and their use in transplantation. Transfusion 1995;35(8):694-702.

27. Burgio GR, Locatelli F.// Bone Marrow Transplant.- 1997.- Vol.19, N.12.- P.l 1631168.

28. Byrne JA, Stankovic AK, Cooper MD. A novel subpopulation of primed T cells in the human fetus. J Immunol. 1994:152:3098-3106.

29. Calhoun D., Li Y., Braylan R. et. al. Assessment of the contribution of the spleen of granulocytopoiesis and erytropoiesis of the mid-gestation human fetals. Earby Hum Dev, 1996, 46,217-222.

30. Campana DJanossy G, Coustan-Smith E, et al. The expression of T cell receptor-associated proteins during T cell ontogeny in mm. J Immunol. 1989;142:57-66.

31. Cardoso AA, Li ML, Batard P, et al. Release from quiescence of CD34+ CD38-human umbilical cord blood cells reveals their potentiality to engraft adults. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90( 18):8707-11.

32. Crystal RG. Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success.1. Science 1995;270:404-410.

33. Emerson S. The regulation of hematopoiesis in the human fetal liver. Biol. Hemato. 1990, 1,21-27.

34. Endeg A., King B. Development of the human york sac. In Nogales F (ed): The Humen York Sac and York Sac tumors, Berlin, Springer-Verlag, 1993, p. 33-45.

35. Falkenburg J.H.F., Lim F.T.H. Использование пуповинной крови вместо костного мозга для аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // РМЖ 1996 - Т. 3 - № 4. - с. 24-31.

36. Fujiki Y, Fukawa K, Kameyama K, et al. Successful multilineage engraftment of human cord blood cells in pigs after in utero transplantation. Transplantation. 2003;75:916-922.

37. Furley AJ, Mizutani S.Weilbaecher K, et al. Developmentally regulated rearrangement and expression of genes encoding the T cell receptor-T3 complex. Cell. 1986;46:75-87.

38. Gaddy J, Risdon G, Broxmeyer HE. Cord blood natural killer cells are functionally and phenotypically immature but readily respond to interleukin-2 and interleukin-12. J Interferon Cytokine Res. 1995;15:527-536.

39. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. // Exp. Hematol. 2000 - 28 - 1197-205.

40. Gluckman E., Broxmeyer H.E. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbilical-cord blood //N. Engl. J. Med -2001 V.344 (24) - 1860-61.

41. Gluckman, E., Rocha, Y., Boyer-Chammard, A., et al Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the European Blood and Marrow Transplantation Group.// N Engl J Med. 1997. -337(6), 373-381.

42. Gonzalez Barca E., Querol S., Granena A.// Bone Marrow Transplant.- 1997.-Vol.20, N4,- P.333-336.

43. Harris DT, LoCascio J, Besencon FJ. Analysis of the alloreactive capacity of human umbilical cord blood: implications for graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplant. 1994:14:545-553.

44. Harris DT, Schumacher MJ, Locascio J, et al. Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 1992:89:10006-10010.

45. Harris, D. T. Experience in autologous and allogeneic cord, blood banking. J Hematother 1996 - 5(2), - 123-128.

46. Haynes BF Phenotypic characterization and ontogeny of the human thymic microenviroment. Clin Res. 1984;32:500-507.

47. Haynes BF, Martin ME, Kay HH, et al. Early events in human T cell ontogeny. Phenotypic characterization and immunohistologic localization of T cell precursors in early human fetal tissues. J Exp Med. 1988,168:1061-1080.

48. Hock RA, Miller AD. Retrrovirus-mediated transfer and expression of drug resistance genes in human hematopoietic progenitor cells. Nature 1986;320:275-277.

49. Huang S., Tertappen L., Lymphoid and myeloidg differentiation of single human CD 34+, HLA-DR+ CD38" hemapoietic stem cells. Blood, 1994, 83, 1515-1520.

50. Huyhn A., Dommergues M., Izac B. Et al. Characterization of hematopoietic progenitors from human york sacs and embryous. Blood, 1995, 86, 4474-4480.

