Биодеструкция глифосата почвенными бактериями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Шушкова, Татьяна Валентиновна

• Шушкова, Татьяна Валентиновна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шушкова, Татьяна Валентиновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. ОРГАНОФОСФОНАТЫ КАК КЛАСС ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ.

1.1.1. Органофосфонаты - соединения с прямой С-Р связью.

1.1.2. Природные и синтетические органофосфонаты.

1.1.3. Глифосат (N-фосфонометилглицин).

1.2. БИОДЕСТРУКЦИЯ ОРГАНОФОСФОНАТОВ.

1.2.1. Микроорганизмы - деструкторы фосфонатов.

1.2.2. Получение накопительных культур.

1.2.3. Энзимология разложения С-Р связи.

1.2.4. Физиологические особенности разложения С-Р связи.

1.2.5. Деструкция глифосата.

1.2.6. Физиологические особенности разложения глифосата.

1.3. ПОВЕДЕНИЕ ГФ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ.

1.3.1. Устойчивость ГФ.

1.3.2. Инактивация ГФ в окружающей среде.

1.3.2.1. Механизм сорбции глифосата.

1.3.2.2. Сорбция глинистыми минералами и органическим веществом.

1.3.2.3. Влияние фосфата на сорбцию ГФ.

1.3.2.4. Биодеструкция ГФ в почве.

1.3.3. Подвижность ГФ в почве.

1.4. БИОРЕМЕДИАЦИЯ - КАК СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ ПОЛЛЮТАНТОВ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

2.1.1. Среды для культивирования бактерий.

2.1.2. Выделение и отбор бактерий-деструкторов.

2.1.3. Условия культивирования бактерий.

2.1.4. Таксономическое определение штаммов-деструкторов.

2.1.5. Изучение выживаемости клеток при длительном хранении.

2.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

2.2.1. Аналитическое определение фосфатов и фосфонатов.

2.2.2. Количественное определение ГФ.

2.2.3. Определение метаболитов деструкции в культуральной жидкости.

2.2.4. Другие аналитические методы.

2.3. ЭКСПЕРИМЕНТЫ В МОДЕЛЬНЫХ ПОЧВЕННЫХ СИСТЕМАХ.

2.3.1. Характеристика используемых почв.

2.3.2. Изучение сорбции ГФ в почвенной суспензии.

2.3.3. Построение изотерм сорбции ГФ.

2.4. БИОДЕГРАДАЦИЯ ГФ В ПОЧВЕ.

2.4.1. Микробная деградация ГФ в почвенной суспензии.

2.4.2. Лабораторные эксперименты по отбору штаммов для биоремедиации.

2.4.3. Изучение миграции ГФ по вертикальному профилю и его биодеструкции в почвенной колонке.

2.4.4. Биоремедиация почвы от загрязнения ГФ в полевых условиях.

2.5. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

2.5.1. Биотестирование на дафниях.

2.5.2. Изучение токсичности штаммов для теплокровных животных.

2.5.3. Определение дегидрогеназной активности в почве.

2.5.4. Определение биомассы аборигенной почвенной микрофлоры.

2.5.5. Определение фитотоксичности.

2.6. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ.

Глава 3. Результаты исследования.

3.1. СОЗДАНИЕ МУЗЕЯ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ ОФ.

3.1.1. Выделение, селекция и оценка деструктивной активности бактериальных штаммов.

3.1.2. Условия длительного хранения штаммов.

3.2. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА О. anthropi GPK 3 С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ДЕСТРУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ.

3.2.1. Поиск оптимального источника углерода.

3.2.2. Влияние источника азота на деструктивную активность штамма О. anthropi GPK 3.

3.2.3. Влияние источника фосфора при подготовке инокулята.

3.2.4. Голодание клеток штамма бактерий О. anthropi GPK 3 по фосфору.

3.2.4.1. Исходная концентрация клеток в инокуляте.

3.2.4.2. Продолжительность голодания инокулята.

3.2.4.3. Эффективность деструкции ГФ в зависимости от продолжительности голодания инокулята.

3.2.4.4. Содержание общего фосфора в клетках О. anthropi GPK 3 в динамике роста культуры.

3.2.5. Определение удельной нагрузки субстрата.

3.2.6. Влияние на биодеструкцию начальной концентрации ГФ.

