Теоретическое и экспериментальное обоснование технологии и стандартизации твердых лекарственных форм бактериофагов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Ковязина Наталья Анатольевна

• Ковязина Наталья Анатольевна
• доктор наук
• 2025

Оглавление диссертации доктор наук Ковязина Наталья Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Антибиотикорезистентность: современное состояние проблемы

1.2 Опыт использования бактериофагов в лечении и профилактике инфекционных болезней

1.2.1 Структура и жизненный цикл бактериофага

1.2.2 Применение бактериофагов в лечении и профилактике инфекционных болезней

1.3 Тенденции разработки рациональных, фармакологически обоснованных лекарственных форм бактериофагов

1.3.1 Ассортимент лекарственных форм бактериофагов

1.3.2 Обзор разработок в области создания твердых лекарственных форм бактериофагов

1.3.3 Современные подходы к конструированию твердых лекарственных форм бактериофагов

Заключение по обзору литературы и постановка проблемы

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Вспомогательные вещества

2.3 Методы исследований

2.3.1 Методы биологических исследований

2.3.2 Методы биофармацевтических исследований in vitro

2.3.3 Методы математических исследований

2.3.4 Методы микробиологических исследований

2.3.5 Методы фармацевтико - технологических и физико -химических исследований

ГЛАВА 3 РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ИНТЕСТИФАГ®,

ТАБЛЕТКИ

3.1 Разработка состава таблеток Интестифаг®

3.1.1 Скрининг вспомогательных веществ

3.1.2 Оптимизация состава таблеток Интестифаг®

3.2 Подбор фракционного состава гранулята с бактериофагом

3.3 Изучение влияния давления прессования на качество таблеток Интестифаг®

3.4 Изучение фармацевтической доступности таблеток Интестифаг®

3.5 Получение лекарственного препарата Интестифаг®, таблетки

3.5.1 Разработка технологической блок-схемы получения лекарственного препарата Интестифаг®, таблетки

3.5.2 Изложение технологического процесса получения лекарственного препарата Интестифаг®, таблетки

3.6 Оценка качества лекарственного препарата Интестифаг®, таблетки

3.7 Изучение стабильности лекарственного препарата Интестифаг®, таблетки ®

Выводы по главе

ГЛАВА 4 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА СЕКСТАФАГ® ПИОБАКТЕРИОФАГ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ, КАПСУЛЫ

4.1 Разработка состава и технологии лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

4.1.1 Оптимизация состава методом дисперсионного анализа

4.1.2 Фармацевтико-технологические исследования по оптимизации состава методом Харрингтона

4.1.3 Оптимизация технологии

4.2 Изучение фармацевтической доступности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

4.3 Получение лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

4.3.1 Разработка технологической схемы получения лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

4.3.2 Изложение технологического процесса получения лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

4.4 Оценка качества лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

4.5 Изучение стабильности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы в процессе хранения

Выводы по главе

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА С МИКРОКАПСУЛИРОВАННЫМ БАКТЕРИОФАГОМ КЛЕБСИЕЛЛ ПНЕВМОНИИ ОЧИЩЕННЫМ, КАПСУЛЫ

5.1 Разработка состава и технологии микрокапсул с бактериофагом клебсиелл пневмонии очищенным

5.2 Оптимизация состава микрокапсулированной системы доставки бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного методом дисперсионного анализа

5.3 Оценка качества микрокапсул бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного

5.4 Изучение фармацевтической доступности лекарственного препарата Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы

5.5 Разработка технологической блок схемы получения лекарственного 187 препарата Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы

5.6 Оценка качества лекарственного препарата Бактериофаг клебсиелл 189 пневмонии очищенный, капсулы

5.7 Изучение стабильности лекарственного препарата Бактериофаг 193 клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы

Выводы по главе

ГЛАВА 6 РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА СЕКСТАФАГ® ПИОБАКТЕРИОФАГ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ, ПЛЕНКИ

6.1 Разработка состава и технологии лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки

6.1.1 Изучение характеристик пленкообразователей

6.1.2 Оптимизация состава матричной системы с комбинированным бактериофагом методом аддитивного критерия оптимальности

6.1.3 Разработка состава пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный с вакуумным методом высушивания

6.1.4 Разработка состава пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный с воздушным методом высушивания

6.2 Изучение фармацевтической доступности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки

6.3 Разработка технологической блок схемы получения лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки

6.4 Оценка качества лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки

6.5 Изучение стабильности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки

Выводы по главе

ГЛАВА 7 РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА СЕКСТАФАГ® ПИОБАКТЕРИОФАГ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ, ПЛАСТИНЫ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ

7.1 Разработка состава и технологии пластин лекарственных Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный

7.1.1 Экспериментальное обоснование выбора бактериофага для разработки пластин лекарственных антимикробного действия

7.1.2 Изучение характеристик формообразователей

7.1.3 Оптимизация состава пластин лекарственных Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный

7.1.4 Подбор способа высушивания пластин лекарственных Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный

7.2 Разработка технологической блок схемы получения лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пластины лекарственные

7.3 Оценка качества лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пластины лекарственные

7.4 Изучение стабильности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пластины лекарственные

Выводы по главе

ГЛАВА 8 БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТВЕРДЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ БАКТЕРИОФАГОВ

8.1 Оценка специфической активности бактериофага в твердых лекарственных формах

8.2 Исследования растворения твердых пероральных лекарственных форм бактериофагов

8.3 Доклинические исследования безопасности и эффективности твердых пероральных лекарственных форм бактериофагов

8.3.1 Оценка общей токсичности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

8.3.2 Оценка аллергизирующего действия лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

8.3.3 Изучение иммунотоксических свойств лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

8.3.4 Изучение фармакокинетики лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

8.3.5 Изучение антифагового иммунного ответа

8.4 Доклинические исследования безопасности и эффективности твердых аппликационных лекарственных форм бактериофагов

8.4.1 Оценка аллергизирующего действия аппликационных лекарственных форм бактериофагов

8.4.2 Изучение антибактериального и ранозаживляющего действия лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки

8.4.3 Изучение антибактериального и ранозаживляющего действия лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пластины лекарственные

Выводы по главе

ГЛАВА 9 МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ТВЕРДЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ

9.1 Биофармацевтические и технологические аспекты создания твердых лекарственных форм препаратов бактериофагов

9.2 Разработка алгоритма технологии твердых лекарственных форм фагопрепаратов, как систем доставки бактериофагов

9.2.1 Пероральные лекарственные формы: таблетки, капсулы, микрокапсулы

9.2.2 Аппликационные лекарственные формы: пленки, пластины

9.3 Научно - методологический подход к фармацевтической разработке

твердых лекарственных форм препаратов бактериофагов

Выводы по главе

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Патент РФ № 2410084 «Фармацевтическая композиция на основе Секстафага (Пиобактериофага поливалентного)

или бактериофага сальмонеллезного и способ её получения»

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Патент РФ № 2520346 «Фармацевтическая

композиция для лечения и профилактики бактериальной инфекции»

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Патент РФ № 2660355 «Антибактериальная фармацевтическая композиция для перорального применения,

содержащая бактериофаги»

ПРИЛОЖЕНИЕ 4. Патент РФ № 2677290 «Биодеградируемые пластины

лекарственные и способ их получения»

ПРИЛОЖЕНИЕ 5. Лабораторный регламент Секстафаг®

Пиобактериофаг поливалентный, капсулы

ПРИЛОЖЕНИЕ 6. Отчет о фармацевтической разработке лекарственного препарата для медицинского применения Секстафаг® Пиобактериофаг

поливалентный, капсулы

ПРИЛОЖЕНИЕ 7. Акты апробации технологии

ПРИЛОЖЕНИЕ 8. Акты внедрения в учебный процесс фрагментов

диссертационной работы

ПРИЛОЖЕНИЕ 9. Титульный лист Практикума по технологии твердых лекарственных форм (порошки, гранулы, таблетки, микрокапсулы,

капсулы)

ПРИЛОЖЕНИЕ 10. Титульный лист учебно-методического пособия

«Лечебно - профилактические бактериофаги»

ПРИЛОЖЕНИЕ 11. Титульный лист монографии «Современные направления развития отечественных биотехнологий в разработке лекарственных средств»

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Теоретическое и экспериментальное обоснование технологии и стандартизации твердых лекарственных форм бактериофагов»

Актуальность проблемы

Эпидемиологическая ситуация, связанная с распространением и ростом смертности от инфекционных болезней в мире, в последние десятилетия остается напряженной [1-3].

Несмотря на современные достижения мировой фармацевтической промышленности в создании новых классов и групп антибиотиков, являющихся основными препаратами этиотропной терапии при инфекционной патологии, наблюдается снижение их эффективности, что вызвано изменением генетического пула микроорганизмов под действием антибиотических веществ и, как следствие, развитием антибиотикорезистентности [4-5].

В 2017 году постановлением Правительства Российской Федерации была утверждена Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года, в которой одним из основных мероприятий по борьбе с антибиотикорезистентными штаммами микроорганизмов определена разработка новых биологических лекарственных препаратов [6-12].

В качестве альтернативных антибиотикам средств предлагается использование лечебно-профилактических препаратов бактериофагов. В условиях глобальной проблемы антибиотикорезистентности бактериофаги могут стать эффективным средством для профилактики и лечения многих бактериальных инфекций [13-16]. Основными достоинствами бактериофагов являются высокая избирательная чувствительность к ним патогенной микрофлоры, сочетаемость со всеми видами антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к применению [16-20].

