Создание клеточной тест-системы для оценки эффективности и селективности ингибиторов гистондеацетилаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Земская Анастасия Сергеевна

• Земская Анастасия Сергеевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Земская Анастасия Сергеевна

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Классификация цинк-зависимых гистондеацетилаз (НОАС)

2.2. Функциональная роль НОАС в патогенезе раковых заболеваний

2.3. Каталитический механизм деацилирования

2.4. Строение фармакофора ингибиторов НОАС (НОАО)

2.5. Методы тестирования антивирусной активности и селективности НОАО

2.5.1. Определение антивирусной активности НОАО

2.5.2. Оценка эффективности и селективности НОАО

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Культуры клеток

3.2. Ингибиторы, субстраты и антитела

3.3. Анализ селективности НОАС

3.4. Анализ жизнеспособности клеток

3.5. Вестерн-блоттинг

3.6. Конфокальная микроскопия

3.7. ПЦР в реальном времени

3.8. Определение протеасомальной активности

3.9. Анализ содержания ДНК

3.10. Оценка уровня активных форм кислорода

3.11. Создание репортерной клеточной линии, стабильно экспрессирующей LC3-GFP, с помощью лентивирусной трансдукции

3.12. Расчет коэффициента корреляции и критерия надежности

3.13. Статистический анализ данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Индукция клеточного старения в клетках линии Huh7-luc/neo

4.1.1. TGF-P1 влияет на репликацию ВГС и выживаемость клеток линии Huh7-luc/neo

4.1.2. TGF-P1 эффективно переводит в предсенесцентное состояние клетки линии Huh7-luc/neo

4.1.3. TGF-P1 активирует в клетках линии Huh7-luc/neo образование липидных капель и аутофагосом

4.2. Совместное действие TGF-P1 и блокаторов полного течения аутофагии на репликацию ВГС в клетках линии Huh7-luc/neo

4.3. Создание клеточной тест-системы для определения эффективности и селективности ингибиторов гистондеацетилаз

4.3.1. Выбор и синтез флуорогенных субстратов НОАС

4.3.2. Разработка трехсубстратной клеточной тест-системы (б3СТ8)

4.3.3. Изучение возможных причин ошибок в работе s3CTS

4.4. Оценка работоспособности s3CTS на примере антираковых препаратов гидразостата и эимбиностата

4.5. Подтверждение результатов s3CTS данными молекулярного докинга

5. ВЫВОДЫ

6. ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AMC - 7-амино-4-метилкумарин FB S - фетальная бычья сыворотка HAT - гистонацетилтрансферазы HDAC - гистондеацетилазы HDACi - ингибиторы гистондеацетилаз HDM - гистондеметилазы

MBLAC2 - металло-ß-лактамазный домен-содержащий белок 2 PBS - фосфатно-солевой буфер ProdLys - Boc-Lys-AMC

s3CTS - трехсубстратная версия системы клеточного тестирования SASP - ассоциированный со старением секреторный фенотип SIRT - сиртуины

SubAc - Boc-Lys(Ac)-AMC, субстрат для HDAC1/2/3 класса I и HDAC6 класса IIb SubPro - B oc-Lys(Pro)-AMC, субстрат для HDAC класса I SubTfa - Boc-Lys(Tfa)-AMC, субстрат для HDAC класса IIa и HDAC8/10/11 TGF-ß1 - трансформирующий фактор роста-ßl

ZBG - цинк-связывающая группа фармакофора ингибитора гистондеацетилаз

АФК - активные формы кислорода

ВГС - вирус гепатита С

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома

ДХФ - 2',7'-дихлорфлуоресцеин

КС - клеточное старение

ЛК - липидные капли

ПОД - препараты опосредованного действия

ППД - препараты прямого действия

ХГС - хроническая форма вируса гепатита С

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание клеточной тест-системы для оценки эффективности и селективности ингибиторов гистондеацетилаз»

1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность и степень разработанности темы исследования

Гистондеацетилазы (НОАС) составляют суперсемейство ферментов, деацилирующих ациллизиновые остатки белков-субстратов, и участвуют в регуляции огромного количества клеточных процессов. Отщепляя от белков-субстратов ацетильные радикалы, HDAC вызывают конденсацию хроматина и подавление экспрессии соответствующих генов. Кроме того, у различных представителей данного семейства есть и свои уникальные функции. Широкая распространенность и множественность функций НОАС играют критическую роль в организме; подавление экспрессии генов этих ферментов часто вызывает последствия в виде тяжелых заболеваний вплоть до летального исхода ещё в эмбриональном периоде [1].

Учитывая важную роль НОАС, в том числе и в патологических процессах, ингибирование этих ферментов может быть использовано в качестве терапии [ 2]. Многие ингибиторы НОАС (НОАС1) влияют на пролиферативный и метаболический статус клеток-мишеней посредством плейотропных эпигенетических эффектов, вследствие чего имеют высокий терапевтический потенциал [3]. Так, HDACi проявляют ярко выраженную активность против вируса гепатита С (ВГС) [4-8]. На практике чаще всего лечения требует хроническая форма гепатита С (ХГС) [9], когда одновременно протекают два патологических процесса — сама вирусная инфекция и вызванная ею хроническая воспалительная реакция, приводящая к старению клетки-хозяина. Стареющие клетки взаимодействуют друг с другом и с внеклеточным микроокружением, секретируя воспалительные цитокины, хемокины, факторы роста и ферменты, модифицирующие внеклеточный матрикс, тем самым способствуя развитию секреторного фенотипа, связанного со старением (SASP) [10]. Трансформирующий фактор роста-01 (TGF-P1) входит в состав SASP и обеспечивает необратимость G1-ареста в клеточном цикле, активируя Smad3/4-зависимую экспрессию ингибиторов CDK [11]. Иммуногистохимический анализ биоптатов больных хроническим

гепатитом С демонстрирует резкое увеличение концентрации TGF-P1 в перипортальных гепатоцитах по сравнению с контрольными образцами тканей печени здоровых людей [12-13]. Следует отметить, что высокие внешние концентрации TGF-P1 вызывают старение в культурах эукариотических клеток и, следовательно, данный фактор может быть использован в качестве индуктора клеточного старения. При культивировании таких клеток создаются условия, более приближенные к состоянию хронически инфицированных ВГС гепатоцитов, что позволяет получать более точные данные об антивирусной активности ИОАС1.

Наиболее важными характеристиками НОАО являются селективность и эффективность ингибирования, поскольку они определяют механизмы терапевтического действия [2]. Начиная с 1990 года для клинического применения в качестве противораковых препаратов были одобрены пять ИЭАС1: вориностат, ромидепсин, панобиностат, белиностат и туцидиностат (рисунок 1) [14].

Ромидепсин

ОН

Туцидиностат

Белиностат

ОН

Панобиностат

ОН

Вориностат

Рисунок 1. Структурные формулы одобренных к клиническому применению

ингибиторов HDAC

Помимо терапии онкологических заболеваний ингибиторы гистондеацетилаз изучались также в качестве потенциальных лекарственных средств для лечения психических расстройств [15], астмы и ХОБЛ [16], воспалительных заболеваний кишечника [17], болезни Шарко-Мари-Тута [18], малярии [19] и коронавируса SARS-CoV-2 [20], а гивиностат даже был одобрен FDA для лечения мышечной дистрофии Дюшенна [21] и дополнительно показывает эффективность в терапии болезни Альцгеймера [22]. Среди этих соединений только панобиностат и белиностат являются универсальными ингибиторами HDAC всех классов (пан-ингибиторы); все остальные соединения проявляют селективность по отношению к разным комбинациям классов HDAC. Для in vitro тестирования селективности и эффективности HDACi чаще всего используются рекомбинантные HDAC и их флуорогенные субстраты, а именно производные Boc-защищенного в-ациллизина, конъюгированного с флуоресцентным 7-амино-4-метилкумарином (AMC), или различные пептиды (некоторые из которых были впервые описаны два десятилетия назад) [23-24]. В настоящее время наиболее популярными и коммерчески доступными флуорогенными субстратами HDAC стали Boc-Lys(Ac)-AMC (субстрат для HDAC1/2/3 класса I и HDAC6 класса IIb) и Boc-Lys(Tfa)-AMC (субстрат для HDAC класса IIa и в меньшей степени для HDAC8/10/11) [25-26]. В обоих случаях ферментативное удаление ацильной группы из субстрата приводит к образованию продукта Boc-Lys-AMC (ProdLys), который после инкубации с трипсином детектируется по высвобождению интенсивно флюоресцирующего АМС [24].

Двухсубстратный метод определения селективности класса HDACi (класс I/IIb или класс IIa) применяют в сложных смесях HDAC, полученных из ядерных или клеточных лизатов. В отличие от индивидуальных рекомбинантных HDAC, клеточные лизаты содержат все классы HDAC в виде многокомпонентных комплексов, характерных для живых клеток [19; 27]. Однако сравнительное внутриклеточное тестирование HDACi с использованием только двух субстратов HDAC, а именно Boc-Lys(Ac)-AMC (SubAc) и Boc-Lys(Tfa)-AMC (SubTfa), не

позволяет различить селективность ингибиторов в отношении HDAC1/2/3 класса I и HDAC6 класса IIb.

В данной работе описывается возможность использования фактора роста TGF-ß1 для индукции клеточного старения как более характерного в случае хронически ВГС-инфицированных гепатоцитов, и изложены разработка и применение трехсубстратной версии системы клеточного тестирования (s3CTS) для корректной оценки эффективности и класс-селективности HDACi.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было создание клеточной тест-системы для оценки активности и селективности ингибиторов гистондеацетилаз.

Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить динамику влияния фактора роста TGF-ß1 на индуцирование состояния клеточного старения и оценить перспективность использования предстареющих клеток для тестирования антивирусной активности HDACi;

2. Оценить возможность совместного использования TGF-ß1 и бафиломицина А1 для моделирования ВГС-зависимого ингибирования аутофагосомно-лизосомного слияния;

3. Разработать и протестировать трехсубстратный вариант клеточной методики определения селективности HDACi и проверить универсальность разработанного подхода по отношению к различным линиям эукариотических клеток;

4. Определить аналитические возможности и ограничения разработанной системы тестирования HDACi;

5. Продемонстрировать работоспособность созданной методики для тестирования ранее не описанного производного белиностата - эимбиностата -струткура которого предполагает селективность к HDAC класса I; и подтвердить полученные результаты тестирования методами вестерн-блот анализа и молекулярного докинга.

Научная новизна

Диссертационное исследование состоит из двух основных частей: создание клеточной тест-системы для изучения антивирусного действия HDACi в условиях клеточного старения и разработка трехсубстратной версии клеточной тест-системы для тестирования ферментативной селективности новых HDACi. В ходе первой части исследования была показана способность фактора роста TGF-ß1 эффективно индуцировать процессы, характерные для состояния старения клеток (остановка клеточного цикла в G1 фазе, окислительный стресс, индукция аутофагии и, в частности, липофагии) в клетках линии Huh7-luc/neo. Было найдено объяснение негативного влияния TGF-ß1 на репликацию ВГС как результат активации липофагии. Впервые было предложено совместное использование TGF-ß1 и бафиломицина А1 для моделирования ВГС-зависимого ингибирования аутофагосомно-лизосомного слияния. В результате данного подхода наблюдалось существенное восстановление вирусной репликации.

Во второй части работы была успешно разработана трехсубстратная методика (s3CTS) определения эффективности и селективности ингибиторов HDAC с использованием флуорогенных субстратов-производных лизина и клеток линии НСТ-116. Тестирование в этих условиях позволяет в большинстве случаев достоверно определять эффективность и селективность HDACi с точностью до класса. Кроме того, было обнаружено, что нецелевое действие на цинк-зависимый фермент, металло^-лактамазу (MBLAC2), гидроксамовых ингибиторов, селективных в отношении HDAC класса IIb, приводит к ложноположительному результату тестирования. С помощью s3CTS были успешно протестированы оригинальные N'-алкилгидразидные производные белиностата - гидразостат и эимбиностат - как эффективные и селективные ингибиторы HDAC класса I, что было подтверждено данными вестерн-блот анализа и молекулярного докинга.

Теоретическая и практическая значимость

Наиболее важными характеристиками ингибиторов HDAC являются субстратная и ферментативная селективности и эффективность ингибирования,

которые в совокупности определяют механизм терапевтического действия. Данная диссертационная работа существенно расширяет набор приемов для создания клеточных тест-систем, нацеленных на поиск перспективных ингибиторов HDAC, и объясняет преимущества и недостатки различных подходов.

Фактор роста TGF-01 эффективно индуцирует процессы, характерные для ранней стадии клеточного старения, однако уровень содержания вирусного репликона падает вследствие того, что TGF-^1 даже при краткосрочном действии индуцирует общую клеточную аутофагию. Блокаторы полного течения аутофагии способны компенсировать падение репликации вируса гепатита С в присутствии TGF-^1 за счет предотвращения слияния аутофагосом с лизосомами. Клеточная тест-система с вирусным репликоном, разработанная в результате такого подхода, позволит более достоверно оценивать эффективность противовирусных препаратов для терапии хронического гепатита С.

Определение селективности ингибиторов гистондеацетилаз в настоящее время чаще всего проводится на рекомбинантных ферментах. Предложенный в работе подход с применением трех флуорогенных субстратов и клеточной линии HCT116 позволяет определить селективность потенциальных ингибиторов с точностью до класса с учетом клеточного окружения гистондеацетилаз и цитоксического действия исследуемых соединений. Использование в тест-методике клеточного супернатанта исключает стадию лизиса клеток и делает возможным малозатратный скрининг ингибиторов, недоступный для аналогичных клеточных методик или вестерн-блот анализа.

Методология и методы исследования В процессе исследования широко применялись основные подходы молекулярной биологии и цитологии, включая конфокальную микроскопию. Использовались количественные аналитические методы по определению экспрессии генов и целевых белков. В качестве модельных объектов были использованы эукариотические клетки линий HCT116, Huh7, HEK293T, HepG2, Vero E6. Для анализа индуцирования клеточного старения определялось распределение клеток по фазам клеточного цикла и уровень активных форм

кислорода, а также течение аутофагии. Клеточная активность отдельных классов HDAC оценивалась по интенсивности флуоресценции 7-амино-4-метилкумарина (АМС), получаемого в ходе двухшаговой реакции расщепления класс-селективных флуорогенных субстратов на базе структуры лизина.

