Сравнительный анализ подвижности мезенхимных стромальных клеток человека в процессе репликативного старения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Лукачева Анастасия Владимировна

• Лукачева Анастасия Владимировна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Лукачева Анастасия Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Положения, выносимые на защиту

Научная новизна полученных результатов

Теоретическая и практическая значимость работы

Личный вклад автора

Апробация работы

Финансовая поддержка работы

Объем и структура диссертации

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Статьи в журналах из списка ВАК

Тезисы

Глава 1. Обзор литературы

1. 1 Характеристика МСК

1.2 Ограниченный срок жизни МСК

1.3 РС при нормальном восстановлении тканей

1.4 Клеточная подвижность

1.5 Типы клеточного движения

1.6 Роль актинового цитоскелета в миграции

1.7 Механизмы полимеризации и деполимеризации актиновых филаментов

1.8 Влияние полимеризации и деполимеризации на клеточную подвижность

1.9 Регуляция клеточной подвижности

1.10 Сигнальные пути, регулирующие ЯЪо ГТФазы

1.11 Эффекторы ЯЪо ГТФаз

1.12 Роль ЯЪо ГТФаз в регуляции клеточной подвижности

1.13 Взаимодействие между ЯЪо ГТФазами

1.14 Функции ЯЪо ГТФаз ядре клетки

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Культуры клеток

2.2 Оценка РС клеток

2.3. Анализ морфологических изменений МСК в процессе РС

2.4 Анализ подвижности

2.5 Анализ модальности распределений

2.6 Иммунофуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия

2.7 Анализ колокализации

2.8. Анализ морфологических изменений актинового цитоскелета в процессе РС МСК

2.8 Анализ экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени

Глава 3. Результаты

3.1 Репликативное старение

3.2 Анализ морфометричсеских показателей

3.3 Анализ подвижности МСК в процессе РС

3.4 Анализ морфологических изменений структуры актинового цитоскелета

3.5 Анализ ядерно-цитоплазматического распределения ЯЪо ГТФаз в процессе РС

3.6 Анализ экспрессии генов ЯЪо ГТФаз в процессе РС

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Подвижность МСК в процессе РС

4.2. Влияние LPA на подвижность МСК в процессе РС

4.3 Изменения ядерной локализации и экспрессии генов ЯЪо ГТФаз в процессе РС МСК

Глава 5. Заключение

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГК - анализ главных компонент ВКМ - внеклеточный матрикс ГДФ - гуанозиндифосфатом ГТФ - гуанозинтрифосфат

ГТФаза - Гидролаза, способная связывать и гидролизовать ГТФ, функционирует в различных конформационных состояниях: в комплексе с ГТФ, ГДФ или в свободной форме

МСК - мезенхимные стромальные клетки

РС - репликативное старение

ЭМП - эпителиально-мезенхимальный переход

P-gal - бета-галактозидаза

SAHF - Senescence-associated heterochromatic foci (гетерохроматиновые очаги)

CDK - Cyclin-dependent kinases (циклинзависимые киназы) EGF - Epidermal Growth Factor (эпидермальный фактор роста) FBS - Fetal bovine serum (фетальная бычья сыворотка) FH 1/2 - белки гомологи формина

GAP - GTPase-Activating Proteins — белки-активаторы ГТФазной активности, которые ускоряют гидролиз ГТФ, ускоряя инактивацию G-белков. В частности, регулятор Rho ГТФаз

GDI - Guanine nucleotide dissociation inhibitor — ингибиторы диссоциации гуаниновых нуклеотидов

GEF - Guanine nucleotide exchange factor (фактор обмена гуаниновых нуклеотидов) — белки или белковые домены, которые активируют малые ГТФазы семейства Rho

LCFD - local connected fractal dimension (локальная связанная фрактальная размерность)

LIMK - LIM kinase (киназы, фосфорилирующие члены семейства ADF/кофилинов)

LPA - lysophosphatidic acid (лизофосфатидная кислота)

MBS - Myosin binding subunit (миозин-связывающая субъединица)

MLC - Myosin light chain (легкая цепь миозина)

MLCK - Myosin light chain kinase (киназа легкой цепи миозина)

MSD - Mean square displacement (среднеквадратичное смещение)

NLS - Nuclear Localization Signal (сигнальная последовательность ядерной локализации)

NPF - Nucleation Promoting Factors (факторы, способствующие нуклеации)

PAC - p21-activated kinase (серин/треониновая киназа, активируемая

p21)

PBS - Phosphate-buffered saline (фосфатно-солевой буфер)

PDGFA - Platelet-derived growth factor subunit A (фактор роста тромбоцитов (субъединица A))

PI3K - Phosphoinositide 3-kinases (фосфатидилинозитол-3-киназа)

ROCK - Rho-associated protein kinase (серин/треониновая Rho-ассоциированная киназа)

SASP - Senescence-associated secretory phenotype (секреторный фенотип, ассоциированный со старением)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Мезенхимные стромальные клетки (МСК) — это мультипотентные клетки, обладающие способностью к самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток соединительной ткани. Одним из критически важных свойств МСК является способность к миграции, обеспечивающая их участие в процессах регенерации тканей и взаимодействия с окружающими клетками. Благодаря этим свойствам МСК широко используются в биомедицинских исследованиях, регенеративной медицине и клеточной терапии [1-4].

Одним из важных преимуществ МСК является возможность их длительного культивирования и получения стабильных клеточных линий. Однако, в отличие от трансформированных и раковых клеток, они не являются иммортализированными и подвержены репликативному старению (РС) [5]. В ходе длительного культивирования МСК постепенно теряют способность к делению: их пролиферативная активность снижается, время удвоения клеточной популяции увеличивается, а затем пролиферация полностью прекращается [6]. Одним из ключевых факторов, приводящих к РС, является укорочение теломер при каждом цикле клеточного деления. Это вызывает активацию специфических сигнальных путей, которая приводит к остановке клеточного цикла и изменению функционального состояния клеток, включая изменения их морфологии и реорганизацию актинового цитоскелета [7].

Визуализация структур актинового цитоскелета осуществляется, в том

числе, с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии, на

полученных изображениях F-актин формирует сложный неправильный

геометрический рисунок и может рассматриваться как фрактальный объект.

Поэтому для количественной оценки структуры актинового цитоскелета

может применяться фрактальный анализ, который позволяет оценить степень

8

организации и уровень структурной сложности сети актиновых микрофиламентов [8].

Актиновый цитоскелет играет ключевую роль в процессах клеточной миграции, обеспечивая формирование стресс-фибрилл, ламеллиподий, филоподий и адгезионных контактов, необходимых для движения клетки [9]. Поскольку в процессе РС происходит перестройка цитоскелета клетки, можно предположить, что РС оказывает влияние и на её подвижность.

Клеточная подвижность регулируется множеством факторов, включая организацию цитоскелета, уровень адгезии и активность сигнальных путей. Особую роль в этом процессе играют малые ГТФазы семейства ЯЪо (например, ЯЪоА, Яас1, Cdc42), которые координируют динамическую реорганизацию актиновых микрофиламентов и адгезионных структур: ЯЪоА регулирует образование стресс-фибрилл и актомиозиновую сократимость, что необходимо для ретракции заднего края клетки; Яас1 участвует в формировании ламеллиподий, которые обеспечивают движение клетки вперёд; Cdc42 контролирует образование филоподий и полярность клетки, влияя на направление миграции [10]. Изменения экспрессии генов ЯЪо ГТФаз и внутриклеточной локализации их белков могут существенно влиять на миграционный потенциал МСК, что, в свою очередь, отражается на их терапевтической эффективности.

Старение организма сопровождается развитием хронического воспаления, одним из медиаторов которого является лизофосфатидная кислота ^РА) [11]. Этот биологически активный липид играет важную роль в регуляции миграции клеток, активируя сигнальные каскады, ассоциированные с малыми ГТФазами семейства ЯЪо, в особенности ЯЪоА [12]. Также известно, что в процессе РС происходит изменение состава клеточного секреторного фенотипа, заключающееся в увеличении количества провоспалительных медиаторов, в том числе LPA [13]. Влияние LPA на подвижность клеток

разных типов изучается в течение многих лет, однако роль LPA в регуляции подвижности МСК в процессе РС остаётся неизученной.

Для изучения подвижности клеток в 2D-культуре проводится прижизненная микроскопия с последующим анализом изображений. В ходе исследования регистрируются траектории движения отдельных клеток, количественная оценка полученных траекторий выполняется с помощью вычисления набора количественных показателей, называемых метриками подвижности. К основным метрикам подвижности относятся: средняя скорость, дисперсия средней скорости, прямолинейность траектории, коэффициент извилистости, коэффициент изменения направления, его дисперсия и др. Анализ этих метрик позволяет объективно оценить особенности клеточной миграции и выявить закономерности, связывающие изменения подвижности МСК с процессом РС.

Для выявления закономерностей, общих для различных линий МСК, мы исследовали клетки, выделенные из разных источников: взрослых, внезародышевых и эмбриональных тканей. Для объективного сравнения подвижности МСК различных линий в процессе РС необходимо ориентироваться на определённые временные точки. Однако, поскольку разные клеточные линии обладают различным временем удвоения, использование номера пассажа в качестве критерия сравнения было бы некорректным. В связи с этим мы приняли решение условно разделить процесс РС на "стадии", что позволяет учитывать особенности каждой линии и анализировать изменения подвижности клеток.

Важным этапом исследования также является сопоставление изменений подвижности МСК в процессе РС с изменениями подвижности иммортализованных фибробластов, подвергающихся длительному культивированию. Такое сопоставление позволяет определить, связаны ли выявленные закономерности изменений подвижности клеток исключительно

с РС или же они являются общими изменениями, возникающими при длительном культивировании клеток независимо от их природы.

Несмотря на значительный объем исследований, посвященных РС МСК [14-16], роль цитоскелетных перестроек и изменений экспрессии генов малых ГТФаз в этом процессе остается недостаточно изученной. До сих пор не было проведено комплексного анализа изменений структуры актинового цитоскелета и характера клеточной подвижности в процессе РС с учетом влияния факторов микроокружения, таких как LPA. Исследование этих аспектов позволит углубить фундаментальные знания о РС МСК, а с практической стороны поможет выявить новые биомаркеры, характеризующие функциональное состояние клеток для их применения в биомедицинских приложениях.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является выявление закономерностей, связывающих процесс РС МСК, выделенных из различных источников, с изменениями в структуре актинового цитоскелета, клеточной подвижности, экспрессии генов малых ГТФаз семейства ЯЪо и внутриклеточной локализации их белков.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать стадии РС, позволяющие сравнивать различные линии МСК.

2. Оценить подвижность МСК на разных стадиях РС и сравнить её с подвижностью иммортализованных клеток в процессе длительного культивирования.

3. Сравнить по метрикам подвижности гетерогенность популяций МСК, находящихся на разных стадиях РС, и иммортализованных клеток в условиях длительного культивирования.

4. Изучить влияние активатора Я^оА-сигналинга — лизофосфатидной кислоты ^РА) — на подвижность МСК на разных стадиях РС.

5. Идентифицировать метрики подвижности, изменения которых коррелируют с различными стадиями РС МСК.

6. Определить соответствие изменений структуры актинового цитоскелета МСК разным стадиям РС.

