Создание трансгенных линий белокочанной капусты с новыми агротехническими свойствами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Грибова, Татьяна Николаевна

• Грибова, Татьяна Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Грибова, Татьяна Николаевна

Список иллюстраций.

Список сокращений.

1. Актуальность проблемы.

2. Цели и задачи работы.

3. Научная новизна.

4. Обзор литературы.

4.1. Селекция капусты белокочанной. Сорта и гибриды.

4.2. Трансгеноз как новый метод селекции растений.

4.2.1. Трансформация Brassica oleracea сегодня.

4.2.2. Техника трансформации.

4.2.3. Маркерные гены.

4.2.4. Регуляторныс последовательности.

4.2.5. Агробактериальная трансформация.

4.2.6. Прямой перенос генов.

4.2.7. Наследование трансгенов у генетически модифицированных растений.

4.3. . Факторы, влияющие на эффективность трансформации.

4.3.1. Бактериальные штаммы и генотип растений.

4.3.2. Тип экспланта.

4.3.3. Оптимальные условия ко-культивирования.

4.3.4. Отбор трансформированных клеток.

4.3.5. Регенерация и снижение стрессовых факторов.

4.3.6. Характеристика трансформантов и экспрессия трансгенов.

4.4. Исследование геномного окружения сайтов интеграции Т-ДНК.

4.4.1. Метод обратной ПЦР (Inverse PCR).

4.4.2. Метод быстрой амплификации геномных окончаний (Rapid amplification of genomic ends - RAGE).

4.4.3. TAIL-PCR.

4.4.4. Метод AL-PCR (adaptor ligation PCR).

5. Материалы и методы.

5.1. Линии капусты, использованные в работе.

5.2. Методы ведения культуры in vitro.

5.2.1. Стерилизация семян.

5.2.2. Среды, использованные в работе для поддержания растений культуры in vitro и трансформационного процесса.

5.2.3. Состав и методика приготовления компонентов питательных сред.

5.2.4. Определение оптимальной концентрации селективного агента.

5.2.5. Подбор концентрации селективного агента для анализа поколений трансгенных растений.

5.2.6. Обработка проростков поколения Т1 раствором гербицида «Баста».

5.3. Создание вектора рВаг на основе плазмиды pBIBar.

5.3.1. Методика выделения плазмидной ДНК.

5.3.2. Рестрикция вектора.

5.3.3. Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля.

5.3.4. Лигирование вектора.

5.3.5. Методика приготовления компетентных клеток.

5.3.6. Трансформация E.coli лигированным вектором.

5.3.7. Трехродительская коньюгация.

5.4. Культура агробактерии.

5.4.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

5.4.2. Состав и способы приготовления среды для культивирования агробактериальных штаммов.

5.4.3. Наращивание агробактериалыюй культуры для трансформации.

5.5. Статистический анализ.

5.5.1. Дисперсионный анализ однофакторного опыта.

5.5.2. Наименьшая существенная разница.

5.5.3. Оценка соответствия между наблюдаемыми и ожидаемыми теоретическими) распределениями по критерию

5.6. Методика выделения растительной ДНК.

5.7. Методика проведения ПЦР.

5.7.1. Состав реакционной смеси для НЦР:.

5.7.2. Анализ продуктов НЦР.

5.8. Методика проведения дот-блот гибридизации.

5.9. Методика проведения AL-PCR.

5.9.1. Рестрикция геномной ДНК.

5.9.2. Конструирование специфических адаптеров и лигирование адаптеров с рестрикциоиной смесью.

5.9.3. Проведение ПЦР.

5.9.4. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля.

5.9.5. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР.

6. Результаты.

6.1. Конструирование вектора рВаг для трансформации капусты белокочанной.

6.2. Разработка схемы селекционного процесса с участием трансгенной составляющей.

6.3. Получение трансгенных растений капусты белокочанной, устойчивых к гербициду фосфинотрицину.

6.3.1. Изучение регенерационнои способности различных типов эксплаитов.