Положения, выносимые на защиту

1. Фактор роста TGF-ß1 эффективно индуцирует процессы, характерные для состояния клеточного старения. Тем не менее, недостатком использования TGF-ß1 для изучения репликации ВГС в стареющих клетках является вызываемая им индукция аутофагии, в частности, липофагии, приводящая к снижению содержания вирусного репликона;

2. Комбинированное действие TGF-ß1 и бафиломицина А1 восстанавливает вирусную репликацию и может быть использовано для моделирования ВГС-зависимого ингибирования аутофагосомно-лизосомного слияния;

3. Созданная в ходе диссертационного исследования трехсубстратная методика тестирования ингибиторов HDAC в клеточном супернатанте (s3CTS) достоверно определяет эффективность и селективность ингибиторов гистондеацетилаз;

4. Перекрестное действие некоторых ингибиторов HDAC класса IIb на нецелевой цинк-зависимый фермент, металло^-лактамазу (MBLAC2), приводит к ложноположительным результатам. Данное обстоятельство является ограничением созданной трехсубстратной методики;

5. Ранее не описанное производное белиностата - эимбиностат -проявляет заложенную в его структуру селективность к HDAC класс I. Предпочтительная селективность эимбиностата к HDAC класс I подтверждена тестированием в системе s3CTS, вестерн-блот анализом, а также данными молекулярного докинга.

Личный вклад автора

Автором был выполнен основной объем экспериментальной работы, представленной в диссертации. Среди ключевых экспериментов такие как: оценка

фазы клеточного цикла, вестерн-блот анализ белков, окрашивание клеток и получение конфокальных изображений, ПЦР в реальном времени для оценки экспрессии вирусного репликона, работа с культурами эукариотических клеток. Микроскопия и анализ изображений проводились совместно с Попенко В.И. и Леоновой О.Г., оценка течения аутофагии была выполнена под руководством Далиной А.А. Автор также принимала активное участие в планировании экспериментов, анализе полученных результатов и написании научных публикаций по теме диссертации.

Объём и структура диссертации Диссертационная работы состоит из следующих разделов: «Список сокращений», «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы» (251 источник). Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 29 рисунков. Ссылки на использованную литературу даются в квадратных скобках.

Степень достоверности и апробация результатов По результатам проведенного исследования опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК. Научные результаты работы были представлены автором на 6 российских и международных конференциях.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Malikova, A.Z., Shcherbakova, A.S., Konduktorov, K.A., Zemskaya, A.S., Dalina, A.A., Popenko, V.I., Leonova, O.G., Morozov, A.V., Kurochkin, N.N., Smirnova, O.A., Kochetkov, S. N., Kozlov, M. V. Pre-Senescence Induction in Hepatoma Cells Favors Hepatitis C Virus Replication and Can Be Used in Exploring Antiviral Potential of Histone Deacetylase Inhibitors // Int. J. Mol. Sci. 2021. Vol. 22, №4559.

2. Kleymenova, A.A., Zemskaya, A.S., Kochetkov, S.N., Kozlov, M.V. In-Cell Testing of Zinc-Dependent Histone Deacetylase Inhibitors in the Presence of Class-Selective Fluorogenic Substrates: Potential and Limitations of the Method // Biomedicines. 2024. Vol.12, №1203.

3. Spirin, P., Vedernikova, V., Volkava, T., Morozov, A., Kleymenova, A., Zemskaya, A., Shyrokova, L., Porozov, Y., Glumakova, K., Lebedev, T., Kozlov, M., Prassolov, V. New and Effective Inhibitor of Class I HDACs, Eimbinostat, Reduces the Growth of Hematologic Cancer Cells and Triggers Apoptosis // Pharmaceutics. 2025. Vol.17, №416.

4. Земская А.С., Кочетков С.Н., Козлов М.В. Тестирование ингибиторов цинк-зависимых гистондеацетилаз (HDAC) // Молекулярная биология. 2025. Том 59, №5. С. 50-74.

Материалы научных конференций:

1. Земская А.С., Щербакова А.С., Кочетков С.Н., Козлов М.В. Влияние клеточного старения на репликацию вируса гепатита С // XXXIII Зимняя молодёжная международная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" 2021 года, Россия, Москва, 8 -11 февраля 2021. Стендовый доклад.

2. Земская А.С., Щербакова А.С. Связь клеточного старения и репликации вируса гепатита С // XXVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2021» Россия, Москва, 12-23 апреля 2021. Стендовый доклад.

3. Земская А.С. Связь липофагии и репликации вируса гепатита С // Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2022», Россия, Москва, 11-22 апреля 2022. Стендовый доклад.

4. Земская А.С., Щербакова А.С., Козлов М.В. Разработка флуоресцентной клеточной тест-системы для определения селективности ингибиторов гистондеацетилаз // Всероссийская конференция «Синтетическая биология и биофармацевтика», Россия, Новосибирск, 24-28 июля 2022 г. Устный доклад.

5. Земская А.С., Щербакова А.С., Козлов М.В. Разработка флуоресцентной клеточной тест-системы для определения селективности ингибиторов гистондеацетилаз // Итоговая научно- практическая конференция

ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. академика Ю.М. Лопухина ФМБА, Россия, Москва, 20 -21 декабря 2022. Стендовый доклад.

6. Земская А.С., Сольев П.Н., Кочетков С.Н., Козлов М.В. Клеточная тест-система для определения селективности ингибиторов гистондеацетилаз на основе флуорогенных субстратов // «МОБИ-ХимФарма2023», Россия, Санкт-Петербург, 24-27 апреля 2023. Устный доклад.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Классификация цинк-зависимых гистондеацетилаз (HDAC)

Гистондеацетилазы подразделяются на две основные группы: цинк-зависимые (HDAC) и NAD+-зависимые (сиртуины, SIRT, класс III). Семейство сиртуинов включает семь изоформ, из которых SIRT1 и SIRT2 преимущественно локализуются в ядре, частично присутствуя в цитозоле, SIRT3, SIRT4 и SIRT5 находятся в митохондриях, а SIRT6 и SIRT7 преимущественно располагаются в ядре [28]. В данном обзоре литературы внимание сосредоточено исключительно на цинк-зависимых HDAC, и сиртуины далее не рассматриваются.

HDAC катализируют процесс удаления ацильных групп с №-ацилированных остатков лизина в различных белковых субстратах, тогда как гистонацетилтрансферазы (HAT) выполняют обратную функцию, присоединяя ацильные группы. На основании субстратной специфичности и функциональных особенностей цинк-зависимые HDAC классифицируют на три группы: классы I, II (подразделяемый на IIa и IIb) и IV. К классу I относятся четыре изофермента — HDAC1, HDAC2, HDAC3 и HDAC8. Все они, за исключением HDAC8, локализуются исключительно в ядре, тогда как HDAC8 обнаружена также и в цитозоле. Эти ферменты играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов, преимущественно деацетилируя гистоны H3 и H4 в специфичных сайтах, таких как H3K4, H3K9, H3K27, H3K56 и H4K16 [29-30].

Изоферменты HDAC1, HDAC2 и HDAC3 входят в состав мультибелковых комплексов - Sin3, NuRD, CoREST и NCoR/SMRT. В этих комплексах деацетилазная каталитическая активность регулируется с большей эффективностью и специфичностью. Важной особенностью является присутствие в большинстве указанных комплексов гистондеметилаз (HDM), что обеспечивает синергичное воздействие HDAC и HDM на гистоны, подвергающиеся множественным модификациям, особенно в транскрипционно неактивных элементах генома [31].

Помимо гистонов, HDAC1, HDAC2 и HDAC3 проявляют высокую активность в отношении негистоновых белков, включая ключевые регуляторы клеточного цикла (BCL6, циклин D1, E2F1, Rb) и факторы транскрипции (p53, STAT3, c-MYC, NF-kB, Smad7) [1; 32]. Для HDAC8 определение специфичных субстратов служит важным инструментом для оценки активности её ингибиторов в опухолевых тканях. В частности, установлено, что HDAC8 деацетилирует белок когезионного комплекса SMC3 и супрессор опухолей ARID1A [33]. Среди HDAC класса I только HDAC8 характеризуется гиперэкспрессией при нейробластоме, что подчеркивает её значимость в патогенезе этого заболевания и позволяет рассматривать HDAC8 как перспективную мишень для разработки новых терапевтических подходов к лечению нейробластомы [34].

Учитывая ключевую роль HDAC класса I в процессах онкогенеза, эти ферменты часто рассматриваются как приоритетные мишени при разработке новых подходов к противоопухолевой терапии. Однако использование ингибиторов, избирательно подавляющих HDAC класса I, связано с развитием приобретенной устойчивости и низкой эффективностью блокировки активности HDAC, не связанной с деацетилированием. Для преодоления этих барьеров были предложены инновационные стратегии, такие как разработка бифункциональных ингибиторов с двойным механизмом действия, технологии направленной деградации белков (например, PROTAC), создание ковалентных ингибиторов, а также комбинации с другими терапевтическими агентами [35]. Эти подходы направлены на повышение селективности, эффективности и устойчивости терапевтического эффекта.

Класс IIa включает четыре изофермента — HDAC4, HDAC5, HDAC7 и HDAC9, которые выполняют преимущественно регуляторные функции. В отличие от HDAC класса I и HDAC6 (класс IIb), ферменты класса IIa характеризуются низкой эффективностью деацетилирования, что обусловлено заменой канонического остатка тирозина на гистидин в «лизиновом» канале активного центра. Кроме того, HDAC класса IIa отличаются наличием дополнительного «структурного» иона цинка, помимо каталитического, что контрастирует с

ферментами класса I [36]. Еще одно важное различие — их значительно больший молекулярный вес (120-135 кДа), по сравнению с ферментами класса I.

На сегодняшний день белковые субстраты для HDAC класса IIa достоверно не идентифицированы, что позволяет предположить, что их псевдокаталитический домен функционирует как «бромодомен», взаимодействуя с №-ацетилированными остатками лизина в белках, участвующих в процессах репарации и синтеза ДНК/РНК [37]. HDAC класса IIa обладают способностью к челночной миграции между ядром и цитоплазмой. В ядре они интегрируются в состав мультибелковых репрессорных комплексов [38], модулируя деацетилазную активность HDAC класса I и участвуя в эпигенетической регуляции в ответ на внешние сигналы. Ингибиторы HDAC класса IIa представляют потенциал для использования в монотерапии острой миелоидной лейкемии (AML) [39], в комбинированной терапии с бортезомибом для лечения рака головы и шеи [37], а также в лечении нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Хантингтона [40]. Однако разработка высокоэффективных ингибиторов HDAC класса IIa остается сложной задачей, и на данный момент известно лишь ограниченное число таких соединений. Дальнейшие исследования в этой области могут способствовать созданию новых терапевтических агентов, способных селективно модулировать активность этих ферментов и минимизировать нежелательные побочные эффекты.

Класс IIb представлен двумя изоферментами — HDAC6 и HDAC10, локализованными преимущественно в цитозоле. HDAC6, наиболее распространенный фермент этого класса, взаимодействует с широким спектром субстратов, включая белки цитоскелета такие, как тубулин и кортактин [41-42], редокс-белки, участвующие в окислительно-восстановительных процессах [43], шапероны, обеспечивающие правильную укладку белков [44], а также некоторые факторы транскрипции, влияющие на экспрессию определенных генов [45-46]. HDAC6 демонстрирует повышенную экспрессию при различных онкологических заболеваниях, включая рак легких, меланому и рак мочевого пузыря, и играет значительную роль на этапах инициации и прогрессирования опухолей [47]. Хотя

данные о терапевтической эффективности ингибиторов HDAC6 в онкологии неоднозначны, не вызывает сомнения их способность снижать инвазивность опухолевых клеток, обусловленную гиперэкспрессией HDAC6 [48].

Для повышения эффективности противораковой терапии разрабатываются двойные ингибиторы, одновременно воздействующие на HDAC6 и другие ключевые клеточные мишени, такие как циклин-зависимая киназа CDK2, бромодоменсодержащий белок BRD4, рецептор фактора роста эндотелия сосудов VEGFR и другие [49]. Помимо онкологических заболеваний, селективные ингибиторы HDAC6 показали терапевтический потенциал в лечении нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера [50], а также при идиопатическом легочном фиброзе и других патологиях [49].

В отличие от HDAC6, субстратами HDAC10 преимущественно являются ацетилированные полиамины - спермидин, путресцин и, в меньшей степени, кадаверин [51]. Кроме того, HDAC10 взаимодействует в ядре с HDAC2 и SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors), а также, вероятно, с HDAC3 в составе репрессорного комплекса SMRT, усиливая их регуляторные функции [52-53]. Показано, что HDAC10 контролирует ось MYC-POLD1 для поддержания процесса репликации ДНК и целостности генома, что может быть использовано в качестве метода лечения лимфоидных злокачественных новообразований [54]. Также опубликованы данные о том, что снижение уровня HDAC10 и, как следствие, усиление регуляции цистеин-обогащенного гликопротеина SPARC подавляет рост клеток меланомы, главным образом, путем активации передачи сигналов AMPK и индукции аутофагии [55].

К классу IV относится единственный изофермент — HDAC11 [56], который играет важную роль в регуляции метаболического гомеостаза и программировании метаболических путей [57]. Снижение активности HDAC11 у млекопитающих значительно повышает чувствительность к инсулину, улучшает толерантность к глюкозе, а также уменьшает проявления гепатостеатоза и повреждения печени. Уникальной особенностью HDAC11 является её значительно более высокая (на

четыре порядка) деацилирующая активность в отношении остатков жирных кислот с длинной цепью (С12-С18), таких как миристиновая кислота, по сравнению с субстратами, ацилированными короткоцепочечными кислотами. Это позволило исследователям классифицировать НОАС11 как №-миристоиллизин гидролазу [58]. Данные свойства делают НОАС11 перспективной мишенью для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на лечение метаболических нарушений, включая диабет и неалкогольную жировую болезнь печени. Известно, что HDAC11 аномально экспрессируется при 25 типах рака и положительно или отрицательно связана с прогнозом при различных видах рака, таких как рак толстого кишечника, рак простаты, рак молочной железы или гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) [59]. Перспективы дальнейших исследований включают создание селективных ингибиторов НОАС11, которые могут модулировать её активность с минимальными побочными эффектами, а также изучение её роли в других физиологических и патологических процессах.