7. Оценить уровень экспрессии генов малых ГТФаз семейства ЯЪо и внутриклеточную локализацию их белков на различных стадиях РС МСК.

Положения, выносимые на защиту

1. Выявлены закономерности в изменении подвижности МСК, соответствующие стадиям РС: при переходе от начальной стадии к промежуточной происходит снижение средней скорости и направленности движения МСК, тогда как на поздней стадии увеличивается направленность движения МСК относительно двух других стадий.

2. Стадия РС МСК может быть предсказана с помощью математической модели, учитывающей 4 метрики подвижности клеток: прямолинейность траектории, дисперсия средней скорости, квадратичное смещение и дисперсия коэффициента изменения направления. Эта модель может применяться для характеристики функционального состояния клеток, используемых в биомедицинских приложениях.

3. В процессе РС МСК происходят разнонаправленные изменения экспрессии генов малых ГТФаз семейства ЯЪо (снижается экспрессия ЯЪоА и Яас1, увеличивается экспрессия Cdc42), что приводит к изменениям в структуре актинового цитоскелета и характере подвижности клеток, находящихся на разных стадиях РС.

4. В процессе РС МСК наблюдается снижение гетерогенности клеточной популяции по метрикам подвижности, обусловленное исчезновением субпопуляций клеток с высокой средней скоростью.

Научная новизна полученных результатов

Впервые проведено систематическое сравнительное исследование подвижности и структуры актинового цитоскелета МСК, выделенных из различных источников, в процессе РС, с учетом влияния провоспалительных условий.

В ходе работы были получены новые данные о динамике клеточной подвижности в процессе РС. Выявлены нелинейные изменения подвижности: снижение скорости миграции на средних стадиях РС с последующим увеличением на поздней стадии, что может быть связано с изменением активности сигнальных путей, регулирующих подвижность. Доказан переход клеток к более направленному типу миграции при прогрессировании РС, что сопровождается увеличением упорядоченности структуры актинового цитоскелета и изменением экспрессии генов ЯЪо ГТФаз.

Впервые проведен комплексный анализ ядерно-цитоплазматического перераспределения малых ГТФаз семейства ЯЪо (ЯЪоА, Яас1, Cdc42) в процессе РС. Установлено снижение ядерной локализации ЯЪоА и Яас1 при старении, что может быть связано с нарушением их регуляторных функций в ядре. Обнаружено увеличение ядерной локализации Cdc42, что может играть роль в адаптации клеток к возрастным изменениям. Показано, что изменения локализации ЯЪо ГТФаз коррелируют с изменением экспрессии их генов, что подтверждает их участие в регуляции клеточного старения. Получены новые данные о перестройке актинового цитоскелета в процессе РС.

Создана математическая модель, способная предсказывать стадию РС МСК по медианным значениям четырех метрик подвижности, что выявляет новые биомаркеры характеризующие функциональное состояние клеток для их применения в биомедицинских приложениях.

Таким образом, полученные результаты расширяют понимание молекулярных механизмов старения МСК и подчеркивают роль малых ГТФаз ЯЪо в регуляции этих процессов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данное исследование расширяет фундаментальные представления о механизмах РС МСК, охватывая изменения их подвижности, перестройку актинового цитоскелета, изменения экспрессии генов ЯЪо ГТФаз, а также изменения локализации ЯЪо ГТФаз в клетке.

Впервые проведен комплексный анализ динамики миграции МСК при РС, что углубляет понимание механизмов их движения и адаптации в условиях клеточного старения. Исследовано влияние активатора Я^оА-сигналинга LPA на подвижность МСК и структуру их актинового цитоскелета, что позволяет лучше понять механизмы регуляции динамики цитоскелета в процессе РС и в провоспалительных условиях. Впервые выявлены особенности ядерно-цитоплазматического перераспределения малых ГТФаз семейства ЯЪо (ЯЪоА, Яас1, Cdc42) и изменения экспрессии их генов в процессе РС, что проясняет их участие в механизмах клеточного старения.

Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов РС и сигналинга малых ГТФаз в клеточной биологии и тканевой инженерии.

Выявленные механизмы регуляции ЯЪо ГТФаз в процессе РС могут послужить основой для поиска новых терапевтических мишеней, направленных на замедление клеточного старения. Изученные механизмы РС МСК могут быть использованы для разработки новых подходов к улучшению заживления хронических ран и терапии патологий, связанных с нарушением регенерации тканей, где функциональное состояние МСК играет ключевую роль.

Таким образом, результаты работы имеют фундаментальное значение для клеточной биологии и одновременно могут быть полезны для применения в биомедицинских приложениях.

Личный вклад автора

Все основные результаты представленной работы получены автором лично. Дизайн экспериментов и полученные результаты обсуждались совместно с научным руководителем Бобковым Д.Е. Публикации готовились совместно с соавторами, указанными в перечне публикаций.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены и обсуждены на 10 международных и всероссийских конференциях: IX Молодежной школе-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (2024), 27-й Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» (2024), XXII Зимней молодежной школы по биофизике и молекулярной биологии (2023), Всероссийской школе-конференции «Коллекции культур клеток человека и животных: современные вызовы и сетевые решения»(2022), VIII Молодежной школе-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (2022), Второй всероссийской очно-заочной научной конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «LifeSciencePolytech» (2022), всероссийской конференции "Неделя науки ИФНиТ" (2020), Всероссийской конференции с Международным участием «Актуальные проблемы клеточной биологии и клеточных технологий» (2019)

Финансовая поддержка работы

Исследования выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках проекта 15.БРК.21.0011 (Соглашение № 075-15-2021-1063) и государственного задания (№ ФМФУ-2021-0005) Института цитологии Российской академии наук.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы, содержащего 200 ссылок на первоисточники. Работа изложена на 147 страницах, содержит 33 рисунка и 1 таблицу.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительный анализ подвижности мезенхимных стромальных клеток человека в процессе репликативного старения»

РАБОТЫ

Статьи в журналах из списка ВАК

1. Bobkov, D., Polyanskaya, A.1, Musorina, A., Lomert E., Shabelnikov S. and Poljanskaya G. Replicative senescence in MSCWJ-1 human umbilical cord mesenchymal stem cells is marked by characteristic changes in motility, cytoskeletal organization, and RhoA localization. Mol Biol Rep 47, 3867-3883 (2020). Квартиль Q1. https://doi.org/10.1007/s11033-020-05476-6

2. Bobkov, D., Polyanskaya, A., Musorina, A., Poljanskaya, G. (2022). The RhoA nuclear localization changes in replicative senescence: new evidence from in vitro human mesenchymal stem cells studies. BIOCELL, 46(9), 2053-2058. Квартиль Q4. https://doi.org/10.32604/biocell.2022.019469

1 Публикации, изданные до 2023 года, опубликованы под фамилией Полянская, а начиная с мая 2023 года — под фамилией Лукачева

3. Bobkov, D.E., Polyanskaya, A.V., Musorina, A.S., Lomert E.V. and Poljanskaya G.G. Cell Motility and Cytoskeleton Structure under the Influence of the Small GTPase RhoA Activator and Inhibitor during Replicative Senescence Process in the MSC Line Derived from the Eyelid Skin of Adult Donor. Cell Tiss. Biol. 17, 56-66. (2023). Квартиль Q4. https://doi.org/10.1134/S1990519X23010029

4. Lukacheva A.V., Gorb A.I., Musorina A.S., Kriger D.V., Poljanskaya G.G. and Bobkov D.E. Replicative Senescence in Human Embryo Bone Marrow MSCs is Characterized by Changes in Cell Motility and Subcellular Localization of Racl and RhoA GTPases. Russ J Bioorg Chem 49 (Suppl 1), S224-S240 (2023). Квартиль Q4. https://doi.org/10.1134/S106816202312018X.

5. Bobkov D.E., Lukacheva A.V., Gorb A.I. and Poljanskaya G.G. Role of Rho Family Small GTPases in the Regulation of Normal and Pathological Processes. Cell Tiss. Biol. 18, 229-243 (2024). Квартиль Q4. https://doi.org/10.1134/S1990519X24700159

6. Lukacheva, A.V., Gorb A.I., Musorina A.S., Kriger D.V., Poljanskaya G.G. and Bobkov D.E. Changes in the Heterogeneity of MSC Subpopulations During Replicative Senescence as Seen from Single-Cell Speed Measurements. Russ J Bioorg Chem 50, 2509-2518 (2024). Квартиль Q4. https://doi.org/10.1134/S106816202408020X

Тезисы

1. Д.Е. Бобков, А.В. Полянская "Реорганизация сократительного аппарата мезенхимальных стволовых клеток человека MSCWJ-1 в процессе репликативного старения" Сборник тезисов всероссийской конференции с Международным участием "Актуальные проблемы клеточной биологии и клеточных технологий" ISSN 2313-1829, Том XIV, №3, 2019, "Гены и Клетки"

2. Полянская А.В., Гончарова Д.Ф., Мусорина А.С., Полянская Г.Г., Бобков Д.Е. «Репликативное старение дермальных фибробластов линии DF2,

выделенных из кожи век человека, сопровождается ядерно-цитоплазматическим перераспределением малой ГТФазы Я^оА»; Сборник материалов всероссийской конференции "Неделя науки ИФНиТ" 2020 г

3. Гончарова Д.Ф., Полянская А.В., Мусорина А.С., Полянская Г.Г., Бобков Д.Е "Оценка изменений внутриклеточной локализации тропомиозина и малой ГТФазы ЯЪоА в клетках линии FetMSC в процессе репликативного старения". Сборник тезисов всероссийской конференции "Медицинская весна - 2021"

4. А. В. Полянская, Д. Ф. Гончарова, А. С. Мусорина, Г. Г. Полянская, Д. Е. Бобков «Анализ подвижности клеток линии FetMSC в процессе репликативного старения», журнал ЦИТОЛОГИЯ, 2022, том 64, N0 7, с. 611-780

5. БобковД.Е., Полянская А.В., Гончарова Д.Ф., Тагаева Р.Б., Юдинцева Н.М., Ломерт Е.В., Полянская Г.Г. «Исследование клеточной подвижности разных линий МСК человека в процессе репликативного старения» сборник тезисов докладов Всероссийская школа-конференция «Коллекции культур клеток человека и животных: современные вызовы и сетевые решения», 2022 г

6. А.В. Полянская, А.С. Мусорина, Г.Г. Полянская, Д.Е. Бобков «Влияние LPA и У-27632 на среднюю скорость миграции клеток FetMSC, находящихся на различных стадиях репликативного старения», журнал "Гены и клетки" Том XVII, №3, 2022 г

7. А.И. Горб, А.В. Полянская, А.С. Мусорина, Г.Г. Полянская, Д.Е. Бобков «Ядерно-цитоплазматическое перераспределение малых ГТФаз ЯЪоА и Яас-1 в процессе длительного культивирования линии МСК человека FetMSC» сборник тезисов второй всероссийской очно-заочной научной конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «LifeSciencePolytech», 2022 г

8. Полянская А.В., Горб А.И., Мусорина А.С., Полянская Г.Г., Бобков Д.Е. «Оценка подвижности клеток FetMSC, выделенных из костного

19

мозга эмбриона человека, в процессе репликативного старения» сборник тезисов докладов XXII Зимней молодежной школы по биофизике и молекулярной биологии, 2022 г

9. А.В. Лукачева, А.И. Горб, А.С. Мусорина, Г.Г. Полянская, Д.Е. Бобков «Ингибиторный анализ подвижности МСК из Вартонова студня пупочного канатика человека в процессе репликативного старения» сборник тезисов 27-й Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА», 2024 г

10. А.В. Лукачева, А.С. Мусорина, Г.Г. Полянская, Д.Е. Бобков "Влияние ингибиторов Cdc42 и ROCK1 на структуру актинового цитоскелета МСК в процессе репликативного старения" сборник тезисов IX Молодежной школы-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, 2024 г

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Характеристика МСК

Мезенхимные стромальные клетки (МСК) являются фибробластоподобными клетками с ограниченным сроком жизни, способными к самообновлению и дифференцировке в разные специализированные клетки. Термин «мезенхимные стромальные клетки» был популяризирован в начале 1990-х годов Капланом [17], но это понятие основано в значительной степени на работах Фриденштейна и коллег в 1970-е гг. [18]. Источником получения МСК являются взрослые, эмбриональные и внезародышевые органы. МСК имеют широкий спектр биологических функций, таких как участие в гомеостазе тканей и их восстановлении или регенерации [19]. При повреждении тканей организма МСК секретируют множество факторов для стимуляции пролиферации, миграции, дифференцировки и выживания клеток-предшественников и усиления регенерации. МСК также проявляют иммуномодулирующие, ангиогенные, противовоспалительные и антиапоптотические свойства [20].