3.2.7. Влияние значения рН и уровня аэрации на разложение ГФ.

3.3. СОРБЦИЯ И БИОДЕСТРУКЦИЯ ГФ В ПОЧВЕННЫХ СУСПЕНЗИЯХ.

3.3.1. Построение изотерм сорбции ГФ.

3.3.2. Динамика сорбция ГФ в почвенной суспензии.

3.3.3. Деградация ГФ штаммом О. anthropi GPK 3 в почвенной суспензии.

3.4. ИЗУЧЕНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ГФ В ПОЧВЕ С ПОМОЩЬЮ ШТАММОВ-ДЕСТРУКТОРОВ.

3.4.1. Отбор штаммов для биоремедиации в условиях лабораторных почвенных экспериментов.

3.4.2. Изучение деструкции глифосата в почве штаммами О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16.

3.4.3. Биодеструкция ГФ и его распределение по вертикальному профилю в лизиметрической колонке.

3.5. БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ ГФ, В УСЛОВИЯХ ПОЛЕВОГО ЭКСПЕРИМЕНТА.

3.6. ПОДБОР СТАБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ АКТИВНОЙ БИОМАССЫ ШТАММОВ-ДЕСТРУКТОРОВ.

3.7. ДЕПОНИРОВАНИЕ И ПАТЕНТОВАНИЕ.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биодеструкция глифосата почвенными бактериями»

Актуальность проблемы

Одним из последствий развития современной цивилизации является загрязнение окружающей среды ксенобиотиками. Среди наиболее опасных загрязнителей -органофосфонаты (ОФ), фосфорорганические соединения, характеризующиеся наличием прямой углерод-фосфорной (С-Р) связи. ОФ необычайно устойчивы к химическому и физическому воздействию из-за особых свойств С-Р связи в их структуре. ОФ входят в состав гербицидов, антибиотиков, пламегасителей, ингибиторов коррозии, часто используются как хелатирующие добавки к детергентам и являются продуктами химической нейтрализации фосфорорганических отравляющих веществ, таких как зарин, зоман, VX.

Самый известный представитель этого класса соединений, глифосат (ГФ), является основой множества гербицидов, зарегистрированных более чем в 120 странах под различными торговыми марками (Раундап, Граунд Био, Ураган, Глисол и др.). Хотя производители приводят доказательства безопасности гербицидов на основе ГФ, независимыми исследователями было показано, что ГФ изменяет почвенную экосистему, влияя на состав и активность микрофлоры, увеличивает восприимчивость культурных растений к болезням, способствует аккумулированию тяжелых металлов в водных экосистемах и оказывает вредное воздействие на гидробионтов. При попадании в организм млекопитающих он приводит к нарушениям функций ряда органов. Остаточные количества ГФ способны сохраняться долгое время в растениях, плодах, рыбе и других продуктах питания. Он может накапливаться и сохраняться в почве вследствие сорбции и миграции и сохраняться в ней в течение нескольких лет.

В такой ситуации особую актуальность приобретают способы очистки и восстановления природной среды, загрязненной ОФ. Из-за устойчивости этих соединений к физико-химическим воздействиям, внимание исследователей привлекают микроорганизмы, способные к их биодеструкции путем разрыва С-Р связи.

Как правило, при разрушении ГФ природными микробными сообществами почвы и воды происходит его трансформация до аминометилфосфоната (АМФК), по-прежнему содержащего С-Р связь. Известны лишь отдельные штаммы-деструкторы, способные минерализовать АМФК. Деструктивный потенциал и общая эффективность таких штаммов не всегда высоки, поэтому поиск и выделение новых штаммов-деструкторов, а также повышение их активности весьма актуальны, причем, в первую очередь, для создания современных биотехнологий ремедиации почвы и воды, загрязненных ГФ.

Сведения о физиологических особенностях штаммов-деструкторов ОФ ограничены. Дефицит таких знаний также сдерживает разработку технологических приемов очистки окружающей среды от ГФ, основанных на использовании потенциала природных микроорганизмов-деструкторов. Поэтому приоритетными задачами являются изучение физиологических условий проявления максимальной деструктивной активности микроорганизмов в отношении ОФ, особенно ГФ, разработка приемов повышения их потенциала и способов применения на практике.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка способа биоремедиации почв, загрязненных глифосатом.

