Стабильная гомогенная форма рецептора GPR17 для структурно-функциональных исследований тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Сафронова Надежда Александровна

• Сафронова Надежда Александровна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Сафронова Надежда Александровна

Введение

Актуальность работы

Актуальность определения пространственных структур рецепторов класса GPCR

Актуальность структурно-функциональных исследований GPR17

Цели и задачи работы

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Объем и структура диссертации

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Рецепторы, сопряженные с G-белком, и их лиганды

1.1.1. Рецепторы класса GPCR и их партнеры по передаче сигнала

1.1.2. Классификация лигандов GPCR

1.1.3. Численные характеристики взаимодействия рецептора и лиганда

1.1.3.1. Константа диссоциации

1.1.3.2. EC50 и ГС50

1.1.3.3. pA2

1.1.3.4. Emax

1.2. GPR17: общая информация

1.3. Экспрессия GPR17

1.4. Функции GPR17 в организме

1.4.1. Регуляция созревания олигодендроцитов

1.4.2. Роль при травмах и ишемии

1.4.3. Метаболизм глюкозы

1.4.4. Другие роли GPR17

1.5. Лиганды GPR17

1.5.1. Эндогенные лиганды

1.5.2. Синтетические лиганды

1.6. Изоформы GPR17

1.7. Димеризация GPR17

1.7.1. Образование гомодимеров

1.7.2. Гетеродимеризация с цистеинил-лейкотриеновыми рецепторами

1.7.3. Гетеродимеризация с хемокиновыми рецепторами

1.8. Партнеры GPR17 по передаче сигнала

1.8.1. Факторы Olig1 и Olig2

1.8.2. G-белки

1.8.3. GRK-киназы

1.8.4. Аррестины

1.8.5. ERK-киназы

1.8.6. Фактор FoxO1

1.8.7. Активные формы кислорода

1.8.8. Другие молекулы, влияющие на GPR17

1.9. Описанные в литературе мутации GPR17

1.10. Трехмерная структура GPR17

1.10.1. Криоэлектронная микроскопия комплекса в активном состоянии

1.10.2. Компьютерное моделирование

1.11. Заболевания, ассоциированные с GPR17

1.11.1. Ишемия

1.11.1.1. Перивентрикулярная лейкомаляция

1.11.1.2. Травмы

1.11.2. Болезнь Альцгеймера

1.11.3. Болезнь Паркинсона

1.11.4. Рассеянный склероз

1.11.5. Общие возрастные изменения

1.11.6. Ожирение и метаболический синдром

1.11.7. Синдром Дауна

1.11.8. Шизофрения

1.11.9. Бешенство

1.11.10. Остеоартрит

1.11.11. Легочный фиброз

1.11.12. Боковой амиотрофический склероз

1.11.13. Хронический риносинусит

1.11.14. Раковые заболевания

1.11.14.1. Глиома

1.11.14.2. Хронический лимфоцитарный лейкоз

1.11.14.3. Множественная эндокринная неоплазия

1.11.14.4. Колоректальный рак

1.12. Важность для фармакологии

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1 Молекулярное клонирование

2.1.2. Экспрессия белков

2.1.3. Выделение, очистка и характеризация экспрессированных белков

2.1.3.1. Анализ экспрессии белка и функциональные тесты в клетках HEK293T

2.2. Методы

2.2.1. Приготовление компетентных клеток

2.2.2. Определение компетентности клеток Тор10

2.2.3. Трансформация компетентных клеток Тор10

2.2.4. Получение генетических конструкций

2.2.5. Трансформация компетентных клеток DH10Bac

2.2.6. Выделение бакмиды

2.2.7. Трансфекция

2.2.8. Получение вируса P1 и его титрование

2.2.9. Экспрессия рецептора в клетках Sf9

2.2.10. Определение полной и поверхностной экспрессии рецептора в Sf9

2.2.11. Экспрессия модифицированного фрагмента антитела scFv16

2.2.12. Очистка scFv16

2.2.13. Выделение и очистка мембранного рецептора

2.2.14. Выделение и очистка комплекса рецептора с G-белками

2.2.15. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.2.16. Эксклюзионная хроматография

2.2.16.1. Аналитическая эксклюзионная хроматография

2.2.16.2. Препаративная эксклюзионная хроматография

2.2.17. Определение термостабильности рецептора

2.2.18. Определение подвижности рецептора в липидной кубической фазе методом FRAP

2.2.19. Кристаллизация рецептора в LCP

2.2.20. Криоэлектронная микроскопия

2.2.21. Функциональные тесты

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Оптимизация генно-инженерных конструкций

3.1.1. Первый этап оптимизации

3.1.2. Второй этап оптимизации

3.1.3. Поиск термостабилизирующих точечных мутаций

3.2. Оптимизация протоколов выделения

3.3. Подбор лигандов

3.4. Постановка кристаллизации и анализ подвижности рецептора в LCP

3.5. Эксперименты по сборке комплекса активной формы рецептора

3.6. Анализ протестированных мутаций

Глава 4. Основные выводы работы

Опубликованные работы по теме диссертации

Публикации в научных изданиях

Личный вклад соискателя в публикациях на тему диссертации

Апробация работы

Тезисы и сборники трудов всероссийских конференций

Тезисы и сборники трудов международных конференций

Благодарности

Список используемых сокращений и аббревиатур

Список литературы

Приложение

Приложение 1. Структурные формулы всех упоминаемых лигандов GPR17

Приложение 2. Поверхностная экспрессия всех протестированных генно-инженерных конструкций GPR17

Приложение 3. Кривые плавления для конструкции R252-BRIL-V253 с различными точечными мутациями и их комбинациями

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стабильная гомогенная форма рецептора GPR17 для структурно-функциональных исследований»

Актуальность работы

Актуальность определения пространственных структур рецепторов класса GPCR

Рецепторы, сопряженные с G-белком (англ. G protein-coupled receptors, GPCR), -важнейший для фармакологии класс мембранных белков: около 35% фармацевтических препаратов на рынке действуют именно на рецепторы этого семейства. В настоящее время в разработке находится более 300 новых препаратов к различным GPCR, и 20% из них нацелены на рецепторы, для которых пространственная структура еще не определена. При этом структура высокого разрешения крайне важна для разработки новых лекарственных средств, нацеленных на этот рецептор. [1], [2]

Структура высокого разрешения дает понимание молекулярного механизма действия GPCR-мишени, дает возможность провести виртуальный скрининг химических соединений-кандидатов, а также позволяет облегчить оптимизацию соединений-лидеров путем картирования лиганд-связывающего кармана. В итоге и временные, и финансовые затраты на разработку нового лекарственного препарата сокращаются в примерно в 1.5 раза: экономия доходит до сотен миллионов долларов. [1], [2] Именно поэтому во многих странах, включая Россию, создавались программы по определению отсутствующих структур GPCR рецепторов. Рецепторы класса GPCR входят в Перечень биомишеней для разработки схожих по фармакотерапевтическому действию и улучшенных аналогов инновационных лекарственных препаратов (МинпромТорг России, Минздрав России, приказ от 19 мая 2016 года N 1605/308н, с изменениями: приказ от 22 марта 2018 года N 991/115н, приказ от 12 февраля 2019 года N 373/55н) и составляют примерно четвертую его часть. Исследования этих рецепторов весьма сложны из-за низкого природного уровня экспрессии, высокой конформационной подвижности и низкой стабильности GPCR. Работы по изучению структур и функций рецепторов класса GPCR были удостоены Нобелевской премии по химии в 2012 году.

Актуальность структурно-функциональных исследований GPR17

Предметом данного научного исследования является человеческий рецептор GPR17 из класса GPCR. Данный рецептор экспрессируется во многих органах и тканях человеческого организма, но с фармакологической точки зрения наиболее важна экспрессия GPR17 в центральной нервной системе и в клетках кишечного эпителия. В кишечнике GPR17 замедляет секрецию гормона GLP-1, что напрямую влияет на аппетит и регулирует уровень глюкозы в крови. [3] В головном и спинном мозге GPR17 является негативным регулятором формирования миелиновой оболочки, проявляя свою активность в ходе эмбрионального развития, а также при различных травмах и поражениях нервной ткани (в том числе ишемические повреждения и заболевания, связанные с недостатком миелина, например, рассеянный склероз). Ингибирование GPR17 способствует восстановлению миелиновых оболочек поврежденных нейронов. [4]

Все вышесказанное делает GPR17 потенциальной мишенью для разработки селективных ингибиторов - потенциальных лекарственных препаратов против ожирения, ишемии и нейродегенеративных заболеваний, в особенности, против рассеянного склероза. Для разработки высокоспецифичных препаратов с минимальными побочными эффектами необходимо знать структуру высокого разрешения рецептора в неактивной конформации. В настоящее время известна структура GPR17 в активном состоянии [5], но, к сожалению, ее разрешение в области лиганд-связывающего кармана недостаточно высоко для точного позиционирования аминокислотных остатков. Структура неактивной конформации лиганд-связывающего кармана на сегодняшний день неизвестна. В данных обстоятельствах не вызывает сомнений актуальность дальнейших структурно-функциональных исследований рассматриваемого рецептора.