Фибробласты — это основные клетки соединительных тканей, которые преимущественно происходят из МСК. Главная роль фибробластов заключается в синтезе коллагена, гликозаминогликанов и других ключевых гликопротеинов внеклеточного матрикса (ВКМ), таких как фибронектин. ВКМ играет важную роль в поддержании структуры многоклеточных тканей, создавая каркас, в пределах которого клетки могут мигрировать и взаимодействовать друг с другом через различные межклеточные контакты. Взаимодействие молекул ВКМ с интегринами активирует локальные белковые киназы, что, в свою очередь, запускает сигнальные пути, поддерживающие нормальное функционирование клеток [21, 22]. Фибробласты могут иметь различную степень дифференцировки: наименее

дифференцированные клетки обладают высокой секреторной активностью и способностью к пролиферации.

Сравнительный анализ потенциала дифференцировки и иммунных характеристик показал сходство между МСК и фибробластами [23, 24]. Обе группы клеток имеют признаки, подтверждающие их статус МСК, такие как адгезия к пластикам для культуры клеток, активная пролиферация и способность дифференцироваться в остеогенные, хондрогенные и адипогенные клетки. Эти характеристики соответствуют требованиям Международного общества клеточной терапии для МСК.

Сходство между фибробластами и МСК объясняется общими функциями, связанными с синтетической и регенеративной активностью этих клеток. Однако функциональная активность клеток зависит от конкретных условий микроокружения, и свойства фибробластов, полученных из различных органов, могут различаться [25].

В последние годы увеличился интерес к терапии с использованием МСК из-за лёгкости их в культивировании, иммуномодулирующей активности и способности к дифференцировке. Эти клетки могут быть применены при лечении таких заболеваний, как стероидорезистентный трансплантат против хозяина, периодонтит, хроническая ишемия миокарда, декомпенсированный цирроз печени, рассеянный склероз, ишемический инсульт, диабет, дефекты костно-хрящевой ткани и болезнь Крона [16, 26, 27].

Хотя клеточная терапия этих заболеваний требует большого количества МСК, лишь небольшой процент МСК обнаруживается во взрослых тканях (примерно 0,001-0,02% мононуклеарных клеток из аспирированного костного мозга); следовательно, экспансия МСК ex vivo перед трансплантацией неизбежна [28].

1.2 Ограниченный срок жизни МСК

Размножение культуры МСК ограничено, как и для любых других нормальных соматических клеток. После определенного числа клеточных делений МСК переходят в состояние репликативного старения (РС) и в конечном итоге прекращают пролиферацию. Эти клетки могут оставаться в таком непролиферативном состоянии в течение нескольких месяцев. Явление РС было впервые описано в 1960-х годах Леонардом Хейфликом [29].

Одной из основных причин РС является укорочение теломер, происходящее при каждом цикле репликации ДНК и, соответственно, при каждом клеточном делении.

Теломеры представляют собой повторяющиеся нуклеотидные последовательности, ассоциированные с белками, расположенные на концах хромосом. Они выполняют функцию защитных структур, предотвращая деградацию хромосом и их слияние. Теломеры состоят из множества коротких тандемных повторов, обогащенных гуанином и тимином ^Т-мотив), за которыми следует одноцепочечный выступ, также богатый GT-повторами. Белки комплекса шелтерина связываются с теломерными последовательностями, способствуя формированию Т-петли, которая защищает концы хромосом и предотвращает их распознавание как поврежденной ДНК. [30].

С каждым циклом репликации ДНК теломеры постепенно укорачиваются на 50-100 пар оснований, что приводит к РС. Во время синтеза ДНК ДНК-полимераза не способна полностью реплицировать концевые последовательности отстающей цепи, что известно как "проблема конечной репликации". В результате эти нереплицированные последовательности усекаются, что приводит к прогрессирующему истощению теломер. Как только теломеры достигают критической длины, структура защитного теломерного колпачка разрушается и распознается клеткой как разрыв

двухцепочечной ДНК, что запускает реакцию повреждения ДНК и останавливает дальнейшее клеточное деление [31].

В настоящее время общепринято, что только трансформированные злокачественные клетки размножаются неограниченно, в то время как нетрансформированные, неиммортализованные клетки способны делиться ограниченное количество раз (предел Хейфлика для неиммортализованных клеток человека примерно равен 52 циклам репликции) [29]. Исключениями являются эндогенные зародышевые и соматические стволовые клетки, эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные в контролируемых условиях in vitro [32, 33].

РС, возникающее при длительном культивировании клеточных популяций МСК, представляет собой сложный динамичный процесс, вызванный генетическими и эпигенетическими изменениями. Этот процесс сопровождается рядом значительных изменений, таких как:

• замедление или полное прекращение пролиферации клеток из-за накопления клеток в фазе G1 клеточного цикла [21].

Только клетки со стабильной остановкой клеточного цикла считаются стареющими. В отличие от покоящихся клеток, стареющие клетки не возвращаются в клеточный цикл в ответ на какие-либо известные физиологические стимулы. Остановка клеточного цикла опосредована путями-супрессорами опухолей p53/p21CIP1 и p16INK4A/pRb.

Ответ на повреждение ДНК из-за хронического геномного стресса или истощения теломер приводит к активации опухолевого супрессора p53, который, в свою очередь, активирует p21CIP1, инициируя остановку клеточного цикла. После активации p53, p21CIP1 ингибирует циклинзависимые киназы (CDK), что предотвращает прогрессирование клеточного цикла через контрольную точку фазы G1 - S. Кроме того, ингибирование CDK блокирует фосфорилирование белка-супрессора опухоли ретинобластомы, который

предотвращает E2F-опосредованную транскрипцию генов, способствующих пролиферации.

• морфологические изменения (увеличение размеров и формирование уплощенной морфологии) [5, 21];

• увеличение лизосомальной активности, в частности увеличение активности лизосомального фермента Р-галактозидазы, ассоциированного с РС [21];

На сегодняшний день окраска на лизосомальную Р-галактозидазу при рН6 (Ь^а1) является единственным хорошо зарекомендовавшим себя методом для анализа клеточного старения. Было показано, что этот фермент активен только в стареющих фибробластах человека, но не в покоящихся или дифференцированных клетках [34]. Этот метод также может быть применен для препаратов МСК. Однако процедура окрашивания не способствует абсолютной количественной оценке стареющего состояния, и она преимущественно окрашивает подмножество очень крупных стареющих клеток. Для создания более подходящей тест-системы потребуется лучшее понимание процесса клеточного старения.

• уменьшение дифференцировочного потенциала [35];

• реорганизация хроматина и измененная экспрессия генов;

Отличительной особенностью стареющих клеток является обширная реорганизация хроматина, в первую очередь образование связанных со старением гетерохроматиновых очагов ^АНБ). Эти участки факультативного гетерохроматина играют роль в подавлении генов, способствующих пролиферации. Стареющие клетки обычно содержат 30-50 SAHF [36].

• наблюдается нарушение целостности ядерной оболочки из-за снижения экспрессии ламина В1 [37];

• митохондриальная дисфункция, накопление активных форм кислорода, потеря клеточного гомеостаза и уменьшение уровня антиоксидантов [38, 39];

• изменение состава секретома, включающего провоспалительные цитокины, протеазы и других факторы, которые в совокупности формируют фенотип SASP [40].

Множество стареющих клеток приобретают секреторный фенотип, ассоциированный с старением (SASP), который вызывает как положительные, так и отрицательные внеклеточные эффекты старения. SASP представляет собой сложную смесь цитокинов, хемокинов, факторов роста и протеаз, состав которой может значительно варьироваться в зависимости от типа клеток, тканей и стимулов, вызывающих старение. Эти секретируемые молекулы помогают взаимодействовать с соседними клетками и иммунной системой, что в конечном итоге влияет на судьбу стареющей клетки. Например, SASP привлекает иммунные клетки к стареющим клеткам, способствуя их удалению, что выполняет роль подавления опухолевого роста [41]. Однако, парадоксально, SASP может также способствовать прогрессированию рака через секрецию факторов, которые стимулируют ангиогенез, ремоделирование внеклеточного матрикса или эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ). Кроме того, хроническое воспаление, вызванное старением, может приводить к системной иммуносупрессии, что повышает риск развития заболеваний, включая рак. Это воспаление также может способствовать повреждению тканей и дегенеративным процессам, связанным с возрастом [14, 42].

Важно отметить, что не все стареющие клетки демонстрируют все биомаркеры старения. Кроме того, биомаркеры старения не обязательно специфичны для стареющих клеток, поскольку некоторые маркеры наблюдаются, например, в апоптотических или покоящихся клетках. Таким

образом, идентификация стареющих клеток зависит от наблюдения за несколькими биомаркерами.

С момента открытия предела Хейфлика было высказано предположение, что РС играет роль в старении всего организма. Действительно, несколько исследований показали обратную зависимость между возрастом донора и продолжительностью культивирования in vitro для фибробластов и МСК [43]. Этот эффект обычно относительно невелик с большим разбросом между разными образцами доноров. Различные исследования документально подтвердили, что МСК от пожилых людей имеют более медленную скорость пролиферации уже на начальном пассаже и что они содержат более крупные и плоские клетки по сравнению с клетками от более молодых доноров. Количество клеток, положительных по ассоциированной со старением P-gal, значительно выше в образцах от пожилых доноров, чем у более молодых доноров. Количество клеток с колониеобразующим потенциалом снижается в более старшем возрасте. Вагнер и соавторы описали, что и на молекулярной основе эти два процесса связаны: гены, которые активируются в долгосрочной культуре, также активируются у пожилых людей [16].