6.3.2. Изучение влияния фитогормонов на регенерационную способность линий капусты белокочанной.

6.3.3. Определение оптимальной концентрации селективного агента.

6.4. Первичный молекулярный анализ трансгенных растений капусты белокочанной.

6.4.1. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи ПЦР-анализа.

6.4.2. Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи дот-блот гибридизации.

6.4.3. Трансформация четырех линий капусты белокочанной.

6.5. Определение количества копий трансгенной вставки методом AL-PCR.

6.5.1. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДПК с 5' конца (правая граница Т-ДНК).

6.5.2. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДНК с 3' конца (левая граница Т-ДНК).

6.6. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений.

6.6.1. Расщепление в первом семенном поколении от самоопыления трансгенного растения.

6.6.2. Расщепление в первом семенном поколении от скрещивания трансгенного растения со стерильной родительской формой.

6.7. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений на проявление признака устойчивости в условиях in vivo.

7. Выводы.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Грибова, Татьяна Николаевна

7. Выводы

1. Выявлены различия в реакции генотипов четырех линий капусты белокочанной отечественной селекции Гэс 2, Мег-2, Зму 7, Дрв 2 на воздействие фитогормонов в процессе регенерации. Эффективность регенерации 86,7% для линии Гэс 2 и 81,5% для линии Зму 7 достигается при содержании в питательной среде 6-БАП - 2 мг/л и кинетина - 1 мг/л; 63,2% для линии Мег-2 - при концентрации борной кислоты -150 мг/л, 6-БАП - 2 мг/л и кинетина - 1 мг/л; и 74,7% для линии Дрв 2 - 6-БАП 0,5 мг/л.

2. Получено 26 трансгенных растений четырех линий Гэс 2, Мег-2, Зму 7, Дрв 2, экспрессирующих ген bar, которые включены в схему селекционного процесса по созданию трансгенного гибрида капусты белокочанной, устойчивого к гербицидам на основе фосфинотрицина.

3. Эффективность трансформации для линий Гэс 2 и Зму 7 составляет 7,1%; для линии Мег-2 - 5,5% и для линии Дрв 2 - 10,9%.

4. В процессе переноса Т-ДНК в геном растения №3117 (линия Мег-2) произошла делеция участка 3' конца Т-ДНК, включая левую границу, не влияющая на функциональное проявление трансгена.

5. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие Т-ДНК растения №3117, гомологичны с известными нуклеотидными последовательностями «GenBank» растительного происхождения (Brassica napus var. napus, Brassica rapa var. pekinensis, Arabidopsis thaliana ), что указывает па интеграцию трансгена в геном растения.

6. При самоопылении трансгенных растений доля устойчивых растений к неустойчивым распределяется как 1:3, причем устойчивые растения, являются гомозиготными по гену bar. При скрещивании трансгенных растений с ЦМС формами расщепление соответствует 1:1.

7. Разработанная схема селекционного процесса с участием трансгенной компоненты позволяет избежать не контролируемый выпуск в окружающую среду трансгенной пыльцы, поскольку основана на использовании линий с ЦМС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Грибова, Татьяна Николаевна, 2006 год

1. Alt-Morbe J, Nedderman P, Von Lintig J, Weiler E, Schroder J. Temperature-sensitive step in Ti-plasmid virregion induction and correlation with cytokinin secretion by Agrobactcria // Molecular Genomics and Genetics. 1989. N. 213. P. 1-8.

2. Arumuganathan K., Earle E. Nuclear DNA content of some important plant species // Plant Molecular Biology. 1991. V. 9. P. 208-218.

3. Axelsson et al. 2000, Genome, 43:679-688

4. Breclin C, Chalot F, Botton E, Jouanin L, Dore C. Potential use of the aux2 gene from Agrobacterium rhizogencs as a conditional negative marker in transgenic cabbage // Transgenic Research. 1993. N. 2. P. 48-55.