2.2. Функциональная роль НОАС в патогенезе раковых заболеваний Если вирусное заболевание начинается с проникновения вируса в клетку и поддерживается работой клеточных систем, обеспечивающих репликацию вируса, то причиной ракового заболевания в ряде случаев является нарушение активности клеточных НОАС [60]. Экстремально высокая экспрессия НОАС чаще всего ассоциируется с трудноизлечимыми формами рака и плохим прогнозом у пациентов. Например, повышенная экспрессия НОАС1, НОАС2 и НОАС3 коррелировала с худшей выживаемостью пациентов с опухолями желудка и яичников [61], а повышенные уровни экспрессии HDAC8 при нейробластоме связаны с прогрессированием заболевания и негативными исходами [33-34]. Примечательно, что уровень экспрессии НОАС не является обязательным условием их влияния на развитие ракового заболевания, поскольку аномальная активность НОАС при прогрессировании рака является обычным явлением [62]. Кроме того, онкогенные фьюжн-белки ЕТО-АМЫ и РМЬ-КЛЕя задействуют НОАС1, НОАС2 и НОАС3 для формирования мультибелковых репрессорных

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Земская Анастасия Сергеевна, 2025 год

— источники HDAC

Наиболее очевидным, но в то же время и самым трудоемким и дорогостоящим источником активности HDAC для тестирования ингибиторов in vitro являются рекомбинантные ферменты [163]. Благодаря достижениям генной инженерии можно получить любую изоформу HDAC высокой чистоты, которая будет активна в реакции деацилирования in vitro. Однако при использовании для скрининга HDACi очищенных ферментов, обычно получаемых в бакуловирусной системе, данные о селективности могут существенно отличаться от результатов, полученных на HDAC из клеток млекопитающих [128]. Альтернативой, лишенной этих недостатков, служат очищенные препараты из гомогената печени крыс, ядерные экстракты или лизаты клеток HeLa [23; 164-165]. Ядерные экстракты, к примеру, применяются в коммерческих наборах как положительный контроль для HDAC класса I [18; 166]. Поскольку клеточные лизаты содержат смесь всех классов HDAC, для оценки класс-селективности ингибиторов необходимы селективные субстраты гистондеацетилаз.

Результаты тестирования ингибиторов HDAC in vitro часто отличаются от данных, полученных в клетках человека [72; 167-168]. На результаты тестирования in cellulo влияет не только ингибирование HDAC, но и ключевые характеристики потенциальных лекарств, такие как эффективность транспорта через мембраны, а также устойчивость к биотрансформации. Наиболее точные данные о класс -селективности и эффективности ингибиторов в клетках дает вестерн-блот анализ

накопления ацилированных белков, являющихся истинными субстратами НОАС [5; 169]. Реже для тестирования т cellulo используют селективные флуорогенные субстраты, хотя этот метод гораздо более производителен [18; 164; 168; 170-171]. Коммерчески доступные препараты из печени крыс, содержащие преимущественно НОАСШ/3 [170] также применяются как источник активности НОАС, но результаты тестирования с их помощью отражают только ингибирование НОАС класса I. В живых организмах селективность и активность ингибиторов НОАС обычно оценивают для изучения тканеспецифического действия препаратов [172].

— субстраты HDAC

— белки

Ацетилирование гистонов, описанное в 1964 году, было одной из первых обнаруженных посттрансляционных модификаций белков [173]. В 1968 году с помощью ион-обменной хроматографии установили, что ацетилируется аминогруппа лизина в аргинин/лизин-обогащенных фрагментах гистонов [174]. В 1969 году DeLange и соавторы показали, что в гистоне Н4 №-ацетиллизин находится в ^концевом кластере в составе пентапептида из основных аминокислот -Lys(Ac)-Arg-His-Arg-Lys(Me)- (АК 16-20) [175]. Эти данные, изначально полученные для гистона Н4, показали специфичность сайтов ацетилирования/деацетилирования. Через 10 лет было установлено, что множественное ацетилирование гистонов Н3 и Н4 в присутствии бутирата натрия вызвано ингибированием гистондеацетилаз и что это повышает чувствительность к ДНКазе I последовательностей ДНК, связанных с этими гистонами в нуклеосомах [176]. Инкубация с бутиратом натрия позволила определить все сайты ацетилирования коровых гистонов: Н2А - Ю, H2B - ^/12/15/20, Ю - 0/14/18/23, Ш - ^/8/12/16/27 [177], а также временную последовательность модификации лизинов в гистонах [178]. В настоящее время ингибирование НОАС класса I в клетках эукариот демонстрируют вестерн-блот анализом накопления Н3К9ас и/или H4K12ac [179].

После того, как были охарактеризованы субстраты HDAC класса I и разработаны соответствующие аналитические методы начались исследования белков-субстратов других классов HDAC. Список этих белков и их специфических сайтов деацетилирования продолжает расширяться, и для каждой изоформы каталитически активных HDAC уже известен свой селективный субстрат (таблица 1).

Таблица 1. Селективные белки-субстраты для изоформ HDAC классов I, IIb и IV

[42-43, 180-194]

Класс HDAC Изоформа HDAC Селективный белковый субстрат Функция Сайт модификации

I 1 и 2 Eg5/KIF11 Митоз-ассоциированный белок К890ас

MSH6 Белок репарации ошибок спаривания ДНК n/d

CDK1 Циклин-зависимая киназа n/d

LSD1 Лизин-специфичная гистондеметилаза n/d

E2F1 Транскрипционный фактор K117/120/125ac

3 RelA Субъединица фактора транскрипции №-кЬ K122/123/218/221/310ac

MEF2 Транскрипционный фактор миоцитов n/d

8 SMC3 Белок комплекса сцепления сестринских хроматид K105/106ac

ERRa (одновременно является субстратом SIRT1) Орфанный эстрогенный рецептор K129ac

ARID1A Белок-супрессор рака, компонент системы ремоделинга хроматина K1808ac

а-Тубулин Белок а,Р-димера микротрубочек K40ac

Кортактин Белок ветвления актиновых филаментов K124/161/235/309ac

Prx I Пероксиредоксин, белок K197ac

6 редокс системы

IIb Prx II Пероксиредоксин, белок редокс системы K196ac

HSP90 Белок теплового шока K294ac

MSH2 Белок репарации ошибок спаривания ДНК K845/847/871/892ac

10 MSH2 Белок репарации ошибок спаривания ДНК K73ac

IV 11 SHMT2 Серингидроксиметил-трансфераза 2 K245myr

— пептиды

Лизин-содержащие олигопептиды, содержащие различные модификации, активно применяются в качестве синтетических субстратов гистондеацетилаз при анализе ингибиторов HDAC в экспериментах in vitro и in cellulo. Селективность этих пептидных субстратов определяется, как аминокислотной последовательностью, так и природой ацильного остатка Ns-ациллизина в пептиде [58]. В ранних исследованиях в качестве субстратов HDAC использовали радиоактивно меченый фрагмент гистона H4 - Ac-Gly-Ala-Lys(3HAc)-Arg-His-Arg-Lys([H3]Ac)-Val-NH2 (АК 14-21) [195-196]. После внедрения флуоресцентного метода для оценки активности HDAC in vitro, в основном применялись ацетилированные три- и тетрапептиды из N-концевой области гистона H4 с остатком 7-амино-4-метилкумарина (АМС) на С-конце, такие как Ac-Leu-Gly-Lys(Ac)-AMC, Ac-Gly-Gly-Lys(Ac)-AMC или Ac-Arg-Gly-Lys(Ac)-AMC [24].

Следует отметить, что целенаправленный подбор последовательности аминокислот и характера ацильной группы в пептиде позволяет получать субстраты, специфичные для отдельных изоформ HDAC. Например, для анализа селективных ингибиторов HDAC2 in vitro и in cellulo использовали тетрапептид из N-концевой области гистона H4 - Boc-Lys(Me2)-Gly-Gly-Ala-Lys(Ac)-NHLH2 (АК 12-16), несущий остаток 6-амино-люциферина (NHLH2) на С-конце [197]. Для тестирования ингибиторов HDAC11 in vitro применяли тетрапептид Ac-Glu-Thr-Asp-Lys(Myr)-AMC, соответствующий фрагменту первичной последовательности дигидролипоамид S-ацетилтрансферазы (DLAT, АК 256-259) [58].

— производные лизина

В 1999 году был впервые описан минимальный субстрат HD AC — Boc-Lys(Ac)-AMC, где флуоресцентный остаток 7-амино-4-метилкумарина (AMC) выступал в качестве репортерной группы (рисунок 8) [198]. Выяснилось, что класс-селективность минимальных субстратов HDAC, основанных на производных лизина с формулой X-Lys(Acyl)-Y, определяется преимущественно структурой ацильной группы (Acyl) или С-концевой репортерной группой (Y = AMC или 4-трифлуорометильный аналог AFC), тогда как ^-защитная группа (X = Boc, Cbz или Fmoc) оказывает незначительное влияние [23; 166].

HN

о

о

о

F

Трифторацетил

Адипоил о

Boc-Lys(Acyl)-AMC

Рисунок 8. Структура флуорогенных лизиновых производных; (А) общая молекулярная структура Boc-Lys(Acyl)-AMC и (Б) важнейшие ацилъные

заместители [163]

В настоящее время субстраты с общей структурой Boc-Lys(Acyl)-AMC широко применяются для оценки активности рекомбинантных гистондеацетилаз [163]. Так, производное валериановой кислоты Boc-Lys(Val)-AMC показало высокую субстратную селективность в отношении HDAC3, что в перспективе может быть использовано для тестирования селективных ингибиторов HDAC3 в клетках (рисунки 8 и 9). Примечательно, что HDAC10 и HDAC11 не проявляли активности к минимальным субстратам.

Рисунок 9. Субстратная селективность производных Boc-Lys(Acyl)-AMC на полной панели рекомбинантных HDAC (HDAC10/H неактивны в условиях теста)

[163]

Согласно данным, полученным на рекомбинантных ферментах (рисунок 9), производные лизина с пропионильным, трифторацетильным и ацетильным остатком проявляют высокую субстратную селективность к HDAC классов I, IIa и I/IIb соответственно, что делает их пригодными для тест-систем с использованием смесей гистондеацетилаз (рисунок 9). Как отмечалось ранее, основными

субстратами HDAC10 являются ацетилированные полиамины [51]. Аналог N8-ацетилспермидина, содержащий AMC — AcNH-(CH2)4-NH-(CH2)2-CO-AMC, — успешно использовался как субстрат при скрининге ингибиторов HDAC10 in vitro [199].

—ранние методы детекции активности HDAC

Современные методы определения активности гистондеацетилаз in vitro и in cellulo используют различные субстраты и способы детекции продуктов деацилирования. Рассмотрим ключевые подходы в хронологическом порядке.

В одной из первых работ по данной тематике описано получение [Н3]-ацетил-меченых гистонов из ретикулоцитов цыплят, которые применялись для оценки активности хроматографических фракций HDAC из проростков кукурузы [200]. Накопление деацилированного субстрата определяли путем экстракции [H3]-меченого ацетата из закисленной смеси холодным этилацетатом с последующим подсчетом радиоактивности с помощью жидкостного сцинтиллятора.

Примерно в то же время были опубликованы методы изучения активности HDAC1/2 в составе комплексов Sin3 и NuRD. В первом использовался TAU-электрофорез, позволяющий разделять на одном геле моно-, ди-, три- и тетра-ацетилированные формы гистонов H2A, H2B, H3 и H4, с визуализацией полос окрашиванием кумасси [201-202]. Во втором случае субстратные свойства ацетил-гистонов в отношении комплекса NuRD изучали с помощью вестерн-блот анализа уровня ацетилирования гистонов H3 и H4 [202]. Сигнал детектировали рентгеновской пленкой, регистрирующей излучение хемилюминесцентного субстрата пероксидазы хрена.

Хотя вестерн-блот в почти современном виде был описан ещё в 1981 году [203], для анализа сайт-селективного ацетилирования гистонов он стал активно применяться с 1998 года [202]. Несмотря на удобство для изучения активности HDAC с белковыми субстратами, вестерн-блот не подходил для скринингового анализа. Поэтому был предложен синтетический флуоресцентный субстрат HDAC

на основе замещенного лизина Boc-Lys(Ac)-AMC, а также разработаны хроматографические и экстракционные методы детекции продукта Boc-Lys-AMC, близкие между собой по чувствительности и точности [23; 198].

— флуоресцентные методы определения активности HDAC

В 2003 году Wegener и соавторы опубликовали работу, радикально изменившую подходы к тестированию и скринингу ингибиторов HDAC. Авторы предложили метод, использующий известный субстрат HDAC — Boc-Lys(Ac)-AMC или его короткие пептидные аналоги, такие как Tos-Gly-Pro-Lys(Ac)-MCA, с детекцией глубины превращения по флуоресценции без необходимости разделения субстрата и продукта деацетилирования [198; 204]. Инновация метода Wegener и соавторов заключалась в применении двухстадийного метода, работающего по принципу «домино» (рисунок 10). На первой стадии HDAC воздействовали на Boc-Lys(Ac)-AMC в присутствии различных концентраций ингибитора. На второй стадии добавление трипсина обеспечивало селективное отщепление AMC от продукта деацетилирования Boc-Lys-AMC. Получившийся в результате реакции свободный 7-амино-4-метилкумарин (AMC) детектировали по флуоресценции на длинах волн 390/460 нм (возбуждение/излучение). Лизиновые производные AMC при этих длинах волн флуоресценцией не обладают.

Рисунок 10. Двухстадийный метод тестирования ингибиторов гистондеацетилаз классов ШЛ с помощью флуорогенного субстрата Boc-Lys(Ac)-AMC. Концентрация продукта Boc-Lys-AMC определяется по

о

Boc-Lys(Ac)-AMC

AMC

флуоресценции АМС на длинах волн 390 нм / 460 нм (возбуждение/излучение)

[198]

Двухстадийный метод сейчас широко применяется для тестирования селективности и силы ингибиторов HDAC in vitro с использованием рекомбинантных ферментов. Наиболее популярны коммерчески доступные флуорогенные субстраты — Boc-Lys(Ac)-AMC (селективен к HDAC1/2/3 класса I и HDAC6 класса IIb) и Boc-Lys(Tfa)-AMC (селективен к HDAC класса IIa и в меньшей степени к HDAC8/10/11) [25; 26]. Эти субстраты также используют для оценки класс-селективности ингибиторов в сложных смесях из клеточных лизатов, где присутствуют все классы HDAC в виде многокомпонентных комплексов, характерных для живых клеток [27].

Идеальным источником гистондеацетилазной активности для тестирования ингибиторов являются живые клетки, что стимулировало разработку методов in cellulo [37; 164; 170; 205-206]. Однако использование только двух субстратов — Boc-Lys(Ac)-AMC и Boc-Lys(Tfa)-AMC — не позволяет различать класс-селективность ингибиторов для HDAC1/2/3 класса I и HDAC6 класса IIb, так как Boc-Lys(Ac)-AMC является общим субстратом для обоих классов. Теоретически, применение трех субстратов, селективных к HDAC классов I, IIa и I/IIb, позволило бы точно определять класс-селективность ингибиторов в живых клетках.