1.3 РС при нормальном восстановлении тканей

Восстановление тканей необходимо для поддержания жизни. Хотя оно редко приводит к полной регенерации, этот процесс предотвращает кровопотерю и инфицирование, а также способствует структурному и функциональному восстановлению, необходимому для выживания. Восстановление тканей происходит быстро и очень динамично, включает в себя множество типов клеток и взаимосвязанных процессов, которые в целом включают в себя остановку кровотечения, воспаление, пролиферацию клеток и ремоделирование кожи [44]. Во время гемостаза образуется нерастворимый кровяной сгусток, и эндотелиальные клетки из повреждённого кровеносного сосуда попадают в рану, образуя временный фибриновый каркас и высвобождая факторы, привлекающие как циркулирующие иммунные клетки,

так и местные клетки кожи. К месту повреждения быстро привлекаются воспалительные клетки, в первую очередь нейтрофилы и провоспалительные макрофаги, которые удаляют бактерии и некротические ткани [45, 46]. Более поздняя стадия заживления характеризуется переключением на противовоспалительные макрофаги, которые поглощают оставшиеся провоспалительные клетки, поддерживая фиброплазию и заживление ран [47]. Чтобы обеспечить эффективное восстановление, кератиноциты частично переходят из эпителиального состояния в мезенхимальное и начинают мигрировать, чтобы закрыть рану. Этот процесс известен как эпительально-мезенхимальный переход (ЭМП). ЭМП кератиноцитов является основой реэпителизации [48]. Формирование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) необходимо для обеспечения питания во время активной стадии заживления [49]. Наконец, незрелый матрикс, образующийся на ранних стадиях заживления, заменяется более прочными белками каркаса, такими как зрелые коллагеновые волокна, которые вырабатываются и модифицируются фибробластами [50]. Каждая стадия заживления раны включает в себя обширную клеточную коммуникацию, регулируемую цитокинами, хемокинами, факторами роста и компонентами внеклеточной среды. Пластичность реакции и возникающее при этом поведение клеток аналогичны тем, что наблюдаются при раке (например, инфильтрация иммунными клетками, инвазия и ЭМП [51]. Поэтому вполне разумно предположить, что старение и связанные с ним механизмы могут существенно влиять на заживление ран.

Действительно, появляется всё больше данных о том, что РС играет ключевую роль в восстановлении тканей, регулируя фиброз и процессы заживления. Оно способствует выработке фибролитических ферментов и удалению клеток, предотвращая избыточное накопление внеклеточного матрикса. В то же время недостаток стареющих клеток может привести к нарушению формирования матрикса и замедлению регенерации [52, 53]. Белки семейства Ссп1-6,

связанные с внеклеточным матриксом, участвуют в регуляции клеточной адгезии, миграции, пролиферации и старения. Их активность способствует ограничению фиброза и поддержанию баланса между ремоделированием тканей и их восстановлением [54, 55]. Исследования продолжают раскрывать роль клеточного старения в заживлении острых ран. Хотя пока они проводятся преимущественно на мышиных моделях, полученные данные свидетельствуют о важности РС для эффективного восстановления кожи.

Как уже упоминалось, регенерация тканей основывается на миграции клеток в место повреждения. Таким образом, изучение влияния РС на подвижность клеток так же является перспективным направлением исследований как для эффективного применения МСК в регенеративной медицине, так и для углубления фундаментальных знаний.

1.4 Клеточная подвижность

Клеточная подвижность - это фундаментальный биологический процесс, участвующий в эмбриогенезе, заживлении ран, иммунном ответе и метастазировании опухолевых клеток. Этот процесс включает координированную работу цитоскелета, молекул адгезии и сигнальных путей, регулирующих направление и скорость движения клетки [56].

Многие типы клеток многоклеточных животных - например, фибробласты или эпителиальные клетки - могут стать поляризованными в ответ на внеклеточный стимул или спонтанно мигрировать в одном направлении. Эта способность необходима клеткам для функционирования в естественной среде. Например, развитие нервной системы у позвоночных требует множества сложных паттернов клеточной миграции. Эпителиальным клеткам необходимо мигрировать, чтобы закрыть раны в эпителиальном слое, тогда как подвижные фибробласты имеют решающее значение для ремоделирования тканей. И наоборот, неправильное регулирование миграции клеток является основой многих аномальных процессов, приводящих, например, к инвазивности опухолевых клеток [57].

29

1.5 Типы клеточного движения

Клетки могут мигрировать разными способами, в зависимости от их типа и условий окружающей среды:

• Мезенхимальный тип миграция - характерен для фибробластов и раковых клеток, включает формирование ламеллиподий и фокальных адгезий [58];

• Амебоидное движение - наблюдается у иммунных, стволовых и раковых клеток, использующих актиновые протрузии и низкую адгезивность [59];

• Коллективная миграция — это тип клеточного движения, при котором группа клеток перемещается как единое целое. Она играет важную роль в эмбриональном развитии и заживлении ран, а также встречается у опухолевых клеток, способных формировать «коллективные инвазии», что способствует метастазированию и росту опухоли [60].

Фибробласты играют решающую роль в заживлении ран [43, 61]. Фибробласты, мигрирующие в рану, имеют тенденцию иметь большие ламеллоподии, простирающиеся в рану, с небольшим количеством стресс-фибрилл в клетке. Напротив, неподвижные фибробласты имеют более мелкие ламеллоподии и характеризуются множеством стресс-фибрилл. Известно, что многие факторы роста, представленные в месте раны, действуют либо как митогены, либо как хемотаксические факторы для фибробластов; к ним относятся, например, эпидермальный фактор роста (EGF) и PDGF. Стимуляция факторами роста может увеличить скорость миграции отдельных фибробластов почти в 3 раза, в то же время увеличивая изменения направления миграции клеток [62].

Именно на миграции фибробластов базируется классическая парадигма передвижения клеток - локомоторный цикл [63]. Локомотроный цикл

30

включает в себя несколько этапов: 1) начало движения в ответ на внешние сигналы (химические или механические стимулы), активация регуляторных белков влияющих на полимеризацию, рост и ветвление актиновых филаментов, образование фокальных контактов и стресс-фибрилл; 2) образование протрузий на переднем крае клетки; 3) прикрепление и движение клетки за счет образования фокальных контактов; 4) ретракция хвоста клетки за счет сократительной способности акто-миозиновых волокон и разрушения фокальной адгезии.

1.6 Роль актинового цитоскелета в миграции

Актин представляет собой высококонсервативный белок, являющийся основным элементом микрофиламентов, диаметр которых составляет 4-6 нм. При полимеризации G-актина (мономера актина) формируется F-актин. Хотя процесс полимеризации G-актина в F-актин может происходить без участия актин-связывающих белков (АСБ), для образования крупных пучков актиновых филаментов необходимо участие таких АСБ, как например, а-актинин и гельзолин, что происходит с затратой энергии в результате гидролиза АТФ. Кроме того, актин-ассоциированные белки, такие как, анкирин и спектрин, способствуют закреплению актиновых филаментов на клеточных органеллах или плазматической мембране.

Структурно мономер актина плоский. Он может поместиться в прямоугольную призму с размерами 55 А х 55 А х 35 А. Полипептидная цепь мономера актина, содержащая 375 аминокислот, обычно складывается из двух основных доменов. Их называют малыми и большими доменами. Из-за их различного расположения в актиновом филаменте их также называют внутренним и внешним доменами [64].

Физиологически актиновый цитоскелет является основным клеточным аппаратом для генерации протрузивных и сократительных сил [65]. Таким образом, актиновый цитоскелет участвует в различных аспектах клеточной биологии, от миграции целых клеток и фагоцитоза до экзоцитоза. Помимо

31

этого, актин является мишенью каспаз во время апоптоза и испытывает окислительное повреждение при возникновении клеточного стресса [65].

1.7 Механизмы полимеризации и деполимеризации актиновых

филаментов

Полимеризация актиновых микрофиламентов при физиологических концентрациях in vitro происходит быстро. Клетки, однако, приобрели различные способы для жесткого контроля полимеризации и деполимеризации актиновых микрофиламентов в соответствии с их потребностями. Принято считать, что подавляющее большинство мономеров актина связывается с помощью мономерных связывающих или секвестрирующих факторов, таких как члены семейства профилинов или тимозин р4, тем самым сильно снижая концентрацию совместимых с полимеризацией мономеров актина в клетках [66].

Полимеризация актина происходит в три этапа:

1. Нуклеация - начальная фаза, когда несколько мономеров G-актина (глобулярного актина) объединяются, образуя стабильное ядро.

Для зарождения актиновых микрофиламентов наиболее важным этапом является образование тримеров или тетрамеров. Общим для всех нуклеаторов актина является то, что они имитируют состояние тримера / тетрамера. На сегодняшний день наиболее важным фактором зарождения актиновых микрофиламентов является белковый комплекс Arp2/3. Этот гетерогептамерный комплекс включает два родственных актину белка, Arp2 и Arp3, которые очень похожи на актин, а также более мелкие субъединицы, называемые ArpC1-ArpC5. Arp2 и Arp3 вместе с двумя мономерами актина наиболее эффективно формируют ядро для генерации дочерних микрофиламентов, это означает, что он связываться с уже существующими микрофиламентами, давая начало большим массивам разветвленных сетей актина [67]. Комплекс Arp2- /-3 по своей природе неактивен, но может быть

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лукачева Анастасия Владимировна, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mahmoodi M., Cheraghi E., Riahi A. The Effect of Wharton's Jelly-Derived Conditioned Medium on the In Vitro Maturation of Immature Oocytes, Embryo Development, and Genes Expression Involved in Apoptosis // Reproductive Sciences. - 2024. - T. 31, № 1. - C. 190-198.

2. Selvaraj S., Rupert S., Nandabalan S. K., Anbalagan C., Rajaram P. S., Satyanesan J., Vennila R., Rajagopal S. Effect of Cell-Derived Matrices on Growth and Differentiation of Human Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells // Cells Tissues Organs. - 2024. - T. 213, № 1. - C. 67-78.

3. Sattar M. A., Lingens L. F., Guillaume V. G. J., Goetzl R., Beier J. P., Ruhl T. Association between Donor Age and Osteogenic Potential of Human Adipose Stem Cells in Bone Tissue Engineering // Curr Issues Mol Biol. - 2024. - T. 46, № 2. -C. 1424-1436.

4. Poblano-Perez L. I., Castro-Manrreza M. E., Gonzalez-Alva P., Fajardo-Orduna G. R., Montesinos J. J. Mesenchymal Stromal Cells Derived from Dental Tissues: Immunomodulatory Properties and Clinical Potential // Int J Mol Sci. - 2024. - T. 25, № 4.

5. Wagner W., Horn P., Castoldi M., Diehlmann A., Bork S., Saffrich R., Benes V., Blake J., Pfister S., Eckstein V., Ho A. D. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process // PLoS One. - 2008. - T. 3, № 5. -C.e2213.

6. Hayflick L., Moorhead P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains // Exp Cell Res. - 1961. - T. 25. - C. 585-621.

7. Weng Z., Wang Y., Ouchi T., Liu H., Qiao X., Wu C., Zhao Z., Li L., Li B. Mesenchymal Stem/Stromal Cell Senescence: Hallmarks, Mechanisms, and Combating Strategies // Stem Cells Transl Med. - 2022. - T. 11, № 4. - C. 356-371.