Традиционной формой выпуска лечебно - профилактических бактериофагов, промышленно производимых в Российской Федерации, являются жидкие препараты (кроме таблетированных форм кишечных фагов), предназначенные для

перорального, местного или наружного применения. Клинические специалисты, использующие эти лекарственные препараты в фаготерапии, отмечают низкую комплаентность пациентов при назначении жидкой формы [21, 22]. При хранении лечебно - профилактических бактериофагов в форме раствора наблюдается падение специфической активности до 3-5 раз [23, 24]. При пероральном приеме жидких фагопрепаратов происходит частичная инактивация бактериофагов кислой средой желудка, приводящая к значительному снижению биологической доступности и эффективности препаратов.

В связи с этим, целесообразно разрабатывать системы доставки бактериофагов, обеспечивающие стабилизацию литической активности фагов и оптимальные потребительские характеристики. Спектр и сферы применения бактериофагов свидетельствует о потребности конструирования пероральных и аппликационных твердых лекарственных форм с локальной доставкой бактериофагов, с отсроченным и пролонгированным высвобождением.

В настоящее время отсутствует единая концепция подхода к разработке препаратов бактериофагов в твердых лекарственных формах. Актуальным является выявление общих закономерностей выбора вспомогательных веществ и технологических приемов конструирования препаратов бактериофагов, что позволит создать определенную методологическую концепцию с целью постоянной коррекцией технологических решений при оптимизации рецептуры, технологии получения и стандартизации лекарственных форм, масштабировании технологии производства и изучении стабильности разрабатываемого лекарственного препарата.

Создание концепции позволит разработать современные высокоэффективные лекарственные препараты бактериофагов, значительно расширить номенклатуру их лекарственных форм, обогатить современное фармацевтическое производство новыми технологиями.

Степень разработанности темы исследования

Пионерские единичные исследования по созданию твердых лекарственных форм бактериофагов были выполнены под руководством советских ученых Ермольевой З.В. (1930 г.), Сергиенко Ф.Е. (1944 г)., Синаюк Г.А. (1949 г.), Кривошеевой С.З. (1963 г.) и Нигматуллина Т.Г. (1974 г.), которые в качестве активной фармацевтической субстанции таблетированных препаратов использовали дизентерийный бактериофаг [25-28]. Большой цикл работ по конструированию комбинированных поливалентных бактериофагов в форме желудочно-резистентных таблеток для лечения и профилактики гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний был выполнен пермскими учеными под руководством В.И. Решетникова (2002-2009 г.) [29, 30]. Данные исследования явились предпосылкой к расширению спектра действия бактериофагов и ассортимента их лекарственных форм.

Созданию новых твердых лекарственных форм бактериофагов посвящены работы Алешкина А.В. с соавторами (2009 г.). Фармацевтическая композиция, разработанная автором, в связи с достаточным спектром стабильной литической активности, может быть использована для профилактики и лечения госпитальных инфекций и представлена в виде различных лекарственных форм: порошок, таблетки, капсулы [31].

Исследования зарубежных авторов представлены немногочисленной информацией о создании твердых лекарственных форм бактериофагов, в том числе с использованием технологии мембранного эмульгирования и инкапсулирования. Единичные работы посвящены разработке препаратов бактериофагов в аппликационных формах [32-34]. Для лечения ран и трофических язв Маркоишвили Н. (1999 г.) описывает высокую эффективность перевязочного материала с бактериофагом Фагобиодерм [34].

Однако системных работ по экспериментально-теоретическому обоснованию состава, технологии и, как следствие, формирования единой концепции разработки твердых лекарственных форм бактериофагов ранее не проводилось, что определяет актуальность данного исследования.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось теоретическое обоснование и экспериментальная разработка технологии и стандартизации твердых пероральных и аппликационных лекарственных форм бактериофагов для профилактики и лечения заболеваний инфекционной природы.

Для достижения поставленной цели требовалось решение следующих задач:

1. Провести анализ современной научной литературы, законодательной и патентной базы в области создания и производства лекарственных форм бактериофагов для профилактики и терапии заболеваний инфекционной природы;

2. Разработать оптимальные составы и технологию получения твердых пероральных и аппликационных лекарственных форм бактериофагов с учетом оценки сочетания биологически активной фармацевтической субстанции и вспомогательных веществ, обеспечивающих их качественные технологические свойства, эффективность и потребительские характеристики;

3. Провести стандартизацию разработанных твердых лекарственных форм бактериофагов в соответствии с требованиями действующих нормативных документов;

4. Изучить стабильность при хранении твердых лекарственных форм бактериофагов методами долгосрочных испытаний и ускоренного хранения с учетом влияния упаковки и условий хранения;

5. Провести комплекс биофармацевтических исследований безопасности и эффективности разработанных твердых пероральных и аппликационных лекарственных форм бактериофагов;

6. На основании выявления общих закономерностей сформулировать методологические подходы к созданию твердых лекарственных форм препаратов бактериофагов;

7. Оформить нормативную документацию.

Научная вдвизна

На основании комплекса теоретических и экспериментальных исследований впервые сформулирован и реализован научно - методологический подход к фармацевтической разработке твердых лекарственных форм препаратов бактериофагов для профилактики и лечения заболеваний инфекционной природы. Разработаны пять оригинальных лекарственных препаратов с выраженным антибактериальным потенциалом: таблетки кишечнорастворимые Интестифаг®; твердые капсулы Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный; твердые капсулы с микрокапсулированным бактериофагом клебсиелл поливалентный очищенным; пленки Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный; пластины лекарственные Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный.

Результаты биофармацевтических исследований показали, что разработанные препараты бактериофагов в твердых лекарственных формах обладают высокой биологической доступностью и не оказывают токсического, аллергизирующего и иммунотоксического действия, что свидетельствует о их безопасности.

Новизна исследований подтверждена патентами на изобретение Российской Федерации:

- «Фармацевтическая композиция на основе Секстафага (Пиобактериофага поливалентного) или бактериофага сальмонеллезного и способ её получения» № 2410084 (Приложение 1);

- «Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики бактериальной инфекции» № 2520346 (Приложение 2);

- «Антибактериальная фармацевтическая композиция для перорального применения, содержащая бактериофаги» № 2660355 (Приложение 3);

- «Биодеградируемые пластины лекарственные и способ их получения» № 2677290 (Приложение 4).

Теоретическая значимость работы

Разработана поэтапная научно-обоснованная методология фармацевтической разработки твердых лекарственных форм бактериофагов. Сумма предложенных конструктивных подходов, технологических схем, а также систем обработки результатов экспериментов, способна послужить универсальным инструктивным руководством при создании линейки препаратов бактериофагов в твердых лекарственных формах.

Практическая значимость работы

Практическая значимость работы заключается в разработке пяти твердых лекарственных форм бактериофагов, обладающих выраженной антимикробной активностью и по показателям качества (подлинность, специфическая активность, микробиологическая чистота, время распадаемости, потеря в массе при высушивании, аномальная токсичность) полностью соответствующих требованиям, предъявляемым к препаратам бактериофагов согласно ОФС 1.7.1.0002.15 «Бактериофаги» Государственной Фармакопеи Российской Федерации.

Разработан и апробирован в промышленных условиях лабораторный регламент на лекарственный препарат Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы (Приложение 5). Оформлен и утвержден отчет о фармацевтической разработке лекарственного препарата для медицинского применения Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы (Приложение 6).

Апробация технологии лекарственных препаратов проведена в отделении бактериофагов филиала АО «Микроген» в г. Пермь «Пермское НПО «Биомед» (Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный в форме твердых капсул) и на базе ООО «Милафарма лабораториз», г. Пермь (пластины, пленки) (Приложение 7).

Фрагменты диссертационной работы по разработке твердых лекарственных форм бактериофагов для профилактики и терапии заболеваний инфекционной природы внедрены в учебный процесс кафедры промышленной технологии

лекарств с курсом биотехнологиии ФГБОУ ВО ПГФА Минздрава России фармацевтического факультета при реализации программ специалитета по специальности 33.05.01 «Фармация» и факультета промышленной фармации при реализации программ бакалавриата 19.03.01 «Биотехнология» (Приложение 8).

Результаты диссертационной работы включены в:

- Практикум по технологии твердых лекарственных форм (порошки, гранулы, таблетки, микрокапсулы, капсулы), рекомендованное к изданию центральным методическим советом ФГБОУ ВО ПГФА Минздрава России протокол № 6 от 25 июня 2019 г. (Приложение 9).

- Учебно-методическое пособие «Лечебно - профилактические бактериофаги», рекомендованное к изданию центральным методическим советом ФГБОУ ВО ПГФА Минздрава России протокол № 4 от 26 апреля 2024 г. (Приложение 10).

Результаты исследования использованы для написания коллективной монографии: Молохова Е.И., Сорокина Ю.В., Ковязина Н.А. «Современные направления развития отечественных биотехнологий в разработке лекарственных средств» (Приложение 11).

Методология и методы исследования

В основе диссертационной работы лежит поиск возможностей расширения номенклатуры отечественных высокоэффективных твердых пероральных и аппликационных лекарственных форм препаратов бактериофагов для профилактики и терапии заболеваний инфекционной природы. Методологический подход предусматривает проведение комплекса теоретических, биологических, биофармацевтических, математических, микробиологических, фармацевтико -технологических и физико - химических исследований, обеспечивающих разработку эффективных и качественных антибактериальных лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты экспериментальных исследований по обоснованию оптимального состава, технологии, технологической блок-схемы получения, стандартизации и стабильности лекарственного препарата Интестифаг®, таблетки;

2. Результаты экспериментальных исследований по фармацевтической разработке оптимального состава, технологии, технологической схемы получения, стандартизации и стабильности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, капсулы;

3. Результаты экспериментальных исследований по обоснованию оптимального состава, технологии, технологической блок-схемы получения, стандартизации и стабильности лекарственного препарата с микрокапсулированным комбинированным бактериофагом клебсиелл поливалентный очищенный, капсулы;

4. Результаты экспериментальных исследований по обоснованию оптимального состава, технологии, технологической блок-схемы получения, стандартизации и стабильности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки;

5. Результаты экспериментальных исследований по обоснованию оптимального состава, технологии и стандартизации лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пластины лекарственные;

6. Результаты биофармацевтических исследований по безопасности и эффективности твердых пероральных и аппликационных лекарственных форм бактериофагов для профилактики и терапии заболеваний инфекционной природы;

7. Методология этапов фармацевтической разработки конструирования твердых пероральных и аппликационных лекарственных форм бактериофагов.