5. Berthornieu P, Jouanin L. Transformation of rapid cycling cabbage (Brassica olcracea var. capitata) with Agrobacterium rhizogencs // Plant Cell Report. 1992. N. 11. P. 334-338.

6. Berthornieu P, Breclin C, Chariot F, Dorre C, Jouanin L. Routine transformation of rapid cycling cabbage (Brassica oleracea)-molecular evidence for regeneration of chimeras // Plant Science. 1994. N. 96. P. 223-235.

7. Birboim H., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmids // Nuclear Acid Research. 1979. V.7. P. 1513-1523.

8. Brasileiro A, Leplre J, Muzzin J, Ounnoughi D, Michel M, Jouanin L. An alternative approach for gene transfer in trees using wild-type Agrobacterium strains // Plant Molecular Biology. 1991. N. 17. P. 441-452.

9. Braun A. Thermal studies on the factors responsible for tumor initiation in crown gall // Am J Botany. 1947. V. 34. P. 234-240.

10. Braun A. A physiological basis for autonomous growth of the crown-gall tumor cell // Proc Natl Acad Sci USA. 1958. V. 44. P. 344349.

11. Brukhin V., Clapham D., Elfstrand M., von Arnold S. Basta tolerance as a selectable and screening marker for transgenic plants of Norway spruce // Plant Cell Reports. 2000. V. 19. N. 9. P.899-903.

12. Budar F., Thia-Toongf, Montagu van M. Agrobaktcriu?n-mcd'mtcd gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T-DNA as a single Mendelian factor// Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.

13. Campisi L, Yang Y., Yi Y., Heilig E, Herman B, Cassista A. Generation of enhancer trap lines in Arabidopsis and characterization of expression patterns in the inflorescence // Plant Journal. 1999. V. 17. P. 699-707.

14. Christey MC, Sinclair BK. Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala) rape (В. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation // Plant Science. 1992. N. 87. P. 161-169.

15. Colby S, Juncosa A, Meredith C. Cellular differences in Agrobacterium susceptibility and regenerative capacity restrict the development of transgenic grapevines // Journal American Society Horticultural Science. 1991. N. 116. P. 356-361.

16. Choi Y., Noh E., Han M., Son S. Adaptor-aided PCR to identify T-DNA junctions in transgenic plants // BioTechniques. 1999. V. 27. P. 222-226.

17. Cheng M., Jarret R., Li Z., Demski J. Expression and inheritance of foreign genes in transgenic peanut plants generated by Agrobacterium-mediated transformation // Plant Cell Report. 1997. V.16. P. 541544.

18. Collins F., Weissman S. Directional cloning of DNA fragments at a large distance from an initial probe: a circularization method // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984 V.81. P. 6812-6816.

19. Cormack R., Somssich I. Rapid amplification of genomic ends (RAGE) as a simple method to clone flanking genomic DNA// Gene. 1997. V. 194. P. 273-276.

20. David С, Tempre J. Genetic transformation of cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) by Agrobacterium rhizogencs // Plant Cell Report. 1988. N. 7. P. 88-91.

21. De Block M, De Brouwer D, Tenning P. Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of bar and neo genes in transgenic plants // Plant Physiology. 1989. N. 91. P. 694-701.

22. De Buck S., De Wilde C., Montagu van M., Depicker A. T-DNA vector backbone sequences are frequently integrated into the genome of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation // Mol. Breed. 2000. V. 6. P. 459-468.

23. Delzer B, Somers D, Orf J. Agrobacterium tumefaciens susceptibility and plant regeneration of 10 soybean genotypes in maturity groups 00 to II // Crop Science. 1990. N. 30. P. 320-322.

24. Deroles S.C. Gardner R.C. Analysis of the T-DNA structure in a large number of transgenic petunias generated by Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 365-377.

25. Devic M, Albert S, Delseny M, Roscoe T. Efficient PCR walking on plant genomic DNA // Plant Physiology and Biochemistry. 1997. V. 35. P. 331-339.