Цели и задачи работы

Главными целями данного исследования являлись:

• получение стабильного и мономерного препарата GPR17 для дальнейших структурно-функциональных исследований;

• сборка комплекса GPR17 с G-белками;

• поиск модификаций рецептора и/или его лигандов, оказывающих положительное влияние на уровень экспрессии, термостабильность и мономерность рецептора.

Были поставлены следующие задачи:

1. Обеспечить экспрессию рецептора в гетерологической системе, в качестве которой была выбрана культура клеток (овариальная культура из Spodoptera Frugiperda).

2. Определить необходимые для стабилизации рецептора генно-инженерные модификации, такие как стабилизирующие точечные мутации, а также слияние аминокислотных последовательностей рецептора и партнерного белка.

3. Оптимизировать протокол очистки рецептора так, чтобы очищенный белковый препарат был достаточно стабильным, мономерным, а также наработан в достаточном для структурных исследований количестве.

4. Выполнить скрининг различных модификаций аминокислотной последовательности GPR17, в частности, ряда точечных мутаций, а также - скрининг потенциальных лигандов для термостабилизации очищенного рецептора.

5. Опробовать различные методы исследования структуры рецептора - кристаллизацию в липидной кубической фазе с дальнейшим рентгеноструктурным анализом и криоэлектронную микроскопию. Отдельно оптимизировать генно-инженерные конструкции рецептора и протоколы выделения и очистки для каждого метода исследования структуры.

Научная новизна

В настоящей работе впервые оптимизирована экспрессия орфанного рецептора класса А GPCR GPR17 в неактивном состоянии в культуре клеток Sf9. Показана зависимость экспрессии, мономерности и термостабильности рецептора GPR17 от различных модификаций аминокислотной последовательности и положения белка-партнера. Также впервые оптимизированы протоколы выделения и очистки данного рецептора для проведения различных структурно-функциональных исследований: кристаллизации, сборки комплекса с аффинными антителами и последующей криоэлектронной микроскопии.

Теоретическая и практическая значимость

В результате данного исследования был разработан ряд генно-инженерных конструкций GPR17, оптимизированных для выделения и очистки рецептора из клеток Были выявлены точечные мутации, которые показали эффект увеличения экспрессии рассматриваемого рецептора и повышение его термостабильности. Также был улучшен протокол очистки GPR17 и определены оптимальные составы буферных растворов. Используя протоколы и генно-инженерные конструкции, разработанные и оптимизированные в ходе данного исследования, можно получить стабильный и мономерный препарат GPR17. Описанные разработки могут быть использованы как для структурно-функциональных исследований GPR17, так и выступать в качестве примера стратегии для оптимизации работы с новыми GPCR.

Методология и методы исследования

Решение поставленных задач требует глубокого понимания методик и подходов как из разных областей биохимии, биофизики, молекулярной биологии и генной инженерии, так и из области современной физики, математики и биоинформатики. Поэтому данное научное исследование является в полном смысле слова мультидисциплинарным.

В работе были использованы нижеследующие методы и технологии:

• Генно-инженерные методы модификации белков: вырезание и вставка фрагментов аминокислотной последовательности, введение точечных мутаций.

• Бакуловирусная экспрессия мембранных белков в эукариотических клетках насекомых.

• Проточная цитофлуориметрия для анализа качества клеток, измерения титра заражающего бакуловируса, а также для количественного анализа экспрессии целевого белка.

• Лизис клеток и очистка мембранной фракции путем гомогенизации в гипо- и гипертонических буферах с последующим центрифугированием.

• Солюбилизация мембранных белков в детергентных мицеллах.

• Очистка белка методами металл-аффинной хроматографии и препаративной гель-фильтрации.

• Электрофорез в полиакриламидном геле, аналитическая гель-фильтрационная хроматография, исследование белковой стабильности методом анализа кривых плавления.

• Исследование диффузии белка в липидной кубической фазе методом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания. Кристаллизация в липидной кубической фазе методом in meso.

• Сборка комплекса рецептора в мицеллах с G белками и аффинным фрагментом антитела.

Положения, выносимые на защиту

1. Определены генно-инженерные модификации рецептора GPR17, увеличивающие экспрессию белка в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых: химерный белок-партнер b562RIL в третьей внутриклеточной петле между аминокислотными остатками R252 и V253 в комбинации с мутацией A329757D увеличивает долю рецептора, успешно встроенного в плазматическую клеточную мембрану, с 0% до 70%.

2. Оптимизированы протоколы экспрессии и очистки рецептора GPR17, основанные на детергентной солюбилизации и металл-хелатной аффинной хроматографии, позволяющие получить белок с достаточным для структурных исследований выходом (0,6 мг/л), гомогенностью (90% рецептора в мономерном состоянии) и термостабильностью (температура плавления 62 °С) и подходящие как для последующей кристаллизации GPR17, так и для исследований методом криоэлектронной микроскопии.

3. Получены и проанализированы экспериментальные и теоретические данные по эффекту воздействия ряда точечных мутаций на GPR17. Идентифицированы как мутации, положительно влияющие на уровень экспрессии, мономерность и термостабильность рассматриваемого рецептора, так и мутации, дестабилизирующие его.

4. Точечные мутации A131324L, Y148341W, F158351Y, F231549L, I234552L повышают степень мономерности рецептора при выделении и очистке до 90%, а температуру денатурации -до 62 »С.

Степень достоверности и апробация результатов

Все данные, представленные в литературном обзоре, опираются на публикации в

ведущих рецензируемых журналах, индексируемых базами данных Web of Sciences, Scopus и

РИНЦ, либо на общепринятые университетские учебники и книги по фармакологии и

медицинской химии. Приведенные экспериментальные данные проверялись общепринятыми статистическими критериями, также проводились повторные эксперименты для подтверждения воспроизводимости. Промежуточные результаты работы были представлены на 25 научных конференциях, в том числе в виде 14 докладов автора диссертации. Результаты работы опубликованы в журнале Биоорганическая химия [6], а двухстатейный обзор новейших методов структурной биологии, используемых в разработке лекарственных препаратов - в журнале Биохимия [1,2].

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, основные выводы работы, публикации по ее результатам, список использованной литературы. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и включает в себя 42 рисунка и 14 таблиц. Список литературы содержит 169 источников. Приложение к диссертации содержит 29 страниц.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Рецепторы, сопряженные с G-белком, и их

лиганды

1.1.1. Рецепторы класса GPCR и их партнеры по передаче сигнала

Рецепторы, сопряженные с G-белком, - семейство трансмембранных рецепторов, включающее в себя 805 различных белков, согласно базе данных GPCRdb.org. Семейство GPCR составляет около 4% от всего генома, кодирующего белки, при этом сами рецепторы являются мишенями для 40% выпускаемых сегодня лекарств [2].

Семейство GPCR отличается богатейшим разнообразием как внеклеточных лигандов, так и эффектов, вызываемых ими в клетке. Среди эндогенных лигандов, активирующих GPCR -нейромедиаторы, гормоны, пептиды, нуклеотиды, ионы, липиды, пахучие вещества, протеазы, фотоны света и пр. [7]

Главные белки-партнеры, передающие сигнал в клетку от рецепторов класса GPCR -гетеротримерные G-белки, состоящие из а-, в- и у-субъединиц, которые при активации рецептором распадаются на а- и Ру-субъединицы (см. рисунок 1). В неактивном состоянии а-субъединица связана с молекулой ГДФ. Когда происходит активация рецептора внеклеточным лигандом, ГДФ заменяется на ГТФ. После этого G-белок разделяется на две части: а- и Ру-субъединицы. Каждая из них взаимодействует со своим эффектором, запуская каскады реакций внутри клетки. Описанные процессы схематично изображены на рисунках 1 и 2.

Рисунок 1. Активация G-белков при присоединении лиганда к рецептору.

Иллюстрация адаптирована из работы [8].

Рисунок 2. Разнообразие лигандов рецепторов класса GPCR и вызываемых ими внутриклеточных эффектов.

Иллюстрация адаптирована из работы [9]. GRK - киназы рецепторов, связанных с G-белками, PKA - протеинкиназа А, GTP - гуанозинтрифосфат, PI3K -фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат-3-киназа, PLC - фосфолипаза С, cAMP - циклический аденозин монофосфат.

В протеоме человека существует 16 различных а-субъединиц, которые делятся на четыре семейства на основе гомологии и связанных с ними сигнальных путей (см. рис. 2):

• Gas (Gas и Gaolf) - а-субъединицы данного семейства активируют аденилатциклазу, в результате чего уровень cAMP в клетке растет.

• Gai/o (Gai1, Gai2, Gai3, Gao, Gat1, Ga^, Ga^ и Gaz) - наоборот, ингибирует аденилатциклазу, концентрация сАМР снижается. Также Gai может мобилизовывать внутриклеточный кальций, но только при непосредственном участии белка Gaq, без которого активация фосфолипазы C невозможна [10].

• Gaq/11 (Gaq, Gan, Ga14 и Ga15) - активирует фосфолипазу С, в результате чего в клетке повышается уровень кальция (см. рис. 3).

• Ga12/13 (Ga12 и Ga13) - взаимодействуют с факторами обмена гуанин-нуклеотида (англ. guanine nucleotide exchange factors - GEF). Регулируют ремоделирование цитоскелета в клетках [11].