Степень достоверности исследований

Научные положения и выводы, представленные в диссертации, основываются на многократной повторяемости экспериментальных исследований с использованием современных информационных технологий, фармацевтико-технологических, биологических, биофармацевтических, микробиологических, физико - химических и математических методов, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты. При проведении экспериментальной работы использовано современное оборудование, проведена статистическая обработка полученных результатов. Заключения и научные положения, изложенные в диссертационной работе, достоверны и обоснованно вытекают из полученных автором результатов.

Апробация результатов исследований

Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены (2007 - 2025 гг.) на: Российских конгрессах - «Человек и лекарство» (Москва, 2010, 2013); Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2013); Международных и российских научно-практических конференциях - «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (Пермь, 2007); «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств (Санкт-Петербург, 2010); «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Ульяновск, 2013), (Нижний Новгород, 2018); «Инновации в здоровье нации» (Санкт-Петербург, 2013); «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 2015); «Молодые ученые - медицине» (Владикавказ, 2015); «Инновации в медицине и фармации» (Минск, 2015); Обеспечение эпидемиологической безопасности и профилактика инфекции в хирургии» (Казань, 2016); «Перспективы развития производства и применения иммунобиологических препаратов в XXI веке» (Пермь, 2018); «Вирусные инфекции и общество: проблемные вопросы диагностики, лечения и профилактики» (Екатеринбург,

2018); «Создание конкурентоспособных лекарственных средств - приоритетное направление развития фармацевтической науки» (Пермь, 2018); «Современные проблемы естественных наук и фармации» (Йошкар-Ола, 2022); «Фармацевтическая наука XXI века: актуальные проблемы и перспективы их решений» (Уфа, 2022 года); «Достижения современной науки: биотехнология, химия и фармация» (Симферополь, 2023); «Кромеровские чтения» (Пермь, 2023, 2024, 2025); «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 2024); «Сандеровские чтения» (Санкт-Петербург, 2024, 2025); «Горизонты биофармацевтики» (Курск, 2024); «Актуальные проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики» (Кемерово, 2024); «Донецкие чтения 2024: образование, наука, инновации, культура и вызовы современности» (Донецк, 2024), «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2024), «Фармакология и фармацевтика: от идеи до лекарственного препарата» (Курск, 2024), «Биотехнология: взгляд в будущее» (Ставрополь, 2024), Медико-биологические и нутрициологические аспекты здоровье сберегающих технологий (Кемерово, 2025).

Личный вклад автора

Личный вклад автора состоит в: выборе научного направления и объектов исследования; постановке проблемы, цели, задач, плана исследований и пути их реализации; анализе данных научной литературы и патентной документации по теме диссертационного исследования; фармацевтической разработке и обоснования оптимальных составов, оптимизации технологии твердых лекарственных форм (таблетки, капсулы, пленки, пластины лекарственные) бактериофагов; изучения стабильности в процессе хранения; биофармацевтических исследований; статистической обработке, анализе, научном обосновании и обобщении экспериментальных результатов; формулировке выводов; публикации научных работ и выступлений на научных конференциях по теме диссертации, разработке нормативной документации. Все приведенные в диссертации данные по биологическим, биофармацевтическим, микробиологическим, математическим, фармацевтико - технологическим и

физико - химическим исследованиям были получены самим автором или при непосредственном его участии на базе ФГБОУ ВО ПГФА Минздрава России, МУЗ «Городская поликлиника № 2» г. Пермь, ООО «Милафарма лабораториз», г. Пермь и АО «Микроген» в г. Пермь «Пермское НПО «Биомед».

Результаты научных исследований опубликованы в моноавторстве и соавторстве. Оформление диссертационной работы выполнено автором самостоятельно.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертационной работы соответствуют паспорту научной специальности 3.4.1. Промышленная фармация и технология получения лекарств.

Результаты экспериментальных исследований соответствуют области исследований научной специальности, конкретно пунктам паспорта специальности: п. 2 - «Проектирование и разработка технологий получения фармацевтических субстанций и лекарственных форм»; п. 3 - «Исследование биофармацевтических аспектов в технологии получения лекарственных средств»; п. 4 - «Организация фармацевтической разработки»; п. 7 «Разработка и совершенствование научных, методологических и практических принципов систем качества».

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 72 работы из них 20 статей в изданиях, входящих в Перечень рецензируемых научных изданий, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России; 1 глава в коллективной монографии «Современные направления развития отечественных биотехнологий в разработке лекарственных средств»; 2 учебных издания (учебно - методическое пособие «Лечебно - профилактические бактериофаги» и практикум по технологии твердых лекарственных форм (порошки, гранулы, таблетки, микрокапсулы, капсулы); получено 4 патента РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 366 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы (глава 1), описание объектов и методов исследования (глава 2), 7 глав собственных экспериментальных исследований, заключение, список сокращений и условных обозначений, список использованной литературы и приложения, содержащие документы, подтверждающие научную практическую значимость полученных результатов. Работа иллюстрирована 50 рисунками и 105 таблицами. Список литературы включает 350 источников (282 отечественных и 68 иностранных).

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Антибиотикорезистентность: современное состояние проблемы

Эпидемиологическая ситуация, связанная с распространением и ростом смертности от инфекционных болезней в мире, в последние десятилетия остается напряженной [1-3, 35, 36]. Несмотря на современные достижения мировой фармацевтической промышленности в создании новых классов и групп антибиотиков, являющихся основными препаратами этиотропной терапии при инфекционной патологии, наблюдается снижение их эффективности, что вызвано изменением генетического пула микроорганизмов под действием антибиотических веществ и, как следствие, развитием антибиотикорезистентности [4, 37-39].

В научно-медицинской литературе антибиотикорезистентности придают статус «вновь появившейся смертельной болезни» [40]. По прогнозам ВОЗ и Центра по контролю и профилактике заболеваний, при текущих темпах распространения устойчивости смертность от инфекционных болезней к 2050 году составит около 10 миллионов человек в год и выйдет на одно из первых мест наравне с онкологическими и сердечно-сосудистыми заболеваниями [6, 41, 42].

В 2024 году ВОЗ опубликовала список из 15 приоритетных бактериальных патогенов, которые представляют наибольшую угрозу для здоровья человека. В качестве «критических» патогенов значатся устойчивые к антибиотикам грамотрицательные бактерии рода Acinetobacter и Pseudomonas. Именно эти микроорганизмы являются причиной внутрибольничных инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии. В РФ ежегодно регистрируется 26-30 тыс. случаев инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, однако по оценкам экспертов фактически же их распространение значительно выше и число может достигать 2 — 2,5 млн, из них 15% - это гнойно-септические инфекции новорожденных, около 16% - гнойно-септические инфекции у оперированных пациентов [36, 43-48].

К патогенам высокого уровня приоритетности отнесены бактерии рода Salmonella, Shigella, Staphylococcus и Enterococcus являющиеся причиной стабильного роста ОКИ. Установлено, что в 2000-2005 гг. показатель заболеваемости ОКИ находился в пределах от 435,1 до 454,3 на 100 тыс. населения, а в 2014-2018 гг. он увеличился до 514,5-555,7, при этом наибольшую опасность пищевые токсикоинфекции представляют в детском возрасте [49]. В настоящее время доля кишечных инфекций неизвестной этиологии остается стабильно высокой и составляет 63,4-69,4% [50, 51].

Патогены среднего уровня приоритетности представлены бактериями рода Streptococcus (в том числе группы А и В), а также Haemophilus influenzae. Эти патогены требуют повышенного внимания, особенно в уязвимых группах населения, включая детей и людей пожилого возраста. Бактериями рода Streptococcus вызывают множество заболеваний, включая фарингит, пневмонию, инфекции ран и кожи, сепсис и эндокардит. По данным ВОЗ, в мире ежегодно возникает свыше 111 млн. случаев стрептодермии и 616 млн. случаев стрептококковых фарингитов.

Таким образом, антибиотикорезистентность способствует хронизации воспалительного процесса, увеличивает сроки госпитализации и, как следствие, финансовую нагрузку на систему здравоохранения [52]. Кроме того, в ряде случаев данное осложнение медицинской деятельности сопровождается инвалидизацией населения, в том числе трудоспособного, в особо сложных случаях - летальным исходом [53].

Сложившаяся ситуация имеет большое социально-экономическое значение и рассматривается как угроза национальной безопасности. Снизить распространенность антибиотикорезистентных генов в окружающей среде в настоящее время представляется маловероятным, поэтому основные усилия направлены на сдерживание этого процесса. С этой целью разрабатываются международные программы и стратегии, создаются общества и ассоциации, принимаются декларации [54, 55].

Так, в 2015 году ВОЗ опубликовала Глобальную стратегию по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам [41, 42], а в 2016 году вопрос борьбы с растущей угрозой антибиотикорезистентности был вынесен на повестку дня Генеральной Ассамблеи ООН.