— люминесцентные методы определения активности HDAC

Идея Wegener и соавторов с использованием принципа «домино» для тестирования активности HDAC была использована в люминесцентном методе HDAC-Glo, где репортерной группой выступал 6'-аминолюциферин (NH2LH2, рисунок 11) [207]. Метод, предназначенный для определения активности HDAC классов I/IIb, включал одновременное взаимодействие пептидного субстрата Boc-Gly-Ala-Lys(Ac)-NHLH2 с рекомбинантной HDAC, трипсином и люциферазой в условиях, обеспечивающих выход люциферазного сигнала на плато через 15-20 минут. Люминесцентный сигнал после суммарной реакции измеряли с помощью планшетного ридера. Основные преимущества метода — одностадийность и

высокая чувствительность, в 10-100 раз превышающая таковую флуоресцентного метода [208].

О .......N_N >.С02Н

BocGIyAla д'' "s............^ Q ......N N sc02" f

' н BocGIyAla N^JI X^J g'' s..............(

; /Й ......N N А^гН ......N N О

HD АС l/llb L IJ / 1............Люцифераза

^ -* ( Трипсин S -*

vch3 ) ---nh2lh2 l nh2lo

-i' H,N

HN,

О

BocG A-Lys( Ac)-N H LH2 BocGA-Lys-NHLH2

Рисунок 11. Тестирование ингибиторов гистондеацетилаз при синхронном

действии трех ферментов - HDAC I/IIb, трипсина и люциферазы - в присутствии люминогенного субстрата Boc-GlyAla-Lys(Ac)-NHLH2. Показан продукт деацетилирования Boc-GlyAla-Lys-NHLH2, 6'-аминолюциферин (NH2LH2) и кето-форма 6'-амино-оксилюциферина (NH2LO) [209-210]

Люминесцентный метод HDAC-Glo был затем адаптирован для определения селективности ингибиторов HDAC классов I/IIb и IIa в живых клетках с использованием хорошо проникающих в клетку коротких пептидов, содержащих №-ацилированный ацетильной или трифторацетильной группой остаток лизина, и конъюгированных с люминофором (рисунок 12) [211]. Пептидная часть субстратов основана на консенсусных последовательностях гистона H4 дрозофилы — 14-Gly-Ala-Lys-16 и 12-Lys-Gly-Gly-Ala-Lys-16 [212]. №-аминогруппу остатка Lys12 диметилировали, чтобы предотвратить расщепление трипсином связи между Lys12 и Gly13 [213].

Стоит отметить, что субстрат Boc-Lys(Me2)-Gly-Gly-Ala-Lys(Ac)-NHLH2 показал селективность к HDAC2, тогда как Boc-Lys(Me2)-Gly-Gly-Ala-Lys(Tfa)-NHLH2 — к HDAC класса IIa (рисунок 12). Таким образом, селективность субстрата определяется природой №-ацильной группы. Введение пропионильной группы в C-концевой лизин (Boc-Lys(Me2)-Gly-Gly-Ala-Lys(Pro)-NHLH2) могло бы обеспечить селективность к HDAC1/2/3 класса I, что позволило бы однозначно определять класс-селективность ингибиторов HDAC в живых клетках.

Значения Km субстратов для коммерческих тест-систем 300т

* 2004

н «

а

н и Ю

гу 100-

0

п п п

Т— Г "I-Т-Т—П-Т—П-Т—

& & (У & & & ó & ó л*

Изоформа HDAC

□ HDAC-Glo™ I/II

□ HDAC-Glo™ 11а

□ HDAC-Glo™ 2

Рисунок 12. Селективность и значения Km для каждой изоформы HDAC в трех методах HDAC-GloTM (Promega). Оптимизированная АК последовательность субстратов: HDAC-GloTM I/II - Boc-Gly-Ala-Lys(Ac)-NHLH2, HDAC-GloTM 11а -Boc-Lys(Me2)-Gly-Gly-Ala-Lys(Tfa)-NHLH2, HDAC-GloTM 2 - Boc-Lys(Me2)-Gly-Gly-

Ala -Lys (Ac) -NHLH2

Исходя из того, что основные характеристики, которые необходимо определить при скрининге ингибиторов HDAC - это эффективность и селективность ингибирующего действия, в данной работе был разработан, верифицирован и адаптирован к практическому применению трехсубстратный метод тестирования HDACi с использованием клеточных тест-систем.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Культуры клеток

Линии клеток HCT116, Huh7, HEK293T, HepG2, Vero E6 выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (BioSera, Франция), 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в присутствии 5% CO2 при 37 °C. Клетки пересевали каждые три дня в соотношении 1:3 или 1:5. Культуру Huh7-luc/neo выращивали в тех же условиях с добавлением 330 мкг/мл генетицина (G418 sulfate,

Selleckchem, Houston, TX, USA). Клетки Huh7-luc/neo, содержащие репортерный люциферазный геном репликона ВГС генотипа 1b, были любезно предоставлены профессором Ральфом Ф.В. Бартеншлягером (Гейдельбергский университет, Гейдельберг, Германия). Линии клеток Jurkat, Hut-78 и Ramos были любезно предоставлены д.б.н. Павлом Владимировичем Спириным (ИМБ имени В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия). Репортерная плазмида pLCMV-GFP-LC3B-puro и плазмиды для производства лентивирусов были любезно предоставлены д.б.н., профессором Петром Михайловичем Чумаковым (ИМБ имени В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия).

3.2. Ингибиторы, субстраты и антитела

Ингибиторы HDAC: Белиностат (S1085), Буфексамак (S3023), Некстурастат А (S7473), Панобиностат (S1030), Тацединалин/С1-994 (S2818), TMP-269 (S7324), Тубастатин А (S8049), UF010 (S5810), Вориностат (S1047) и WT161 (S8495), все были от Selleckchem (США); Cmpd13 был синтезирован, как описано в [6]. Субстраты, Boc-Lys(Ac)-AMC (4033972), Boc-Lys(Tfa)-AMC (4060676) и Boc-Lys-AMC (4033973), все были от Bachem (Швейцария). Исходные растворы тестируемых соединений (100 мМ в ДМСО, если не указано иное) серийно разбавляли ДМСО до 100-кратных концентраций; соответствующий 100-кратный раствор добавляли в каждую лунку культурального планшета в количестве 1% от его объема. Контрольные образцы обрабатывали тем же количеством ДМСО.

Антитела: мышиное анти-№3 (LS-C343002) от LSBio (Сиэтл, штат Вашингтон, США); кроличьи антигистоновые H3 (9715S) и кроличьи антиацетилированные гистоны H3 K9/14 (9677S) от CST (США); кроличьи антиацетилированные а-тубулины K40 (sab5600134), кроличье анти-NSSB (ab35586), кроличье антаЬС3В (ab51520) и мышиное анти-SQSTM1/p62 (ab56416) от Abcam (США); мышиные анти-а-тубулины (T5168) от Sigma (США). Конъюгаты пероксидазы хрена со вторичными специфическими антителами (антимышиными (sc-2005) и антикроличьими (sc-2004)) от SCBT (США).

Красители: Hoechst 33342 тригидрохлорид тригидрат (H3570), Acridine Orange (A1301), LysoTracker Red DND-99 (L7528) и Bodipy 493/503 (D3922) были получены от Invitrogen (Waltham, MA, США). Реагент для оценки количества АФК 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетат (D6883) был получен от компании Sigma (Сент-Луис, МО, США). Флуоресцентный протеасомный зонд Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS (UbiQ-018) был получен от компании UbiQ, Нидерланды.

Белок TGF-ß1 (abl 16150) был получен от Abcam (Кембридж, MA, США). Количество 5 мкг лиофилизированного продукта восстанавливали в 20 мкл 10 мМ цитрата натрия (pH 3,0), выдерживали 5 мин, разбавляли 80 л 0,2% BSA в PBS, делили на аликвоты по 10 мкл и хранили при -20 °C.

3.3. Анализ селективности HDAC

Клетки HCT 116 высевали в 96-луночные культуральные планшеты с плотностью 1,5 х 104 клеток на лунку; через 24 ч после высевания (90-100% монослоя) клетки инкубировали с различными концентрациями тестовых ингибиторов в течение 24 ч, затем три четверти объема из каждой лунки удаляли и заменяли тем же объемом среды без сыворотки, содержащим как ингибитор в той же концентрации, так и один из трех субстратов, SubAc/Pro/Tfa, в концентрации 40 мкМ (для получения итоговой концентрации 30 мкМ). После дополнительной 4-часовой инкубации аликвоты культуральной среды переносили в черную чашку, подходящую для измерения флуоресценции (SPL Life Sciences, Корея), разбавляли раствором 2 мг/мл трипсина в буфере Tris-HCl, pH = 8, и инкубировали в течение 60 мин при 37 °C. Флуоресценцию измеряли с помощью многофункционального планшетного ридера Spark (Tecan Trading, Швейцария) на длинах волн ex/em 360/470 нм.

Затем интенсивность флуоресценции в каждой лунке нормализовали по данным цитотоксичности, полученным для той же лунки. Средний нормализованный уровень флуоресценции для каждой концентрации каждого тестируемого соединения рассчитывали по приведенной ниже формуле.

RFU =

n

где Fi — значение флуоресценции в тестовой лунке, F0 — значение флуоресценции в лунке со средой и без клеток, Cv — жизнеспособность клеток, n — количество повторов.

3.4. Анализ жизнеспособности клеток

После переноса аликвоты в лунку жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ теста. В каждую лунку планшета добавляли свежеприготовленный раствор тиазолилового синего тетразолия бромида в конечной концентрации 0,4 мг/мл. Инкубацию проводили при +37°C в течение 2 ч. Среду, содержащую непрореагировавший МТТ, удаляли аспирацией. Для растворения формазана, образовавшегося в результате реакции, в каждую лунку планшета добавляли по 100 мкл изопропанола. Результат анализа оценивали с помощью спектрофотометра Tecan Spark (поглощение при 544 нм).

3.5. Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг был выполнен в основном в соответствии с ранее опубликованной процедурой [6]. Вкратце, клетки высевали в 6-луночные культуральные планшеты с плотностью 1,4 х 105 клеток на лунку, культивировали в течение 24 ч (40-50% монослоя) и обрабатывали указанными концентрациями соединений в течение указанного времени. После этого среду удаляли, а клетки промывали PBS и лизировали лизирующим реагентом (Promega, США). Белки из супернатантов разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле подходящего процента и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану обрабатывали 5% сухим молоком (Bio-Rad, США) в PBST в течение 60 мин при комнатной температуре. Первичные антитела к NS3 (1:2000), NS5B (1:5000), LC3B (1:2000), SQSTM1/p62 (1:2000), ацетилированному гистону H3 K9/14 (1:2000), гистону H3 (1:4000), ацетилированному а-тубулину K40 (1:3000) и а-тубулину (1:7000) добавляли к мембране, после чего инкубировали в течение ночи при 4 °C и промывали PBST. Соответствующий конъюгат пероксидазы хрена со вторичными

специфическими антителами (1:8000) добавляли к мембране, после чего инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем мембрану промывали PBST, и сигнал визуализировали с помощью набора ECL (Pierce Thermo Scientific, США) и системы визуализации ChemiDoc (Bio-Rad, США).

3.6. Конфокальная микроскопия

Конфокальные изображения получали на конфокальном микроскопе Leica DMI 6000B, оснащенном блоком лазерного сканирования Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Мангейм, Германия). Клетки, выращенные на покровных стеклах, обрабатывали веществами и окрашивали смесью красителей, содержащей Hoechst 33342 (Hoechst), Lysotracker Red (LTR) и Bodipy 493/503 (Bodipy) в конечных концентрациях 5 мкг/мл, 1 мкМ и 0,5 мкМ, соответственно, в течение еще 30 мин. Окрашивание акридиновым оранжевым (АО) всегда проводили отдельно. Клетки окрашивали 26 мкМ акридинового оранжевого в течение не более 5 мин. Клетки, окрашенные смесью красителей без дополнительной промывки, рассматривали под микроскопом в течение 10-20 мин, а клетки, окрашенные АО, — в течение 5-10 мин. Hoechst возбуждался при 405 нм и обнаруживался в диапазоне 417 -481 нм; LTR возбуждался при 543 нм и обнаруживался в диапазоне 555-606 нм; Bodipy возбуждался при 488 нм и обнаруживался в диапазоне 498-540 нм; АО возбуждался при 458 нм и обнаруживался в диапазонах 467-549 нм и 584-680 нм; LC3-GFP возбуждался при 488 нм и обнаруживался в диапазоне 498-540 нм.

Все изображения были получены в режиме «последовательного сканирования», чтобы полностью избежать размывания. Площади и интенсивности измеряли с помощью программы ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/, дата обращения: 21 января 2021 г.). Анализ колокализации проводили с помощью плагинов Coloc2 и JACoP [214]. Для проверки колокализации использовали набор изображений CBS001RGM-CBS010RGM из Colocalization Benchmark Source [215].

3.7. ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК выделяли из 5х105 клеток с помощью набора PerfectPure RNA Cultured Cell kit (5 Prime) и восстанавливали с помощью обратной

транскриптазы RevertAid (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) и случайных гексамерных праймеров в соответствии с протоколом производителя. Репликон ВГС и ß-актин, используемый в качестве эталона, определяли методом S YBR Green qPCR с использованием системы LightCycler® 96 (Roche). Праймерами для ß-актина были: 5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3' (смысловые), 5'-ACTCCTGCTTTGCTGATCCAC-3' (антисмысловые); праймеры для HCV (IRES) были такими: 5'-CTGTCTTCACGCAGAAAGCG-3' (смысловые), 5'-GTCCTGGCAATTCCGGTGTA-3' (антисмысловые). Изменения уровней каждой мРНК оценивали методом AACt.

3.8. Определение протеасомальной активности

Определение активности протеасом в клетках проводили, как описано ранее [216]. Флуоресценцию измеряли на цитометре BD Fortessa (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Данные анализировали с помощью программы ModFit LT (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

3.9. Анализ содержания ДНК

Клетки Huh7-luc/neo высевали с плотностью 1х105 клеток/лунку в 6-луночные культуральные планшеты (без антибиотика G418), культивировали в течение 24 ч и обрабатывали различными концентрациями исследуемых веществ в течение соответствующего времени. Клетки соскабливали в 0,5 мл PBS и фиксировали постепенным добавлением 0,5 мл холодного этанола при осторожном вихревом перемешивании. После инкубации в течение 20 мин клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляли, а клетки ресуспендировали в 0,5 мл PI-RNAse буфера (10 мкг/мл пропидий иодида и 0,1 мг/мл РНКазы А в PBS) и инкубировали в темноте в течение 20 мин. Содержание ДНК в клетках анализировали с помощью цитометра LSRFortessa (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения ModFit LT (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

3.10. Оценка уровня активных форм кислорода

Уровень внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) измеряли в клетках Huh7-luc/neo после 24 ч инкубации с соединениями. Затем удаляли среду, клетки инкубировали с 10 мкМ 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетата (ДХФ-ДА) 30 минут и промывали 10 раз 500 мкл PBS. Интенсивность флуоресценции (интенсивность ДХФ) измеряли в 200 мкл PBS с помощью ридера Plate CHAMELEON V (Hidex, Turku, Finland) с возбуждением при 485 нм и эмиссией при 535 нм.

