Влияние температурного стресса на пероксидазу в культуре ткани Rawuolfia serpentina Benth тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Мулла Ахмад Исмаил

• Мулла Ахмад Исмаил
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мулла Ахмад Исмаил

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структура пероксидазы.

1.2 Физико-химические свойства растительных пероксидаз.

1.3 Распространение и субклеточная локализация пероксидазы.

1.4 Биологическая и физиологическая роль пероксидазы. 17 1.4.1 Возможные механизмы участия пероксидазы в формировании ответных реакций на действие различных стресс-факторов.

1.5 Биосинтез пероксидазы

1.6 Молекулярная гетерогенность пероксидазы. •

1.7 Механизм действия пероксидазы. • •■=. •. 40 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования и метод культивирования ткани

2.2 Выделение цитоплазматической фракции пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina

2.3 Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina.

2.4 Определение концентрации белка

2.5 Определение активности пероксидазы

2.6 Электрофоретические методы

2.6.1 Электрофорез в пластинах полиакриламидного геля

2.6.2 Определение активности пероксидазы в геле

2.7 Иммунологические методы

2.7.1 Получение антисыворотки к пероксидазе

2.7.2 Радиальная иммунодиффузия в агаровом геле

2.7.3 Определение концентрации антигена

2.8 Радиоиммунонлогические методы

2.8.1 Определение параметров кругооборота пероксидазы и общего белка

2.9 Статистическая обработка результатов эксперимента.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Активность пероксидазы и концентрация белка в динамике роста Rauwolfia serpentina, штамм К

3.1.1 Подбор оптимальных условий определения активности

3.2 Изучение кинетики пероксидазы на разных этапах роста каллусной культуры Rauwolfia serpentina.

3.3 Молекулярная гетерогенность пероксидазы в процессе культивирования штамма Rauwolfia serpentina.

3.4 Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани Rauwolfia serpentina.

3.4.1 Подбор оптимальных условий высаливания

3.5 Определение молекулярной массы пероксидазы, влияние температуры и рН на ее активность.

3.5.1 Влияние температуры и рН на активность пероксидазы.

3.6. Изучение параметров обмена пероксидазы и общего белка в культуре ткани Rauwolfia serpentina

3.7 Исследование специфичности антипероксидазной сыворотки

3.8 Влияние высоко- и низкотемпературного шока на активность и кинетические параметры пероксидазы в культуре ткани Rauwolfia serpentina.

3.8.1. Влияние температурного шока на кинетические параметры пероксидазы

3.9 Молекулярная гетерогенность пероксидазы при высоко- и низкотемпературном шоке.

3.10 Обмен внутриклеточного белка и пероксидазы в культуре ткани 72 Rauwolfia serpentina

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние температурного стресса на пероксидазу в культуре ткани Rawuolfia serpentina Benth»

В последние годы внимание исследователей все в большей мере привлекают культивируемые растительные клетки и ткани. Это связано, с одной стороны, с перспективностью их использования в качестве продуцентов ценных биологически активных веществ, а с другой - в качестве модели для изучения молекулярных механизмов протекания тех или иных процессов в растительных клетках.

Изолированные клетки растений находят все большее применение в качестве модельных систем для изучения не опосредованных другими тканями растения реакций на действие разнообразных внешних факторов. Кроме того, исследование механизмов клеточного метаболизма в дедифферепцировапых т.е. находящихся в стрессовых условиях клетках создает условия для более эффективного развития биотехнологии клеточных культур [65].

Растения рода Rauwolfia известны как перспективный источник получения многих алкалоидов, применяемых в медицинской практике. В Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии в результате многолетней селекции культуры ткани Raiiwofia serpentina получен высокоэффективный штамм - суперпродуцент антиаритмических алкалоидов. В процессе селекции использованы различные мутагены и иные стрессовые факторы, что привело к существенному изменению биохимических процессов, протекающих в культивируемых клетках Rauwofia serpentina. В рамках осуществления биохимического контроля за состоянием клеточных культур анализировали пероксидазу - один из основных ферментов метаболизма кислорода. Этот фермент принимает участие в каталитическом окислении различных субстратов, таких как фенолы, ароматические амины и др. Факт, что пероксидаза присутствует в микробных, растительных и животных клетках дает основание считать его жизненно важным соединением. Что касается растительной перокеидазы, то одной из основных ее функций является защита растения от различных неблагоприятных факторов абиотической и биотической природы. Имеется много работ, посвященных биологической активности этого фермента, однако анализ синтеза и стабильности пероксидазы ранее ни кем не изучался. Мы полагаем, что такого рода исследования могут быть весьма актуальными, т.к. они дают весьма важную информацию не только об активности, но и о синтезе и распаде пероксидазы в динамике роста клеток. Задачи исследования: В работе были поставлены следующие задачи: Изучить динамику изменения активности, физико-химические свойства и молекулярную гетерогенность пероксидазы в течение роста каллусной культуры Rauvvolfia serpentina.

Выделить и очистить до гомогенного состояния пероксидазу из культуры ткани Rauvvolfia serpentina, изучить ее физико-химические свойства и получить к ней моноспецифические антитела.

Оценить скорость синтеза, распада и время функционирования в клетках ткани Rauvvolfia serpentina.

Исследовать влияние температурного шока на содержание и свойства пероксидазы, ее молекулярную гетерогенность в культивируемых растительных клетках.

Научная новизна. В работе впервые была изучена динамика изменения пероксидазной активности растущей культуры клеток Rauvvolfia serpentina. Также впервые были изучены такие параметры, как молекулярная гетерогенность, синтез и стабильность пероксидазы. Разработай способ ее выделения и очистки до гомогенного состояния, изучены физико-химические свойства пероксидазиого белка.

В работе изучено влияние низко и высокотемпературного стресса на состояние пероксидазы и общего белка в каллусной культуре ткани Rauvvolfia serpentina. Установлено, что как при низко- так и при высокотемпературном шоке активность пероксидазы повышалась за счет увеличения ее содержания в клетках и изменения активность отдельных изоформ. Показано более выраженное повреждающее действие низкотемпературного шока.

Теоретическая и практическая значимость Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные о физико-химических свойствах, скоростях синтеза и распада, времени функционирования и содержания пероксидазы в каллусиой культуре ткани Rauwolfia serpentina позволяют расширить наши представления об обмене индивидуальных белков в культуре растительных клеток.

Кроме того, результаты исследования содержат информацию о влиянии экстремальных температур на состояние растительных клеток, а также о протекторном действии пероксидазы, защищающей клетку от повреждения различными токсическими продуктами, возникающими в результате температурного воздействия.

Учитывая тот факт, что работа проводилась с промышленным штаммом Rauwolfia serpentina, знание белкового обмена этого штамма может оказать весьма существенную помощь при дальнейших селекционных работах. Кроме того культура ткани Rauwolfia serpentina может быть использована в качестве источника для получения пероксидазы.

Структура и объем диссертации. Работа изложена па 111 страницах машинописи, содержит 19 таблиц и 24 рисунка . Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя наименований.