В результате проведенных мероприятий при правительствах США, Франции, Великобритании, Бельгии, Канады созданы специальные комитеты, занимающиеся консультированием законодателей по проблемам и различным аспектам применения антибиотиков.

Постановлением правительства РФ в 2017 году утверждена «Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года» [7, 8, 11]. Документ прежде всего направлен на совершенствование контроля безрецептурного отпуска противомикробных препаратов, их рациональное использование в сфере здравоохранения, ветеринарии и сельском хозяйстве. В сфере развития фармацевтической промышленности РФ Стратегия направлена на разработку, внедрение и производство качественных антибактериальных средств [12].

Разработка новых препаратов антибиотиков является не только многолетней дорогостоящей процедурой, но и не снижает числа нежелательных побочных реакций при использовании данных препаратов.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Ковязина Наталья Анатольевна, 2025 год

и - „

8 е 4

ЕТ РР

к л 3 -&1 н

|Ц Зн

к а 1 о £ 1 Й 0

4,7 4,5

0 3 6 9 12 15 18 21

Хранение, мес.,

Рисунок 22 - Стабильность лекарственного препарата Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы

Специфическая (литическая) активность микрокапсулированного бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного изначально составляла 10"4,7±0'35. Последующий ежемесячный контроль активности был на идентичном уровне. Разработанные микрокапсулы бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного стабильны в течение 21 месяцев хранения (срок наблюдения) при температуре от 2°С до 8°С.

Результаты фармацевтико-технологических и микробиологических испытаний в процессе хранения в течение 21 месяца при температуре от 2 до 8 °С. согласно разработанной Спецификации на бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы для приема внутрь приведены в таблице 60.

Оценку качества лекарственного препарата бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы в процессе хранения проводили в течение 21 месяца по показателям: описание, подлинность, специфическая активность, однородность массы, распадаемость, микробиологические испытания, аномальная токсичность.

Таблица 60 - Оценка качества лекарственного препарата Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы в процессе

хранения

Показатели качества Срок хранения, мес.

0 6 12 18 21

Описание Твердые желатиновые капсулы № 4 белого цвета, непрозрачные, цилиндрической формы с полусферическими концами, состоящие из двух частей (корпуса и крышечки). Поверхность капсул гладкая, без повреждений и видимых воздушных и механических включений. Содержимое капсул - микрокапсулы светло-бежевого цвета, правильной симметричной сферической формы со специфическим запахом.

Подлинность Специфически лизирует по методу Аппельмана бактерии Klebsiella pneumoniae

Специфическая активность 2Q-4,70±0,35 Y Q-4,20±0,40 2Q-3,80±0,38 2Q-3,50±0,35 2Q-3,30±0,32

Однородность массы соответствует соответствует соответствует соответствует соответствует

Распадаемость соответствует соответствует соответствует соответствует соответствует

Микробиологиче ские испытания Соответствует категории ЗА

Аномальная токсичность нетоксичен нетоксичен нетоксичен нетоксичен нетоксичен

В результате наблюдения установлено, что при хранении разработанного лекарственного препарата Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы в полимерной герметичной упаковке (полимерная банка с винтовой крышкой и силикагелевой вставкой), в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °С ЛП соответствует требованиям нормативного документа по качеству и стабилен в течение 21 месяца, что подтверждает совместимость фармацевтической композиции разработанного препарата Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы с первичной упаковкой и высокую биологическую эффективность на протяжении регламентированного срока годности.

Выводы по главе 5

1. Проведена оптимизация микрокапсулирования бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного с помощью греко-латинского квадрата. Выявлена рациональность получения микрокапсул путем капельного дисперигования 3% геля альгината натрия с БФ в растворе 10 % кальция хлорида, с образованием кальциевой соли альгиновой кислоты. Оптимальная скорость диспергирования является 500 об/мин. Исследовано влияние вида и режима сушки (вакуумное и воздушное) на стабильность фага в микрокапсулах. Наилучшее сохранение специфической активности в композиции обеспечивало вакуумное высушивание при определенном значении средней глубины вакуума.

2. Проведена оценка качества микрокапсул бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного по показателям: описание, геометрические размеры (диаметр), однородность массы, потеря в массе при высушивании, насыпная плотность, сыпучесть и специфическая активность. Подобран типоразмер твердых капсул для капсулирования микрокапсулированного бактериофага.

3. Получены экспериментальные бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного, капсулы. Разработана технологическая блок-схема и приведено изложение технологического процесса получения микрокапсулированного бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного в форме твердых капсул.

4. Изучена фармацевтическая доступность микрокапсул бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного. Установлено, что в микрокапсулированной форме сохранение активности клебсиеллезного БФ после воздействия кислой среды в 5,5 раза выше, чем в растворе. Исследования показали наличие гастрорезистентных свойств микрокапсул бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного и высокой биодоступностью в сравнении с ЛП бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного в форме раствора.

5. Оценка качества ЛП Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы по показателям: описание, подлинность, специфическая активность, микробиологические испытания, аномальная токсичность, однородность массы, распадаемость показала соответствие требованиям спецификации. Валидированы по промежуточной прецизионности методы контроля по испытанию Однородность массы дозированных лекарственных форм, подтверждена пригодность, соответствие для контроля качества и процесса получения ЛП Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы

6. Установлены сроки годности ЛП Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный, капсулы. Хранение при температуре от 2 до 8 °С в течение 21 месяца показало стабильность микрокапсулированного бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного в форме твердых капсул, что подтверждает максимальный срок наблюдения и соответствие требованиям проекта спецификации.

ГЛАВА 6 РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА СЕКСТАФАГ® ПИОБАКТЕРИОФАГ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ, ПЛЕНКИ

6.1 Разработка состава и технологии лекарственного препарата Секстафаг®

Пиобактериофаг поливалентный, пленки

Создание пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный с пролонгированным действием, включало ряд последовательных этапов. В первой серии экспериментов были предприняты исследования по разработке состава -подбор основы (пленкообразователя); подбор соотношения пластификатора к пленочной массе с целью коррекции технологических свойств пленок; при получении пленочных композиций БАФС вводят либо в сухой, либо в жидкой форме. Мы отдали предпочтение последней, поскольку по литературным данным активность жидких фагов сохраняется в 2 раза дольше, чем сухих [64], а исключение стадии лиофилизации удешевляет производство препарата. Проведенные нами исследования по высушиванию Секстафага также показали значительную инактивацию БФ в процессе сушки и выявили наиболее лабильные фаги: стрептококковый и стафилококковый (см. гл. 3.1.). Второй этап заключался в оптимизации технологического процесса получения пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный.

6.1.1 Изучение характеристик пленкообразователей

На первом этапе проводили подбор полимерной матрицы - носителя, которая выполняет функции иммобилизации фага и матричного носителя БАФС, как системы доставки ЛС. В качестве матрицы производители используют материалы на основе природных и синтетических полимеров различной природы и структуры, что существенно отличает степень биологической доступности БФ. Немало важное

значение имеет стабильность поливалентных БФ в матрицеобразующих полимерах.

С целью исследования стабильности иммобилизованного Секстафага в полимерной основе (%), получены 12 модельных образцов пленок. В качестве пленкообразователей использовали биодеградирующие полимеры природного и синтетического происхождения: ГПМЦ, желатин, карбопол, коллаген Коротко Волокнистый, крахмал картофельный, метилцеллюлозу марки 15 и 35, карбоксиметилцеллюлозу натрия, альгинат натрия, пектин цитрусовый, пектин яблочный, поливиниловый спирт.

Биофармацевтические характеристики пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный включают способность обеспечивать оптимальную биологическую доступность иммобилизованных БФ и максимально сохранять стабильность БАФС в полимерной форме.

Изучение влияния природы полимерной матрицы на стабильность бактериофагов в 3 % геле представлено на рисунке 23.

гипромеллоза желатин карбопол коллаген крахмал картофельный метилцеллюлоза - 15 метилцеллюлоза - 35 кармеллоза натрия натрия альгинат пектин цитрусовый пектин яблочный спирт поливиниловый

В

=□

20

40

60

80

100

Специфическая активность, %

Рисунок 23 - Стабильность бактериофага Секстафага в 3 % геле

0

Изучение специфическая активность БФ в модельных образцах 3 % геля показало варьирование в диапазоне от 8% до 100 %. Полное сохранение

специфической активности БФ установлено при контактировании с природными полимерами - желатина и коллаген, с синтетическими - МЦ. Наименьшая - у альгината натрия, пектина цитрусового и яблочного, при этом у гелей на основе пектина наблюдали полную инактивацию стафилококкового фага, что возможно связано с его сорбцией. Стафилококковый фаг наиболее лабилен к воздействию полимеров альгината натрия, кармеллозы натрия, пектина яблочного, пектина цитрусового и поливинилового спирта, чем синегнойный БФ.

Бактериофаг при высушивании подвергается консервации, лишаясь свободной воды, переходят в состояние анабиоза [287]. Скрининг пленкообразователей осуществляли по ксеропротекторным свойствам.

Полуфабрикаты 3% деаэрированного геля с Секстафагом выливали на подложки толщиной 10-12 мм в зависимости от природы полимера высушивали. Модельные образцы пленок получали методами воздушного высушивания в термостате при температуре 37±1 °С.

Коллаген не сформировал твердую пленку, поэтому дальнейшие исследования проводили на 11 полимерах природного и синтетического происхождения.

Результаты по определению специфической активности в модельных пленках Секстафаг, пленки представлены на рисунке 24.