В соответствии с этим решались следующие задачи:

1. Выделение и отбор штаммов-деструкторов глифосата из загрязненных почв.

2. Оптимизация условий культивирования штаммов-деструкторов глифосата.

3. Изучение взаимодействия глифосата с почвой.

4. Оценка деструктивной активности отобранных штаммов в почве в условиях микрокосма.

5. Изучение биодеструкции глифосата и изменение токсикологических показателей почвы в полевых условиях.

6. Изучение условий хранения биомассы штаммов-деструкторов.

Научная новизна

Из почв с многолетним загрязнением органофосфонатами выделены новые эффективные штаммы-деструкторы ГФ и метилфосфоновой кислоты (МФК). Наиболее активный из них, Ochrobactram anthropi GPK 3, был способен к росту в среде с концентрацией ГФ до 10 г/л. В отличие от многих известных штаммов отобранные нами бактерии обладали способностью минерализовать токсикант без накопления АМФК, как продукта трансформации, содержащего устойчивую С-Р связь. Показана способность штаммов-деструкторов выживать и сохранять деструктивную активность в почве при высоком уровне загрязнения ГФ, в десять раз превышающем рекомендуемые нормы применения гербицида.

Путем оптимизации условий культивирования (голодание посевного материала по фосфору, исходная концентрация ГФ, значение рН и рОг и др.) эффективность деструкции ГФ была повышена в 2,5 раза.

Впервые была проведена комплексная оценка процесса ремедиации загрязненной ГФ почвы, включающая как убыль ГФ при интродукции бактерий-деструкторов О. anthropi

GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16 с учетом сорбции и миграции токсиканта, так и изменение экотоксикологических характеристик загрязненной почвы. Показано восстановление биологической активности почвы в результате биоремедиации. Изучение биодеструкции ГФ интродуцированными штаммами, как в лабораторных, так и в полевых условиях проводилось впервые.

Практическая значимость

Создана коллекция бактерий-деструкторов, способных разрушать разные типы С-Р связи, которые могут использоваться для создания технологий очистки объектов окружающей среды от ОФ различной структуры. Микроорганизмы, отобранные для внесения в почву, непатогенны для теплокровных животных, не обладают фито- и интегральной токсичностью и могут использоваться в процессе биоремедиации без ограничений. Разработаны способы улучшения деструктивных свойств штаммов, выделенных из окружающей среды.

Подобраны стабилизаторы, внесение которых в биомассу штаммов-деструкторов позволяет сохранять их высокую деструктивную активность при комнатной температуре в течение 50 суток.

В лабораторных и полевых экспериментах доказана эффективность применения выделенных микроорганизмов, Achromobacter sp. Kg 16 и О. anthropi GPK 3, для биоремедиации почвы, загрязненной ГФ. В условиях периодического культивирования наибольшую эффективность как деструктор ГФ показал штамм О. anthropi GPK 3, тогда как в экспериментах с интродукцией штаммов в почву, особенно в полевых условиях, лучшим деструктором оказался Achromobacter sp. Kg 16. Получен акт полевых испытаний по биоремедиации почвы, проведенных на специально выделенных участках Серпуховского района Московской области в летний период 2006, 2007 гг.

Полученные сведения о процессах сорбции ГФ и его вертикальной миграции в почве, а также степени участия природного микробного сообщества в деструкции токсиканта позволяют более точно оценивать эффективность интродукции штаммов-деструкторов и риски при обработке почвы гербицидами на основе ГФ.

На основе проведенных исследований впервые разработан способ очистки почв, загрязненных ГФ (заявка на получение патента РФ № 2009105432 «Штамм бактерий Achromobacter sp. - деструктор органофосфонатов и способ его применения для биоремедиации почвы»).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Шушкова, Татьяна Валентиновна

ВЫВОДЫ

1. Из образцов загрязненных почв выделено 40 изолятов, способных использовать глифосат и метилфосфонат в качестве единственных источников фосфора, сформирована коллекция из 13 перспективных штаммов. Для биоремедиации почвы были отобраны наиболее эффективные деструкторы глифосата - О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kgl6; они непатогенны для млекопитающих, не обладают фито- и интегральной токсичностью.