8. Revittser A., Selin I., Negulyaev Y., Chubinskiy-Nadezhdin V. The analysis of F-actin structure of mesenchymal stem cells by quantification of fractal dimension // PLoS One. - 2021. - T. 16, № 11. - C. e0260727.

9. Schaks M., Giannone G., Rottner K. Actin dynamics in cell migration // Essays Biochem. - 2019. - T. 63, № 5. - C. 483-495.

10. Ridley A. J. Rho GTPase signalling in cell migration // Curr Opin Cell Biol. -2015. - T. 36. - C. 103-12.

11. Knowlden S., Georas S. N. The autotaxin-LPA axis emerges as a novel regulator of lymphocyte homing and inflammation // J Immunol. - 2014. - T. 192, № 3. - C. 851-7.

12. Tran K. C., Zhao J. Lysophosphatidic Acid Regulates Rho Family of GTPases in Lungs // Cell Biochem Biophys. - 2021. - T. 79, № 3. - C. 493-496.

13. Chen W. M., Chiang J. C., Lin Y. C., Lin Y. N., Chuang P. Y., Chang Y. C., Chen C. C., Wu K. Y., Hsieh J. C., Chen S. K., Huang W. P., Chen B. P. C., Lee H. Lysophosphatidic acid receptor LPA(3) prevents oxidative stress and cellular senescence in Hutchinson-Gilford progeria syndrome // Aging Cell. - 2020. - T. 19, № 1. - C. e13064.

14. Dong Z., Luo Y., Yuan Z., Tian Y., Jin T., Xu F. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities // Mol Cancer. - 2024. - T. 23, № 1. - C. 181.

15. Bobkov D., Polyanskaya A., Musorina A., Lomert E., Shabelnikov S., Poljanskaya G. Replicative senescence in MSCWJ-1 human umbilical cord mesenchymal stem cells is marked by characteristic changes in motility, cytoskeletal organization, and RhoA localization // Mol Biol Rep. - 2020. - T. 47, № 5. - C. 3867-3883.

16. Wagner W., Bork S., Horn P., Krunic D., Walenda T., Diehlmann A., Benes V., Blake J., Huber F. X., Eckstein V., Boukamp P., Ho A. D. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells // PLoS One. -2009. - T. 4, № 6. - C. e5846.

17. Caplan A. I. Mesenchymal stem cells // J Orthop Res. - 1991. - T. 9, № 5. - C. 641-50.

18. Friedenstein A. J., Chailakhyan R. K., Latsinik N. V., Panasyuk A. F., Keiliss-

Borok I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the

128

hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo // Transplantation. - 1974. - T. 17, № 4. - C. 331-40.

19. Krampera M., Pasini A., Pizzolo G., Cosmi L., Romagnani S., Annunziato F. Regenerative and immunomodulatory potential of mesenchymal stem cells // Curr Opin Pharmacol. - 2006. - T. 6, № 4. - C. 435-41.

20. Caplan A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine // J Cell Physiol. - 2007. - T. 213, № 2. - C. 341-7.

21. Бобков Д. Е., Полянская, Г.Г. Клеточные и молекулярные характеристики репликативного старения мезенхимных стволовых клеток человека // Цитология. - 2020. - T. 62, № 11. - C. 782-792.

22. Крылова Т. А., Мусорина, А.С., Зенин, В.В., Яковлева, Т.К., Полянская, Г.Г. . Сравнительные характеристики линий мезенхимных стволовых клеток, полученных из костного мозга и мышцы конечности раннего эмбриона человека // Цитология. - 2014. - T. 56, № 8. - C. 562-573.

23. Крылова Т. А., Кольцова, А.М., Зенин, В.В, Мусорина, А.С., Яковлева,Т.К. Сравнительные характеристики новых линий мезенхимных стволовых клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток, костного мозга и крайней плоти человека. // Цитология. - 2012. - T. 54, № 1. - C. 5-16.

24. Кольцова А. М., Зенин, В.В., Яковлева, Т.К., Полянская, Г.Г. Характеристика новой линии мезенхимных стволовых клеток, выделенных из эмбриональных стволовых клеток человека // Цитология. - 2015. - T. 57, № 11.

- C. 761-770.

25. Крылова Т. А., Зенин, В.В., Мусорина, А.С., Кольцова, А.М., Кропачева, И.В., Турилова, В.И., Яковлева, Т.К., Полянская, Г.Г. Получение и характеристика неиммортализованных клеточных линий дермальных фибробластов человека, выделенных из кожи век взрослых доноров разного возраста // Цитология. - 2016. - T. 58, № 11. - C. 850-864.

26. Sensebe L., Krampera M., Schrezenmeier H., Bourin P., Giordano R. Mesenchymal stem cells for clinical application // Vox Sang. - 2010. - T. 98, № 2.

- C. 93-107.

27. Le Blanc K., Frassoni F., Ball L., Locatelli F., Roelofs H., Lewis I., Lanino E., Sundberg B., Bernardo M. E., Remberger M., Dini G., Egeler R. M., Bacigalupo A., Fibbe W., Ringden O., Developmental Committee of the European Group for B., Marrow T. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study // Lancet. - 2008. - T. 371, № 9624. - C. 1579-86.

28. Alvarez-Viejo M., Menendez-Menendez Y., Blanco-Gelaz M. A., Ferrero-Gutierrez A., Fernandez-Rodriguez M. A., Gala J., Otero-Hernandez J. Quantifying mesenchymal stem cells in the mononuclear cell fraction of bone marrow samples obtained for cell therapy // Transplant Proc. - 2013. - T. 45, № 1. - C. 434-9.

29. Hayflick L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains // Exp Cell Res. - 1965. - T. 37. - C. 614-36.

30. Meena J., Rudolph K. L., Gunes C. Telomere Dysfunction, Chromosomal Instability and Cancer // Recent Results Cancer Res. - 2015. - T. 200. - C. 61-79.

31. Martens U. M., Chavez E. A., Poon S. S., Schmoor C., Lansdorp P. M. Accumulation of short telomeres in human fibroblasts prior to replicative senescence // Exp Cell Res. - 2000. - T. 256, № 1. - C. 291-9.

32. Zeng X. Human embryonic stem cells: mechanisms to escape replicative senescence? // Stem Cell Rev. - 2007. - T. 3, № 4. - C. 270-9.

33. Shimamoto A., Yokote K., Tahara H. Werner Syndrome-specific induced pluripotent stem cells: recovery of telomere function by reprogramming // Front Genet. - 2015. - T. 6. - C. 10.

34. Dimri G. P., Lee X., Basile G., Acosta M., Scott G., Roskelley C., Medrano E. E., Linskens M., Rubelj I., Pereira-Smith O., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1995. - T. 92, № 20. - C. 9363-7.

35. Yang Y. K., Ogando C. R., Wang See C., Chang T. Y., Barabino G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro // Stem Cell Res Ther. - 2018. - T. 9, № 1. - C. 131.

36. Aird K. M., Zhang R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF) // Methods Mol Biol. - 2013. - T. 965. - C. 185-96.

37. Shah P. P., Donahue G., Otte G. L., Capell B. C., Nelson D. M., Cao K., Aggarwala V., Cruickshanks H. A., Rai T. S., McBryan T., Gregory B. D., Adams P. D., Berger S. L. Lamin B1 depletion in senescent cells triggers large-scale changes in gene expression and the chromatin landscape // Genes Dev. - 2013. - T. 27, № 16. - C. 1787-99.

38. Yu J., Shi J., Zhang Y., Zhang Y., Huang Y., Chen Z., Yang J. The replicative senescent mesenchymal stem / stromal cells defect in DNA damage response and anti-oxidative capacity // Int J Med Sci. - 2018. - T. 15, № 8. - C. 771-781.

39. Gu Y., Li T., Ding Y., Sun L., Tu T., Zhu W., Hu J., Sun X. Changes in mesenchymal stem cells following long-term culture in vitro // Mol Med Rep. -2016. - T. 13, № 6. - C. 5207-15.

40. Turinetto V., Vitale E., Giachino C. Senescence in Human Mesenchymal Stem Cells: Functional Changes and Implications in Stem Cell-Based Therapy // Int J Mol Sci. - 2016. - T. 17, № 7.

41. Coppe J. P., Patil C. K., Rodier F., Sun Y., Munoz D. P., Goldstein J., Nelson P. S., Desprez P. Y., Campisi J. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor // PLoS Biol. - 2008. - T. 6, № 12. - C. 2853-68.

42. Battram A. M., Bachiller M., Martin-Antonio B. Senescence in the Development and Response to Cancer with Immunotherapy: A Double-Edged Sword // Int J Mol Sci. - 2020. - T. 21, № 12.

43. Martin P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration // Science. -1997. - T. 276, № 5309. - C. 75-81.

44. Wilkinson H. N., Hardman M. J. The role of estrogen in cutaneous ageing and repair // Maturitas. - 2017. - T. 103. - C. 60-64.

45. Velnar T., Bailey T., Smrkolj V. The wound healing process: an overview of the cellular and molecular mechanisms // J Int Med Res. - 2009. - T. 37, № 5. - C. 1528-42.

46. Young A., and McNaught, C.-E. . The physiology of wound healing // Surgery.

- 2011. - T. 29. - C. 475-479.

47. Korns D., Frasch S. C., Fernandez-Boyanapalli R., Henson P. M., Bratton D. L. Modulation of macrophage efferocytosis in inflammation // Front Immunol. - 2011.

- T. 2. - C. 57.

48. Shaw T. J., Martin P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration // Curr Opin Cell Biol. - 2016. - T. 42. - C. 29-37.

49. Baum C. L., Arpey C. J. Normal cutaneous wound healing: clinical correlation with cellular and molecular events // Dermatol Surg. - 2005. - T. 31, № 6. - C. 67486; discussion 686.

50. Li J., Chen J., Kirsner R. Pathophysiology of acute wound healing // Clin Dermatol. - 2007. - T. 25, № 1. - C. 9-18.

51. Schafer M., Werner S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2008. - T. 9, № 8. - C. 628-38.

52. Krizhanovsky V., Yon M., Dickins R. A., Hearn S., Simon J., Miething C., Yee H., Zender L., Lowe S. W. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis // Cell. - 2008. - T. 134, № 4. - C. 657-67.

53. Meyer K., Hodwin B., Ramanujam D., Engelhardt S., Sarikas A. Essential Role for Premature Senescence of Myofibroblasts in Myocardial Fibrosis // J Am Coll Cardiol. - 2016. - T. 67, № 17. - C. 2018-28.

54. Jun J. I., Lau L. F. The matricellular protein CCN1 induces fibroblast senescence and restricts fibrosis in cutaneous wound healing // Nat Cell Biol. - 2010. - T. 12, № 7. - C. 676-85.

55. Demaria M., Ohtani N., Youssef S. A., Rodier F., Toussaint W., Mitchell J. R., Laberge R. M., Vijg J., Van Steeg H., Dolle M. E., Hoeijmakers J. H., de Bruin A., Hara E., Campisi J. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA // Dev Cell. - 2014. - T. 31, № 6. - C. 722-33.