В зависимости от природы полимерной матрицы специфическая активность БФ в пленках варьировала от 18% до 100 %. У пленок на основе карбопола, поливинилового спирта, кармеллозы натрия, крахмала картофельного, МЦ марки 35, МЦ марки 15 и желатина пищевого стабильность бактериофагов после воздушного высушивания составила более 50% [288, 289].

гипромеллоза желатин пищевой карбопол крахмал картофельный метилцеллюлоза - 15 метилцеллюлоза - 35 кармеллоза натрия альгинат натрия пектин цитрусовый пектин яблочный спирт поливиниловый

Зн

20

40 60 80 100

Специфическая активность, %

Рисунок 24 - Специфическая активность бактериофага Секстафаг, пленки

Определение адгезионных свойств пленкообразователей показало, что показатели адгезии для изученных полимеров оказались относительно близки и входили в интервал значений 3,0 -3, Н*10 (Рисунок 25).

гипромеллоза желатин карбопол крахмал картофельный метилцеллюлоза - 15 метилцеллюлоза - 35 кармеллоза натрия альгинат натрия пектин цитрусовый пектин яблочный спирт поливиниловый

0

0,5

1

1,5

2 2,5 3 3,5

Адгезия пленок, Н

Рисунок 25 - Адгезионные свойства полимерных систем

0

4

Высокий показатель адгезии наблюдали у образцов на основе кармеллозы натрия - 3,5 ± 0,1 Н, желатина - 3,4 ± 0,1 Н, МЦ марки 15 - 3,3 ± 0,1 Н. Наименьшие

адгезионные свойства проявились у образцов на основе пектина цитрусового - 3,0 ± 0,1 Н, карбопола 3,0 ± 0,1 Н, альгината натрия - 3,0 ± 0,1 Н, крахмала - 3,0 ± 0,1 Н, спирта поливинилового - 2,0 ± 0,1 Н.

Таким образом, в результате эксперимента по изучению адгезионных свойств было установлено, что полимерные композиции рационально получать на основе производных целлюлозы и желатина.

Биологическая эффективность пленок основана на комплексном воздействии БАФС (бактериофаг) и матрицы-носителя. БФ отличаются высокой лабильностью по отношению к ВВ и технологическим факторам производства. В связи с этим при конструировании полимерных композиций необходим комплексный подход.

Следующим этапом скрининга гидрофильных полимерных носителей для конструирования биодеградируемых высокоактивных пленок с БФ являлось изучение биологической доступности фагов из матричных систем методом диффузии в агаровый гель. Релиз БФ из модельных полимерных матричных систем с комбинированным бактериофагом Секстафаг представлен в таблице 61.

Таблица 61 - Релиз бактериофагов из полимерных матричных систем

Полимер Фаголизабельность бактериальной культуры тест-штамма %

Staphyloc occus &тер1осос сш Proteus Pseudomo nas Klebsiella E. Coli

Гипромеллоза + + + + ++ ++ 44

Желатин ++ ++ ++ ++ +++ ++ 100

Карбопол ++ ++ ++ +++ +++ +++ 83

Крахмал ++ + + + ++ + 44

Метилцеллюлоза - 15 ++ ++ ++ ++ +++ ++ 89

Метилцеллюлоза - 35 + ++ ++ ++ +++ ++ 78

Кармеллоза натрия +++ ++ ++ ++ +++ ++ 72

Альгинат натрия ++ ++ + + +++ ++ 61

Пектин цитрусовый + + + + + + 33

Пектин яблочный +++ ++ + ++ ++ + 39

Спирт поливиниловый +++ +++ ++ +++ +++ ++ 89

Изучение биологической доступности фагов из пленок Секстафаг® методом диффузии в агаровый гель показало, что все изученные образцы являются релиз-активными. Выявлено, что высвобождение стафилококкового БФ,

стрептококкового, протейного, синегнойного, энтерококкового, клебсиеллезного, фага кишечной палочки происходит путем сочетания двух процессов: диффузии и биодеградации [290].

Релиз-активными полимерными матричными системами с высоким показателем высвобождения иммобилизованных БФ являются пленкообразователи - желатин, карбопол, метилцеллюлоза, кармеллоза натрия и спирт поливиниловый.

6.1.2 Оптимизация состава матричной системы с комбинированным бактериофагом методом аддитивного критерия оптимальности

Первостепенной задачей при разработке пленок с бактериофагом являлся подбор основы (пленкообразователя), которая минимально инактивирует компоненты комбинированного бактериофага и обеспечивает оптимальные технологические свойства пленочной композиции.

В таблице 62 обобщены биофармацевтические свойства полимерных систем с бактериофагом: специфическая активность Секстафага в геле, специфическая активность СФ в пленке, релиз СФ из пленки, диализ СФ, адгезия.

Таблица 62 - Биофармацевтические свойства полимерных систем с комбинированным бактериофагом Секстафаг® Пиобактериофаг

поливалентный

Полимер Специфическая активность, % Релиз, % Диализ АИС0-6 Адгезия, Н

гель пленка

Пектин цитрусовый 24 ± 3 18 ± 3 33 0,27 3,0±0,1

Пектин яблочный 28 ± 3 22 ± 3 39 0,27 3,1±0,1

Карбопол 100 ± 0 65 ± 2 83 24,23 3,0±0,1

Альгинат натрия 49 ± 2 34 ± 2 61 6,61 3,0±0,1

Желатин 100 ± 0 100 ± 0 89 19,41 3,4±0,1

Крахмал 100 ± 0 78 ± 2 44 12,02 3,0±0,1

Спирт поливиниловый 70 ± 2 65 ± 2 89 26,68 2,0±0,1

Метилцеллюлоза - 15 100 ± 0 90 ± 2 89 22,57 3,2±0,1

Метилцеллюлоза - 35 100 ± 0 92 ± 2 78 24,65 3,3±0,1

Гипромеллоза 61 ± 2 48 ± 2 44 11,10 3,1±0,1

Кармеллоза натрия 85 ± 2 66 ±2 72 23,95 3,5±0,1

Оптимизацию состава матричной системы бактериофага проводили методом многокритериальной выборки по аддитивному критерию оптимальности.

В качестве стратегий оптимизации исследованы 11 полимеров. Критериями оптимизации являлись специфическая активность СФ в пленке, релиз СФ из пленки, диализ СФ, адгезия. Нормализация аддитивных критериев оптимальности для полимерных матриц с комбинированным БФ представлена в таблице 63.

На рисунке 26 представлены значения аддитивного критерия оптимальности для полимерных матриц с комбинированным БФ (пектина цитрусового, пектина яблочного, карбопола, альгината натрия, желатина, крахмала картофельного, спирта поливинилового, МЦ марки 15, МЦ марки 35, гипромеллозы, кармеллозы натрия).

гипромеллоза

желатин ' '

карбопол крахмал картофельный метилцеллюлоза - 15 ' '

метилцеллюлоза - 35 ' '

кармеллоза натрия I I

альгинат натрия пектин цитрусовый пектин яблочный спирт поливиниловый

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Аддитивный критерий оптимальности

Рисунок 26 - Значение аддитивного критерия оптимальности для полимерных матриц с комбинированным бактериофагом

Анализ значений аддитивных критериев оптимальности для полимерных матриц с комбинированным бактериофагом Секстафаг показал выбор оптимальных стратегий № 6 - желатин (0.925); № 10 - метилцеллюлоза марки 35 (0.916), № 9 - метилцеллюлоза марки 15 (0.915), № 12 карбоксиметилцеллюлоза натрия (0.842). Наибольшему значению аддитивного критерия оптимальности соответствует стратегию F6 (Вариант №6) желатин [291].

Таблица 63 - Нормализация аддитивных критериев оптимальности для полимерных матриц с комбинированным __бактериофагом__

Стратегии Критерии оптимальности Аддитивный критерий оптимальности, F

Критерий № 1 Критерий № 2 Критерий № 3 Критерий № 4

СА БФ в пленке, % Релиз, % Диализ AUC0-6 Адгезия, Н

№ 1 Пектин цитрусовый 18/100 = 0.18 33/89 = 0.3708 0.27/26.68 = 0.0101 3/3.5 = 0.8571 0.3545

№ 2 Пектин яблочный 22/100 = 0.22 39/89 = 0.4382 0.27/26.68 = 0.0101 3.1/3.5 = 0.8857 0.3885

№ 3 Карбопол 65/100 = 0.65 83/89 = 0.9326 24.33/26.68 = 0.9119 3/3.5 = 0.8571 0.8379

№ 4 Альгинат натрия 34/100 = 0.34 61/89 = 0.6854 6.61/26.68 = 0.2478 3/3.5 = 0.8571 0.5326

№ 5 Желатин 100/100 = 1 89/89 = 1 19.41/26.68 = 0.7275 3.4/3.5 = 0.9714 0.9247

№ 6 Крахмал 78/100 = 0.78 44/89 = 0.4944 12.02/26.68 = 0.4505 3/3.5 = 0.8571 0.6455

№ 7 Спирт поливиниловый 65/100 = 0.65 89/89 = 1 26.68/26.68 = 1 2/3.5 = 0.5714 0.8054

№ 8 Метилцеллюлоза - 15 90/100 = 0.9 89/89 = 1 22.57/26.68 = 0.846 3.2/3.5 = 0.9143 0.9151

№ 9 Метилцеллюлоза - 35 92/100 = 0.92 78/89 = 0.8764 24.65/26.68 = 0.9239 3.3/3.5 = 0.9429 0.9158

№ 10 Гипромеллоза 48/100 = 0.48 44/89 = 0.4944 11.01/26.68 = 0.4127 3.1/3.5 = 0.8857 0.5682

№ 11 Кармеллоза натрия 66/100 = 0.66 72/89 = 0.809 23.95/26.68 = 0.8977 3.5/3.5 = 1 0.8417

Вес критерия, Xj 0.25 0.25 0.25 0.25

Значение max 100 89 26.68 3.5

6.1.3 Разработка состава пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный с вакуумным методом высушивания

Сушка пленочной массы - один из основных этапов технологического процесса получения лекарственной формы - пленки.