Рисунок 3. Мобилизация внутриклеточного кальция в результате активации фосфолипазы C субъединицами Gai и/или Gaq.

PIP2 - фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат, DAG - диацилглицерол, IP3 - инозитол 1,4,5-трифосфат, PKC - протеинкиназа С. Иллюстрация адаптирована из книги [12].

Кроме G-белков, рецепторы класса GPCR взаимодействуют с двумя другими семействами сигнальных белков: с аррестинами и с GRK-киназами. Как правило, рецептор последовательно взаимодействует с G-белком, GRK и аррестином. Однако GRK и аррестины могут присоединяться к GPCR и связываться с ними независимо от функционально активных G-белков. [13]

GRK-киназы - это рецепторные киназы, связанные с G-белком и представляющие собой группу из семи ферментов — серин/треониновых протеинкиназ, которые связываются с активированными GPCR и фосфорилируют их по остаткам Ser и Thr. Далее с фосфорилированными остатками связываются аррестины, которые деактивируют GPCR-рецепторы, блокируя их дальнейшую активацию и запуская процесс интернализации с помощью белка клатрина [14,15]. Интернализованный белок иногда продолжает передавать сигналы внутри клетки или разрушается в протеасомах. Также он может быть направлен обратно в плазматическую мембрану — этот процесс тоже регулируется аррестинами. Взаимодействие рецептора с GRK-киназой и аррестином схематично изображено на рисунке 4.

Рисунок 4. Взаимодействие GPCR с GRK-киназой и бета-аррестином.

Иллюстрация адаптирована из работы [16].

Помимо вышесказанного, аррестины связывают GPCR с другими сигнальными путями, включая активацию нерецепторной тирозинкиназы SRC (сокр. от англ. sarcoma, саркома, т.к. повышенная активность данной киназы связана с прогрессированием рака) и митоген-активируемой протеинкиназы (другое название - ERK-киназа, англ. Extracellular signal-Regulated kinases или MAPK-киназа, англ. Mitogen activated protein kinase). В этих каскадах аррестины выступают в роли адаптеров и каркасов, способствуя пространственной организации взаимодействия киназ друг с другом и с рецептором [17].

На функционирование GPCR также влияет гомо- и гетеродимеризация, которая характерна для многих рецепторов. Этот процесс изменяет подвижность белка на клеточной мембране, его транспорт внутрь клетки, а также модулирует передачу сигнала рецептором [18].

Эффект смещенной сигнализации (или эффект функциональной селективности лигандов) — активация одних сигнальных путей в ущерб другим в зависимости от лиганда. На сегодняшний день наиболее изучено смещение между G-белками и аррестинами, но исследования последних лет показали возможность смещения между семействами G-белков и даже между подтипами, принадлежащими к одному семейству. Механизм смещенной сигнализации может быть объяснен конформационным отбором. В частности, лиганд и эффектор, связывающиеся с противоположных сторон клеточной мембраны, могут предпочитать одну и ту же конформацию рецептора и тем самым аллостерически выбирать друг друга. Терапевтическое использование смещенной сигнализации может повысить эффективность лекарств, избегая при этом побочных эффектов, связанных с определенными путями передачи сигналов. [13]

1.1.2. Классификация лигандов GPCR

Лиганды, которые связываются с основным (ортостерическим) сайтом рецептора, называются ортостерическими. А лиганды, влияющие на активность рецептора путем связывания с дополнительным (аллостерическим) сайтом, отличным от основного, — аллостерическими модуляторами.

Если рассматривать, как синтетические лиганды регулируют активность рецепторов класса GPCR, то все ортостерические лиганды можно разделить на три группы: агонисты, антагонисты (их иногда называют нейтральными антагонистами) и обратные агонисты [19]. Синтетический лиганд называют агонистом, если он вызывает в клетке повышение активности относительно базального уровня, как и природный активатор рецептора.

Синтетический лиганд-агонист может быть:

• частичным агонистом — если вызываемый им клеточный ответ слабее, чем реакция на эндогенный лиганд;

• полным агонистом — если клеточный ответ такой же, как от природного лиганда;

• суперагонистом — если реакция сильнее, чем на естественный лиганд.

Когда рецептор связывается с антагонистом, клеточный ответ в отсутствие других лигандов не меняется: активность рецептора остается на базальном уровне. В присутствии

антагониста ответ рецептора на эндогенные активаторы или синтетические агонисты снижается, т.к. антагонист блокирует лиганд-связывающий карман рецептора, конкурируя с другими лигандами.

При взаимодействии GPCR с обратным агонистом клеточный ответ снижается. Это можно обнаружить, если активность рецептора в отсутствие эндогенного лиганда ненулевая. Ненулевой уровень базальной активности обычно возникает из-за спонтанных переходов рецептора в активное состояние без активации лигандом. Такое свойство может быть присуще самому рецептору или возникнуть в результате мутации в аминокислотной последовательности GPCR [20,21].

Классификация лигандов GPCR по различному клеточному ответу изображена на рисунке 5.

Рисунок 5. Эффект от связывания рецептором класса GPCR различных лигандов: агонистов и антагонистов.

Иллюстрация адаптирована из работы [22].

1.1.3. Численные характеристики взаимодействия рецептора и лиганда

Для количественной характеристики связывания рецепторов и лигандов могут использоваться разные величины, но в случае рецепторов класса GPCR обычно используются лишь следующие из них: Kd, EC50, IC50, pA2, Emax.

1.1.3.1. Константа диссоциации

Константа диссоциации в случае рецепторов, сопряженных с G-белками, и их лигандов определяется следующим образом:

¡s I [свободный лиганд]*[свободный рецептор]

лй — -}-:--.- ,

[связанный комплекс] '

где под квадратными скобками подразумеваются концентрации в М. В случае, когда — [свободный лиганд], концентрация свободного рецептора равна концентрации рецептора, связанного с лигандом, то есть, константа диссоциации представляет собой такую концентрацию лиганда, при которой связана ровно половина доступных рецепторов. Это верно только в том случае, если у рецептора есть только один карман связывания для рассматриваемого лиганда, а также в случае отсутствия конкурирующих лигандов. В большинстве практических случаев исследования рецепторов класса GPCR эти условия соблюдаются.

В случае ингибирующего лиганда константа диссоциации иногда обозначается Ki.

Константу диссоциации Kd для рецепторов класса GPCR зачастую бывает сложно измерить, в силу того, что для этого, как правило, нужно извлечь рецептор из клеток, что сопряжено с высоким риском нарушения его структурно-функциональной целостности. Поэтому в литературе чаще встречаются величины EC50 для агонистов и IC50 для антагонистов.

1.1.3.2. EC50 и IC50

EC50 и IC50 - это такие концентрации лигандов, при воздействии которых биологический эффект равен половине от максимально возможного. EC50 (англ. effective concentration) определяется для лигандов, активирующих рецептор, а IC50 (англ. inhibitory concentration) - для его ингибиторов. При изучении рецепторов класса GPCR, как правило, величины EC50 и IC50 относительны, то есть, как нулевой, так и максимальный уровень биологического эффекта определяется для конкретного лиганда, а в качестве контроля принимаются клетки с базальной

активностью рецептора, т.е. клетки, в которых экспрессируется рассматриваемым рецептор, но которые не подвергаются воздействию лиганда. На рисунке 6 схематично показана методика определения 1С50 и ЕС50 для различных лигандов. 1С50, как правило, измеряется в присутствие агониста рецептора, эффект которого принимается за 100%, а ЕС50 - в отсутствие других лигандов.

75

50

0 •

-25

Активность рецептора, % А

\

1 1

....... !

1 т 1 Ж ч 1 I

0.001 0.01 0.1 1 10 Концентрация лиганда

100

125 100 75 Н 50 25 -0 -

-25

Активность рецептора: % Б

1 т г X N-1-1

0.001 0.01 0.1 1 10 Концентрация лиганда

100

■ Активность рецептора 100%

Базальная активность

- Максимально достижимый эффект лиганда

К — Относительное значение Ю50 (А) или ЕС50 (Б)

—

Абсолютное

значение 1С50 (А) или ЕС50 (Б)

Рисунок 6. Определение абсолютного и относительного значения ГС50 или EC5o. (А) - 1С50 для исследуемого антагониста, (Б) - ЕС50 для агониста.

100% - максимально достижимый эффект для рассматриваемого рецептора при данном методе анализа, 0% - контроль: клетки с рецептором без воздействия лиганда. В некоторых случаях для определения ЕС50 может использоваться график типа А: например, в случае Gai-сопряженного рецептора, биологическим эффектом которого является снижение концентрации сАМР в клетке. Иллюстрация адаптирована из работы [23].

Для определения EC50 и IC50 в исследованиях рецепторов класса GPCR применяется множество различных методов, но в данном обзоре литературы в большинстве источников упоминаются следующие:

• Связывание [35S]GTPyS. В процессе передачи сигнала рецептором в Ga-субъединице происходит обмен GDP на радиоактивно меченый, негидролизуемый [35S]GTPyS, в результате чего образуется заякоренный в мембране комплекс Ga-[35S]GTPyS, который не может повторно присоедиться к рецептору. После отмывки клеточных мембран от не связавшегося [35S]GTPyS измеряется интенсивность излучения изотопа [35S].