56. Ridley A. J., Schwartz M. A., Burridge K., Firtel R. A., Ginsberg M. H., Borisy G., Parsons J. T., Horwitz A. R. Cell migration: integrating signals from front to back // Science. - 2003. - T. 302, № 5651. - C. 1704-9.

132

57. Lauffenburger D. A., Horwitz A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process // Cell. - 1996. - T. 84, № 3. - C. 359-69.

58. Friedl P., Wolf K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms // Nat Rev Cancer. - 2003. - T. 3, № 5. - C. 362-74.

59. Lammermann T., Bader B. L., Monkley S. J., Worbs T., Wedlich-Soldner R., Hirsch K., Keller M., Forster R., Critchley D. R., Fassler R., Sixt M. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing // Nature. - 2008. - T. 453, № 7191. - C. 51-5.

60. Mayor R., Etienne-Manneville S. The front and rear of collective cell migration // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2016. - T. 17, № 2. - C. 97-109.

61. Schreier T., Degen E., Baschong W. Fibroblast migration and proliferation during in vitro wound healing. A quantitative comparison between various growth factors and a low molecular weight blood dialysate used in the clinic to normalize impaired wound healing // Res Exp Med (Berl). - 1993. - T. 193, № 4. - C. 195205.

62. Ware M. F., Wells A., Lauffenburger D. A. Epidermal growth factor alters fibroblast migration speed and directional persistence reciprocally and in a matrix-dependent manner // J Cell Sci. - 1998. - T. 111 ( Pt 16). - C. 2423-32.

63. Abercrombie M., Heaysman J. E., Pegrum S. M. The locomotion of fibroblasts in culture. I. Movements of the leading edge // Exp Cell Res. - 1970. - T. 59, № 3.

- C. 393-8.

64. Dominguez R., Holmes K. C. Actin structure and function // Annu Rev Biophys.

- 2011. - T. 40. - C. 169-86.

65. Amberg D., Leadsham J. E., Kotiadis V., Gourlay C. W. Cellular ageing and the actin cytoskeleton // Subcell Biochem. - 2012. - T. 57. - C. 331-52.

66. Buracco S., Claydon S., Insall R. Control of actin dynamics during cell motility // F1000Res. - 2019. - T. 8.

67. Sokolova O. S., Chemeris A., Guo S., Alioto S. L., Gandhi M., Padrick S., Pechnikova E., David V., Gautreau A., Goode B. L. Structural Basis of Arp2/3

Complex Inhibition by GMF, Coronin, and Arpin // J Mol Biol. - 2017. - T. 429, № 2. - C. 237-248.

68. Breitsprecher D., Goode B. L. Formins at a glance // J Cell Sci. - 2013. - T. 126, № Pt 1. - C. 1-7.

69. Bear J. E., Gertler F. B. Ena/VASP: towards resolving a pointed controversy at the barbed end // J Cell Sci. - 2009. - T. 122, № Pt 12. - C. 1947-53.

70. Bieling P., Hansen S. D., Akin O., Li T. D., Hayden C. C., Fletcher D. A., Mullins R. D. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation // EMBO J. - 2018. - T. 37, № 1. - C. 102121.

71. Funk J., Merino F., Schaks M., Rottner K., Raunser S., Bieling P. A barbed end interference mechanism reveals how capping protein promotes nucleation in branched actin networks // Nat Commun. - 2021. - T. 12, № 1. - C. 5329.

72. McGough A., Pope B., Chiu W., Weeds A. Cofilin changes the twist of F-actin: implications for actin filament dynamics and cellular function // J Cell Biol. - 1997. - T. 138, № 4. - C. 771-81.

73. Blanchoin L., Boujemaa-Paterski R., Sykes C., Plastino J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility // Physiol Rev. - 2014. - T. 94, № 1. -C. 235-63.

74. Ono S. Regulation of actin filament dynamics by actin depolymerizing factor/cofilin and actin-interacting protein 1: new blades for twisted filaments // Biochemistry. - 2003. - T. 42, № 46. - C. 13363-70.

75. Yin H. L., Stossel T. P. Control of cytoplasmic actin gel-sol transformation by gelsolin, a calcium-dependent regulatory protein // Nature. - 1979. - T. 281, № 5732. - C. 583-6.

76. Small J. V., Stradal T., Vignal E., Rottner K. The lamellipodium: where motility begins // Trends Cell Biol. - 2002. - T. 12, № 3. - C. 112-20.

77. Oakes P. W., Bidone T. C., Beckham Y., Skeeters A. V., Ramirez-San Juan G. R., Winter S. P., Voth G. A., Gardel M. L. Lamellipodium is a myosin-independent

mechanosensor // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2018. - T. 115, № 11. - C. 26462651.

78. Charras G., Paluch E. Blebs lead the way: how to migrate without lamellipodia // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2008. - T. 9, № 9. - C. 730-6.

79. Paluch E. K., Raz E. The role and regulation of blebs in cell migration // Curr Opin Cell Biol. - 2013. - T. 25, № 5. - C. 582-90.

80. Burridge K., Guilluy C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension // Exp Cell Res. - 2016. - T. 343, № 1. - C. 14-20.

81. Parsons J. T., Horwitz A. R., Schwartz M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2010. - T. 11, № 9. - C. 633-43.

82. Tojkander S., Gateva G., Lappalainen P. Actin stress fibers—assembly, dynamics and biological roles // J Cell Sci. - 2012. - T. 125, № Pt 8. - C. 1855-64.

83. Hotulainen P., Lappalainen P. Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells // J Cell Biol. - 2006. - T. 173, № 3. - C. 38394.

84. Alexandrova A. Y., Arnold K., Schaub S., Vasiliev J. M., Meister J. J., Bershadsky A. D., Verkhovsky A. B. Comparative dynamics of retrograde actin flow and focal adhesions: formation of nascent adhesions triggers transition from fast to slow flow // PLoS One. - 2008. - T. 3, № 9. - C. e3234.

85. Choi C. K., Vicente-Manzanares M., Zareno J., Whitmore L. A., Mogilner A., Horwitz A. R. Actin and alpha-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner // Nat Cell Biol. - 2008. - T. 10, № 9. - C. 1039-50.

86. Ponti A., Machacek M., Gupton S. L., Waterman-Storer C. M., Danuser G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells // Science. - 2004. -T. 305, № 5691. - C. 1782-6.

87. Schonichen A., Mannherz H. G., Behrmann E., Mazur A. J., Kuhn S., Silvan U., Schoenenberger C. A., Fackler O. T., Raunser S., Dehmelt L., Geyer M. FHOD1 is a combined actin filament capping and bundling factor that selectively associates

135

with actin arcs and stress fibers // J Cell Sci. - 2013. - T. 126, № Pt 8. - C. 1891901.

88. Gupton S. L., Waterman-Storer C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration // Cell. -2006. - T. 125, № 7. - C. 1361-74.

89. Burnette D. T., Manley S., Sengupta P., Sougrat R., Davidson M. W., Kachar B., Lippincott-Schwartz J. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells // Nat Cell Biol. - 2011. - T. 13, № 4. - C. 371-81.

90. Amano M., Nakayama M., Kaibuchi K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity // Cytoskeleton (Hoboken). - 2010. - T. 67, № 9.

- C. 545-54.

91. Takai Y., Sasaki, T., & Matozaki, T. Small GTP-Binding Proteins // Physiological Reviews. - 2001. - T. 81, № 1. - C. 153-208.

92. Xiao H., Wang G., Zhao M., Shuai W., Ouyang L., Sun Q. Ras superfamily GTPase activating proteins in cancer: Potential therapeutic targets? // Eur J Med Chem. - 2023. - T. 248. - C. 115104.

93. Ridley A. J., Hall A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors // Cell. - 1992.

- T. 70, № 3. - C. 389-99.

94. Johnson D. I. Cdc42: An essential Rho-type GTPase controlling eukaryotic cell polarity // Microbiol Mol Biol Rev. - 1999. - T. 63, № 1. - C. 54-105.

95. Hanna S., El-Sibai M. Signaling networks of Rho GTPases in cell motility // Cell Signal. - 2013. - T. 25, № 10. - C. 1955-61.

96. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology // Nature. - 2002.

- T. 420, № 6916. - C. 629-35.

97. Moon S. Y., Zheng Y. Rho GTPase-activating proteins in cell regulation // Trends Cell Biol. - 2003. - T. 13, № 1. - C. 13-22.

98. Garcia-Mata R., Boulter E., Burridge K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2011. - T. 12, № 8. - C. 493504.

99. DerMardirossian C., Bokoch G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation // Trends Cell Biol. - 2005. - T. 15, № 7. - C. 356-63.

100. Sciorra V. A., Morris A. J. Roles for lipid phosphate phosphatases in regulation of cellular signaling // Biochim Biophys Acta. - 2002. - T. 1582, № 1-3. - C. 4551.

101. Zhou Y., Little P. J., Ta H. T., Xu S., Kamato D. Lysophosphatidic acid and its receptors: pharmacology and therapeutic potential in atherosclerosis and vascular disease // Pharmacol Ther. - 2019. - T. 204. - C. 107404.

102. Macias M. J., Musacchio A., Ponstingl H., Nilges M., Saraste M., Oschkinat H. Structure of the pleckstrin homology domain from beta-spectrin // Nature. - 1994. -T. 369, № 6482. - C. 675-7.

103. Schmidt A., Hall A. Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases: turning on the switch // Genes Dev. - 2002. - T. 16, № 13. - C. 1587-609.

104. Hawkins P. T., Eguinoa A., Qiu R. G., Stokoe D., Cooke F. T., Walters R., Wennstrom S., Claesson-Welsh L., Evans T., Symons M., et al. PDGF stimulates an increase in GTP-Rac via activation of phosphoinositide 3-kinase // Curr Biol. - 1995.

- T. 5, № 4. - C. 393-403.

105. Lopez-Lago M., Lee H., Cruz C., Movilla N., Bustelo X. R. Tyrosine phosphorylation mediates both activation and downmodulation of the biological activity of Vav // Mol Cell Biol. - 2000. - T. 20, № 5. - C. 1678-91.

106. DeMali K. A., Burridge K. Coupling membrane protrusion and cell adhesion // J Cell Sci. - 2003. - T. 116, № Pt 12. - C. 2389-97.

107. Goldmann W. H. Mechanotransduction and focal adhesions // Cell Biol Int. -2012. - T. 36, № 7. - C. 649-52.

108. Wang Y., McNiven M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex // J Cell Biol. - 2012.

- T. 196, № 3. - C. 375-85.

109. Jobichen C., Pal K., Swaminathan K. Crystal structure of mouse RhoA:GTPgammaS complex in a centered lattice // J Struct Funct Genomics. -2012. - T. 13, № 4. - C. 241-5.

110. Lamarche N., Tapon N., Stowers L., Burbelo P. D., Aspenstrom P., Bridges T., Chant J., Hall A. Rac and Cdc42 induce actin polymerization and G1 cell cycle progression independently of p65PAK and the JNK/SAPK MAP kinase cascade // Cell. - 1996. - T. 87, № 3. - C. 519-29.

111. Jha R. K., Strauss C. E. 3D structure analysis of PAKs: A clue to the rational design for affinity reagents and blockers // Cell Logist. - 2012. - T. 2, № 2. - C. 6977.