26. Eimert K, SchrEoder C, Siegemund F. Expression of the NPTII-sequence in cauliflower after injection of Agrobacterium into seeds // Journal Plant Physiology. 1992. N. 140. P. 37-40.

27. Eimert K, Siegemund F. Transformation of cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) an experimental survey // Plant Molecular Biology. 1992. N. 19. P. 485-490.

28. Errampali D., Patton D., Castle L., Mickelson K., Hansen K., Schnall J., Feldmann K., Meinke D. Embryogenic lethals and T-DNAinscrtional mutagenesis in Arabidopsis // Plant Cell. 1991. V. 3. P. 149-159.

29. Finnegan J, McElroy D. Transgene inactivation: plants fight back // Biotechnology. 1994. N. 12. P. 883-888.

30. Fladung M. Gene stability in transgenic aspen (Populus). Flanking DNA sequences and T-DNA structure / / Molecular Genomics and Genetics. 1999. V. 260 P. 574-581.

31. Fry J, Barnason A, Horsch R. Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors // Plant Cell Report. 1987. N. 6. P. 321-325.

32. Fu X., Du L.T., Fontana S. et. al. Linear transgene constructs lacking vector bacbone sequences generate low- copy-number transgenic plants with simple integration patterns //Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 11-19.

33. Gamborg O., Miller R., Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. // Experimental Cell Research. 1968. V.50. P. 151-158.

34. Genji Q. Obtaining and analysis of flanking sequences from T-DNA transformants of Arabidopsis // Plant Science. 2003. V. 165. P. 941949.

35. Goodwin I, Todd G, Ford-Lloyd B, Newbury H. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mcdiatcd transformation vary according to plant species // Plant Cell Report. 1991. N. 9. P. 671-675.

36. Graaff E., Dulk-Ras A., Hooykaas P. Deviating T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plants // Plant Molecular Biology. 1996. V. 31. P. 677-681.

37. Hamada M, Hosoki T, Kusabiraki У, Kigo T. Hairy root formation and plantlet regeneration from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera Zenk.) mediated by Agrobacterium rhizogenes // Plant Tissue Culture Letter. 1996. N. 6. P. 130-133.

38. Hamill J., Rounslcy S, Spencer A, Todd G, Rhodes M. The use of the polymerase chain reaction in plant transformation studies / / Plant Cell Report. 1991. V. 10. P. 221-224.

39. Hobbs S.L., Jackson J.A., Baliski D.S. Genotype- and promoter-induced variability in transient beta-glucoronidase expression in pea protoplast // Pants Cell Reporns. 1990. V. 9. P. 17-20.

40. Hoekema A, Hirsch P, Hooykaass P, Schilperoort R. A binary vector strategy based on separation of vir- and T-region of Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid // Nature. 1983. N. 303. P. 179-180.

41. Hoeven van der C. Variability of organ-specific gene expression in transgenic tobacco plants // Transgenic Res. 1994.V. 3. P. 159-165.

42. Holford P, Hernandez N, Newbury H. Factors influencing the efficiency of T-DNA transfer during co-cultivation of Antirrhinum majus with Agrobacterium tumefaciens // Plant Cell Report. 1992. N. 11. P. 196-199.

43. Holbrook L, Miki B. Brassica grown gall tumrigenesis and in vitro of transformed tissue // Plant Cell Report. 1985. N. 4. P. 329-332.

44. Horsch R.B. Fry J.E., Hoffmann L.A.N. Inheritance of functional forein genes in plants // Science. 1984. V. 223, N4653. P. 496-499.

45. Hosoki T, Shiraishi K, Kigo T, Ando M. Transformation and regeneration of ornamental kale (Brassica oleracea var. acephala DC) mediated by Agrobacterium rhizogenes // Scientist Horticulturae. 1989. N.40. P. 259-266.

46. Hosoki T, Kanbe H, Kigo T: Transformation of ornamental tobacco and kalemediated by Agrobacterium tumefaciens and A, rhizogenes harbouring a reporter p-glucuronidase gene // Japan Society Horticultural Science. 1994. N. 63. P. 167-172.