51. Ikuta KM Nippon Rinsho.- 1998.- Vol.56, N2.- P.521-530.

52. Kelemen E., Calvo W., Fleidner T.M. Atlas of Human Hemopoietic Development. N.X., Springer-Verlag, 1979.

53. Kogler, G., Callejas, J., Hakenberg, P., et al. Hematopoietic transplant potential of unrelated cord blood: Critical issues. J Hematother 1996 - 5(2), 105-116.

54. Krangel MS.Yssel H, Brocklehurst C, et al. A distinct wave of human T cell receptor gamma/delta lymphocytes in the early fetal thymus: evidence for controlled gene rearrangement and cytokine production. J Exp Med. 1990;172:847-859.

55. Krause DS, Fackler MJ, Civin CI, May WS. CD34: Structure, Biology, and Clinical Utility. Blood 1996;87(1):1-13.

56. Lai R,Visser L.Poppema S. Postnatal changes of CD45 expression in peripheral blood T and В cells. Br J Haematol 1994:87:251-257.

57. Li MX, Banerjee D, Zhao SC, et al. Development of a retroviral constructcontaining a human mutated dihydrofolate reductase cDNA for hematopoietic stem cell transduction. Blood 1994:83(11):3403-3408.

58. Lindton B, Markling L, Ringden O, et al. Mixed lymphocyte culture of human fetal liver cells. Fetal Diagn Ther. 2000:15:71-78.

59. Lobach DF, Hensley LL, Ho W, et al. Human T cell antigen expression during early stages of fetal thymic maturation, J Immunol. 1985;135:1752-1759.

60. Migliaccio G., Migliaccio A., Petti S. et. al. Human embrionic hemopoiesis: kinetics of progenitors and precursors underlying of yolk sac-liver transition. Y. Clin. Investig. 1986, 78, 51-57.

61. Miller DG, Adam MA, Miller AD. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection published erratum appears in Mol Cell Biol 1992 Jan;12(l):433. Mol Cell Biol 1990;10(8):4239-42.

62. Moore MAS. Ex vivo expansion and gene therapy using cord blood CD34 cells. J. of Hematotherapy 1993;2:221-224.

63. Moritz T, Keller DC, Williams DA. Human cord blood cells as targets for gene transfer: potential use in genetic therapies of severe combined immunodeficiency disease. J Exp Med 1993;178(2):529-36.

64. Muench MO, Pott Bartsch EM, Chen JC, et al. Ontogenic changes in CD95 expression on human leukocytcs: prevalence of T-cclls expressing activation markers and identification of CD95-CD45RO+T-cells in the fetus. Dev Comp Immunol. 2003;27:899-914.

65. Muench MO, Rae J, Barccna A, et al. Transplantation of a fetus with paternal Thy-1+CD34+ cells for chronic granulomatous disease. Bone Mat-row Transplant. 2001;27:355-364.

66. Mychaliska GB, Muench MO, Rice HE, et al. The biology and ethics of banking fetal liver hematopoietic stem cells for in utero transplantation. J Pediatr Surg. 1998;33:394-399.

67. Pahal GS, Jauniaux E, Kinnon C, et al. Normal development of human fetal hematopoiesis between eight and seventeen weeks' gestation. Am J Obstet Gynecol. 2000;183:1029-1034.

68. PhillipsJH,HoriT,NaglerA,etal. Ontogeny of human natural killer (NK) cells: fetal NK cells mediate cytolytic function and express cytoplasmic CD3 epsilon, delta proteins. J Exp Med. 1992;175:1055-1066.

69. Porcu P, Gaddy J, Broxmeyer HE. Alloantigen-induced unresponsiveness in cord blood T lymphocytes is associated with defective activation of Ras. Proc Natl Acad Sci USA. 1998:95:4538-4543.

70. Rayfield LS, Brent L, Rodeck CH. Development of cell-mediated lympholysis in human foetal blood lymphocytes. Clin Exp Immunol. 1980:42:561-570.

71. Rcnda MC, Fecarotta E, Dieli F, et al. Evidence of alloreactive T lymphocytes in fetal liver: implications for fetal hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant. 2000;25:135-141.

72. Risdon G, Gaddy J, Horie M, et al. Alloantigen priming induces a state of unresponsiveness in human umbilical cord blood T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1995:92:2413-2417.

