Функционирование уреалитического звена микробиома желудочно-кишечного тракта у представителей диких растительноядных птиц и млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Степаньков Александр Александрович

• Степаньков Александр Александрович
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Степаньков Александр Александрович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Введение ключевых понятий

1.2. Роль микробиома в физиологии позвоночных

1.3. Участие микроорганизмов желудочно-кишечного тракта в пищеварении

1.4. Азотный метаболизм позвоночных

1.4.1. Общая характеристика ключевых этапов азотного метаболизма

1.4.2. Регуляция положительных статей азотного метаболизма

1.4.3. Регуляция отрицательных статей азотного метаболизма

1.5. Феномен рециклизации мочевины

1.6. Уреазная активность как ключевой регулятор интенсивности рециклизации мочевины

1.7. Уреалитическое сообщество микробиома ЖКТ фитофагов

1.7.1. Метагеномный подход в изучении некультивируемых микроорганизмов

1.7.2. Биоинформатическая обработка метагеномных данных для некультивируемых прокариот

1.7.3. Пилотные работы в области метагеномики симбионтов, участвующих в азотном цикле животных

2. Объекты и Методы

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Грызуны

2.1.2. Зайцеобразные

2.1.3. Курообразные

2.2. Методы исследования

2.2.1. Измерение уреазной активности

2.2.2. Измерение содержания общего азота и углерода

2.2.3. Статистическая обработка количественных данных

2.2.4. Определение культивируемых уреалитических микроорганизмов

45

2.2.5. Определение некультивируемых уреалитических микроорганизмов

2.2.6. Определение метаболических функциональных возможностей микробиома ЖКТ

2.2.7. Количественный учет микроорганизмов методом люминесцентной микроскопии

3. Результаты и обсуждение

3.1. Измерение уреазной активности в ЖКТ диких фитофагов

3.1.1. Уреазная активность у зайцеобразных

3.1.2. Уреазная активность у грызунов

3.1.3. Уреазная активность у курообразных

3.1.4. Общие закономерности проявления уреазной активности в ЖКТ

изученных фитофагов

3.1.5. Сопряжение рециклизации мочевины с другими процессами азотного цикла

3.2. Изменение концентрации общего азота химуса ЖКТ фитофагов

3.3. Расчет максимально-возможных темпов рециклизации азота

мочевины на основании величины уреазной активности

3.4. Определение культивируемых уреалитических микроорганизмов .... 71 3.4.1. Определение функциональных возможностей микробиома ЖКТ фитофагов

3.5. Определение некультивируемых прокариот-уреалитиков путем

секвенирования метагенома слепой кишки зайца русака

3.6. Заключение

4. Выводы

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Микробиом желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) активно участвует в обеспечении питания позвоночных и беспозвоночных животных. Он осуществляет ферментирование трудноперевариваемых веществ, обогащает корма белком и витаминоподобными соединениями, а также регулирует иммунную систему (Stevens, Hume, 1998; Dicks et al, 2018) Особенно важен микробиом в пищеварении растительноядных животных, которые потребляют клетчатковые корма с низким содержанием белка. Известна роль симбионтов в деградации клетчатки до летучих жирных кислот (Лактионов, 2007; Allison, 1984). Но не менее важно обогащение пищевой массы азотом, который особенно необходим в периоды роста, беременности и лактации. Проблема дефицита диетарного азота особенно остро стоит в сельском хозяйстве, поскольку даже незначительная его нехватка приводит к драматической потере массы тела животного и снижению удоев (Shirley, 1986) Экономические потери обуславливают повышенный интерес общества к изучению эволюционных путей компенсации дефицита диетарного азота -в первую очередь, за счет внутренних цепей питания. Рассматриваются три основных пути такой компенсации: ферментация неперевариваемых азотистых компонентов пищи (например: хитина или кератина), азотфиксация и рециклизация мочевины (Egan et al., 1986). По современным оценкам именно последний путь - рециклизация азота мочевины - имеет максимальное физиологическое значение. Он заключается в