В процессе сушки трудным моментом является создание условий, которые ускоряют движение воды из пленочной биомассы к ее поверхности и обеспечивают ровную структуру поверхности пленки.

Действуют следующие законы, которые регулируют движение воды в пленочной биомассе. Скорость перемещения влаги в пленочной биомассе зависит:

1. От температуры.

2. От степени вакуума в сушильной камере.

3. От перепада температур (вода движется из мест, имеющих высокую температуру, к местам с низкой температурой).

4. От разности концентраций (вода движется из мест более насыщенных влагой к местам с меньшей насыщенностью) [292].

Изучение возможности получения пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный с применением вакуумного высушивания поливочной биомассы проводили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 34±2 °С, глубина вакуума "от -0,04 до -0,1 МПа" (по вакуумметру).

Для получения пленок, соответствующих требованиям НД, необходимо правильно подобрать технологические параметры производства.

Согласно значениям аддитивных критериев оптимальности (см. Глава 6.1.2.) модельные пленки Секстафаг получали на полимерных носителях - желатин, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия.

Для оптимизации органолептических, технологических и биологических показателей пленок пленочные композиции получали с различными параметрами вакуумного высушивания: № 1. Глубина вакуума -0,1 МПа; № 2. Постепенное создание глубины вакуума "от -0,02 МПа к -0,04 МПа к -0,06 МПа к -0,08 МПа к -

0,1 МПа"; № 3. Постепенное создание глубины вакуума "от -0,06 МПа к -0,08 МПа к -0,1 МПа"; № 4. Глубина вакуума -0,05 МПа; № 5. Глубина вакуума -0,07 МПа.

Влияние режима сушки на качественные характеристики пленок Секстафаг по показателям специфическая активность (титр 10-2 - 10-3) и описание приведены в таблице 64.

Модельные пленки на основе желатина показали полное сохранение специфической активности, однако, при вакуумном высушивании пленки вздувались и расслаивались. Исследования показали, что желатин в качестве пленкообразователя при применении вакуумного высушивания биомассы является нетехнологичным формообразователем.

Изучение качественных характеристик модельных пленок с комбинированным бактериофагом Секстафаг на основе метилцеллюлозы и кармеллозы натрия по показателям специфическая (литическая) активность и описание показало, что многократное вакуумное подсушивание пленочной массы (сброс вакуума и открывание дверцы у сушильного шкафа) ведет к снижению литической активности бактериофагов.

При высушивании пленочной биомассы под вакуумом "-0,1 МПа" - пленки сохраняли специфическую (литическую) активность бактериофага, но вздувались, расслаивались и теряли форму.

Оптимальными органолептическими и технологическими показателями обладали пленки Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на основе гидрогелей метилцеллюлозы и кармеллозы натрия высушенные при постепенном создании глубины вакуума "от -0,02 МПа к -0,04 МПа к -0,06 МПа к -0,08 МПа к -0,1 МПа", при этом выявлено снижение активности компонентов комбинированного БФ в 1,69 раза.

Пленки с комбинированным БФ на основе гидрогелей метилцеллюлозы и кармеллозы натрия высушенные при постепенном создании глубины вакуума "от -0,06 МПа к -0,08 МПа к -0,1 МПа" обладали оптимальными органолептическими показателями, но активность БФ варьировала от 73 % до 95 %.

Таблица 64 - Влияние режима сушки на качественные характеристики пленок Секстафаг

№ Режим вакуумного высушивания Пленкообразователь

Желатин Метилцеллюлоза Кармеллоза натрия

Описание СА, % Описание СА, % Описание СА, %

1 Глубина вакуума -0,1 МПа Вздутие, расслаивание 100±0 Вздутие, расслаивание 92,8±3,2 Вздутие, расслаивание 72,5±2,3

2 Постепенное создание глубины вакуума "от -0,02 МПа к -0,04 МПа к -0,06 МПа к -0,08 МПа к -0,1 МПа" Вздутие, расслаивание 100±0 Пластинки плотные, ровные 59±2,1 Пластинки плотные, ровные 50,7±2,3

3 Постепенное создание глубины вакуума "от -0,06 МПа к -0,08 МПа к -0,1 МПа" Вздутие, расслаивание 100±0 Пластинки плотные, ровные 86±2,7 Пластинки плотные, ровные 62,4±2,5

4 Глубина вакуума -0,05 МПа Вздутие, расслаивание 100±0 Пластинки плотные, ровные 93,5±3,8 Пластинки плотные, ровные 74,8±2,6

5 Глубина вакуума -0,07 МПа Вздутие, расслаивание 100±0 Пластинки плотные, ровные 91,0±3,2 Пластинки плотные, ровные 70,2±2,5

м о

7

К снижению специфической (литической) активности компонентов комбинированного бактериофага в пленочных композициях приводит постепенное создание глубины вакуума и высушивание при глубине вакуума до -0,05 МПа. Пленки, высушенные при глубине вакуума -0,08 МПа и выше, не соответствовали органолептическим и технологическим показателям.

Высокий показатель сохранения специфической активности комбинированного БФ (более 90 %) наблюдали у серий пленок, высушенных при определенном значении глубины вакуума (глубина вакуума -0,05 МПа, глубина вакуума -0,07 МПа) [293].

Анализ сохранения специфической (литической) активности компонентов комбинированного бактериофага в пленочных композициях на основе метилцеллюлозы и кармеллозы натрия по испытанию специфическая (литическая) активность показало, что у метилцеллюлозы ксеропротекторные свойства выше, чем у кармеллозы натрия [294].

Таким образом, наилучшими технологическими параметрами вакуумной сушки пленочной биомассы с комбинированным бактериофагом Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на основе гидрогеля метилцеллюлозы являлись: однократное высушивание и определенное значение глубины вакуума от -0,05 МПа до -0,07 МПа [289].

Подбор пленочной композиции Секстафаг

Выбор вспомогательных веществ для композиции составов пленок проводили с учетом физиологических особенностей взаимодействия фага с клеткой, природы вещества, технологических особенностей пленочной массы и показателя сохранения специфической активности.

Подбор основы. В ходе проведенных исследований выявили, что оптимальным пленкообразователем для пленок с Секстафагом является метилцеллюлоза. В ходе разработки воспроизводились составы, концентрация пленкообразователя в которых варьировала в интервале 2-6%. Оптимальное количество пленкообразователя 3-5%, большая концентрация усложняла

дозирование. У пленок, полученных на основе с высокой вязкостью, отклонение от средней массы составляло более 40 %, что означало неоднородность дозирования концентрированного Секстафага [289].

Подбор пластификатора. В качестве пластификатороа апробированы глицерин и сорбитолпридает оптимальные свойства модельным пленкам придают глицерин в количестве 1,5 - 2 %, сорбитол 5 - 10 %. При концентрации сорбитола более 10 %, пленки плохо просыхали, имели повышенную липкость и не отвечали технологическим свойствам. При концентрации сорбитола менее 5 % или его отсутствия, пленки были хрупкими, не эластичными.

Порядок введения наполнителей и объекта в пленочную массу. В концентрированный Секстафаг добавляли предварительно простерилизованную смесь метилцеллюлозы и сорбитола, выдерживали до образования гомогенного раствора.

6.1.4 Разработка состава пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный с воздушным методом высушивания

При производстве лекарственных препаратов с использованием искусственной сушки полупродуктов перед технологами фармацевтического производства стоят задачи: 1. Получить продукцию высокого качества с необходимой конечной влажностью; 2. Провести процесс сушки за минимальное время; 3. Затратить минимальное количество энергии [292].

Минимальное количество энергозатрат имеет искусственная сушка. Также важными этапами фармацевтической разработки пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный являются выбор биосовместимой плёнкообразующей основы для получения пленок и оценка высвобождения БАФС, определяющие эффективность аппликационной лекарственной формы.

Скрининг биодеградируемых полимерных материалов синтетического и природного происхождения (пленкообразователей) для получения пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный осуществляли по ксеропротекторным свойствам. В качестве формообразователей использовали 11 полимеров: гиромеллоза, желатин, карбопол, крахмал картофельный, МЦ марки 15, МЦ марки 35, кармеллоза натрия, альгинат натрия, пектин цитрусовый, пектин яблочный, поливиниловый спирт.

Модельные образцы пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный получали методами воздушного высушивания поливочной биомассы в сушильном шкафу (термостат) при температуре 37±1 °С. Полуфабрикаты 3% деаэрированного геля с Секстафагом выливали на подложки толщиной 10-12 мм в зависимости от природы полимера высушивали. Модельные образцы пленок получали методами воздушного высушивания в термостате при температуре 37±1 °С. Коллаген не сформировал твердую пленку, поэтому дальнейшие исследования проводили на 1 1 полимерах природного и синтетического происхождения.

Биофармацевтические характеристики пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный включают способность обеспечивать оптимальную биологическую доступность иммобилизованных бактериофагов.

Стабильность комбинированного бактериофага Секстафаг в пленочных композициях, полученные воздушным методом высушивания биомассы представлена на рисунке 27.

В зависимости от природы полимерной матрицы специфическая активность бактериофагов в пленках варьировала от 18% до 100 %. У пленок на основе карбопола, поливинилового спирта, кармеллозы натрия, крахмала картофельного, метилцеллюлозы марки 35, метилцеллюлозы марки 15 и желатина пищевого стабильность бактериофагов после воздушного высушивания составила более 50%.