47. Hosoki T, Kigo T. Transformation of Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera Zenk.) by Agrobacterium rhizogenes harbouring a reporter ^-glucuronidase gene // Journal Japan Society Horticultural Science. 1994. N. 63. P. 589-592.

48. Iglesias V., Moscone E., Papp I. Molecular and cytogenetic analyses of stably and unstable expressed transgene loci in tobacco // The Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1251-1264.

49. Jakowitsch J., Papp I., Moscone E.A. Molecular and cytogenetic characterization of a transgene locus that induces silencing and methylation of homologous promoters in trans // Plant J. 1999. V.17. P.131-140.

50. Jordan MC, McHughen A. Transformed callus does not necessarily regenerate transformed shoots // Plant Cell Report. 1988. N. 7. P. 285-287.

51. Kohli A., Leech M., Vain P. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V.95. P. 7203-7208.

52. Kuai В., Perret S., Wan S., Dalton S., Bettany A., Morris P. Transformation of oat and inheritance of bar gene expression // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2001. V. 66. P. 79-88.

53. Li Z., Yu M., Zhang H., Wang H., Wang L. Improved rapid amplification of cDNA ends (RACE) for mapping both the 5' and 3' terminal sequences of paramyxovirus genomes / / Journal of Virological Methods. 2005. V. 130. P. 154-156.

54. Lin J-J, Assad-Garcia N, Kuo J. Effects of Agrobacterium cell concentration on the transformation efficiency of tobacco and Arabidopsis thaliana // Focus. 1994. V. 16. N. 3. P. 70-73.

55. Liu Y., Whittier R. Thermal asymmetric interlaced PCR: Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from PI and YAC clones for chromosome walking // Genomics. 1995. V. 25. P. 674-681.

56. Liu Y, Mitsukawa N, Oosumi Т., Whittier R. Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR // Plant Journal. 1995. V.8. P. 457463.

57. Mannerlof M., Tenning P. Variadility of gene expression in transgenic tobacco //Euphytica. 1997. V. 98. P. 133-139.

58. Matzke M.A., Matzke A.J.M. Epigenetic silencing of plant transgenes as a consequence of diverse cellular defence responses // Cel. and Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 94-103.

59. Matzke M.A.,Priming M., Tronovsky J., Matzke A.J.M. Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed tobacco plants//ЕМВО J. 1989. V. 8. P. 643-649.

60. McBride K, Svab Z, Schaaf D, Hogan P, Stalker D, Maliga P. Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco / / Biotechnology. 1995. N. 13. P. 362-365.

61. McGarvey P., Kaper J. A simple and rapid method for screening transgenic plants using the PCR // BioTechniques. 1991. V. 11. P.428-430.

62. Metz T, Dixit R, Earle E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (B. oleracea var. capitata) // Plant Cell Report. 1995. N.15. P. 287-292.

63. Metz TD, Roush RT, Tang JD, Shelton AM, Earlc ED. Transgenic broccoli expressing a Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein: implications for pest resistance management strategies // Molecular Breeding. 1995. N. 1. P. 309-317.

64. Meyer P. Understanding and controlling transgene expression // Trends Biotechnology. 1995. N. 13. P. 332-337.

65. Mullins, Chen X, Romaine P, Raina R, Geiser DM, Kang S. Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an enceinte tool for insertional mutagenesis and gene transfer // Phytopathology. 2001. V. 91. P.173-180.

66. Murata M, Orton T. Callus initiation and regeneration capacities in Brassica species // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1987. N. 11. P. 111-123.

67. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans // Plant Cell. 1990. N. 2. P. 279-289.

68. Narasimhulu S, Prakash S, Chopra V. Comparative shoot regeneration in diploid and amphidiploid Brassica species and their interspecific hybrids // Canadian Journal Botany. 1992. N. 70. P. 1513-1514.

69. Padegimas L., Reichert N. Adaptor ligation-based polymerase chain reaction-mediated walking // Anal Biochemistry. 1998. V. 260. P. 149-153.