• Определение внутриклеточной концентрации cAMP. Используется для рецепторов, сопряженных с белками Gas и Gai, так как эти G-белки влияют на активность аденилатциклазы. В случае Gas-сопряженного рецептора наблюдается увеличение концентрации cAMP по сравнению с контролем, а в случае Gai - ее уменьшение.

• Анализ мобилизации кальция. Как правило, используется для Gaq-сопряженных рецепторов, но в литературе встречаются данные и для Gai-GPCR, так как Gai-субъединица тоже может активировать фософолипазу С, хоть и зависимо от Gaq.

Помимо вышеописанных методов, в исследованиях фармакологии и сигнализации GPCR применяются и другие, не менее важные.

Для исследования белок-белковых взаимодействий и внутриклеточной передачи сигнала был разработан ряд биосенсоров на основе резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET, англ. Bioluminescence resonance energy transfer). В BRET-биосенсоре один из взаимодействующих белков помечается биолюминесцентным донором энергии, а его партнер -флуоресцентным акцептором. Перенос энергии (собственно, BRET) происходит, когда расстояние между донором и акцептором менее 10 нм, а эффективность переноса обратно пропорциональна шестой степени расстояния, поэтому BRET-биосенсоры особенно хорошо подходят для изучения белок-белковых взаимодействий между рецепторами класса GPCR, G-белками, Р-аррестинами и их многочисленными эффекторами, а также для измерения образования и накопления вторичных мессенджеров после активации рецептора. По мере расширения биохимического спектра биосенсоров BRET количество сигнальных путей, которые могут быть измерены, также соответственно увеличивается. Способность BRET в реальном времени измерять интенсивность передачи сигналов по разным путям особенно полезна для оценки функциональной селективности лигандов. [24,25]

Наиболее часто используемый донор BRET — Rluc (оксидаза, выделенная из биолюминесцентных морских анютиных глазок, R. reniformis). Люцифераза из морских креветок O. gracilirostris, известная как Nluc21, также оказалась подходящей для некоторых приложений BRET. Флуорофоры, используемые в качестве акцепторов BRET, обычно принадлежат к семейству GFP, происходящих либо от Aequorea Victoria, либо от R reniformis. [25] В последнее время для исследований GPCR большую популярность получила BRET-система NanoLuc binary technology (NanoBiT), основанная на взаимодействии фрагментов Nluc массой 18 кДа (LgBiT) и массой 1,3 кДа (SmBiT). [26]

Для оценки функциональности GPCR также могут использоваться тесты, в которых измеряется активность G-белок-связанных калиевых каналов внутреннего выпрямления (GIRK, англ. G-protein-coupled inwardly rectifying potassium). Обычно каналы GIRK активируются посредством прямого связывания субъединиц GPï при активации GPCR в присутствии фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата (PIP2). [27] После стимуляции GPCR лигандами внутриклеточные концентрации ионов и/или мембранный потенциал претерпевают изменения вследствие активации каналов GIRK, и эти изменения можно отслеживать с помощью различных методов, включая патч-кламп или флуоресцентную визуализацию. [28,29]

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сафронова Надежда Александровна, 2025 год

Список литературы

1. Khorn P.A. et al. Rational Design of Drugs Targeting G-Protein-Coupled Receptors: A Structural Biology Perspective // Biochem. Mosc. Pleiades Publishing Ltd, 2024. Vol. 89, № 4. P. 747-764.

2. Luginina A.P. et al. Rational Design of Drugs Targeting G-Protein-Coupled Receptors: Ligand Search and Screening // Biochem. Mosc. 2024. Vol. 89, № 5. P. 958-972.

3. Yan S. et al. Intestinal Gpr17 deficiency improves glucose metabolism by promoting GLP-1 secretion // Cell Rep. 2022. Vol. 38, № 1. P. 110179.

4. Hennen S. et al. Decoding Signaling and Function of the Orphan G Protein-Coupled Receptor GPR17 with a Small-Molecule Agonist // Sci. Signal. 2013. Vol. 6, № 298.

5. Ye F. et al. Cryo-EM structure of G-protein-coupled receptor GPR17 in complex with inhibitory G protein // MedComm. 2022. Vol. 3, № 4. P. e159.

6. Safronova N.A. et al. Construct Design, Isolation, and Purification of the Human GPR17 Receptor Monomeric Form for Structural and Functional Studies // Russ. J. Bioorganic Chem. 2025. Vol. 51, № 1. P. 308-319.

7. Sakmar TP. Introduction: G-Protein Coupled Receptors // Chem. Rev. 2017. Vol. 117, № 1. P. 1-3.

8. Nature education. GPCR [Electronic resource] // Scitable by Nature education. URL: https://www.nature.com/scitable/topicpage/gpcr-14047471/ (accessed: 09.09.2024).

9. Dorsam R.T., Gutkind J.S. G-protein-coupled receptors and cancer // Nat. Rev. Cancer. 2007. Vol. 7, № 2. P. 79-94.

10. Pfeil E.M. et al. Heterotrimeric G Protein Subunit Gaq Is a Master Switch for Gßy-Mediated Calcium Mobilization by Gi-Coupled GPCRs // Mol. Cell. 2020. Vol. 80, № 6. P. 940-954.e6.

11. Wang D. et al. G Proteins G12 and G13 Control the Dynamic Turnover of Growth Factor-induced Dorsal Ruffles // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 43. P. 32660-32667.

12. Virginia Tech Carilion School of Medicine, LeClair R. Cell Biology, Genetics, and Biochemistry for Pre-Clinical Students. Virginia Tech Publishing, 2022.

13. Kolb P. et al. Community guidelines for GPCR ligand bias: IUPHAR review 32 // Br. J. Pharmacol. 2022. Vol. 179, № 14. P. 3651-3674.

14. Ribas C. et al. The G protein-coupled receptor kinase (GRK) interactome: Role of GRKs in GPCR regulation and signaling // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2007. Vol. 1768, № 4. P. 913-922.

15. Peterson Y.K., Luttrell L.M. The Diverse Roles of Arrestin Scaffolds in G Protein-Coupled Receptor Signaling // Pharmacol. Rev. / ed. Michel M.C. 2017. Vol. 69, № 3. P. 256-297.

16. Zhai R. et al. Double life: How GRK2 and ß-arrestin signaling participate in diseases // Cell. Signal. 2022. Vol. 94. P. 110333.

17. Pierce K.L., Lefkowitz R.J. Classical and new roles of ß-arrestins in the regulation of G-PROTEIN-COUPLED receptors // Nat. Rev. Neurosci. 2001. Vol. 2, № 10. P. 727-733.

18. Lohse M.J. Dimerization in GPCR mobility and signaling // Curr. Opin. Pharmacol. 2010. Vol. 10, № 1. P. 53-58.

19. Williams R. Discontinued drugs in 2012: oncology drugs // Expert Opin. Investig. Drugs. 2013. Vol. 22, № 12. P. 1627-1644.

20. Basic Principles of Drug Discovery and Development. Elsevier, 2015.

21. Tao Y. Constitutive activation of G protein-coupled receptors and diseases: Insights into mechanisms of activation and therapeutics // Pharmacol. Ther. 2008. Vol. 120, № 2. P. 129-148.

22. Szkudlinski M.W. New Frontier in Glycoprotein Hormones and Their Receptors Structure-Function // Front. Endocrinol. 2015. Vol. 6.

23. Sebaugh J.L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation // Pharm. Stat. 2011. Vol. 10, № 2. P. 128-134.

24. Salahpour A. BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction // Front. Endocrinol. 2012. Vol. 3.

25. Kobayashi H. et al. Bioluminescence resonance energy transfer-based imaging of protein-protein interactions in living cells // Nat. Protoc. 2019. Vol. 14, № 4. P. 1084-1107.

26. Dale N.C. et al. NanoBRET: The Bright Future of Proximity-Based Assays // Front. Bioeng. Biotechnol. 2019. Vol. 7. P. 56.

27. Lei Q. et al. Activation and inhibition of G protein-coupled inwardly rectifying potassium (Kir3) channels by G protein ßy subunits // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. Vol. 97, № 17. P. 9771-9776.

28. Kano H. et al. Structural mechanism underlying G protein family-specific regulation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channel // Nat. Commun. 2019. Vol. 10, № 1. P. 2008.

29. Tabak G. et al. Mutual action by Gy and Gß for optimal activation of GIRK channels in a channel subunit-specific manner // Sci. Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 508.

30. Kenakin T.P. Drug Antagonism // Pharmacology in Drug Discovery. Elsevier, 2012. P. 51-80.

31. Merten N. et al. Repurposing HAMI3379 to Block GPR17 and Promote Rodent and Human Oligodendrocyte Differentiation // Cell Chem. Biol. 2018. Vol. 25, № 6. P. 775-786.e5.

32. Ritter J. et al. Rang & Dale's Pharmacology. Ninth edition. Edinburgh London New York: Elsevier, 2020. 789 p.

33. Harrington A.W. et al. Identification and characterization of select oxysterols as ligands for GPR17 // Br. J. Pharmacol. 2023. Vol. 180, № 4. P. 401-421.

34. Hilton B.J., Bradke F. Growing Myelin around Regenerated Axons after CNS Injury // Neuron. 2020. Vol. 108, № 5. P. 797-798.