112. Takenawa T., Miki H. WASP and WAVE family proteins: key molecules for rapid rearrangement of cortical actin filaments and cell movement // J Cell Sci. -2001. - T. 114, № Pt 10. - C. 1801-9.

113. Struckhoff A. P., Rana M. K., Worthylake R. A. RhoA can lead the way in tumor cell invasion and metastasis // Front Biosci (Landmark Ed). - 2011. - T. 16, № 5. - C. 1915-26.

114. Narumiya S., Tanji M., Ishizaki T. Rho signaling, ROCK and mDia1, in transformation, metastasis and invasion // Cancer Metastasis Rev. - 2009. - T. 28, № 1-2. - C. 65-76.

115. Mizutani T., Kawabata K., Koyama Y., Takahashi M., Haga H. Regulation of cellular contractile force in response to mechanical stretch by diphosphorylation of myosin regulatory light chain via RhoA signaling cascade // Cell Motil Cytoskeleton. - 2009. - T. 66, № 7. - C. 389-97.

116. Bravo-Cordero J. J., Oser M., Chen X., Eddy R., Hodgson L., Condeelis J. A novel spatiotemporal RhoC activation pathway locally regulates cofilin activity at invadopodia // Curr Biol. - 2011. - T. 21, № 8. - C. 635-44.

117. Tang Y., Olufemi L., Wang M. T., Nie D. Role of Rho GTPases in breast cancer // Front Biosci. - 2008. - T. 13. - C. 759-76.

118. Campellone K. G., Welch M. D. A nucleator arms race: cellular control of actin assembly // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2010. - T. 11, № 4. - C. 237-51.

119. El-Sibai M., Nalbant P., Pang H., Flinn R. J., Sarmiento C., Macaluso F., Cammer M., Condeelis J. S., Hahn K. M., Backer J. M. Cdc42 is required for EGF-

stimulated protrusion and motility in MTLn3 carcinoma cells // J Cell Sci. - 2007. -T. 120, № Pt 19. - C. 3465-74.

120. Nobes C. D., Hawkins P., Stephens L., Hall A. Activation of the small GTP-binding proteins rho and rac by growth factor receptors // J Cell Sci. - 1995. - T. 108 ( Pt 1). - C. 225-33.

121. Van Troys M., Huyck L., Leyman S., Dhaese S., Vandekerkhove J., Ampe C. Ins and outs of ADF/cofilin activity and regulation // Eur J Cell Biol. - 2008. - T. 87, № 8-9. - C. 649-67.

122. Price L. S., Leng J., Schwartz M. A., Bokoch G. M. Activation of Rac and Cdc42 by integrins mediates cell spreading // Mol Biol Cell. - 1998. - T. 9, № 7. -C. 1863-71.

123. Kaverina I., Krylyshkina O., Small J. V. Regulation of substrate adhesion dynamics during cell motility // Int J Biochem Cell Biol. - 2002. - T. 34, № 7. - C. 746-61.

124. Arjonen A., Kaukonen R., Ivaska J. Filopodia and adhesion in cancer cell motility // Cell Adh Migr. - 2011. - T. 5, № 5. - C. 421-30.

125. Hoffmann M., Schwarz U. S. A kinetic model for RNA-interference of focal adhesions // BMC Syst Biol. - 2013. - T. 7. - C. 2.

126. Kwiatkowska A., Symons M. Signaling determinants of glioma cell invasion // Adv Exp Med Biol. - 2013. - T. 986. - C. 121-41.

127. Palecek S. P., Huttenlocher A., Horwitz A. F., Lauffenburger D. A. Physical and biochemical regulation of integrin release during rear detachment of migrating cells // J Cell Sci. - 1998. - T. 111 ( Pt 7). - C. 929-40.

128. Cox E. A., Sastry S. K., Huttenlocher A. Integrin-mediated adhesion regulates cell polarity and membrane protrusion through the Rho family of GTPases // Mol Biol Cell. - 2001. - T. 12, № 2. - C. 265-77.

129. Vega F. M., Ridley A. J. Rho GTPases in cancer cell biology // FEBS Lett. -2008. - T. 582, № 14. - C. 2093-101.

130. Navarro-Lerida I., Pellinen T., Sanchez S. A., Guadamillas M. C., Wang Y., Mirtti T., Calvo E., Del Pozo M. A. Racl nucleocytoplasmic shuttling drives nuclear shape changes and tumor invasion // Dev Cell. - 2015. - T. 32, № 3. - C. 318-34.

131. Dubash A. D., Guilluy C., Srougi M. C., Boulter E., Burridge K., Garcia-Mata R. The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals // PLoS One. - 2011. - T. 6, № 2. - C. e17380.

132. Бобков Д. Е., Лукачева, А.В., Горб, А.И., Полянская, Г.Г. Роль малых ГТфаз семейства Rho в регуляции нормальных и патологических процессов // Цитология. - 2024. - T. 66, № 1. - C. 3-19.

133. Magalhaes Y. T., Farias J. O., Silva L. E., Forti F. L. GTPases, genome, actin: A hidden story in DNA damage response and repair mechanisms // DNA Repair (Amst). - 2021. - T. 100. - C. 103070.

134. Joyce D., Bouzahzah B., Fu M., Albanese C., D'Amico M., Steer J., Klein J. U., Lee R. J., Segall J. E., Westwick J. K., Der C. J., Pestell R. G. Integration of Rac-dependent Regulation of Cyclin D1 Transcription through a Nuclear Factor-κB-dependent Pathway * // Journal of Biological Chemistry. - 1999. - T. 274, № 36. - C. 25245-25249.

135. Montaner S., Perona R., Saniger L., Lacal J. C. Activation of Serum Response Factor by RhoA Is Mediated by the Nuclear Factor-κB and C/EBP Transcription Factors * // Journal of Biological Chemistry. - 1999. - T. 274, № 13. - C. 8506-8515.

136. Van Camp J. K., Beckers S., Zegers D., Van Hul W. Wnt Signaling and the Control of Human Stem Cell Fate // Stem Cell Reviews and Reports. - 2014. - T. 10, № 2. - C. 207-229.

137. Baarlink C., Plessner M., Sherrard A., Morita K., Misu S., Virant D., Kleinschnitz E. M., Harniman R., Alibhai D., Baumeister S., Miyamoto K., Endesfelder U., Kaidi A., Grosse R. A transient pool of nuclear F-actin at mitotic exit controls chromatin organization // Nat Cell Biol. - 2017. - T. 19, № 12. - C. 1389-1399.

138. Yoo Y., Wu X., Guan J. L. A novel role of the actin-nucleating Arp2/3 complex in the regulation of RNA polymerase II-dependent transcription // J Biol Chem. -2007. - T. 282, № 10. - C. 7616-23.

139. Li J., Wang J., Jiao H., Liao J., Xu X. Cytokinesis and cancer: Polo loves ROCK'n' Rho(A) // J Genet Genomics. - 2010. - T. 37, № 3. - C. 159-72.

140. Mettouchi A., Klein S., Guo W., Lopez-Lago M., Lemichez E., Westwick J. K., Giancotti F. G. Integrin-specific activation of Rac controls progression through the G(1) phase of the cell cycle // Mol Cell. - 2001. - T. 8, № 1. - C. 115-27.

141. Новоселецкая Е. С., Григорьева, О.А., Ефименко, А.Ю., Калинина, Н.И. Внеклеточный матрикс в регуляции дифференцировки стволовых клеток // Биохимия. - 2019. - T. 84. - C. 343-353.

142. Poljanskaya G., Bobkov, D., Koltsova, A., Musorina, A., Mikhailova, N. Creation, working principles, development of applied and fundamental scientific activities of the Collection of Cell Cultures of Vertebrates // Biological Communications. - 2022. - T. 67. - C. 312-330.

143. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. - 2006. - T. 8, № 4. - C. 315-7.

144. Koltsova A. M., Krylova, T. A., Musorina, A. S., Zenin, V. V., Turilova, V. I., Yakovleva, T. K., Poljanskaya, G. G. The Dynamics of Cell Properties during Long-Term Cultivation of Two Lines of Mesenchymal Stem Cells Derived from Wharton's Jelly of Human Umbilical Cord // Cell and Tissue Biology. - 2018. - T. 12, № 1. - C. 7-19.

145. Krylova T. A., Kol'tsova A. M., Zenin V. V., Musorina A. S., Iakovleva T. K., Polianskaia G. G. [Comparative characteristics of new mesenchymal stem cell lines derived from human embryonic stem cells, bone marrow and foreskin] // Tsitologiia. - 2012. - T. 54, № 1. - C. 5-16.

146. Cleaver J. E., Cortes F., Lutze L. H., Morgan W. F., Player A. N., Mitchell D. L. Unique DNA repair properties of a xeroderma pigmentosum revertant // Mol Cell Biol. - 1987. - T. 7, № 9. - C. 3353-7.

147. Collection of Vertebrate Cell Cultures: Creation, Activity / Под ред. Poljanskaya G., Musorina, A.; Sciences I. o. c. o. R. A. o. - Peater the Great Saint Petersbutg Polytechnic University: Publishing House of the Polytechnic University, 2018.

148. ImageJ User Guide 1.46r. / Tiago Ferreira W. R., 2012.

149. Selmeczi D., Mosler S., Hagedorn P. H., Larsen N. B., Flyvbjerg H. Cell motility as persistent random motion: theories from experiments // Biophys J. -2005. - T. 89, № 2. - C. 912-31.

150. Donald James McLean M. A. S. V. trajr: An R package for characterisation of animal trajectories // ETHOLOGY. - 2018. - T. 124, № 6. - C. 440-448.

151. Wortel I. M. N., Liu A. Y., Dannenberg K., Berry J. C., Miller M. J., Textor J. CelltrackR: An R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data // Immunoinformatics (Amst). - 2021. - T. 1-2.

152. Bovet P., & Benhamou, S. Spatial Analysis of Animals' Movements Using a Correlated Random Walk Model // Journal of Theoretical Biology. - 1988. - T. 131, № 4. - C. 419-433.

153. Kareiva P. M., Shigesada N. Analyzing insect movement as a correlated random walk // Oecologia. - 1983. - T. 56, № 2-3. - C. 234-238.

154. Benhamou S. How to reliably estimate the tortuosity of an animal's path: straightness, sinuosity, or fractal dimension? // J Theor Biol. - 2004. - T. 229, № 2. - C. 209-20.

155. Mokhtari Z., Mech F., Zitzmann C., Hasenberg M., Gunzer M., Figge M. T. Automated characterization and parameter-free classification of cell tracks based on local migration behavior // PLoS One. - 2013. - T. 8, № 12. - C. e80808.

156. Michalet X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium // Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. - 2010. - T. 82, № 4 Pt 1. - C. 041914.

142

157. Sagi Y., Brook M., Almog I., Davidson N. Observation of anomalous diffusion and fractional self-similarity in one dimension // Phys Rev Lett. - 2012. - T. 108, №2 9. - C. 093002.

158. Bruno L., Levi V., Brunstein M., Desposito M. A. Transition to superdiffusive behavior in intracellular actin-based transport mediated by molecular motors // Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. - 2009. - T. 80, № 1 Pt 1. - C. 011912.