70. Parkin et al. // Genome. 1995. V. 38. P. 1112-1131.

71. PasseFegue E, Kerlan C. Transformation of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis) by transfer of cauliflower mosaic virus genethrough cocultivation with virulent and avirulent strains of Agrobacterium // Plant Science. 1996. N. 113. P. 79-89.

72. Pawlowski W., Somers D. Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 12106-12110.

73. Peach C, Velten J. Transgene expression variability (position effect) of CAT andGUS reporter genes driven by linked divergent T-DNA promoters // Plant Molecular Biology. 1991. N. 17. P. 49-60.

74. Petit A, David C, Dahl GA, Ellis JG, Guyon P, Casse-Delbart F, Tempre J. Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacteriumrhizogenes cooperate for opine degradation / / Molecular Genetics and Genomics. 1983. N. 190. P. 204-214.

75. Prols F., Meyer P. The methylation pattens of chromosomal integfration regions influense gene activity of transferred DNA in Petunia hybrida //Plant Journal. 1992. V. 2. P. 465-475.

76. Pua EC, Mehra-Palta A, Nagy F, Chua N. Transgenic plants of Brassica napus L. // Biotechnology. 1987. N. 5. P. 815-817.

77. Puddephat I.J., Riggs T.J., Fenning T.M. Transformation of Brassica oleracea L.: a critical review //Molecular Breeding. 1996. V.2. P. 185-210.

78. Radchuk V., Ryschka U., Schumann G., Klockc E. Genetic transformation of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis) by direct DNA uptake into mesophyll protoplasts // Physiologia Plantarum. 2002. N.3. V. 114. P. 429.

79. Radke S, Turner J, Facciotti D. Transformation and regeneration of Brassica rapa using Agrobacterium tumefaciens // Plant Cell Report. 1992. N. 11. P. 499-505.

80. Raina S., Mahalingam R. Chen F., Fedoroff N. A collection of sequenced and mapped Ds transposon insertion sites in Arabidopsis thaliana // Plant Molecular Biology. 2002. V. 50. P. 93-110.

81. Ramanathyn V., Veluthambi K. Transfer of nonTDNA portions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from the terminus of TLDNA //Plant Mol. Biol. 1995. V. 28. P. 1149-1154.

82. Reynolds J. Regeneration in vegetable species // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. / Ed. Vasil IK. London. Academic Press. 1986. V. 3. Plant Regeneration and Genetic Variability, P. 151-178.

83. Salas M., Park S., Srivatanakul M., Smith R. Temperature influence on stable T-DNA integration in plant cells // Plant Cell Report. 2001. V. 20. P. 701-705.

84. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 84. P. 5463-5467.

85. Schmulling T, Schell J. Transgenic tobacco plants regenerated from leaf disks can be periclinal chimeras // Plant Molecular Biology. 1993. N. 21. P. 705-708.

86. Siebert P., Chenchik A, Kellogg D., Lukyanov K., Lukyanov S. An improved PCR-method for walking in uncloned genomic DNA // Nuclear Acids Research. 1995. V.23. P. 1087-1088.

87. Sheikholeslam S, Weeks D. Acetosyringone promotes high efficiency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens // Plant Molecular Biology. 1987. N. 8. P. 291-298.

88. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // Journal Molecular Biology. 1975. V. 98. P. 503-517.

89. Spertini D, Beliveau C., Bellemare G. Screening of transgenic plants by amplification of unknown genomic DNA flanking T-DNA // BioTechniques. 1999. V. 27. P. 308-314.

90. Srivastava V, Reddy AS, Guha-Mukhejee S. Transformation and regeneration of Brassica oleracea mediated by an oncogenic

91. Agrobactcrium tumefaciens // Plant Cell Report. 1988. N. 7. P. 504-507.

92. Stachel S., Timmerman В., Zambryski P. Generation of single-stranded T-DNA molecules during the initial stage of T-DNA transfer for Agrobacterium tumefaciens to plant cells // Nature. 1986. V.322. P. 706-712.