перенаправлении потока мочевины из почек в один из микробных ферментеров ЖКТ (обычно: преджелудок или слепую кишку), где микроорганизмы гидролизируют мочевину до аммиака и синтезирует из него свой белок. Образующийся микробный белок, усваивается организмом-хозяином и компенсирует недостаток экзогенного протеина (Mobley, Hausinger, 1989) Таким образом, животные могут существенно снижать потребность в диетарном белке и обходиться легкодоступными, но бедными растительными кормами. Позвоночные способны рециклизировать от 0 до 95% образующейся мочевины (Stevens, Hume, 1998). При максимальных темпах рециклизации животные могут быть практически автономными по азоту. Возникает вопрос о факторах, которые обеспечивают регуляцию темпов рециклизации в таком огромном диапазоне (0 и 95% - это «все» и «ничего»). Очевидно, что способность манипулировать этими факторами позволила бы решить или хотя бы смягчить проблему азотного питания в животноводстве. К основным факторам, регулирующим темпы рециклизации, относят следующие: интенсивность реабсорбции мочевины в почечных канальцах, количество транспортеров мочевины в стенках ЖКТ и уреазную активность симбионтов (Marini et al., 2004). В последние годы появились данные о незначительном вкладе первых двух факторов. На ряде модельных животных показано, что скорость рециклизации зависит в первую очередь от уреазной активности, а не от прочих факторов (Mobley et al., 1995). Это автоматически поднимает интерес именно к этому аспекту рециклизации

азота. Однако в литературе существуют только отрывочные данные по этому показателю. Изучены только некоторые сельскохозяйственные животные, причем упор сделан на организмы с преджелудочной ферментацией (Мюкпоуа е1 а1., 1979). Непонятно, что происходит у животных, питающихся естественными кормами, как отличается активность у животных с предгастричной, слепокишечной, тонкокишечной и заднекишечной ферментацией. Отдельным вопросом является рециклизация азота у урикотелических животных - экскретирующих азот в форме мочевой кислоты. Известно, что ряд птиц, например домашняя курица и белая куропатка, осуществляют рециклизацию азота (Мойешеп, Ттёа11, 1981) Однако роль именно уреазной (а не уриказной) активности для этих животных остается малопонятной. Также труднорешаемой задачей является сопоставление немногочисленных литературных данных. Нет двух авторов, которые бы представили свои данные по уреазной активности в ЖКТ в одинаковой форме. Величины нормируют на сухое вещество, на влажную навеску, на мл, на г, на минуту, на час, на 20 мин и на полминуты. Инкубацию осуществляют преимущественно при 25 градусах, в то время как физиологическая температура находится в диапазоне 35-39 градусов (Степаньков и др., 2017а). В итоге сейчас нет никакой возможности прямо сравнить имеющийся литературный материал по одному из важных вопросов физиологии. Решением проблемы могла бы стать экспериментальная работа,

охватившая под одной методикой несколько диких животных-фитофагов, реализующих различные типы микробной ферментации.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функционирование уреалитического звена микробиома желудочно-кишечного тракта у представителей диких растительноядных птиц и млекопитающих»

Актуальность темы

Рециклизация мочевины — одна из крупнейших экологических адаптаций, позволяющая животным-фитофагам (в том числе, подавляющему числу сельскохозяйственных животных) компенсировать недостаток диетарного азота (Б§ап а/., 1986; Ьиёёеп а/., 2000; К1гап, Mutsvangwa, 2010). Однако на настоящий момент в литературе отсутствуют систематизированные количественные данные по уреазной активности, характеризующие ключевой этап рециклизации — микробный гидролиз мочевины. Не ясен таксономический состав и экологические потребности уреалитических кишечных симбионтов. Существующая методика работы с прокариотами-уреалитиками охватывает только культивируемые формы, а методики метагеномных исследований, которые бы охватывали некультивируемые штаммы, пока не отработаны. Это обуславливает сохраняющееся до сих пор непонимание основных принципов инициации и регуляции процесса рециклизации мочевины. Перечисленные проблемы особенно актуальны как для теоретической физиологии, так и для прикладных вопросов, касающихся внедрения эффективных схем кормления сельскохозяйственных животных с различными типами морфологии ЖКТ.