35. Chen Y. et al. The oligodendrocyte-specific G protein-coupled receptor GPR17 is a cell-intrinsic timer of myelination // Nat. Neurosci. 2009. Vol. 12, № 11. P. 1398-1406.

36. Bläsius R. et al. A Novel Orphan G Protein-Coupled Receptor Primarily Expressed in the Brain Is Localized on Human Chromosomal Band 2q21 // J. Neurochem. 1998. Vol. 70, № 4. P. 1357-1365.

37. Ciana P. et al. The orphan receptor GPR17 identified as a new dual uracil nucleotides/cysteinyl-leukotrienes receptor // EMBO J. 2006. Vol. 25, № 19. P. 4615-4627.

38. Zhang L.-H., Zho J.-B., Wang Y.-F. [Research advance in cysteinyl leukotriene receptors with

brain injury] // Zhejiang Xue Xue Bao Yi Xue Ban J. Zhejiang Univ. Med. Sci. 2008. Vol. 37, № 3. P. 315-320.

39. Maisel M. et al. Transcription Profiling of Adult and Fetal Human Neuroprogenitors Identifies Divergent Paths to Maintain the Neuroprogenitor Cell State // Stem Cells. 2007. Vol. 25, № 5. P. 1231-1240.

40. Ceruti S. et al. The P2Y-like receptor GPR17 as a sensor of damage and a new potential target in spinal cord injury // Brain. 2009. Vol. 132, № 8. P. 2206-2218.

41. Banfi C. et al. P2 receptors in human heart: upregulation of P2X6 in patients undergoing heart transplantation, interaction with TNFa and potential role in myocardial cell death // J. Mol. Cell. Cardiol. 2005. Vol. 39, № 6. P. 929-939.

42. Agier J. et al. Leukotriene receptor expression in mast cells is affected by their agonists // Cell. Immunol. 2017. Vol. 317. P. 37-47.

43. Zelechowska P. et al. Adipocytokines leptin and adiponectin function as mast cell activity modulators // Immunology. 2019. Vol. 158, № 1. P. 3-18.

44. Itagaki K. et al. Eicosanoid-Induced Store-Operated Calcium Entry in Dendritic Cells // J. Surg. Res. 2011. Vol. 169, № 2. P. 301-310.

45. Aalto Y. et al. Distinct gene expression profiling in chronic lymphocytic leukemia with 11q23 deletion // Leukemia. 2001. Vol. 15, № 11. P. 1721-1728.

46. Maekawa A. et al. GPR17 is a negative regulator of the cysteinyl leukotriene 1 receptor response to leukotriene D 4 // Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. Vol. 106, № 28. P. 11685-11690.

47. Tyler W. A. et al. Proteomic identification of novel targets regulated by the mammalian target of rapamycin pathway during oligodendrocyte differentiation // Glia. 2011. Vol. 59, № 11. P. 1754-1769.

48. Ou Z. et al. Olig2-Targeted G-Protein-Coupled Receptor Gpr17 Regulates Oligodendrocyte Survival in Response to Lysolecithin-Induced Demyelination // J. Neurosci. 2016. Vol. 36, № 41. P. 10560-10573.

49. Fumagalli M. et al. Phenotypic Changes, Signaling Pathway, and Functional Correlates of GPR17-expressing Neural Precursor Cells during Oligodendrocyte Differentiation // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286, № 12. P. 10593-10604.

50. Zhao B. et al. The new P2Y-like receptor G protein-coupled receptor 17 mediates acute neuronal injury and late microgliosis after focal cerebral ischemia in rats // Neuroscience. 2012. Vol. 202. P. 42-57.

51. McQueen J. et al. Restoration of Oligodendrocyte Pools in a Mouse Model of Chronic Cerebral Hypoperfusion // PLoS ONE / ed. Arai K. 2014. Vol. 9, № 2. P. e87227.

52. Lecca D. et al. The Recently Identified P2Y-Like Receptor GPR17 Is a Sensor of Brain Damage and a New Target for Brain Repair // PLoS ONE / ed. Hashimoto K. 2008. Vol. 3, № 10. P. e3579.

53. Franke H. et al. Changes of the GPR17 receptor, a new target for neurorepair, in neurons and glial cells in patients with traumatic brain injury // Purinergic Signal. 2013. Vol. 9, № 3. P. 451-462.

54. Cosentino S. et al. Expression of dual Nucleotides/Cysteinyl-Leukotrienes Receptor GPR 17 in early trafficking of cardiac stromal cells after myocardial infarction // J. Cell. Mol. Med. 2014. Vol. 18, № 9. P. 1785-1796.

55. Angelini J. et al. The Distribution of GPR17-Expressing Cells Correlates with White Matter Inflammation Status in Brain Tissues of Multiple Sclerosis Patients // Int. J. Mol. Sci. 2021. Vol. 22, № 9. P. 4574.

56. Boda E. et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: Focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage // Glia. 2011. Vol. 59, № 12. P. 1958-1973.

57. Nave K. -A. Neurological mouse mutants and the genes of myelin // J. Neurosci. Res. 1994. Vol. 38, № 6. P. 607-612.

58. Bonfanti E. et al. The role of oligodendrocyte precursor cells expressing the GPR17 receptor in brain remodeling after stroke // Cell Death Dis. 2017. Vol. 8, № 6. P. e2871-e2871.

59. Viganô F. et al. GPR17 expressing NG2-Glia: Oligodendrocyte progenitors serving as a

reserve pool after injury // Glia. 2016. Vol. 64, № 2. P. 287-299.

60. Boccazzi M. et al. A new role for the P2Y-like GPR17 receptor in the modulation of multipotency of oligodendrocyte precursor cells in vitro // Purinergic Signal. 2016. Vol. 12, № 4. P. 661-672.

61. Zhao B. et al. GPR17 mediates ischemia-like neuronal injury via microglial activation // Int. J. Mol. Med. 2018.

62. Lu C. et al. G-Protein-Coupled Receptor Gpr17 Regulates Oligodendrocyte Differentiation in Response to Lysolecithin-Induced Demyelination // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 4502.

63. Marangon D. et al. Rewiring of Glucose and Lipid Metabolism Induced by G Protein-Coupled Receptor 17 Silencing Enables the Transition of Oligodendrocyte Progenitors to Myelinating Cells // Cells. 2022. Vol. 11, № 15. P. 2369.

64. Liu H. et al. G-protein-coupled receptor GPR17 inhibits glioma development by increasing polycomb repressive complex 1-mediated ROS production // Cell Death Dis. 2021. Vol. 12, № 6. P. 610.

65. Wang Z. et al. Inhibition of GPR17 with pranlukast protects against TNF-a-induced loss of type II collagen in ATDC5 cells // Int. Immunopharmacol. 2020. Vol. 88. P. 106870.

66. Chen Z. et al. Physiological and genomic signatures of evolutionary thermal adaptation in redband trout from extreme climates // Evol. Appl. 2018. Vol. 11, № 9. P. 1686-1699.

67. Tian S. et al. Genomic Analyses Reveal Genetic Adaptations to Tropical Climates in Chickens // iScience. 2020. Vol. 23, № 11. P. 101644.

68. Sun H. et al. Gut transcriptomic changes during hibernation in the greater horseshoe bat (Rhinolophus ferrumequinum) // Front. Zool. 2020. Vol. 17, № 1. P. 21.

69. Zhu Z.-X. et al. First identification of two co-existing genome-wide significant sex quantitative trait loci (QTL) in red tilapia using integrative QTL mapping // Zool. Res. 2022. Vol. 43, № 2. P. 205-216.

70. Rabinovitch N. et al. Methylation of cysteinyl leukotriene receptor 1 genes associates with lung function in asthmatics exposed to traffic-related air pollution // Epigenetics. 2021. Vol. 16, № 2. P. 177-185.

71. Bearson S.M.D. et al. Cross-protective Salmonella vaccine reduces cecal and splenic colonization of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Heidelberg // Vaccine. 2019. Vol. 37, № 10. P. 1255-1259.

72. Yatsuzuka A. et al. GPR17 is an essential regulator for the temporal adaptation of Sonic hedgehog signalling in neural tube development // Development. 2019. P. dev.176784.

73. Benned-Jensen T., Rosenkilde M. Distinct expression and ligand-binding profiles of two constitutively active GPR17 splice variants // Br. J. Pharmacol. 2010. Vol. 159, № 5. P. 1092-1105.

74. Qi A.-D., Harden T.K., Nicholas R.A. Is GPR17 a P2Y/Leukotriene Receptor? Examination of Uracil Nucleotides, Nucleotide Sugars, and Cysteinyl Leukotrienes as Agonists of GPR17 // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2013. Vol. 347, № 1. P. 38-46.

75. Simon K. et al. The Orphan Receptor GPR17 Is Unresponsive to Uracil Nucleotides and Cysteinyl Leukotrienes // Mol. Pharmacol. 2017. Vol. 91, № 5. P. 518-532.

76. Parravicini C. et al. A promiscuous recognition mechanism between GPR17 and SDF-1: Molecular insights // Cell. Signal. 2016. Vol. 28, № 6. P. 631-642.

77. Sensi C. et al. Oxysterols act as promiscuous ligands of class-A GPCRs: In silico molecular modeling and in vitro validation // Cell. Signal. 2014. Vol. 26, № 12. P. 2614-2620.