3.11. Создание репортерной клеточной линии, стабильно экспрессирующей LC3-GFP, с помощью лентивирусной трансдукции

Клетки HEK293T, выращенные в течение 24 ч в 35-мм чашках Петри до конфлюэнтности 70-80%, трансфецировали 2,4 мкг ДНК (0,3 мкг лентивирусного вектора pLenti-CMV-GFP-LC3B-puro и упаковочных плазмид: 0. 6 мкг pCMV-Rev, 1,2 мкг pCMV-Gag, 0,3 мкг pVSV-G) с использованием 16 мкл TurboFect (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Через 4-8 ч среду заменяли 2-3 мл среды DMEM, содержащей 2% FBS. Первый запас лентивирусных частиц собирали через 36 ч, а последующие -каждые 24 ч в течение 3-4 дней и замораживали. После того как все запасы были собраны, их размораживали, фильтровали через шприцевые фильтры с низким уровнем связывания белка (TPP) с порами 0,45 мкм, делили на аликвоты по 0,5 мл и хранили при -70 °C.

Для лентивирусной трансдукции клетки Huh7 высевали в 12-луночный планшет и заражали 0,5 мл аликвоты лентивирусных частиц при конфлюэнтности 40-60 %, затем клетки высевали в большую посуду и отбирали с помощью 1 мкг/мл пуромицина до полной гибели неинфицированных контрольных клеток (3-6 дней).

3.12. Расчет коэффициента корреляции и критерия надежности

Поскольку исходные ряды Rank1 и Rank2 содержат одинаковые значения,

расчет коэффициента ранговой корреляции Спирмена проводился по формуле, включающей поправку на повторы (в этом случае идентичным вариантам присваивался средний ранг) [217]:

rs =

где п — объем выборки; d — разность рангов сопряженных значений

признаков x и у; Tx и Ty — поправки на серию повторов для каждого образца:

т _ _

х 12 У 12

где t — количество членов в каждой группе идентичных вариантов. Поправки ^ и ^ учитывают ^ и ky групп повторяющихся вариантов.

Статистическая погрешность и критерий надежности отличия коэффициента корреляции от нуля рассчитывались по формулам:

1 -г}

mr = и tr = rsmr

3.13. Статистический анализ данных

Все данные представлены как среднее и стандартное отклонение не менее трех независимых повторов. Статистическая значимость (оцененная с помощью ANOVA с апостериорным тестом Даннетта) показана на рисунках: **** (p < 0,001), *** (0,001 < p < 0,01), ** (0,01 < p < 0,05), * (0,05 < p < 0,1), ns - не значимо.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Индукция клеточного старения в клетках линии Huh7-luc/neo Клеточное старение (КС) — это процесс, приводящий чаще всего к необратимому аресту клеточного цикла, при котором клетки перестают пролиферировать, но не подвергаются апоптозу из-за активации антиапоптотических путей [218]. КС вызывается различными причинами, среди которых окислительный стресс, повышенная экспрессия онкогенов, вирусные заболевания, ДНК-повреждающая терапия рака, и, кроме того, в норме оно происходит в эмбриональном развитии, при заживлении ран и старении организма

[219]. КС развивается также при хронической инфекции вируса гепатита С за счет серьезных клеточных повреждений, вызванных, главным образом, окислительным стрессом [152]. Степень воспаления и фиброзного поражения печени пациентов, страдающих хроническим гепатитом С, коррелирует с интенсивностью процессов клеточного старения в поврежденных тканях. Однако влияние КС на репликацию вируса гепатита С (ВГС) до сих пор не изучено, хотя оно может играть крайне важную роль на поздних стадиях заболевания.

4.1.1. ТОБ-р1 влияет на репликацию ВГС и выживаемость клеток линии Н^7-

1ис/пео

Для первоначальной оценки влияния ТОБ-р1 на функционирование репликона в клетках линии ИиИ7-1ис/пео мы провели тестирование данного препарата, как это делается при скрининге соединений на антивирусную активность. Инкубация клеток в присутствии ТОБ-р1 снижала люциферазный сигнал, что является индикатором падения количества репликона. Кривая концентрации репликона в клетках монотонно падала с увеличением концентрации ТОБ-р1. Следующим шагом было измерение цитотоксического/цитостатического эффекта для данного препарата. Было показано, что кривая зависимости жизнеспособности клеток от дозы имела обратную S-образную форму, достигая наклонного плато сигнала МТТ (вырабатываемого живыми клетками) в диапазоне концентраций 0,1-1 нг/мл (рисунок 13А).

При скрининге низкомолекулярных соединений на антивирусную активность уровень люциферазного сигнала в лизате клеток ИиИ7-1ис/пео чаще всего является надежным индикатором для количества РНК ВГС [220]. Однако сложный характер действия ТОБ-р1 на сигнальные пути в клетке требовал дополнительного определения уровня вирусной РНК, чтобы получить более актуальную информацию о функционировании репликона. Оказалось, что в присутствии ТОБ-р1 баланс между содержанием репликона и люциферазы существенно менялся. Кривая содержания вирусной РНК имела обратную S-образную форму, и в то же время нормализованная кривая сигнала люциферазы

шла параллельно со смещением в сторону более низких концентраций (рисунок 13Б,В). Таким образом, если сравнивать с контролем, то ТОБ-р1 повышал содержание репликона по отношению к люциферазному сигналу в 2-2,5 раза. Полученный результат, гипотетически, можно объяснить ускорением протеасомальной деградации люциферазы. В самом деле, так как репортерная люцифераза светлячка связана с убиквитином в составе фьюжн-белка, транслируемого с первого цистрона репликона [139], то убиквитин-зависимый путь протеасомальной деградации для люциферазы выглядит наиболее предпочтительным.

ТСР-|31 (нг/мл) ТОР-Р1 (нг/мл) ТСР-р1 (нг/мл)

Рисунок 13. Тестирование TGF-в1 в культуре клеток Н^7-1ис/пео. Активность люциферазы (А, п=4) и жизнеспособность клеток (Б, п=6) измеряли, как описано

в разделе Материалы и методы. Были построены кривые нормированной на выживаемость клеток активности люциферазы и qRT-ПЦР-анализа содержания репликона (РНКВГС/мРНК актина) (п=3). Во всех случаях клетки обрабатывали определенными концентрациями ТО¥-$1 в течение 48 ч; п - количество независимых экспериментов. Статистическая значимость (оцененная с помощью 1-критерия), показана на рисунке: ** (р < 0,001), ** (0,001 < р < 0,01), * (0,01 < р < 0,05), # (0,05 < р < 0,1), т - не значимо

4.1.2. ТОБ-р1 эффективно переводит в предсенесцентное состояние клетки линии

ИиИ7-1ис/пео

Остановка пролиферации является основной отличительной чертой активации клеточного старения. Как было показано по данным проточной цитофлуориметрии, в присутствии ТОБ-р1 происходило экстраординарное накопление клеток, остановленных в G1 фазе клеточного цикла (рисунок 14). Однако подобное перераспределение клеток по фазам клеточного цикла

достигалось только через 48 часов и при концентрации фактора 10 нг/мл, несовместимой с выживанием репликона ВГС, как было показано ранее (рисунок

13).

ТСР-р1 (нг/мл)

Рисунок 14. TGF-в1 запускает программу клеточного старения в клетках Huh7-1ис/пео. А - клетки инкубировали с TGF-в1 в течение 48 часов и анализировали на распределение по клеточному циклу методом проточной цитометрии; Б - TGF-

/31 после 24-часовой инкубации индуцировал окислительный стресс, регистрируемый по образованию АФК, определяемому с помощью флуорометрии окрашенных дихлорфлуоресцеином клеток (п=5); В - конфокальные изображения

клеток, окрашенных акридиновым оранжевым, обработанных определенными концентрациями TGF-в1 (показаны в верхнем левом углу каждого изображения). Статистическая значимость (оцененная с помощью 1-критерия), показанная на рисунке: *** (р < 0,001), ** (0,001 <р < 0,01), * (0,01 <р < 0,05), # (0,05 <р <

0,1), т - не значимо

TGF-P1-индуцированное старение ассоциировано с индукцией Nox4 и накоплением АФК [11]. Cудя по усилению флуоресцентного сигнала ДХФ, уровень АФК в клетках, обработанных TGF-P1 возрастал, приблизительно, двукратно, причем, инкубация обработанных клеток совместно с 10 мМ ^ацетилцистеина

(NAC) в качестве ингибитора образования АФК значительно подавляла разгорание флуоресценции, что подтверждало специфичность наблюдаемого эффекта (рисунок 14Б).

По мере развития старения клетки претерпевают морфологические изменения - увеличивается их клеточное ядро и общий размер, происходит уплощение формы. Окрашивание клеток Huh7-luc/neo красителем акридиновый оранжевый, который флуоресцирует в зеленом диапазоне в ядре и в красном - в лизосомах, показало, что 48 часов инкубации клеток с TGF-ß1 достаточно, чтобы активировать биогенез лизосом преимущественно перинуклеарной локализации (рисунок 14В).

4.1.3. TGF-ß1 активирует в клетках линии Huh7-luc/neo образование липидных

капель и аутофагосом

Известно, что процесс формирования вирусных частиц ВГС происходит на поверхности липидных капель, интегрированных в мембранную сеть клетки. Белок core, ассоциированный с мембранами липидных капель, взаимодействует с неструктурными белками и репликативным комплексом, одновременно способствуя олигомеризации белков оболочки в капсид и упаковке вирусной РНК в зрелые вирусные частицы [221]. Изобилие и увеличенный размер липидных капель (ЛК) являются характерными признаками клеточного старения [222]. Инфекция ВГС также стимулирует биогенез ЛК, однако, делает это независимым от старения способом, а, именно, понижая экспрессию miR-122 [223].

Для оценки влияния TGF-ß1 на биогенез липидных капель и лизосом, участвующих в липидном метаболизме, проводилась их визуализация в живых клетках Huh7-luc/neo с помощью красителей Bodipy и LTR. Окрашивание клеток Huh7-luc/neo LTR и зеленым флуоресцентным трейсером Bodipy 493/503 показало, что в присутствии TGF-ß1 на фоне общего увеличения количества ЛК и ЛК-содержащих везикул, возрастает количество органелл со смешанной оранжевой флуоресценцией (LTR+Bodipy) как результат слияния лизосом с аутофагосомами утилизирующих ЛК в ходе липофагии (рисунок 15). Профиль сигнала LTR+Bodipy,

показанный под изображением, в присутствии 3 нг/мл ТОБ-р1 соответствовал ситуации, при которой в клетке за вычетом органелл слияния плотность распределения ЛК уменьшалась, также как и их диаметр.

Рисунок 15. TGF-ß1 активирует биогенез липидных капель, лизосом и их слияние в

клетках гепатомы человека. А - конфокальные изображения клеток Huh7-luc/neo, окрашенных Hoechst (синий цвет, ядро), LTR (красный цвет, лизосомы) и Bodipy (зеленый цвет, липидные капли), обработанных указанными концентрациями TGF-ß1 (T) в течение 48 часов и совместная локализация флуоресценции Bodipy и LTR, на которых показан профиль с красно-зелеными полосами под совместным изображением; Б - диаграмма рассеяния интенсивности зеленого и красного пикселей (PI) клеток и диаграмма рассеяния в интересующей области (ROI), содержащей лизосомы в клетках, показанная для концентрации TGF-ß1 3 нг/мл (А); PCC — коэффициент корреляции Пирсона; В -

площадь (мкм2 на ячейку), занимаемая зеленой меткой (ЛК) и красной меткой (лизосомы) в ячейках, показанных на рисунке А; Г - интенсивность зеленого (ЛК) и красного (лизосомы) флуорохромов; излучение на ячейку рассчитывалось как сумма интенсивностей (0-255) всех флуорохромов. Зеленые и красные пиксели в ячейке и выражены в относительных единицах измерения (RU). Площадь 1

пикселя составляет 0,0574 мкм2.

Для подтверждения активации биогенеза аутофагосом под воздействием TGF-ß1 была использована лентивирусная инфекционная система, с помощью

которой были получены клетки Huh7, стабильно экспрессирующие химерный белок GFP-LC3. Белок LC3 (ассоциированный c микротрубочками белок 1A/1B-light chain 3) представляет собой растворимый белок с молекулярной массой около 17 кДа, широко распространённый в тканях млекопитающих и клеточных культурах. Этот белок играет ключевую роль в процессе аутофагии, обеспечивая поглощение аутофагосомами цитоплазматических компонентов, включая цитозольные белки и органеллы. В ходе аутофагии цитозольная форма LC3 (LC3 -I) подвергается конъюгации с фосфатидилэтаноламином, образуя конъюгат LC3-II, который интегрируется в мембраны формирующихся аутофагосом. На следующем этапе аутофагосомы сливаются с лизосомами, формируя аутолизосомы, в которых под действием лизосомальных гидролаз происходит деградация внутриаутофагосомальных компонентов [224].

В условиях базового уровня аутофагии трансфецированные клетки Huh7, стабильно экспрессирующие химерный белок GFP-LC3, демонстрировали диффузный цитоплазматический флуоресцентный сигнал, свидетельствующий о равномерном распределении GFP-LC3 в цитозоле. Однако при обработке клеток TGF-pi наблюдалось значительное изменение характера флуоресценции: сигнал становился более интенсивным и отчетливо точечно локализованным, что происходило дозозависимым образом. Данные изменения указывали на усиление экспрессии GFP-LC3 и его релокализацию из цитозоля в мембраны аутофагосом, что является характерным признаком активации формирования аутофагосом.

Вестерн-блот анализ содержания LC3/LC3-II показал, что TGF-pi индуцирует образование аутофагосом, и в его присутствии происходит дозозависимое накопление LC3-II (см. рисунок 16). Эти данные свидетельствуют о том, что TGF-pi стимулирует биогенез аутофагосом.