93. Swensen J. PCR with random primers to obtain sequence from yeast artificial chromosome insert ends or plasmids / / Bio-Techniques. 1996. V. 20. P. 486-491.

94. ТетрГе J, Casse-Delbart F. Plant gene vectors and genetic transformation: Agrobactcrium Ri plasmids // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants / Ed. Vasil IK. London: Academic Press, 1987. V. 6. P. 25-49.

95. Tepfer D. Genetic transformation using Agrobacterium rhizogenes // Physiology Planta. 1990. N. 79. P. 140-146.

96. Van Haute E., et al., // EMBO J. 1983 - V.2. - P. 411418.

97. Vickers J, Graham G., Henry R. A Protocol for the Efficient Screening of Putatively Transformed Plants for bar, the Selectable Marker Gene, Using the Polymerase Chain Reaction / / Plant Molecular Biology Reporter. 1996. V. 14. N 4. P. 363-368.

98. Verma SC, Rees H. Nuclear DNA and the evolution of allotetraploid Brassicae // Heredity. 1974. N.33. P. 61-68.

99. Wang M.-B. High-efficiency of a Pglucuronidase gene in rise is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 29-38.

100. Wijbrandi J, de Both M. Temperate vegetable crops // Science Horticultural. 1993. N. 55. P. 37-63.

101. Williams J, Pink D, Biddington N. Effect of silver nitrate on long term culture and regeneration of callus from Brassica oleracca var. gemmifera // Plant Cell Tissue Organ Culture. 1990. N. 21. P. 61-66.

102. Zambryski P, Joos H, Genetello C, LeemansM, Van Montagu M, Schell J. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity // EMBO J. 1983. N. 2. P. 2143-2150.

103. Zambryski P. Chronicles from the Agrobacterium -plant cell DNA transfer story // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1992. V. 43. P.465-490.

104. Zee S, Johnson B. Cole crops // Handbook of Plant Cell Culture / Ammirato PV, Evans DA, Sharp WR, Yamada Y (eds). Macmillan, New York. 1984. V. 3, P. 227-246.

105. Zhou Y, Newton R., Gould J. A simple method for identifying plant/T-DNA junction sequences resulting from Agrobacterium-mediated DNA transformation // Plant Molecular Biology Report. 1997. V. 15. P. 246-254.

106. Гаииаров M. ГМ продукты. Мифы и реальность. М.: 2004.

107. Дейнеко Е.В., Загорская А.А, Филипенко Е.А., Филипенко М.Л., Комарова Н.И., Кочетов А.В., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) при инбридинге // Генетика. 1998. Т. 34,№9. С.1212-411.

108. Доспехов Б. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) // М.: Агропромиздат. 1985. 351 с.

109. Конвенция о биологическом разнообразии. Текст и приложения. 1992.

110. Луговой А., Луговой А. Динамика производства овощей на орошаемых землях краснодарского края // 2004

111. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: «Мир». 1984. 480 с.

112. Методические указания по оценке биобезопасности гснно-инженерно-модифицированных растений, Москва, 2002.

113. Моиахос Г.Ф. // Схема селекции Fj гибридов капусты кочанной на основе линий с цитоплазмотической мужской стерильностью. / Доклады III Международной научной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова, Москва, 2003.

114. Падегимас Л., Шульга О., Скрябин К. // Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину / Мол. Биол. 1993. Т. 27. №4. С.947-951.

115. Пивоваров В.Ф., П.Ф. Конопков, В.П. Никулыпин. Овощи новинки на вашем столе. М.: ВНИИССОК, 1995. 226 с.

116. Постановление Правительства РФ от 16 февраля 2001 г. № 120 "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов".

117. Федеральный закон №86 от 05 июня 1996 г. "О государственном регулировании в области генно-ииженерной деятельности".129. http: / /www.gossort.com130. www.agbios.com, GM-database, Maize, DAS 06275-8