78. Lin X. et al. Structural basis of ligand recognition and self-activation of orphan GPR52 // Nature. 2020. Vol. 579, № 7797. P. 152-157.

79. Wong T. et al. Cryo-EM structure of orphan G protein-coupled receptor GPR21 // MedComm. 2023. Vol. 4, № 1. P. e205.

80. Daniele S. et al. Agonist-Induced Desensitization/Resensitization of Human G Protein-Coupled Receptor 17: A Functional Cross-Talk between Purinergic and Cysteinyl-Leukotriene Ligands // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2011. Vol. 338, № 2. P. 559-567.

81. Konda Mani S. et al. Structural analysis of human G-protein-coupled receptor 17 ligand

binding sites // J. Cell. Biochem. 2023. Vol. 124, № 4. P. 533-544.

82. Daniele S. et al. Regulation of PC12 cell survival and differentiation by the new P2Y-like receptor GPR17 // Cell. Signal. 2010. Vol. 22, № 4. P. 697-706.

83. Capelli D. et al. Surface Plasmon Resonance as a Tool for Ligand Binding Investigation of Engineered GPR17 Receptor, a G Protein Coupled Receptor Involved in Myelination // Front. Chem. 2020. Vol. 7. P. 910.

84. Zhuo T. et al. Synthesis and Ability of New Ligands for G Protein-Coupled Receptors 17 (GPR17) // Med. Sci. Monit. 2017. Vol. 23. P. 953-959.

85. Salituro F.G. et al. 3-(2-Carboxyindol-3-yl)propionic acid-based antagonists of the NMDA (N-methyl-D-aspartic acid) receptor associated glycine binding site // J. Med. Chem. 1992. Vol. 35, № 10. P. 1791-1799.

86. Li C. et al. A functional role of NMDA receptor in regulating the differentiation of oligodendrocyte precursor cells and remyelination // Glia. 2013. Vol. 61, № 5. P. 732-749.

87. Baqi Y. et al. 3-(2-Carboxyethyl)indole-2-carboxylic Acid Derivatives: Structural Requirements and Properties of Potent Agonists of the Orphan G Protein-Coupled Receptor GPR17 // J. Med. Chem. 2018. Vol. 61, № 18. P. 8136-8154.

88. Mariapia Abbracchio et al. Gpr17-modulating compounds, diagnostic and therapeutic uses thereof: pat. WO2012059869A1 USA. 2011.

89. Nguyen P. et al. Synthesis and Preclinical Validation of Novel Indole Derivatives as a GPR17 Agonist for Glioblastoma Treatment // J. Med. Chem. 2021. Vol. 64, № 15. P. 10908-10918.

90. Saravanan K.M. et al. Identification of novel GPR17-agonists by structural bioinformatics and signaling activation // Int. J. Biol. Macromol. 2018. Vol. 106. P. 901-907.

91. Doan P. et al. Targeting Orphan G Protein-Coupled Receptor 17 with T0 Ligand Impairs Glioblastoma Growth // Cancers. 2021. Vol. 13, № 15. P. 3773.

92. Doan P. et al. Alkylaminophenol and GPR17 Agonist for Glioblastoma Therapy: A Combinational Approach for Enhanced Cell Death Activity // Cells. 2021. Vol. 10, № 8. P. 1975.

93. Nguyen P. et al. GPR17 signaling activation by CHBC agonist induced cell death via modulation of MAPK pathway in glioblastoma // Life Sci. 2022. Vol. 291. P. 120307.

94. Pillaiyar T. et al. Design, synthesis and biological evaluation of suramin-derived dual antagonists of the proinflammatory G protein-coupled receptors P2Y2 and GPR17 // Eur. J. Med. Chem. 2020. Vol. 186. P. 111789.

95. Pugliese A.M. et al. Functional characterization of two isoforms of the P2Y-like receptor GPR17: [ 35 S]GTPyS binding and electrophysiological studies in 1321N1 cells // Am. J. Physiol.-Cell Physiol. 2009. Vol. 297, № 4. P. C1028-C1040.

96. Wang W., Qiao Y., Li Z. New Insights into Modes of GPCR Activation // Trends Pharmacol. Sci. 2018. Vol. 39, № 4. P. 367-386.

97. Yang J. et al. FLIM-FRET-Based Structural Characterization of a Class-A GPCR Dimer in the Cell Membrane // J. Mol. Biol. 2020. Vol. 432, № 16. P. 4596-4611.

98. Daniele S. et al. Functional Heterodimerization between the G Protein-Coupled Receptor GPR17 and the Chemokine Receptors 2 and 4: New Evidence // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 24, № 1. P. 261.

99. Maekawa A. et al. GPR17 Regulates Immune Pulmonary Inflammation Induced by House Dust Mites // J. Immunol. 2010. Vol. 185, № 3. P. 1846-1854.

100. Heise C.E. et al. Characterization of the Human Cysteinyl Leukotriene 2 Receptor // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 39. P. 30531-30536.

101. Maekawa A., Austen K.F., Kanaoka Y. Targeted Gene Disruption Reveals the Role of Cysteinyl Leukotriene 1 Receptor in the Enhanced Vascular Permeability of Mice Undergoing Acute Inflammatory Responses // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 23. P. 20820-20824.

102. Chen K. et al. Expression of cysteinyl leukotriene receptor GPR17 in eosinophilic and non-eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps // Asian Pac. J. Allergy Immunol. 2018.

103. Wang X. et al. Quetiapine promotes oligodendroglial process outgrowth and membrane expansion by orchestrating the effects of Olig1 // Glia. 2021. Vol. 69, № 7. P. 1709-1722.

104. Simon K. et al. The Orphan G Protein-coupled Receptor GPR17 Negatively Regulates Oligodendrocyte Differentiation via Gai/o and Its Downstream Effector Molecules // J. Biol. Chem. 2016. Vol. 291, № 2. P. 705-718.

105. Zappelli E. et al. A Rapid and Efficient Immunoenzymatic Assay to Detect Receptor Protein Interactions: G Protein-Coupled Receptors // Int. J. Mol. Sci. 2014. Vol. 15, № 4. P. 6252-6264.

106. Fumagalli M. et al. The ubiquitin ligase Mdm2 controls oligodendrocyte maturation by intertwining mTOR with G protein-coupled receptor kinase 2 in the regulation of GPR17 receptor desensitization: Mdm2 Controls Myelination Regulating GPR17 // Glia. 2015. Vol. 63, № 12. P. 2327-2339.

107. Daniele S. et al. Does GRK-ß arrestin machinery work as a "switch on" for GPR17-mediated activation of intracellular signaling pathways? // Cell. Signal. 2014. Vol. 26, № 6. P. 1310-1325.

108. Gaesser J.M., Fyffe-Maricich S.L. Intracellular signaling pathway regulation of myelination and remyelination in the CNS // Exp. Neurol. 2016. Vol. 283. P. 501-511.

109. Marschallinger J. et al. Structural and functional rejuvenation of the aged brain by an approved anti-asthmatic drug // Nat. Commun. 2015. Vol. 6, № 1. P. 8466.

110. Ren H. et al. Gpr17 in AgRP Neurons Regulates Feeding and Sensitivity to Insulin and Leptin // Diabetes. 2015. Vol. 64, № 11. P. 3670-3679.

111. Ren H. et al. FoxO1 Target Gpr17 Activates AgRP Neurons to Regulate Food Intake // Cell.

2012. Vol. 149, № 6. P. 1314-1326.

112. Fratangeli A. et al. The Regulated Expression, Intracellular Trafficking, and Membrane Recycling of the P2Y-like Receptor GPR17 in Oli-neu Oligodendroglial Cells // J. Biol. Chem.

2013. Vol. 288, № 7. P. 5241-5256.

113. Boccazzi M. et al. G protein-coupled receptor 17 is regulated by WNT pathway during oligodendrocyte precursor cell differentiation // Neurobiol. Dis. 2023. Vol. 187. P. 106315.

114. Ou Z. et al. A GPR17-cAMP-Lactate Signaling Axis in Oligodendrocytes Regulates Whole-Body Metabolism // Cell Rep. 2019. Vol. 26, № 11. P. 2984-2997.e4.

115. Ballesteros J.A., Weinstein H. Integrated methods for the construction of three-dimensional models and computational probing of structure-function relations in G protein-coupled receptors // Methods Neurosci. 1995. № 25. P. 366-428.

116. Wang Z. et al. Uncovering the heterogeneous genetic variations in two insulin-expressing tumors in a patient with MEN1 // Oncol. Lett. 2018.

117. COSMIC - catalogue of somatic mutations in cancer: GPR17 (COSG544369).

118. Conley J.M. et al. Human GPR17 missense variants identified in metabolic disease patients have distinct downstream signaling profiles // J. Biol. Chem. 2021. Vol. 297, № 1. P. 100881.

119. Parravicini C. et al. Development of the first in vivo GPR17 ligand through an iterative drug discovery pipeline: A novel disease-modifying strategy for multiple sclerosis // PLOS ONE / ed. De Castro F. 2020. Vol. 15, № 4. P. e0231483.

120. Parravicini C. et al. GPR17: Molecular modeling and dynamics studies of the 3-D structure and purinergic ligand binding features in comparison with P2Y receptors // BMC Bioinformatics. 2008. Vol. 9, № 1. P. 263.