гипромеллоза желатин карбопол крахмал картофельный метилцеллюлоза - 15 метилцеллюлоза - 35 кармеллоза натрия альгинат натрия пектин цитрусовый пектин яблочный спирт поливиниловый

0 20 40 60 80 100

Специфическая активность, %

Рисунок 27 - Стабильность комбинированного бактериофага Секстафаг,

пленки воздушно высушенные

Дальнейшим этапом исследований являлось изучение влияния природы полимерных матричных систем на высвобождение иммобилизованного комбинированного бактериофага из плёнкообразующей матрицы методом диффузии в агар.

Релиз БФ из пленок варьировал от 33% до 89 % в зависимости от природы полимерной матрицы (Рисунок 33). У пленок на основе альгината натрия, кармеллозы натрия, метилцеллюлозы марки 15, карбопола, поливинилового спирта, метилцеллюлозы марки 35 и желатина пищевого релиз БФ составил более 50%.

Скрининг оптимальной биосовместимой плёнкообразующей основы по многокритериальным показателям выбирали среди множества Парето. В качестве критериев оптимизации использовали показатель специфической активности БФ в пленках Секстафаг® (ось x, x — max) и релиз БФ из полимерных матричных систем (ось y, y —> max). Доминирующие биофармацевтические характеристики по критериям оптимизации выявлены у плёнкообразующей матрицы из биодеградируемого материала природного происхождения на основе желатина [295-297]. Диаграмма наглядно демонстрирует, что пленки Секстафаг®

Пиобактериофаг поливалентный на основе желатина оптимальны по принципу Парето (Рисунок 28).

100

V 90

180 I 70

О Я СР

<и

60 50 40 30

к

<

о с

п К

§ 20

8 10

<

(и

^ 0

11 ЗО О

6 О

7 О

5 о

8 О

10 9 О О

1 о

4 о

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Специфическая активность БФ, %

Рисунок 28 - Многокритериальная оптимизация пленкообразователей по принципу Парето

(1 - Гипромеллоза, 2 - Желатин, 3 - Карбопол, 4 - Крахмал картофельный, 5 - Метилцеллюлоза-15, 6 - Метилцеллюлоза-35, 7 - Кармеллоза натрия, 8 - Альгинат натрия, 9 - Пектин цитрусовый, 10 - Пектин яблочный, 11 - поливиниловый спирт)

Таким образом, плёнкообразующая основа желатина сохраняет стабильность комбинированного бактериофага при высушивании пленочной композиции, является биосовместимой и релиз-активной аппликационной лекарственной формой, а также обладает гемостатическим и репаративным действием [298-300], что говорит о рациональном применении желатина для получения пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный.

Следующим этап исследований являлось изучение физико-химических свойств пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на основе желатина.

На основе комбинированного бактериофага Секстафаг® получены биодеградируемые пленки, в качестве пленкообразователя использовали желатин, пластификатор - глицерин, растворитель - вода очищенная.

2

0

Выбор оптимального состава пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, обеспечивающего необходимые физиологические свойства, проводили путем скрининга матриц на основе желатина.

С целью изучения влияния плотности и толщины биодеградируемых пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на физико-химические свойства получено 7 составов фармацевтических композиции на основе 5-20% растворов желатина, при соотношении пластификатора к пленкообразователю 1^3. Секстафаг вводили в стерильные гомогенные растворы желатина с пластификатором при температуре 40 °С, затем выливали на подложки и сушили воздушным способом при температуре 37 °С, в течение 24-48 часов.

Полученные пленки на основе различных композиций представляли собой однородные, прозрачные, эластичные пластинки желтого цвета различных оттенков.

Следующий этап работ заключался в выборе оптимальной фармацевтической композиции пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на основе изучения физико-химических свойств.

Адгезионные свойства полимеров являются одним из важнейших критериев отбора оптимальной пленочной основы, поскольку определяют прочность фиксации пленки на месте аппликации [301-303]. От прочности адгезионного соединения напрямую зависит время лечебного действия пленки лекарственной [304-306], так как в случае ее сползания или отклеивания с места аппликации терапевтический эффект снижается или полностью исчезает [307].

Зависимость адгезионных свойств полимерных систем от плотности и толщины композиции представлена в таблице 65.

Таблица 65 - Физико-химические параметры матричных систем на основе желатина

№ % С полимера Характеристики

Толщина, мм Х ± АХ Поверхностная плотность, мг/см2 Х ± АХ Сила адгезии, Н Х ± АХ

1 5,0 0,2036 ± 0,0079 25.29 ± 1,90 7,5320 ± 0,4574

2 7,5 0,3083 ± 0,0241 38,25 ± 2,14 9,7087 ± 0,5561

3 10,0 0,3975 ± 0,0155 54,25 ± 2,98 10,9699 ± 0,6204

4 12,5 0,4678 ± 0,0225 64,57 ± 3,28 8,4035 ± 0,7440

5 15,0 0,5650 ± 0,0315 75,50 ± 3,24 8,3953 ± 0,7538

6 17,5 0,5958 ± 0,0381 78,83 ± 3,81 7,6848 ± 0,7295

7 20,0 0,6050 ± 0,0351 83,29 ± 3,71 7,9625 ± 0,6904

Исследование по выявлению зависимости влияния плотности (мг/см2) модельных пленок Секстафаг® на основе желатина на адгезивные свойства, показало, что фармацевтический фактор - плотность полимерной композиции оказывает влияние на прочность фиксации пленки на субстрате. При плотности 38.25^54.25 мг/см2 и толщине 0.3^0.4 мм биологическая доступность БФ из матричных систем максимальна. Увеличение или уменьшение плотности приводит к снижению силы отрыва от субстрата и прочности фиксации на месте аппликации [308].

Абсорбционные свойства являются одним их основных параметров набухания пленок, характеризующих диффузионные возможности полимерных систем. Характер набухания (абсорбция) определяет скорость и полноту высвобождения БФ из матрицы, прогнозирует пролонгированное действие, а также способность впитывать экссудат. Таким образом, от количества поглощенной воды и времени набухания будет зависеть длительность и эффективность терапевтического действия пленок.

В таблице 66 представлены данные абсорбирующих свойств экспериментальных пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на основе желатина.

Исследования показали, что с увеличением плотности матричной системы уменьшается степень абсорбции. Композиции через 15 минут абсорбировали от

122 % до 252 % биологической жидкости, а через 60 минут от 300% до 500%, что говорит о хороших абсорбционных свойствах желатина. Желатиновые пленки с плотностью более 52 мг/см2 показали незначительное увеличение абсорбирующих свойств [309].

Таблица 66 - Абсорбционные свойства матричных систем на основе желатина

Время, мин Абсорбция, %

Поверхностная плотность, мг/см2

25 36 46 52 68 74 71

15 252±10 208±9 174±9 151±8 128±8 125±8 122±8

30 312±12 246±10 211±10 202±10 187±10 185±10 182±10

45 420±13 364±12 305±12 301±12 296±12 285±11 284±11

60 500±13 469±13 398±13 348±12 306±12 302±12 300±12

Таким образом, кинетика набухания показывает, что наилучшими абсорбционными свойствами обладают пленки на основе желатина плотностью до 52 мг/см2.

Паропроницаемостъ характеризует фибриллярность структуры пленок, ее порозность и степень аэрации нижележащих тканей. Степень насыщения парами полимера характеризует её пористость и абсорбционные свойства.

В таблице 67 представлены результаты паропроницаемости матричных систем на основе желатина с плотностью от 19.00 до 76.25 мг/см2.

Таблица 67 - Паропроницаемость матричных систем на основе желатина

Плотность, мг/см2 Паропроницаемость, г/м2

Время, час

3 12 24 48 72

19,00 71±4 114±10 247±11 250±12 253±12

32,57 130±6 212±11 411±13 420±22 427±23

43,00 161±8 292±13 521±24 540±25 552±26

51,80 167±8 338±17 560±26 578±26 583±27

66,14 189±8 424±22 664±30 681±32 707±33

72,86 204±13 506±24 719±33 746±34 762±34

76,25 248±13 519±24 750±34 762±34 783±34

Исследования показали закономерное насыщение парами воды образцов желатиновых пленок - с увеличением поверхностной плотности и толщины увеличивается паропроницаемость пленки. У пленок с поверхностной плотностью 51,80 мг/см2 проницаемость водяного пара составила 560 г/м2. Полимерные матрицы характеризуются паропроницаемостью, достаточной для аэрации тканей на месте аппликации [309, 310].

Таким образом, в результате эксперимента по изучению влияния плотности полимерных систем на паропроницаемость, было установлено, что желатиновые пленки с плотностью до 52 мг/см2 и толщиной 0.4 мм обеспечивают постоянство микроклимата тканей и наибольшую биологическую доступность бактериофагов из матричных систем.

Для оценки возможности возникновения раздражения слизистой поверхности и кожи определены значения рН модельных составов пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на основе желатина. Установлено, что растворы пленок имеют рН 6,2 ^ 6,3. Следовательно, их применение на слизистых оболочках и коже не окажет раздражающего эффекта.

Изучение влияния технологического фактора (воздушная сушка при температуре 37 °С, в течение от 24 до 48 часов) на стабильность БФ в матричной системе на основе желатина, показало, что с увеличением плотности матричной полимерной системы литическая активность Секстафага снижается, что связано с регламентным временем сушки поливочного материала. Пленки с плотностью до 60 мг/см2 высыхали в течение 24 часов, полное высыхание пленок с большей плотностью наблюдали через 48 часов. Во всех экспериментальных образцах в матричной системе на основе желатина с плотностью от 25 до 83 мг/см2 компоненты комплексного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный сохраняли литическую активность в разведениях не ниже 104 (Таблица 68).