73. Roy V., Miller J., Verfaillie C. Phenotypic and functional characterization of committed and primitive myeloid and lymphoid hematopoietic precursors in human fetal liver. Exp. Hematol., 1997, 25, 387-392.

74. Sanchez MJ, Muench MO, Roncarolo MG, et al. Identification of a common T/natural killer cell progenitor in the human fetal thymus. JExpMed. 1994; 180:569576.

75. Sanchez MJ, Spits H, Lanier LL, et al. Human natural killer cell committed thymocytes and their relation to the T cell lineage. J Exp Med. 1993;178:1857-1866.

76. Sato K, Nagayama H.TakahashiTA. Aberrant CD3- and CD28-mediated signaling events in cord blood T cells are associated with dysfunctional regulation of Fas ligand-mediated cytotoxicity. J Immunol. 1999;162:4464-4471.

77. Schelonka RL, Raaphorst FM, Infante D, et al. T cell receptor repertoire diversity and clonal expansion in human neonates. Pediatr Res. 1998;43:396-402.

78. Scott R., Burger Umbilical Cord Blood Stem Cells- Handbook of Transfusion Medicine Academic Press 2001 - 171-178.

79. Shapiro F, Yao TJ, Raptis G, Reich L, Norton L, Moore MAS. Optimization ofconditions for ex vivo expansion of CD34+ cells from patients with stage IV Breast cancer. Blood 1994;84(10):3567-3574.

80. Stites DP Carr MC, Fudenberg HH. Ontogeny of cellular immunity in the human fetus: development of responses to phytohemagglutinin and to allogeneic cells. Cell Immunol 1974;11:257-271.

81. Sutherland HJ, Lansdorp PM, Henkelman DH, Eaves AC, Eaves CJ. Functional characterization of individual human hematopoietic stem cells cultured at limiting dilution on supportive marrow stromal layers. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87(9):3584-8.

82. Tavassoli M. Embrionic and fetal hemopoiesis: an overview. Blood Cells, 1991, 1, 269-274.

83. Tavian M., Coulombel L., Luton D. Et al. Aorta-associated CD-34+ hematopoietic cells in the early human embrio. Blood., 1996, 87, 67-72.

84. Thilaganathan B, Abbas A, Nicolaides KH. Fetal blood-natural killer cells in human pregnancy. FetalDiagn Ther. 1993,8:149-153.

85. Thomas ED. Frontiers in bone marrow transplantation. Blood Cells 1991; 17:259267.

86. Traineau R., Dal Cortivo L.// Transfiis Clin. Biol.- 1998.- Vol.5, N 1,- P.56-63.

87. Traycoff CM, Abboud MR, Laver J, Clapp DW, Srour EF. Rapid exit from GO/G1 phases of cell cycle in response to stem cell factor confers on umbilical cord blood CD34+ cells an enhanced ex vivo expansion potential. Exp Hematol 1994;22(13): 1264-72.

88. Turner C., Yeager A., Waller E. Et al. Engraftment potential of different sources of human hematopoietic progenitor cells in BNX mia. Blood. 1996, 87, 3237-3242.

89. Vormoor J, Lapidot T, Pflumio F, et al. Immature human cord blood progenitors engraft and proliferate to high levels in severe combined immunodeficient mice. Blood 1994;83(9):2489-97.

90. Vormoor J, Larochelle A, Moritz T, Murdoch B, Williams DA, Dick JE. Genetic manipulation of primitive human haematopoietic cells assayed by transplantation into SCID mice. Blood 1994;84(10, Suppl.l):254a.

91. Wagner JE, Broxmeyer HE, Byrd RL, Zehnbauer B, Smeckpeper B, Shah N, et al. Transplantation of umbilical cord blood after myeloablative therapy: analysis of engraftment. Blood 1992:79:1874-81.

92. Wagner JE. Umbilical cord blood transplantation. Transfusion 1995;35(8):619-621.

93. Wang YZ, Ning ZQ, Zhang QX. Responses of human fetal splenocytcs and thymocytes to interleukin-2 and comparison with adult peripheral blood lymphocytes. Immunol Lett. 1993:37:229-233.

94. Yurasov SV, Vladimirskaya EB, Moore MAS. Analysis of density distribution of hematopoietic stem cells in imbilical cord blood. Gematologiya I Transfuziologiya 1996, №2.