Рисунок 16. TGF-fi1 активирует образование аутофагосом и индуцирует полное течение аутофагии. A - конфокальные изображения клеток Huh7 (синим окрашены ядра, зеленым - фъюжн белок GFP-LC3); B - результаты вестерн-блот анализа на содержание LC3 в клетках линии Huh7; C - результаты вестерн-блот анализа на содержание расходного белка аутофагии p62 в клетках линии Huh7. Клетки инкубировали с TGF-fi1 в течение 48 ч; для вестерн-блота в качестве контроля загрузки использовали а-тубулин. Содержание белка выражается в виде относительной интенсивности полосы LC3-II или p62 по

сравнению с полосой а-тубулина

Чтобы достоверно подтвердить, что TGF-pi активирует полное течение аутофагии в клетках Huh7, дополнительно была изучена динамика содержания белка p62/SQSTM1, который выступает в качестве «расходного» рецептора аутофагии, обеспечивающего селективную доставку цитоплазматического «груза» в аутофагосомы. Белок p62 взаимодействует с мембранным белком липидных капель ADPR, участвуя в регуляции оборота липидных капель в процессе липофагии [225]. В диапазоне концентраций TGF-pi от 0,3 до 3 нг/мл наблюдалось снижение уровня p62, которое сопровождалось увеличением содержания LC3-II (см. рисунок 16). Эти изменения коррелировали с активным протеканием липофагии.

Таким образом, совокупность полученных данных подтверждает, что TGF-pi индуцирует в клеточной линии Huh7 интенсивное течение аутофагии, включая липофагию, что оказывает значительное негативное влияние на репликацию вируса гепатита С. По нашим данным, этот эффект может быть обусловлен слиянием реплисом, локализованных в составе двухмембранных липидных везикул, с аутофагосомами и далее с лизосомами, что приводит к деградации вирусных компонентов и подавлению вирусной репликации.

4.2. Совместное действие TGF-P1 и блокаторов полного течения аутофагии на

На основании полученных данных была выдвинута гипотеза, согласно которой ингибиторы полного течения аутофагии могут компенсировать снижение репликации вируса гепатита С (ВГС) в присутствии трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-P1) за счёт предотвращения слияния аутофагосом с лизосомами.

Для уклонения от механизмов аутофагии ВГС использует ряд стратегий, включая: 1) пространственное разобщение аутофагосом и лизосом, препятствующее их взаимодействию; 2) ингибирование процессов слияния аутофагосом с лизосомами; 3) нейтрализацию содержимого лизосом, что снижает их лизисную активность. Эти механизмы позволяют вирусу частично избегать аутофагического ответа клетки, поддерживая эффективность репликации даже в условиях активации липофагии, вызванной TGF-P1. Подавление данных механизмов полезно для разработки потенциальных терапевтических подходов, направленных на усиление противовирусного эффекта аутофагии [226-228].

Чтобы оценить влияние ингибиторов слияния аутофагосом и лизосом на репликацию вируса гепатита С в присутствии TGF-P1, были протестированы три соединения: СГО-1067700 (ингибитор киназы Rab7), N^3 (ингибитор киназы Р14К2А) и бафиломицин А1 (BafA1, ингибитор ацидификации лизосом). Структурные формулы этих соединений представлены на рисунке 17.

Рисунок 17. Структурные формулы потенциальных ингибиторов аутофагосомно-лизосомного слияния

В нашем эксперименте BafA1, единственный из трех соединений, демонстрировал свойства антагониста TGF-P1: при совместном добавлении TGF-

репликацию ВГС в клетках линии Huh7-luc/neo

о

CID-1067700

NC-03

Бафиломицин А1

Р1 и BafA1 в культуру клеток Huh7 уровень люциферазного сигнала репликона в клетках превышал теоретически ожидаемое значение (рисунок 18). Согласно литературным данным, BafA1 способен восстанавливать репликацию ВГС в условиях нокаута белка р7 в системе репликона [229]. Таким образом, весьма вероятно, что BafA1 за счет снижения кислотности лизосом эффективно блокирует их слияние с аутофагосомами, предотвращая деградацию вирусных компонентов и компенсируя ингибирующее действие TGF-P1 на репликацию ВГС.

Рисунок 18. Совместное действие TGF-в1 и Ва/А1 на пролиферацию полноразмерного репликона ВГС по данным люциферазной активности

Восстановление репликации ВГС при одновременном присутствии TGF-P1 и BafA1 было подтверждено и результатами ПЦР-анализа, показавшими достоверное увеличение содержания вирусной РНК в клетках Huh7 luc/neo (рисунок 19). Как известно из литературы [230], вирусный белок р7 ВГС встраивается в мембрану лизосом и функционирует как протонный канал, повышая значения рН внутри лизосом. BafA1 также ингибирует ацидификацию лизосом, препятствуя их нормальному функционированию, что, вероятно, позволяет ему выступать антагонистом слияния аутофагосом с лизосомами, индуцированного TGF-Р1, тем самым предотвращая деградацию вирусных компонентов в аутолизосомах и

способствуя восстановлению репликации ВГС. Полученные данные указывают на сходство механизмов действия BafA1 и вирусного белка р7, а также подтверждают ключевую роль нарушения ацидификации лизосом в модуляции аутофагического ответа, что может быть использовано для дальнейшего изучения стратегий ВГС по уклонению от клеточной защиты.

о 8 ш

н

о о

S 6-1

s ® . s4

л ц

р

2-

о о

X

н

О 0

Репликон ВГС

** J

................IV" ns

— ns ***

-г

**** ****

1 - контроль

2 - пальбоциклиб 1 мкМ

3 - TGFß 1 0,3 нг/мл

4 - TGFß 1 1 нг/мл

5 - бафиломицин A1 0,3 нМ

6 - бафиломицин A1 1 нМ

7 - TGF-ß 1 0,3 нг/мл + бафиломицин A1 0,3 нМ

8 - TGF-ß 1 1 нг/мл + бафиломицин A1 0,3 нМ

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 19. Совместное действие TGF-ß1 и BafAl на пролиферацию полноразмерного репликона ВГС по данным ПЦР в реальном времени.

Результаты были нормированы на ген домашнего хозяйства GUS, инкубация составила 48 часов. Статистическая значимость (оцененная с помощью t-критерия), показана на рисунке: ** (p < 0,001), ** (0,001 < p < 0,01), * (0,01 < p <

0,05), # (0,05 < p < 0,1), ns - не значимо

Далее мы исследовали влияние совместного воздействия TGF-ß1 и BafAl на содержание лизосом и липидных капель в клетках Huh7 luc/neo, исходя из гипотезы о том, что эти два препарата оказывают противоположное влияние на процесс липофагии. Результаты, полученные с использованием конфокальной микроскопии, показали, что по сравнению с необработанным контролем под действием TGF-ßl в клетках резко возрастало число лизосом и липидных везикул (рисунок 20.2). В присутствии BafA1 число визуализированных лизосом, наоборот, резко сокращалось и происходило существенное накопление жировых капель в клетках (рисунок 20.3). Воздействие комбинации TGF-ßl и BafAl на клетки Huh7 luc/neo выражалось в многократном увеличении количества липидных капель, что указывает на синергетическое влияние обоих препаратов на накопление

липидсодержащих структур, характерное для неполного течения аутофагии и липофагии как её части (рисунок 20.4).

МооеЛ»г/1.ТЯ/ВоФру

Рисунок 20. Совместное влияние TGF-в1 и Ва/А1 на содержание липидных капель в клеткахи Н^71ис/пео; синим окрашены ядра, красным -лизосомы, зеленым -

липидные капли. 1 - контроль; 2 - ТО¥-$1 0,3 нг/мл (стрелкой показано накопление лизосом); 3 - Ва/НотустА1 0,3 нМ (стрелкой показано накопление липидных капель); 4 - ТО¥-$1 0,3 нг/мл + Ва/НотуапА1 0,3 нМ (стрелкой показано накопление липидных капель)

Интересно, что результаты, представленные на рисунках 20.3 и 20.4, демонстрируют отсутствие лизосомального окрашивания при индивидуальном воздействии Ва£А1 или совместно с TGF-P1. Механизм лизосомального накопления красителя LTR, который является липофильным амином, основан на различиях в свойствах заряженной и незаряженной форм амина. Из цитозоля (pH~7,2) краситель в нейтральной форме (LTR) легко диффундирует через мембраны лизосом. В кислой среде лизосом (рН=4-5) равновесие между незаряженными и заряженными формами LTR^LTRН+ смещается в сторону катиона, что ограничивает диффузию препарата обратно в цитозоль и приводит к его накоплению в лизосомах [231]. Ва£А1 ингибирует ацидификацию лизосом, повышая в них значения рН до уровня значений цитозоля [232], вследствие чего равновесие LTRН+^LTR смещается в сторону нейтральной формы, которая перестает удерживаться в лизосомах. Таким образом, резкий спад флуоресцентного окрашивания лизосом в присутствии LTR и BafA1 является результатом активности последнего.

Полученные результаты свидетельствуют о сложном взаимодействии TGF-Р1 и BafA1 в регуляции аутофагии и репликации ВГС. Комбинация обоих препаратов хорошо моделирует состояние хронически инфицированных ВГС гепатоцитов и может помочь достовернее оценивать эффективность противовирусных препаратов для терапии хронического гепатита С.

4.3. Создание клеточной тест-системы для определения эффективности и селективности ингибиторов гистондеацетилаз Ранее полученные в нашей лаборатории данные свидетельствуют о том, что многие селективные ингибиторы гистондеацетилаз демонстрируют высокую антивирусную активность в отношении вируса гепатита С как в пролиферирующих, так и в стареющих клетках. Этот факт представляет особый интерес, поскольку открывает новые перспективы для разработки эффективных терапевтических стратегий для лечения хронического гепатита С на поздних стадиях заболевания. Однако тестирование большого числа соединений с помощью вестерн-блот анализа оказалось трудоёмким и финансово затратным. В связи с этим была поставлена задача разработки высокопроизводительной методики для ускоренного скрининга потенциальных ингибиторов гистондеацетилаз (НОАС^, которые представляют перспективу в качестве терапевтических агентов против ВГС.

4.3.1. Выбор и синтез флуорогенных субстратов НОАС Ключевую роль в распознавании модельных субстратов НОАС разных классов с общей структурой Boc-Lys(Acyl)-AMC (SubAcyl, рисунок 8) играет ацильная группа [163]. Как отмечалось в обзоре литературы, определение селективности НОАО может быть проведено на живых клетках, используемых в качестве естественного источника НОАС, поскольку клеточные мембраны обеспечивают свободное прохождение субстратов SubAc/Tfa внутрь клетки и продукта их деацилирования из клетки наружу [170]. Важным аргументом

в пользу SubAc/Tfa как селективных субстратов НОАС являются данные о том, что гистондеацетилазы семейства SIRT деацетилируют пептиды, содержащие Ас-№-

Lys, на два порядка медленнее, чем HDAC [233], тогда как остатки Tfa-N8-Lys в модифицированных пептидах ими вообще не деацилируются [234].

В настоящее время многие №-ациллизиновые субстраты общей структуры Boc-Lys(Acyl)-AMC активно используются для определения активности рекомбинантных гистондеацетилаз [235]. Кротонильные и пропионильные производные Boc-Lys(Cro)-AMC (SubCro) и Boc-Lys(Pro)-AMC (SubPro) ранее были описаны как высокоселективные субстраты рекомбинантных HDAC класса I [163], однако оба эти соединения не являются коммерчески доступными. Использование субстратов SubCro/Pro, SubTfa и SubAc, селективных для HDAC класса I, 11а и I/IIb, теоретически позволило бы идентифицировать селективность класса любого HDACi при тестировании в живых клетках. Для реализации данного подхода в нашей лаборатории был проведен синтез SubCro/Pro. Из двух субстратов после тестирования для дальнейшей работы был выбран SubPro, так как инкубация клеток в присутствии SubCro при прочих равных условиях давала уровень флуоресцентного сигнала ProdLys в несколько раз ниже. Кроме того, стабильность субстрата с пропионильным заместителем была существенно выше, что значительно повышало воспроизводимость результатов и снижало ошибку измерения.

4.3.2. Разработка трехсубстратной клеточной тест-системы (s3CTS) 4.3.2.1. Оптимизация условий для определения активности HDAC Эукариотическую клетку можно рассматривать как природный «реактор HDAC», в котором приток синтетических субстратов на основе лизина SubAcyl и отток продукта их №-деацилирования ProdLys обеспечивается проницаемостью мембраны [170]. При выборе оптимальных условий для тестирования HDACi мы опирались на данные ряда работ [164, 170, 236], однако исключили из протокола стадию лизиса клеток и определяли активность HDAC только по содержанию ProdLys в культуральной среде. Целесообразность такого подхода была доказана в дальнейших экспериментах. Схема протокола для наглядности представлена на рисунке 21.

Рисунок 21. Схематическое представление протокола для определения эффективности и селективности HDACi

Кроме того, в протокол испытаний на этапе перехода от инкубации с ингибиторами к инкубации с субстратами и затем с трипсином мы ввели замену клеточной среды, содержащей 10% FBS, на среду, содержащую 2,5% FBS. Необходимость снизить концентрацию сыворотки в среде была обнаружена в ходе соответствующих экспериментов. Обрабатывая трипсином раствор синтетического ProdLys в среде DMEM, содержащей различные концентрации FBS, мы обнаружили, что именно процент FBS определяет кинетику накопления AMC (рисунок 22А), которая практически совпадает с кинетикой, полученной при обработке трипсином культуральных сред с разным содержанием FBS после 24-часовой инкубации клеток HCT116 с SubAc (рисунок 22Б). Падение сигнала флуоресценции, наблюдаемое на рисунках 22А и 22Б при концентрациях FBS 0% и 2,5%, можно объяснить выгоранием AMC в результате повторных измерений. Таким образом, уменьшение процента FBS позволило нам резко увеличить

активность трипсина на заключительном этапе теста и тем самым снизить в 3-10 раз концентрацию SubAcyl без заметного снижения точности метода по сравнению с более ранними протоколами [164, 170, 236].