121. Ivanov K.P. [Brain hypoxia and the role of active forms of oxygen and of energy deficit in the neuron degeneration] // Usp. Fiziol. Nauk. 2012. Vol. 43, № 1. P. 95-110.

122. Zolfaghari Dehkharghani M. et al. Importance of long non-coding RNAs in the pathogenesis, diagnosis, and treatment of myocardial infarction // Int. J. Cardiol. Heart Vasc. 2024. Vol. 55. P. 101529.

123. Lin K.-N. et al. Insulin-like Growth Factor 1 Promotes Cell Proliferation by Downregulation of G-Protein-Coupled Receptor 17 Expression via PI3K/Akt/FoxO1 Signaling in SK-N-SH Cells // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23, № 3. P. 1513.

124. Lin K. et al. [G protein-coupled receptor 17 is involved in CoCl2-induced hypoxic injury in RGC-5 cells] // Zhejiang Xue Xue Bao Yi Xue Ban J. Zhejiang Univ. Med. Sci. 2018. Vol. 47, № 5. P. 487-492.

125. Cosentino S. et al. Expression of dual Nucleotides/Cysteinyl-Leukotrienes Receptor GPR 17 in

early trafficking of cardiac stromal cells after myocardial infarction // J. Cell. Mol. Med. 2014. Vol. 18, № 9. P. 1785-1796.

126. Sun Y. et al. Elucidating the Molecular Mechanism of Ischemic Stroke Using Integrated Analysis of miRNA, mRNA, and lncRNA Expression Profiles // Front. Integr. Neurosci. 2021. Vol. 15. P. 638114.

127. NIH: National institute of neurological disorders and stroke. Periventricular Leukomalacia [Electronic resource] // Health information. 2024. URL:

https://www.ninds.nih.gov/health-information/disorders/periventricular-leukomalacia (accessed: 12.09.2024).

128. Li W.-J. et al. Treatment with UDP-glucose, GDNF, and memantine promotes SVZ and white matter self-repair by endogenous glial progenitor cells in neonatal rats with ischemic PVL // Neuroscience. 2015. Vol. 284. P. 444-458.

129. Mao F. et al. GPR17 plays a role in ischemia-induced endogenous repair of immature neonatal cerebral White matter // Brain Res. Bull. 2020. Vol. 161. P. 33-42.

130. Mao F. et al. Periventricular leukomalacia long-term prognosis may be improved by treatment with UDP-glucose, GDNF, and memantine in neonatal rats // Brain Res. 2012. Vol. 1486. P. 112-120.

131. Ye X.-Y. et al. [Effect of pranlukast on neonatal rats with periventricular leukomalacia] // Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi Chin. J. Contemp. Pediatr. 2020. Vol. 22, № 6. P. 656-661.

132. He L. et al. Knockdown of G protein-coupled receptor-17 (GPR17) facilitates the regeneration and repair of myelin sheath post-periventricular leukomalacia (PVL) // Bioengineered. 2021. Vol. 12, № 1. P. 7314-7324.

133. Zhou Y. et al. Combination Therapy With Hyperbaric Oxygen and Erythropoietin Inhibits Neuronal Apoptosis and Improves Recovery in Rats With Spinal Cord Injury // Phys. Ther. 2019. Vol. 99, № 12. P. 1679-1689.

134. Depp C. et al. Myelin dysfunction drives amyloid-ß deposition in models of Alzheimer's disease // Nature. 2023. Vol. 618, № 7964. P. 349-357.

135. Rivera A.D. et al. Functional genomic analyses highlight a shift in Gpr17 -regulated cellular processes in oligodendrocyte progenitor cells and underlying myelin dysregulation in the aged mouse cerebrum // Aging Cell. 2021. Vol. 20, № 4. P. e13335.

136. Liang Y. et al. Knockdown and inhibition of hippocampal GPR17 attenuates lipopolysaccharide-induced cognitive impairment in mice // J. Neuroinflammation. 2023. Vol. 20, № 1. P. 271.

137. Jin S. et al. Inhibition of GPR17 with cangrelor improves cognitive impairment and synaptic deficits induced by Aß1-42 through Nrf2/HO-1 and NF-kB signaling pathway in mice // Int. Immunopharmacol. 2021. Vol. 101. P. 108335.

138. Khatami S.H. et al. Electrochemical biosensors in early detection of Parkinson disease // Clin. Chim. Acta Int. J. Clin. Chem. 2025. Vol. 565. P. 120001.

139. Wang H. et al. [Expression and distribution of cysteinyl leukotriene receptors CysLT1R and CysLT2R, and GPR17 in brain of Parkinson disease model mice] // Zhejiang Xue Xue Bao Yi Xue Ban J. Zhejiang Univ. Med. Sci. 2013. Vol. 42, № 1. P. 52-60.

140. Wang J. et al. Robust Myelination of Regenerated Axons Induced by Combined Manipulations of GPR17 and Microglia // Neuron. 2020. Vol. 108, № 5. P. 876-886.e4.

141. Paladini M.S. et al. Prenatal Stress Impairs Spinal Cord Oligodendrocyte Maturation via BDNF Signaling in the Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Model of Multiple Sclerosis // Cell. Mol. Neurobiol. 2022. Vol. 42, № 4. P. 1225-1240.

142. Mastaitis J. et al. GPR17 gene disruption does not alter food intake or glucose homeostasis in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. 2015. Vol. 112, № 6. P. 1845-1849.

143. Deem J.D., Faber C.L., Morton G.J. AgRP neurons: Regulators of feeding, energy expenditure, and behavior // FEBS J. 2022. Vol. 289, № 8. P. 2362-2381.

144. Reilly A.M. et al. Gpr17 deficiency in POMC neurons ameliorates the metabolic derangements caused by long-term high-fat diet feeding // Nutr. Diabetes. 2019. Vol. 9, № 1. P. 29.

145. Wargent E.T. et al. Leanness and Low Plasma Leptin in GPR17 Knockout Mice Are Dependent on Strain and Associated With Increased Energy Intake That Is Not Suppressed by Exogenous Leptin // Front. Endocrinol. 2021. Vol. 12. P. 698115.

146. Meraviglia V. et al. SNX27, a protein involved in down syndrome, regulates GPR17 trafficking and oligodendrocyte differentiation // Glia. 2016. Vol. 64, № 8. P. 1437-1460.

147. Jia P. et al. Network-Assisted Investigation of Combined Causal Signals from Genome-Wide Association Studies in Schizophrenia // PLoS Comput. Biol. / ed. Roth F.P. 2012. Vol. 8, № 7. P. e1002587.

148. Ma Q. et al. Activation of A 2B adenosine receptor protects against demyelination in a mouse model of schizophrenia // Exp. Ther. Med. 2022. Vol. 23, № 6. P. 396.

149. Liu W. et al. G protein-coupled receptor 17 restricts rabies virus replication via BAK-mediated apoptosis // Vet. Microbiol. 2022. Vol. 265. P. 109326.

150. Liu J. et al. Candidate methylated genes in osteoarthritis explored by bioinformatics analysis // The Knee. 2016. Vol. 23, № 6. P. 1035-1043.

151. Mishra S. et al. Network analysis of transcriptomics data for the prediction and prioritization of membrane-associated biomarkers for idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) by bioinformatics approach // Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. Elsevier, 2021. Vol. 123. P. 241-273.

152. Zhan T. et al. Cangrelor alleviates bleomycin-induced pulmonary fibrosis by inhibiting platelet activation in mice // Mol. Immunol. 2020. Vol. 120. P. 83-92.

153. Zhan T.-W. et al. Cangrelor alleviates pulmonary fibrosis by inhibiting GPR17-mediated inflammation in mice // Int. Immunopharmacol. 2018. Vol. 62. P. 261-269.

154. Luo Q. et al. Cangrelor ameliorates CLP-induced pulmonary injury in sepsis by inhibiting GPR17 // Eur. J. Med. Res. 2021. Vol. 26, № 1. P. 70.

155. Bonfanti E. et al. Abnormal Upregulation of GPR17 Receptor Contributes to Oligodendrocyte Dysfunction in SOD1 G93A Mice // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, № 7. P. 2395.

156. Rossmeisl J.H. Novel Treatments for Brain Tumors // Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 2025. Vol. 55, № 1. P. 81-94.

157. Dougherty J.D. et al. Candidate Pathways for Promoting Differentiation or Quiescence of Oligodendrocyte Progenitor-like Cells in Glioma // Cancer Res. 2012. Vol. 72, № 18. P. 4856-4868.

158. Johnson R.M. et al. Development of a gene expression-based prognostic signature for IDH wild-type glioblastoma // Neuro-Oncol. 2020. Vol. 22, № 12. P. 1742-1756.

159. Mutharasu G. et al. Transcriptomic analysis of glioblastoma multiforme providing new insights into GPR17 signaling communication // J. Biomol. Struct. Dyn. 2022. Vol. 40, № 6. P. 2586-2599.

160. Wu Z. et al. RTEL1 is upregulated in colorectal cancer and promotes tumor progression // Pathol. - Res. Pract. 2023. Vol. 252. P. 154958.

161. Häberlein F. et al. Humanized zebrafish as a tractable tool for in vivo evaluation of pro-myelinating drugs // Cell Chem. Biol. 2022. Vol. 29, № 10. P. 1541-1555.e7.