2. Подобраны оптимальные условия культивирования штамма О. anthropi GPK 3, позволяющие увеличить эффективность деструкции глифосата в 2,5 раза: использование глутамата натрия как источника углерода, хлорида аммония и глутамата натрия как источников азота, интенсивность аэрации в диапазоне 10-60 % от насыщения, рН 6,0-7,0, голодание посевного материала по фосфору в течение 48 часов.

3. Показано, что до 90 % внесенного гербицида сорбируется дерново-подзолистой почвой в горизонте 0-20 см, 10 % глифосата остается в почвенном растворе, необратимо связанного глифосата не обнаружено. В условиях обильных осадков ГФ может мигрировать на глубину до 30 см.

4. Проведена биоремедиация загрязненной почвы в полевых условиях с интродукцией двух отобранных штаммов. В результате содержание глифосата снижалось на 59 % (О. anthropi GPK 3) и 75 % (Achromobacter sp. Kg 16) по сравнению с контролем (29 %) в условиях 10-кратного увеличения нормы использования ГФ, восстанавливалась биологическая активность почвы, а интегральная токсичность и фитотоксичность соответствовали показателям чистой почвы.

5. Подобраны условия для длительного хранения биомассы О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16, предназначенной для внесения в почву, с сохранением деструктивного потенциала.

6. В результате проведенных исследований разработан способ биоремедиации почв, загрязненных глифосатом.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам Научно-исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов Федерального медико-биологического Агентства России (г. Серпухов) проф. д.б.н. Жарикову Г.А. за организацию токсикологической экспертизы и к.б.н. Киселевой Н.И. за помощь в проведении тестов по фитотоксичности, вед.н.с. Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (г. Пущино) к.б.н. Васильевой Г.К. за консультации при постановке почвенных экспериментов, сотрудникам ИБФМ РАН Гафарову А.Б. и Соколову С.Л. за помощь в идентификации штаммов, к.х.н. Зеленковой Н.Ф. и Винокуровой Н.Г. за консультации по вопросам аналитического определения органофосфонатов, Насыбуллиной М.Ф. за определение внутриклеточного содержания фосфора, а также всем сотрудникам лаборатории микробной энзимологии за внимание и поддержку при выполнении настоящей работы.

Особую благодарность автор приносит старшему научному сотруднику лаборатории микробной энзимологии к.б.н. Инне Тихоновне Ермаковой за благожелательное отношение и неоценимую помощь в планировании экспериментальной работы и интерпретации результатов, а также своему руководителю д. б. н. Алексею Аркадьевичу Леонтьевскому за постоянное внимание, консультации и плодотворное обсуждение этапов работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шушкова, Татьяна Валентиновна, 2010 год

1. Берестецкий О.А. Методы определения токсичности почвы. Микробиологические и биохимические исследования почв. Киев: Урожай, 1971.

2. Булгаков Н. Г. Индикация состояния природных экосистем и нормирование факторов окружающей среды. Обзор существующих подходов. Усп. соврем, биол., 2002, т. 122, №2, с.115-135.

3. Бурдин К.С. Основы биологического мониторинга, М: МГУ, 1985.

4. Васильева Г.К., Суровцева Э.Г., Белоусов В.В. Разработка микробиологического способа для очистки почвы от загрязнения пропанидом и 3,4-дихлоранилином. -Микробиология, 1994, т. 63, с. 129-144.

5. Вельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации. Биотехнология, 2001, №2, с. 70-76.

6. Вершинина О.А., Знаменская Л.В. Pho регулоны бактерий. Микробиология, 2002, т. 71, с. 581-595.

7. Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. Успехи биологической химии, 2004, т. 44, с. 307-340.

8. Зеленкова Н.Ф., Винокурова Н.Г. Определение глифосата и продуктов его биодеградации хроматографическими методами. Журнал Аналитической Химии, 2008, №9, с. 958-961.

9. Кононова С.В., Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами. -Биохимия, 2002, т. 67, № 2, с. 220-233.

10. Кравцов И.С., Янов С.Н, Дармов И.В., Ковтун А.Л. Выделение из окружающей среды микроорганизмов, способных разлагать фосфонаты. Химическая и биологическая безопасность, 2006, № 6, с. 3-9.13.