А

SubAc + HCT116

60 90 120 150 180 Трипсин (мин)

Б

ProdLys

60 90 120 Трипсин (мин)

0% FBS 2.5% FBS 5.0% FBS 10.0% FBS

180

Рисунок 22. Влияние FBS (0, 2,5, 5 и 10%) на генерацию флуоресцентного сигнала AMC в смеси трипсина и ProdLys. А. Увеличение интенсивности флуоресценции при расщеплении ProdLys (10 мкМ) трипсином (1 мг/мл) в клеточной среде (0-10% FBS); Б. Увеличение интенсивности флуоресценции при обработке культуральной среды трипсином (1 мг/мл) после 24-часовой инкубации клеток HCT116 в присутствии SubAc (30 мкМ)

4.3.2.2. Проверка s3CTS путем тестирования HDACi известной селективности Насколько нам известно, субстратная селективность SubPro для HDAC класса

I в клеточных системах ранее не изучалась. Используя клетки рака толстой кишки

HCT116, которые проявили высокую активность HDAC в условиях тестирования,

мы показали, что деацилирование SubPro было почти полностью ингибировано в

присутствие UF010 [237] и CI-994/Tacedinaline (TAC) [238], двух селективных

ингибиторов HDAC1/2/3 (рисунок 23). Селективные ингибиторы HDAC класса IIa,

Cmpd13 [239], TMP269 [240], а также селективный ингибитор HDAC6/10 класса

IIb, Bufexamac (BUF) [171], на деацилирование SubPro не влияли.

К нашему везению, баланс активностей HDAC1/2/3 и HDAC6 в клетках НСТ116 был примерно равным, так что ингибиторы UF010 и TAC даже в высоких концентрациях снижали уровень деацетилирования SubAc не полностью, а только примерно наполовину; оставшийся вклад в деацетилирование субстрата, по-видимому, приходился на активность HDAC6 класса IIb. Соответственно, BUF

также примерно на 50% снизил силу сигнала SubAc, поскольку в его присутствии деацетилазная активность HDAC класса I не ингибировалась. Наконец, ни UF010, ни TAC, ни BUF не повлияли на уровень сигнала в случае SubTfa.

Рисунок 23. Структурные формулы класс-селективных HDACi с опубликованными данными IC50 и результаты их тестирования с использованием

s3CTS

Селективность ингибиторов TMP269 и Cmpd13 для HDAC класса IIa проявилась в почти 100%-ном падении флуоресцентного сигнала при инкубации с SubTfa и в неизменности уровня флуоресцентного сигнала в случае SubAc/Pro (Рисунок 23). Таким образом, можно утверждать, что при использовании трех

выбранных нами класс-селективных субстратов Sub

Ac/Pro/Tfa

ожидаемая класс-

селективность пяти перечисленных HDACi была однозначно подтверждена.

Следующий селективный ингибитор HDAC6/10 класса IIb, который мы протестировали, тубастатин А (TUBA) [174], неожиданно вызвал подавление флуоресцентного сигнала всех трех субстратов, примерно в одинаковой степени (рисунок 23). Этот обескураживающий результат имел фундаментальный характер и требовал дальнейшего изучения и объяснения.

4.3.2.3. Валидация s3CTS с использованием неселективных HDACi

В рамках дальнейшей валидации метода были протестированы два неселективных и один панселективный HDACi - вориностат (VOR), белиностат (BEL) и панобиностат (PAN), соответственно (рисунок 24). Мы наблюдали хорошее соответствие между результатами in cell тестирования и данными, полученными на рекомбинантных ферментах [241], что было наиболее наглядно продемонстрировано в случае VOR. Этот ингибитор, который был неактивен против HDAC класса 11а in vitro, также не подавлял деацилирование SubTfa в клетке (рисунок 24). Поскольку VOR, как и TUBA, является сильным ингибитором HDAC6/10, стало ясно, что отклонения в работе тестовой системы, наблюдаемые в случае TUBA, связаны со структурными особенностями молекулы ингибитора, а не с селективностью в отношении HDAC6/10.

Рисунок 24. Структурные формулы неселективных HDACi с опубликованными данными Ю50 и результаты их тестирования с использованием 83СТ8

Помимо селективности, s3CTS позволила корректно сравнивать активность разных HDACi между собой. Согласно полученным результатам, наиболее активным среди трех исследованных HDACi оказался PAN, что хорошо согласуется с литературными данными (рисунок 24). Заметим, что для некоторых соединений наблюдались расхождения относительной силы ингибирования HDAC разных классов с литературными значениями, что могло быть связано с различиями между условиями s3CTS и in vitro тестирования HDACi.

4.3.3. Изучение возможных причин ошибок в работе s3CTS 4.3.3.1. Комбинация ингибитора и субстрата не вызывает ингибирования

HDAC

Для установления возможной причины некорректной работы s3CTS мы изначально изучили версию прямого подавления комбинацией TUBA и SubPro активности HDAC класса I. Результаты вестерн-блот анализа показали, что совместное присутствие TUBA с любым из трех субстратов SubAcyl в клеточной среде в течение 24 ч не приводило к накоплению ацетилированного белка-субстрата, а именно гистона H3K9/14ac [6], то есть активность HDAC класса I не была ингибирована ни в одном из этих случаев (рисунок 25А). Аналогичный эксперимент, проведенный с HDAC6 в качестве положительного контроля, подтвердил нормальное накопление соответствующего ацетилированного белка-субстрата, а именно а-тубулина K40ac [6] в присутствии TUBA и каждого из субстратов SubAcyl (рисунок 25Б). Таким образом, отклонение от ожидаемой селективности TUBA в присутствии SubPro не может быть объяснено ингибированием HDAC класса I.

Рисунок 25. Вестерн-блот-анализ ингибирующего эффекта TUBA на HDAC в присутствии SubAc//Pro^fa. А. Накопление гистона H3K9/14ac, субстрата HDAC класса I. Б. Накопление а-тубулина K40ac, субстрата HDAC6 класса IIb; клетки HCT116 инкубировали в течение 24 ч в присутствии TUBA (10 мкМ) и субстрата SubAcyl (30 мкМ). Ингибитор HDAC класса I UF010 (10 мкМ) был взят в качестве положительного (А) или отрицательного (Б) контроля

4.3.3.2. Ошибки тест-системы связаны с активностью металло^-лактамазы MBLAC2

Цинк-зависимый фермент, металло^-лактамазный домен-содержащий белок 2 (MBLAC2), обладающий пальмитоил-КоА-гидролазной активностью [242], недавно был идентифицирован как нецелевой фермент для нескольких гидроксамовых HDACi, включая TUBA [243]. Мы решили исследовать, существует ли связь между неправильной производительностью s3CTS и дополнительной активностью HDACi в отношении MBLAC2. Гипотетически, причиной отклонений от нормальной работы s3CTS может быть влияние TUBA (а) на активный трансмембранный транспорт SubAcyl и/или ProdLys [244], или (б) на ферментативную модификацию ProdLys, такую как №-метилирование [245], или (в) на хранение ProdLys в лизосомах и т. д. С другой стороны, все эти процессы должны быть следствием ингибирования нецелевого, скорее всего, металлозависимого фермента. Очевидно, что положительная идентификация MBLAC2 как ключевого игрока значительно облегчит поиск клеточных процессов, ответственных за сбои в работе s3CTS.

Чтобы увеличить выборку тестируемых соединений, известных своей активностью против MBLAC2 согласно [243], для дальнейшей работы мы дополнительно выбрали два селективных ингибитора HDAC6- WT161 [246] и

Nexturastat A (NUSA) [247]. Тестирование с помощью s3CTS показало, что селективность ингибирующего действия в отношении HDACs для обоих соединений определяется неверно - в случае SubAc и SubPro наблюдалось резкое падение флуоресцентного сигнала, что более характерно для плюрипотентных HDACi (рисунок 24); кроме того, в случае NUSA было зарегистрировано двукратное снижение сигнала SubTfa (рисунок 26).

Рисунок 26. Структурные формулы HDAC6i с опубликованными данными IC50 и результаты их селективного тестирования с использованием s3CTS

Чтобы оценить, насколько надежно производительность s3CTS связана с ингибированием MBLAC2, мы рассчитали коэффициент ранговой корреляции Спирмена для небольшой выборки HDACi, которая у нас была (n=8; таблица). Первоначальное ранжирование соединений было выполнено в соответствии с опубликованными значениями аффинности взаимодействия между HDACi и MBLAC2 (pKdapp), полученными с помощью хемопротеомного конкурентного анализа [243]. Среди восьми HDACi, для которых были известны значения pKdapp, один был аминоанилидом (TAC), а семь - производными гидроксамовых кислот -бензойной кислоты (TUBA и NUSA), фенилуксусной кислоты (BUF), коричной

кислоты (BEL и PAN) и субериновой дикарбоновой кислоты (VOR и WT161). Второе ранжирование HDACi было выполнено в соответствии с параметром правильности результатов тестирования, используя двузначную шкалу «0» и «1» — правильно и неправильно соответственно (таблица 2).

Таблица 2. Ранжирование протестированных HDACi.

HDACi pKdapp* Ранг 1 Некорректность Ранг 2

BUF <4.52 2.5 0 3

TAC <4.52 2.5 0 3

VOR <4.52 2.5 0 3

BEL <4.52 2.5 0 3

PAN 5.86 5 0 3

WT 6.04 6 1 7

TUBA 6.31 7 1 7

NUSA 7.59 8 1 7

* Данные из [243].

Рассчитанный коэффициент ранговой корреляции Спирмена оказался равным rs=0.901, что для представленной выборки (n=8) соответствовало критерию надежности Стьюдента tr=5.076 и означало наличие сильной корреляции (p <0.01). Таким образом, мы получили формализованный математический аргумент в пользу того, что активность MBLAC2 необходима для правильного тестирования HDACi и, наоборот, отклонение от известной селективности ингибирования HDAC в условиях s3CTS, весьма вероятно, связано с подавлением активности MBLAC2.

Известно, что фармакологическое ингибирование MBLAC2 индуцирует биогенез экзосом и приводит к их накоплению в супернатантах клеточной культуры [243]. С другой стороны, биогенез экзосом является начальным этапом в опосредованном экзосомами оттоке лекарств, который защищает раковые клетки от токсического воздействия лекарств [248-249]. Учитывая дополнительную активность TUBA/WT161/NUSA как ингибиторов MBLAC2, нельзя исключать, что эти соединения могут усиливать опосредованный экзосомами отток гидрофобных

субстратов SubAcyl из клетки, тем самым снижая их доступность для гистондеацетилаз. В этом случае наблюдаемое падение флуоресцентного сигнала для всех трех субстратов (рисунки 23 и 26) нашло бы свое объяснение.

4.4. Оценка работоспособности s3CTS на примере антираковых препаратов

гидразостата и эимбиностата Недавно №-пропилгидразидные аналоги гидроксамовых ингибиторов пан-НОАС, таких как панобиностат и белиностат, были идентифицированы как высокоэффективные и селективные ингибиторы HDAC I класса с уникальными противораковыми свойствами [6; 250-251]. Размер пропильного заместителя в цинк-связывающей группе гидразида обеспечивает более сильное ингибирование изоформы НОАС3, в то время как более объемная бутильная группа показывает сопоставимое ингибирование изоформ НОАС1, 2 и 3 [237]. В данной работе проводилось сравнение ингибирующего действия ингибиторов НОАС белиностата и синтезированных в нашей лаборатории гидразостата и эимбиностата в концентрациях, соответствующих 1С50 и 2*1С50. Формулы соединений представлены на рисунке 27.

,он

н

.N.

Н N.

Белиностат

Гидразостат

Эимбиностат

Рисунок 27. Структурные формулы тестируемых соединений

Эффективность ингибирования HDAC оценивали по накоплению ацетилированных форм двух белковых субстратов: а-тубулина (a-TubK40ac) и гистона H3 (H3K9/14ac). Хорошо известно, что деацетилирование a-TubK40ac в основном опосредовано HDAC6 (класс IIb), в то время как деацетилирование H3K9/14ac обеспечивается преимущественно ферментами HDAC класса I.

Инкубирование клеток с пан-HDAC ингибитором белиностатом привело к значительному повышению уровня ацетилирования как а-тубулина, так и гистона H3. Напротив, гидразостат и эимбиностат избирательно ингибировали активность HDAC класса I, не оказывая существенного влияния на уровень a-TubK40ac (рисунок 28А) и усиливая только накопление H3K9/14ac (рисунок 28Б).

Селективность действия гидразостата и эимбиностата в отношении HDACs I класса была дополнительно подтверждена с помощью s3CTS. Мы показали, что деацилирование SubPro практически полностью ингибировалось в присутствии эимбиностата и гидразостата, но оба они не полностью снижали уровень деацетилирования SubAc из-за сохраняющейся активности HDAC6 класса IIb. Кроме того, ни эимбиностат, ни гидразостат не влияли на уровень сигнала в случае SubTfa (рисунок 28В). Подобная картина кривых ингибирования деацилирования SubPro/Ac/Tfa характерна для селективных ингибиторов HDAC1/2/3, например, UF010 и CI-994 (рисунок 23). Результаты тестирования белиностата подтвердили его мультипотентную ингибирующую активность с предпочтительным действием против HDACs класса I/IIb (рисунок 28В), как и было показано ранее (рисунок 24).

Рисунок 28. Данные тестирования эимбиностата в сравнении с белиностатом и гидразостатом. А - данные вестерн-блот анализа накопления a-tubK40ac на клеточных линиях Jurkat, Hut-78 и Ramos; Б - данные вестерн-блот анализа накопления H3K9/14ac на клеточных линиях Jurkat, Hut-78 и Ramos; В - данные по остаточной активности клеточных HDAC, полученные с использованием s3CTS

на клеточной линии HCT116

Так как гидразостат и эимбиностат потенциально предназначены для терапии лимфом, все эксперименты кроме оценки селективности проводились на суспензионных клеточных линиях лимфомы. Система для оценки селективности HDACi разработана для адгезионных клеток линии НСТ116, однако нами было показано, что флуоресцентный сигнал может быть получен и на других клеточных линиях. Так, в порядке убывания силы сигнала при инкубации с SubAc вслед за HCT116 следовали линии HEK293T, Huh7 и HepG2 с одинаковым уровнем сигнала и наиболее низкий сигнал показала линия Vera E6 (в шесть раз ниже, чем у HCT116). Однако, несмотря на разницу в интенсивности получаемого сигнала, все протестированные линии показали одинаковый кинетический профиль деацетилирования SubAc в зависимости от концентрации тестируемых HDACi.

4.5. Подтверждение результатов s3CTS данными молекулярного докинга

Первоначально в качестве референсной молекулы для докинга был взят белиностат. Результаты выбранных методов расчетов молекулярного докинга белиностата с HDAC3 (PDB ID: 4A69) продемонстрировали высокую аффинность данной молекулы к активному центру фермента. В частности, было продемонстрировано, что белиностат формирует стабильную координационную связь с ионом цинка (Zn2+), расположенным в каталитическом сайте белка, что является ключевым фактором для ингибирования ферментативной активности HDAC3. Анализ пространственной укладки лиганда в комплексе с HDAC3 выявил полное соответствие конформации белиностата эталонной модели, представленной в структуре 5EEN, депонированной в Protein Data Bank. Это совпадение подтверждает высокую точность и воспроизводимость примененных вычислительных подходов, включая используемые алгоритмы молекулярного докинга и выбранные параметры моделирования. Полученные данные свидетельствуют о надежности и применимости разработанных вычислительных моделей для исследования взаимодействий лигандов с HDAC3.