162. Fenalti G. et al. Fluorescence Recovery After Photobleaching in Lipidic Cubic Phase (LCP-FRAP) // Methods in Enzymology. Elsevier, 2015. Vol. 557. P. 417-437.

163. Caffrey M., Cherezov V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases // Nat. Protoc. 2009. Vol. 4, № 5. P. 706-731.

164. Chun E. et al. Fusion Partner Toolchest for the Stabilization and Crystallization of G Protein-Coupled Receptors // Structure. 2012. Vol. 20, № 6. P. 967-976.

165. Cherezov V., Abola E., Stevens R.C. Recent Progress in the Structure Determination of GPCRs, a Membrane Protein Family with High Potential as Pharmaceutical Targets // Membrane Protein Structure Determination / ed. Lacapère J.-J. Totowa, NJ: Humana Press, 2010. Vol. 654. P. 141-168.

166. Popov P. et al. Computational design of thermostabilizing point mutations for G protein-coupled receptors // eLife. 2018. Vol. 7. P. e34729.

167. Zhou Q. et al. Common activation mechanism of class A GPCRs // eLife. 2019. Vol. 8. P. e50279.

168. Luginina A. et al. Structure-based mechanism of cysteinyl leukotriene receptor inhibition by antiasthmatic drugs // Sci. Adv. 2019. Vol. 5, № 10. P. eaax2518.

169. Gusach A. et al. Structural basis of ligand selectivity and disease mutations in cysteinyl leukotriene receptors // Nat. Commun. 2019. Vol. 10, № 1. P. 5573.

Приложение

Приложение 1. Структурные формулы всех упоминаемых лигандов GPR17

Все приведенные ниже структурные формулы были созданы с помощью сервиса https://molview.org/ .

П1.1. UDP

К разделу 1.4.1.

о

о

у

н

П1.2. UDP-глюкоза

П1.3. UDP-галактоза

П1.4. АТФ (англ. АТР)

К разделу 1.4.1.

V>Г" / \ // 0 \ Р 0

П1.5. Лейкотриен С4 (англ. ЬТС4)

К разделу 1.4.1.

П1.6. Лейкотриен D4 (англ. LTD4)

К разделу 1.4.1.

н

о о

П1.7. 27-гидроксихолестерин (англ. 27-hydroxycholesterol)

К разделу 1.4.1.

П1.8. 7а-гидроксихолестерин (7a-Hydroxycholesterol)

К разделу 1.4.1.

П1.9. 22R-Hydroxycholesterol

К разделу 1.4.1.

П1.10. 24(s)-hydroxycholesterol (24S-HC)

К разделу 1.4.1.

П1.11. 22(S)-hydroxycholesterol

К разделу 1.4.1.

П1.12. 24(S),25-epoxycholesterol

К разделу 1.4.1.

П1.13. 27-hydroxycholestenone

К разделу 1.4.1.

П1.14. Монтелукаст (англ. Montelukast)

К разделу 1.4.2.

П1.15. Пранлукаст (англ. Pranlukast)

К разделу 1.4.2.

о

П1.16. Cangrelor

К разделу 1.4.2.

П1.17. MRS2179

К разделу 1.4.2.

н

П1.18. MDL29,951

К разделу 1.4.2.

П1.19. Asinex~1...5

Asinex-1. Другое название - ASN02563583. К разделу 1.4.2.

Asinex-2. Другое название - ASN04421891. К разделу 1.4.2.

/ \

>4,

Л

Asinex-3. Другое название - ASN04450772. К разделу 1.4.2.

Asinex-4. Другое название - ASN04885796. К разделу 1.4.2.

F

Asinex-5. Другое название - ASN06917370. К разделу 1.4.2.

П1.20. N6-циклопентил-ATФ (англ. N6-cyclopentyl ATP)

К разделу 1.4.2.

о ov

V /^N

П1.21. N6-мeтил-ATФ-пpoизвoднoe

К разделу 1.4.2.

П1.22. HAMI3379

К разделу 1.4.2.

П1.23. BayCysLT2

К разделу 1.4.2.

П1.24. T0510-3657

К разделам 1.4.2, 1.9.2 и 1.10.14.1.

О

о = s = о

П1.25. AC1MLNKK

Другое название ASN05294701. К разделу 1.4.2.

П1.26. CHBC

К разделам 1.4.2 и 1.10.14.1.

П1.27. Compound 33

К разделу 1.4.2.

П1.28. Compound 43

К разделу 1.4.2.

П1.29. Производные сурамина

К разделу 1.4.2.

14а:

ч гч

ГЛ

/

\ ^н о

14Ь:

VU

\ /г~л

/

14f:

F F

ч /гл

14j:

14k:

141:

14m:

14n:

CI

14r:

VH

14s:

ci

\

\ /~л

17a:

\ /

\ /М

V"

0 H

s — ы

22a:

Приложение 2. Поверхностная экспрессия всех протестированных генно-инженерных конструкций

GPR17

Конструкции c партнерным белком в ICL3 (указана вариабельная часть TM5--ICL3—TM6) WT D105 2.50N D321 Y148

...CYLLЫRSLRQ-GLRV--------EKRLKTK... 0%

...CYLLЫRSLRQ-GLR|BRIL|V—EKRLKTK... 0% 0% 4% 22%

...CYLLЫRSLR-|BRIL|Q—GLRVEKRLKTK... 0% 0% 0%

...CYLLЫRSLR-|BRIL|GLRV---EKRLKTK... 0% 0%

...CYLLЫRSLR-|BRIL|LRV----EKRLKTK... 0% 0%

...CYLLЫRSLR-|BRIL|RV-----EKRLKTK... 0% 0% 0%

...CYLLЫRSLR-|BRIL|V------EKRLKTK... 0% 0% 0%

...CYLLЫRSLRQ-G|rubredoxin|-RLKTK... 0% 0% 0% 0%

.CYLLIIRSLRQ-GL|BRIL|V---EKRLKTK... 6%

...CYLLЫRSLRQ-|BRIL|V-----EKRLKTK... 13%

...CYLLЫRSLR-|BRIL|-------EKRLKTK... 1%

...CYLLЫRSLR-|BRIL|--------KRLKTK... 0%

Конструкции c партнерным белком на Оконце (указана вариабельная часть BRIL|N-конец) WT D105 2.50N D321 7.49N Y148 3.41W

BRIL|MNGLE... 0% 0% 4% 7%

BRIL|TNFL... 0% 0% 0% 13%

BRIL|CGQE... 0% 0%

Другие протестированные конструкции

вконец ICL3 C-конец Точечные мутации SE

полный ...GLR|BRIL|V... до Р350 F1583■51Y 50%

полный ...GLR|BRIL|V... до Р350 М3247-521 10%

полный ...GLR|BRIL|V... до Р350 Л3297570 66%

полный ...GLR|BRIL|V... до Р350 Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... до Р350 R3087■35D 13%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W 40%

полный ...GLR|BRIL|V... до G342 Y1483■41W 8%

полный ...GLR|BRIL|V... полный А13132ФЬ + Y1483■41W + F1583■51Y + F2315•49L + I2345•52L + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + I2345•52L + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + F2315•49L + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный М6013^ + Y1483■41W + F1583■51Y + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный 17114ФЬ + Y1483■41W + F1583■51Y + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + N282^ + Л3297■57D выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный А13132^ + Y1483■41W + F1583■51Y + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + А3047-3^ + Л3297■57D выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + М3247521 + Л3297■57D выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + Q2495•67A + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + Т259°^ + Л3297570 выше 75%

полный ...GLR|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + G3187.46S + Л3297570 выше 75%

полный полный Y1483■41W + Л3297570 40%

полный полный Y1483■41W + F1583■51Y + Л3297570 50%

полный полный Л3297570 30%

с Е33 ...GLR-|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + Л3297570 55%

с G38 ...GLR-|BRIL|V... полный Y1483■41W + F1583■51Y + Л3297570 выше 75%

Приложение 3. Кривые плавления для конструкции R252-BRIL-V253 с различными точечными мутациями и их комбинациями

Точечные мутации в конструкции К252-ВК11_-\/253 и влияние линкера Б перед ВРИ

1 1 / 1

л / / / / ( / /

30 40 50 60 70 80 90

-А7.570 + У3.41\Л/ + Р3.51У-А7.570 + У3.41\Л/

— А7.570 + У3.41\Л/ Б-ЬгИ А7.570 5-ЬгМ

Влияние 4-ой точечной мутации на терм оста бил ьн ость конструкции К252-ВРЯ1_-\/253 с мутациями А7.570, У3.41\Л/ и Р3.51У

о ----

40 50 60 70 80

15.521 -Р5.491_ -М1.331. без доп. мутаций -N6.541 — АЗ.241.

Влияние добавленных точечных мутаций на термостабильность конструкции Р252-ВШ1-\/253 с мутациями А7.570, У3.4Ш и Р3.51У

40 50 60 70 80

Р5.491. + 15.521 -15.521.+Р5.491. + 11.441 АЗ.241. + Р5.491. + 15.521

АЗ.241. + 11.441+ 15.521.-АЗ.241.+ 11.441+ ^5.491-Р5.491. + 67.465