Изучение физико-химических свойств полимерных систем на основе желатина и влияние на биологическую активность компонентов Секстафага выявило, что наилучшими адгезионными и абсорбционными свойствами обладают пленки с плотностью 50-55 мг/см2. Установлено, что матричные системы на основе

желатина характеризуются паропроницаемостью достаточной для аэрации тканей на месте аппликации и способностью иммобилизировать бактериофаги с сохранением литической активности [309].

Таблица 68 - Результаты специфической активности Секстафаг® _ Пиобактериофаг поливалентный, пленки_

№ Поверхностная плотность, мг/см2 Специфическая активность (титр 10-300 - 10-500)

Streptococcus Staphylococcus Ps. aerug. Klebsiella Proteus E. coli Среднее

1 25,29 10-500 10-475 10-475 Ю-500 10-475 Ю-500 10-488

2 38,25 10-500 10-475 10-475 Ю-500 10-475 Ю-500 10-488

3 54,25 10-475 Ю-450 10-475 Ю-500 10-475 10-475 10-4,75

4 64,57 10-4.50 Ю-450 Ю-450 Ю-500 10-45 10-475 10-463

5 75,50 10-4.50 Ю-450 Ю-450 Ю-500 10-45 10-4,50 10-458

6 78,83 10-4.50 Ю-450 10-425 Ю-500 10-45 Ю-450 10-454

7 83,29 10-425 10-425 10-425 Ю-500 10-425 Ю-450 10-442

Таким образом, матричная система на основе желатина обладает способностью иммобилизировать бактериофаги с сохранением их специфической активности, что свидетельствует о перспективности ее использования в качестве пленкообразователя для получения пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный.

6.2 Изучение фармацевтической доступности лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки

Исследована биологической доступности бактериофагов из пленок антибактериального действия следующих составов:

Пленки состава № 1 (желатин - 5,0; глицерин - 2,0; Секстафаг® - 40,0; вода очищенная - 53,0), полученные методом воздушного высушивания поливочной биомассы при температуре при температуре 37±1 °С. Коэффициент усушки пленок составил 13,76±0,42.

Пленки состава № 2 (метилцеллюлоза - 3,0; глицерин - 1,5; кальция карбонат - 1,5; Секстафаг® - 40,0; вода очищенная - 54,0), полученные методом вакуумного высушивания поливочной биомассы при глубине вакуума -0,05 МПа, при температуре при температуре 37±1 °С. Коэффициент усушки пленок составил 15,93±0,46.

Пленки состава № 1 и 2 обладают специфической активностью по методу Аппельмана 10-3 и выше по отношению к Staphylococcus (aureus, epidermidis), Streptococcus (pneumoniae, agalactiae, pyogenes), Proteus (mirabilis, vulgaris), Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, энтеропатогенных Escherichia coli.

Показателем качества пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный является способность обеспечивать оптимальную биологическую доступность иммобилизованных БФ. Определенный вклад в кинетику высвобождения (релиз) БАФС вносит процесс набухания полимерных матриц. От количества поглощенной воды и времени набухания зависит длительность и эффективность фармакотерапевтического действия пленок. Кинетические кривые набухания пленок на основе желатина и метилцеллюлозы представлены на рисунке 29.

о 450 ^ 400

S 300

уб 250

н 200

ь

w 150

е

5 100 тС 50

0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

^"Пленки на основе желатина ^"Пленки на основе метилцеллюлозы

Время, мин.,

Рисунок 29 - Кинетические кривые набухания пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный

Из представленных данных видно, что с увеличением продолжительности процесса степень набухания возрастает, но с разной интенсивностью. Высокую способность к набуханию имеют пленки на основе желатина, меньшее набухание наблюдается у плёнок на основе метилцеллюлозы. Кинетическая кривая для пленок на основе метилцеллюлозы имеет вид кривой неограниченного набухания и проходит через максимум степени набухания 305 %. У желатиновых пленок степень набухания в течение трех часов составила 410 % и согласно кинетической кривой полимерная матричная система относится к ограниченно набухающим полимерам, так как при набухании не переходит в золь и не растворяется при взаимодействии с водой очищенной [311].

Константу скорости набухания пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на основе желатина и метилцеллюлозы определяли по графику, представленному на рисунке 30.

4

тсо 3,5

1п-

тсо - тт 3

2,5 2

1,5 1

0,5 0

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 Лекарственные пленки на основе желатина Время, мин ^^"Лекарственные пленки на основе метилцеллюлозы

Рисунок 30 - График для определения константы набухания

Константа скорости набухания для пленок на основе желатина составила 0,4877 мин-1, для пленок на основе метилцеллюлозы 1,0724 мин-1. Таким образом, константа скорости набухания полимерных систем на основе метилцеллюлозы больше в 2,2 раза, чем на основе желатина [311].

Профиль скорости набухания полимерных матриц определяли по графику представленному на рисунке 31.

■Лекарственные пленки на основе метилцеллюлозы

Рисунок 31 - Профиль скорости набухания полимерных матричных систем

Скорость набухания для исследуемых полимерных систем снижается экспоненциально с увеличением продолжительности [311].

Таким образом, пленки Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный относятся к системам с пролонгированным высвобождением. Релиз осуществляется по механизму диффузии с постепенной биодеградации полимерной системы с иммобилизованным комбинированным БФ. Пленки на основе метилцеллюлозы способны высвобождать БФ с активным его релизом в начале процесса набухания с постепенным уменьшением скорости высвобождения и полной биодеградацией полимера. Пленки на основе желатина способны медленно и продолжительно высвобождать БФ.

Дальнейшим этапом исследований являлось изучение влияния композиции пленки на высвобождение иммобилизованного БФ из матричной системы методом диффузии в агар. На рисунке 32 приведена диаграмма степени высвобождения бактериофага из пленочных композиций. Из представленных данных видно, что матричная система на основе желатина более эффективно высвобождает иммобилизованный комбинированный бактериофаг.

к

X

<D H (U X u iy

3

X

о

со

Oh H <u

s

CÖ

к

CÖ

30 25 20

i 15

CÖ

H

Э

H О (U H

10

Streptococcus Staphylococcus Ps. aeruginosa Kl. pneumoniae Proteus E. coli □ Пленки на основе желатина □ Пленки на основе метилцеллюлозы

Рисунок 32 - Диаграмма степени высвобождения бактериофага из пленочных

композиций

5

0

Таким образом, проведенные исследования показали, что рациональной релиз-активной лекарственной формой являются пленки Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный на основе желатина [311].

Результаты кинетики высвобождения (релиз) бактериофага из лекарственных форм представлены в таблице 69.

Таблица 69 - Кинетика высвобождения бактериофага из лекарственных форм

Штамм культуры Время, мин

30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360

Пленки с комбинированным бактериофагом

Streptococcus spp. + + + + + + + - - - - -

Enterococcus spp. + + + + + + - - - - - -

Staphylococcus spp. + + + - - - - - - - - -

Ps. aeruginosa + + + - - - - - - - - -

Kl. pneumoniae + + + - - - - - - - - -

Proteus spp. + + + + + + + - - - - -

E. coli + + + + + + + + - - - -

'аствор ) с комбинированным бактериофагом

Streptococcus spp. + + + + + - - - - - - -

Enterococcus spp. + + + + - - - - - - - -

Staphylococcus spp. + + - - - - - - - - - -

Ps. aeruginosa + + - - - - - - - - - -

Kl. pneumoniae + + - - - - - - - - - -

Proteus spp. + + + + + - - - - - - -

E. coli + + + + + - - - - - - -

Примечание. Фаголизабельность бактериальной культуры тест-штамма: «+» — наличие лизиса или фаговых колоний; «--» активный рост культуры.

При изучении кинетики высвобождения комбинированного БФ из пленок и раствора методом диффузии через полупроницаемую мембрану установлено, что стрептококковый, стафилококковый, синегнойный, клебсиеллезный, коли и протейный фаговые компоненты композиции диффундируют через диализную мембрану и обнаруживаются в диализной среде. У пленок релиз БФ иммобилизованного в полимерную матрицу желатина толщиной 0,4 мм, наблюдали в течение 240 мин, а из раствора - в течение 150 мин [311, 312].

Данные кинетики свидетельствуют о пролонгированном характере высвобождения бактериофага из пленок.

6.3 Разработка технологической блок схемы получения лекарственного препарата Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, пленки

По результатам оптимизации состава и технологии пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, был выбран оптимальный состав:

Пленки состава № 1 (желатин - 5,0; глицерин - 2,0; Секстафаг® - 40,0; вода очищенная - 53,0), полученные методом воздушного высушивания биомассы.

Пленки состава № 2 (метилцеллюлоза - 3,0; глицерин - 1,5; кальция карбонат - 1,5; Секстафаг® - 40,0; вода очищенная - 54,0), полученные методом вакуумного высушивания биомассы при глубине вакуума -0,05 МПа

Технологическая блок-схема получения пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, представленная на рисунке 33, разработана согласно ОСТ 64-02003-2002, ГОСТР 56639-2015 [256-259].

Разработанная блок-схема получения комбинированного бактериофага Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный в форме пленок включает стадии технологического процесса получения лекарственной формы со вспомогательными работами и технологическими операциями с указанием отходов производства на каждой стадии. Технологическая блок-схема получения пленок Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный включает:

10

Рисунок 33 - Технологическая блок-схема получения пленок Секстафаг®