159. Regner B. M., Vucinic D., Domnisoru C., Bartol T. M., Hetzer M. W., Tartakovsky D. M., Sejnowski T. J. Anomalous diffusion of single particles in cytoplasm // Biophys J. - 2013. - T. 104, № 8. - C. 1652-60.

160. Codling E. A., Plank M. J., Benhamou S. Random walk models in biology // J R Soc Interface. - 2008. - T. 5, № 25. - C. 813-34.

161. Statistac L. LaplacesDemon: Complete Environment for Bayesian Inference // Book LaplacesDemon: Complete Environment for Bayesian Inference / EditorBayesian-Inference.com, 2021.

162. Costes S. V., Daelemans D., Cho E. H., Dobbin Z., Pavlakis G., Lockett S. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells // Biophys J. - 2004. - T. 86, № 6. - C. 3993-4003.

163. Alhussein G., Shanti A., Farhat I. A., Timraz S. B., Alwahab N. S., Pearson Y. E., Martin M. N., Christoforou N., Teo J. C. A spatiotemporal characterization method for the dynamic cytoskeleton // Cytoskeleton (Hoboken). - 2016. - T. 73, № 5. - C. 221-32.

164. Qian A. R., Li D., Han J., Gao X., Di S. M., Zhang W., Hu L. F., Shang P. Fractal dimension as a measure of altered actin cytoskeleton in MC3T3-E1 cells under simulated microgravity using 3-D/2-D clinostats // IEEE Trans Biomed Eng.

- 2012. - T. 59, № 5. - C. 1374-80.

165. Fuseler J. W., Valarmathi M. T. Nitric Oxide Modulates Postnatal Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Migration // Front Cell Dev Biol. - 2016.

- T. 4. - C. 133.

166. Fuseler J. W., Millette C. F., Davis J. M., Carver W. Fractal and image analysis of morphological changes in the actin cytoskeleton of neonatal cardiac fibroblasts in

143

response to mechanical stretch // Microsc Microanal. - 2007. - T. 13, N° 2. - C. 13343.

167. Karperien A. FracLac for ImageJ. - 2012. - URL: http://rsb.info.nih.gov/ii/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm

168. Wilson E. B. Probable Inference, the Law of Succession, and Statistical Inference // Journal of the American Statistical Association. - 1927. - T. 22, №2 158.

169. Shapiro S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples) // Biometrika. - 1965. - T. 52, № 3-4. - C. 591-611.

170. Anderson T. W. D. D. A. Asymptotic Theory of Certain "Goodness of Fit" Criteria Based on Stochastic Processes // The Annals of Mathematical Statistics. -1952. - T. 23, № 2. - C. 193-212.

171. D'agostino R. B. B. A., D'agostino R. B. A Suggestion for Using Powerful and Informative test of Normality // The American Statistician. - 1990. - T. 44, № 1. -C. 316-321.

172. N. S. Table for Estimating the Goodness of Fit of Empirical Distributions // The Annals of Mathematical Statistics. - 1948. - T. 19. - C. 279-281.

173. Welch B. L. The generalisation of student's problems when several different population variances are involved // Biometrika. - 1947. - T. 34, № 1-2. - C. 28-35.

174. Kruskal W. A Nonparametric test for the Several Sample Problem // Annals of Mathematical Statistics. - 1952. - T. 23, № 4. - C. 525-540.

175. Arora P., Boyne D., Slater J. J., Gupta A., Brenner D. R., Druzdzel M. J. Bayesian Networks for Risk Prediction Using Real-World Data: A Tool for Precision Medicine // Value Health. - 2019. - T. 22, № 4. - C. 439-445.

176. Koot P. J. P., Mendoza-Lugo, M. A., Paprotny, D., Morales-Nápoles, O., Ragno, E., Worm, D.T.H. PyBanshee version (1.0): A Python implementation of the MATLAB toolbox BANSHEE for Non-Parametric Bayesian Networks with updated features // SoftwareX. - 2023. - T. 21, № 3. - C. 101279-101279.

177. Mikhail I. Bogachev D. V. T., Artur M. Gafurov, Bulat I. Gareev, Rasul G. Imaev, Dmitrii I. Kaplun, Maria I. Markelova, Nikita S. Pyko, Svetlana A. Pyko, Valeria A. Romanova, Anastasiia N. Safonova, Aleksandr M. Sinitca, Bulat M.

144

Usmanov, Airat R. Kayumov. The impact of Grey Heron (Ardea cinerea L.) colony on soil biogeochemistry and vegetation: a natural long-term in situ experiment in a planted pine forest // Frontiers in Environmental Science. - 2023. - T. 11. - C. 1197657.

178. Bogachev M., Sinitca A., Grigarevichius K., Pyko N., Lyanova A., Tsygankova M., Davletshin E., Petrov K., Ageeva T., Pyko S., Kaplun D., Kayumov A., Mukhamedshina Y. Video-based marker-free tracking and multi-scale analysis of mouse locomotor activity and behavioral aspects in an open field arena: A perspective approach to the quantification of complex gait disturbances associated with Alzheimer's disease // Front Neuroinform. - 2023. - T. 17. - C. 1101112.

179. Liu Y., Li Y. Q., Wang H. Y., Li Y. J., Liu G. Y., Xu X., Wu X. B., Jing Y. G., Yao Y., Wu C. T., Jin J. D. Effect of serum choice on replicative senescence in mesenchymal stromal cells // Cytotherapy. - 2015. - T. 17, № 7. - C. 874-84.

180. Vultaggio-Poma V., Scussel Bergamin L., Falzoni S., Tarantini M., Giuliani A. L., Sandona D., Polverino De Laureto P., Di Virgilio F. Fetal bovine serum contains biologically available ATP // Purinergic Signal. - 2024. - T. 20, № 1. - C. 83-89.

181. Khasawneh R. R., Al Sharie A. H., Abu-El Rub E., Serhan A. O., Obeidat H. N. Addressing the impact of different fetal bovine serum percentages on mesenchymal stem cells biological performance // Mol Biol Rep. - 2019. - T. 46, № 4. - C. 4437-4441.

182. Barkholt L., Flory E., Jekerle V., Lucas-Samuel S., Ahnert P., Bisset L., Buscher D., Fibbe W., Foussat A., Kwa M., Lantz O., Maciulaitis R., Palomaki T., Schneider C. K., Sensebe L., Tachdjian G., Tarte K., Tosca L., Salmikangas P. Risk of tumorigenicity in mesenchymal stromal cell-based therapies--bridging scientific observations and regulatory viewpoints // Cytotherapy. - 2013. - T. 15, № 7. - C. 753-9.

183. Rebehn L., Khalaji S., KleinJan F., Kleemann A., Port F., Paul P., Huster C., Nolte U., Singh K., Kwapich L., Pfeil J., Pula T., Fischer-Posovszky P., Scharffetter-Kochanek K., Gottschalk K. E. The weakness of senescent dermal fibroblasts // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2023. - T. 120, № 34. - C. e2301880120.

145

184. Ghosh D., Mejia Pena C., Quach N., Xuan B., Lee A. H., Dawson M. R. Senescent mesenchymal stem cells remodel extracellular matrix driving breast cancer cells to a more-invasive phenotype // J Cell Sci. - 2020. - T. 133, № 2.

185. Tiurin-Kuz'min P. A., Vorotnikov A. V., Tkachuk V. A. [Molecular mechanisms of gradient sensing in mesenchymal cells] // Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova. - 2013. - T. 99, № 3. - C. 294-312.

186. McHugh D., Gil J. Senescence and aging: Causes, consequences, and therapeutic avenues // J Cell Biol. - 2018. - T. 217, № 1. - C. 65-77.

187. Pijuan J., Barcelo C., Moreno D. F., Maiques O., Siso P., Marti R. M., Macia A., Panosa A. In vitro Cell Migration, Invasion, and Adhesion Assays: From Cell Imaging to Data Analysis // Front Cell Dev Biol. - 2019. - T. 7. - C. 107.

188. Vis M. A. M., Ito K., Hofmann S. Impact of Culture Medium on Cellular Interactions in in vitro Co-culture Systems // Front Bioeng Biotechnol. - 2020. - T. 8. - C. 911.

189. Бобков Д. Е., Полянская, А. В., Мусорина, А. С., Ломерт, Е. В., Полянская, Г. Г. Клеточная подвижность и структура цитоскелета под влиянием активатора и ингибитора малой ГТФазы RhoA в процессе репликативного старения линии МСК, выделенной из кожи век взрослого донора // Цитология. - 2022. - T. 64, № 5. - C. 466-477.

190. Burja B., Barlic A., Erman A., Mrak-Poljsak K., Tomsic M., Sodin-Semrl S., Lakota K. Human mesenchymal stromal cells from different tissues exhibit unique responses to different inflammatory stimuli // Curr Res Transl Med. - 2020. - T. 68, № 4. - C. 217-224.

191. Liu M., Lei H., Dong P., Fu X., Yang Z., Yang Y., Ma J., Liu X., Cao Y., Xiao R. Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells from the Elderly Exhibit Decreased Migration and Differentiation Abilities with Senescent Properties // Cell Transplant. - 2017. - T. 26, № 9. - C. 1505-1519.

192. Walmod P. S., Hartmann-Petersen R., Prag S., Lepekhin E. L., Ropke C., Berezin V., Bock E. Cell-cycle-dependent regulation of cell motility and

determination of the role of Rac1 // Exp Cell Res. - 2004. - T. 295, № 2. - C. 40720.

193. Chen S., Liang B., Xu J. Unveiling heterogeneity in MSCs: exploring marker-based strategies for defining MSC subpopulations // J Transl Med. - 2024. - T. 22, № 1. - C. 459.

194. McKinnon K. M. Flow Cytometry: An Overview // Curr Protoc Immunol. -2018. - T. 120. - C. 5 1 1-5 1 11.

195. Adan A., Alizada G., Kiraz Y., Baran Y., Nalbant A. Flow cytometry: basic principles and applications // Crit Rev Biotechnol. - 2017. - T. 37, № 2. - C. 163176.

196. Taherian Fard A., Leeson H. C., Aguado J., Pietrogrande G., Power D., Gomez-Inclan C., Zheng H., Nelson C. B., Soheilmoghaddam F., Glass N., Dharmaratne M., Watson E. R., Lu J., Martin S., Pickett H. A., Cooper-White J., Wolvetang E. J., Mar J. C. Deconstructing heterogeneity of replicative senescence in human mesenchymal stem cells at single cell resolution // Geroscience. - 2024. - T. 46, № 1. - C. 9991015.

197. Payapilly A., Malliri A. Compartmentalisation of RAC1 signalling // Curr Opin Cell Biol. - 2018. - T. 54. - C. 50-56.

198. Hinde E., Yokomori K., Gaus K., Hahn K. M., Gratton E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation // Scientific Reports. - 2014. - T. 4, № 1. - C. 4219.

199. Kim J. G., Islam R., Cho J. Y., Jeong H., Cap K. C., Park Y., Hossain A. J., Park J. B. Regulation of RhoA GTPase and various transcription factors in the RhoA pathway // J Cell Physiol. - 2018. - T. 233, № 9. - C. 6381-6392.

200. Debidda M., Williams D. A., Zheng Y. Rac1 GTPase regulates cell genomic stability and senescence // J Biol Chem. - 2006. - T. 281, № 50. - C. 38519-28.