Значение функции, оценивающей энергию связывания белиностата с HDAC3, составило -9.117 ккал/моль, что указывает на прочное взаимодействие лиганда с активным центром белка. Анализ взаимодействий выявил образование координационной хелатной связи между карбонильной группой белиностата и ионом цинка (Ztf+) в каталитическом сайте фермента, что играет ключевую роль в стабилизации комплекса. Кроме того, были идентифицированы водородные связи с аминокислотными остатками HIS134, GLY296 и GLY143, обеспечивающие дополнительную специфичность связывания. Значительный вклад в стабилизацию комплекса вносят гидрофобные взаимодействия, а также п-п-взаимодействия с ароматическими остатками PHE144, PHE200 и HIS172, что продемонстрировано визуализацией на рисунках 29А и 29В.

АБР

Рисунок 29. Схема связывания лигандов и HDAC3 (PDB Ю 4Л69); А - белиностат, Б - эимбиностат. Позиция докинга и взаимодействие лиганда с мишенью: В -

белиностат, Г - эимбиностат

В случае эимбиностата молекулярный докинг с той же мишенью (НОАСЗ, PDB ГО: 4А69) показал более высокую энергию связывания, составившую -9,62 ккал/моль, что свидетельствует о потенциально более сильном взаимодействии с ферментом по сравнению с белиностатом. Укладка эимбиностата в активном центре белка также оказалась практически идентичной эталонной структуре 5ЕЕ^ что снова подтвердило надежность используемых вычислительных методов. Эимбиностат формирует водородные связи с остатками ASP93, GLY143 и Н^134, обеспечивая прочное закрепление лиганда в активном центре. Дополнительно были выявлены п-п-взаимодействия с остатками Н1322 и РНЕ200, а карбонильный кислород эимбиностата участвует в координации с ионом 7п2+, что аналогично способу связывания белиностата (см. рисунки 29Б и 29Г). Гидрофобные

взаимодействия также вносят существенный вклад в стабилизацию комплекса эимбиностат-HDAC3. Таким образом, сравнительный анализ результатов докинга белиностата и эимбиностата демонстрирует их общую высокую аффинность к НОАС3, с незначительным преимуществом эимбиностата по энергии связывания.

Клеточный транспорт и метаболизм гидразостата и эимбиностата, двух гомологичных соединений, должны быть очень похожи, если не идентичны. Различия в их фармакологических свойствах, вероятнее всего, определялись только сродством к активным центрам целевых HDAC I класса. Так называемые «ножные карманы», расположенные в непосредственной близости от каталитического центра, играли в данном случае определяющую роль в управлении селективностью и аффинностью №-алкилгидразидных лигандов, за счет взаимодействия алкильного фрагмента с гидрофобными аминокислотными остатками «карманов» [129]. Таким образом, тонкая настройка структуры алкильного заместителя в молекулах ингибиторов НОАС1/2/3 позволяет оптимизировать их селективность и эффективность, что открывает перспективы для разработки новых терапевтических агентов с улучшенным профилем безопасности и более целенаправленным действием на изоформы HDAC, релевантные для лечения злокачественных, неврологических, метаболических и многих других заболеваний.

5. ВЫВОДЫ

1) Показана способность фактора роста TGF-ß1 эффективно индуцировать процессы, характерные для состояния старения клеток (остановка клеточного цикла в G1 фазе, окислительный стресс, индукция аутофагии и, в частности, липофагии) в клетках линии Huh7-luc/neo;

2) Недостатком использования TGF-ß1 для тестирования антивирусной активности ингибиторов гистондеацетилаз (HDACi) в условиях клеточного старения является падение содержания вирусного репликона в результате активации липофагии;

3) Предложено совместное использование TGF-ß1 и бафиломицина А1 для моделирования опосредованного вирусом гепатита С ингибирования аутофагосомно-лизосомного слияния. В результате использования такого подхода наблюдалось существенное восстановление вирусной репликации;

4) Разработана трехсубстратная методика (s3CTS) определения эффективности и селективности ингибиторов HDAC с использованием клеток линии НСТ-116, которая позволяет в большинстве случаев достоверно определять селективность HDACi с точностью до класса;

5) Обнаружено, что нецелевое действие гидроксамовых ингибиторов HDAC класс IIb - тубастатина А, некстурастата А и WT161 - на цинк-зависимый фермент, металло^-лактамазу (MBLAC2), приводит к ложноположительному результату тестирования;

6) С помощью тест-системы s3CTS оригинальные N'-алкилгидразидные производные белиностата - гидразостат и эимбиностат - были охарактеризованы как эффективные и селективные ингибиторы HDAC класс I, что было подтверждено данными вестерн-блот анализа и молекулярного докинга.

Работа была выполнена при поддержке грантов:

- российского научного фонда (РНФ) № 23-24-00542 и № 23-64-10018;

- российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) № 20-0400504.

Автор приносит благодарность:

- к.х.н. Козлову М.В. за научное руководство;

- д.х.н. Кочеткову С.Н. за участие в работе и обсуждении результатов;

- Клейменовой А.А. за помощь в работе над s3CTS;

- Далиной А.А. за создание клеточной линии, экспрессирующий фьюжн-белок GFP-LC3;

- д.б.н. Попенко В.И. и к.б.н. Леоновой О.Г. за помощь в получении конфокальных изображений;

- к.х.н. Сольеву П.Н. за помощь в работе и техническом оснащении;

- Маликовой А.З., к.б.н. Щербаковой А.С., д.б.н. Спирину П.В., а также коллективам Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений и Лаборатории биохимии вирусных инфекций за помощь в работе.

6. ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ

[1] Witt O. et al. HDAC family: What are the cancer relevant targets? // Cancer Lett. 2009. Vol. 277, № 1. P. 8-21.

[2] Ho T. C. S., Chan A. H. Y., Ganesan A. Thirty years of HDAC inhibitors: 2020 insight and hindsight // J. Med. Chem. 2020. Vol. 63, № 21. P. 12460-12484.

[3] Hamze A. How do we improve histone deacetylase inhibitor drug discovery? // Expert Opin. Drug Discov. 2020. Vol. 15, № 5. P. 527-529.

[4] Zhou Y. et al. Histone deacetylase 3 inhibitor suppresses hepatitis C virus replication by regulating Apo-A1 and LEAP-1 expression // Virol. Sin. 2018. Vol. 33, № 5. P. 418-428.

[5] Kozlov M. V. et al. Structural isomers of cinnamic hydroxamic acids block HCV replication via different mechanisms // Eur. J. Med. Chem. 2019. Vol. 183. P. 111723.

[6] Kozlov M. V. et al. Synthesis of N'-propylhydrazide analogs of hydroxamic inhibitors of histone deacetylases (HDACs) and evaluation of their impact on activities of HDACs and replication of hepatitis C virus (HCV) // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2019. Vol. 29, № 16. P. 2369-2374.

[7] Ai T. et al. Hydroxamic acids block replication of hepatitis C virus // J. Med. Chem. 2015. Vol. 58, № 2. P. 785-800.

[8] Sato A. et al. Suppressive effect of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on hepatitis C virus replication // J. Cell. Biochem. 2013. Vol. 114, № 9. P. 1987-1996.

[9] Blackard J. T. et al. Acute hepatitis C virus infection: a chronic problem // Hepatology. 2008. Vol. 47, № 1. P. 321-331.

[10] Бородкина А. В. и др. «Социальная жизнь» стареющих клеток: что такое SASP и зачем его изучать? // Acta Naturae. 2018. Т. 10, № 1. С. 4-14.

[11] Zhang Y., Alexander P. B., Wang X. F. TGF-P family signaling in the control of cell proliferation and survival // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2017. Vol. 9, № 4. P. a022145.

[12] Gomaa W. M., Ibrahim M. A., Shatat M. E. Overexpression of cyclooxygenase-2 and transforming growth factor-beta 1 is an independent predictor of poor virological

response to interferon therapy in chronic HCV genotype 4 patients // Saudi J. Gastroenterol. 2014. Vol. 20, № 1. P. 59-65.

[13] Nelson D. R. et al. Transforming growth factor-beta 1 in chronic hepatitis C // J. Viral Hepat. 1997. Vol. 4, № 1. P. 29-35.

[14] Di Bello E. et al. Current HDAC inhibitors in clinical trials // Chimia. 2022. Vol. 76, № 5. P. 448-453.

[15] Schroeder F. A. et al. A selective HDAC 1/2 inhibitor modulates chromatin and gene expression in brain and alters mouse behavior in two mood-related tests // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 8. P. e71323.

[16] Zwinderman M. R. H., de Weerd S., Dekker F. J. Targeting HDAC complexes in asthma and COPD // Epigenomes. 2019. Vol. 3, № 3. P. 19.

[17] Li C. et al. Histone deacetylase in inflammatory bowel disease: novel insights // Ther. Adv. Gastroenterol. 2025. Vol. 18. P. 17562848251318833.

[18] Shen S. et al. Bicyclic-capped histone deacetylase 6 inhibitors with improved activity in a model of axonal Charcot-Marie-Tooth disease // ACS Chem. Neurosci. 2016. Vol. 7, № 2. P. 240-258.

[19] Potluri V. et al. Discovery of FNDR-20123, a histone deacetylase inhibitor for the treatment of Plasmodium falciparum malaria // Malar. J. 2020. Vol. 19, № 1. P. 365.

[20] Omidkhah N., Hadizadeh F., Ghodsi F. HDAC inhibitors against SARS-CoV-2 // Lett. Drug Des. Discov. 2024. Vol. 21, № 1. P. 2-14.

[21] Aartsma-Rus A. Histone deacetylase inhibition with givinostat: a multi-targeted mode of action with the potential to halt the pathological cascade of Duchenne muscular dystrophy // Front. Cell Dev. Biol. 2025. Vol. 12. P. 1514898.

[22] Gao Q. C. et al. A promising drug repurposing approach for Alzheimer's treatment: Givinostat improves cognitive behavior and pathological features in APP/PS1 mice // Redox Biol. 2024. Vol. 78. P. 103420.

[23] Heltweg B., Jung M. A microplate reader-based nonisotopic histone deacetylase activity assay // Anal. Biochem. 2002. Vol. 302, № 2. P. 175-183.

[24] Wegener D. et al. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening // Chem. Biol. 2003. Vol. 10, № 1. P. 61-68.

[25] Bradner J. E. et al. Chemical phylogenetics of histone deacetylases // Nat. Chem. Biol. 2010. Vol. 6, № 3. P. 238-243.

[26] Schweipert M., Amurthavasan A., Meyer-Almes F. J. Continuous enzyme activity assay for high-throughput classification of histone deacetylase 8 inhibitors // Explor. Target. Anti-tumor Ther. 2023. Vol. 4, № 3. P. 447-459.

[27] Fan J. et al. Ischemic preconditioning, retinal neuroprotection and histone deacetylase activities // Exp. Eye Res. 2016. Vol. 146. P. 269-275.

[28] Carafa V. et al. Sirtuin functions and modulation: from chemistry to the clinic // Clin. Epigenetics. 2016. Vol. 8. P. 61.

[29] Bure I. V., Nemtsova M. V., Kuznetsova E. B. Histone modifications and non-coding RNAs: mutual epigenetic regulation and role in pathogenesis // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23, № 10. P. 5801.

[30] Wang Z. A. et al. Histone H2B deacylation selectivity: exploring chromatin's dark matter with an engineered sortase // J. Am. Chem. Soc. 2022. Vol. 144, № 8. P. 33603364.

[31] Hayakawa T., Nakayama J. Physiological roles of class I HDAC complex and histone demethylase // J. Biomed. Biotechnol. 2011. Vol. 2011. P. 129383.

[32] Glozak M. A. et al. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins // Gene. 2005. Vol. 363. P. 15-23.

[33] Rettig I. et al. Selective inhibition of HDAC8 decreases neuroblastoma growth in vitro and in vivo and enhances retinoic acid-mediated differentiation // Cell Death Dis. 2015. Vol. 6, № 2. P. e1657.

[34] Oehme I. et al. Histone deacetylase 8 in neuroblastoma tumorigenesis // Clin. Cancer Res. 2009. Vol. 15, № 1. P. 91-99.

[35] Huang Z. et al. Overview of class I HDAC modulators: inhibitors and degraders // Eur. J. Med. Chem. 2024. Vol. 276. P. 116696.

[36] Bottomley M. J. et al. Structural and functional analysis of the human HDAC4 catalytic domain reveals a regulatory structural zinc-binding domain // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, № 39. P. 26694-26704.

[37] Asfaha Y. et al. 5-(Trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazole (TFMO)-based highly selective class IIa HDAC inhibitors exhibit synergistic anticancer activity in combination with bortezomib // Eur. J. Med. Chem. 2024. Vol. 263. P. 115907.

[38] Agarwal R. et al. Structure-based identification of novel histone deacetylase 4 (HDAC4) inhibitors // Pharmaceuticals. 2024. Vol. 17, № 7. P. 867.

[39] Urwanisch L. et al. The class IIa histone deacetylase (HDAC) inhibitor TMP269 downregulates ribosomal proteins and has anti-proliferative and pro-apoptotic effects on AML cells // Cancers. 2023. Vol. 15, № 4. P. 1039.

[40] Stott A. J. et al. Evaluation of 5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazole-based class IIa HDAC inhibitors for Huntington's disease // ACS Med. Chem. Lett. 2021. Vol. 12, № 3. P. 380-388.

[41] Hubbert C. et al. HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase // Nature. 2002. Vol. 417, № 6887. P. 455-458.

[42] Zhang X. et al. HDAC6 modulates cell motility by altering the acetylation level of cortactin // Mol. Cell. 2007. Vol. 27, № 2. P. 197-213.

[43] Parmigiani R. B. et al. HDAC6 is a specific deacetylase of peroxiredoxins and is involved in redox regulation // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. Vol. 105, № 28. P. 9633-9638.

[44] Kovacs J. J. et al. HDAC6 regulates Hsp90 acetylation and chaperone-dependent activation of glucocorticoid receptor // Mol. Cell. 2005. Vol. 18, № 5. P. 601-607.

[45] de Ruijter A. J. et al. Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family // Biochem. J. 2003. Vol. 370, Pt 3. P. 737-749.

[46] Thakur N. et al. Smad7 enhances TGF-ß-induced transcription of c-Jun and HDAC6 promoting invasion of prostate cancer cells // iScience. 2020. Vol. 23, № 9. P. 101470.