Цель исследования

Охарактеризовать в сравнительном аспекте уреалитическое звено микробиома желудочно-кишечного тракта представителей диких растительноядных птиц и млекопитающих.

Задачи исследования

• Определение уреазной активности в содержимом разных отделов ЖКТ изучаемых животных с разным типом ферментации.

• Определение численности и группового состава микроорганизмов-уреалитиков ЖКТ.

• Определение функциональных возможностей микробиомов разных уреалитических ферментеров ЖКТ.

• Изучение влияния уреазной активности на изменение концентрации азота и углерода в содержимом ЖКТ.

Научная новизна

В настоящей работе впервые в рамках единой методики собраны данные по уреазной активности у диких растительноядных птиц и млекопитающих, принадлежащих к разным отрядам.

Впервые была установлена сезонная динамика уреазной активности, связанная с изменением характера корма.

Впервые был разработан и применен метод метагеномного секвенирования совокупности фрагментов игеС гена для выявления таксономического состава бактерий-уреалитиков кишечника.

В рамках текущего исследования был разработан уникальный алгоритм обработки биоинформатических данных, запущенный на специально подготовленном сервере.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты изучения таксономического состава уреалитических кишечных симбионтов существенно расширяют представления об экологии микроорганизмов. В частности, благодаря метагеномным исследованиям стало известно о потенциальной уреалитической активности некультивируемых представителей таких малоизученных фил, как планктомицеты, тенерикуты и ТМ-7. Помимо этого, полученные данные проливают свет на активно обсуждаемую в литературе проблему отсутствия больших количеств мочевой кислоты в экскрементах птиц-фитофагов.

Результаты настоящей работы расширяют представления о факторах, влияющих на величину уреазной активности в желудочно-кишечном тракте животных-фитофагов. Этот процесс имеет не только теоретическое, но и несколько практических приложений:

1. Уреазная активность во многом определяет продуктивность мясных и молочных пород скота.

2. Патологическая уреазная активность приводит к алкалозу рубца жвачных животных, обуславливающий падеж скота.

3. Уреазная активность обуславливает потери карбамидных удобрений на полях.

4. Уреазная активность является фактором патогенности многих возбудителей заболеваний человека и животных, включая Helicobacter pylori.

Основные положения, выносимые на защиту

Микробная уреазная активность в ЖКТ диких представителей грызунов и зайцеобразных на порядок превосходит известные значения для всеядных животных (свинья, крыса) и сопоставима с активностью у домашних зеленоядных фитофагов (корова, кролик).

У диких курообразных в ЖКТ наблюдается уреазная активность, превосходящая таковую у домашних курообразных в 2-10 раз.

Уреазная активность прокариот ЖКТ у всех изученных видов позволяет рециклизировать азот на физиологически значимом уровне.

Основной уреалитический отдел ЖКТ грызунов, зайцеобразных и курообразных — слепая кишка. Предгастричная ферментация не играет роли в рециклизации мочевины у изученных животных.

Доминанты уреалитических звеньев микробиома зайца-русака, тетерева-косача и полуденной песчанки относятся к факультативно анаэробным гамма-протеобактериям (сем. Enterobacteriaceae) и фирмикутам.

Обоснованность и достоверность результатов

Основные выводы диссертационной работы сделаны на основе результатов, полученных путем экспериментов, выполненных на современном оборудовании по актуальным методикам с применением хорошего статистического аппарата.

Личный вклад автора

Автор лично проводил эксперименты, осуществлял расчеты, принимал значительное участие в написании и публикации научных трудов. Лично сформулировал ключевые тезисы диссертационной работы, а также написал текст диссертации и автореферата.

Апробация работы

Работа была заслушана на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, а также на межлабораторном коллоквиуме в Институте проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН.

Опубликованные работы

2018 Рециклизация мочевины у мышевидных грызунов. Степаньков А.А., Кузнецова Т.А., Умаров М.М., Наумова Е.И., Вечерский М.В., в журнале Известия Российской академии наук. Серия биологическая, издательство Наука, №1, с. 79-82.

2017 Зоомикробные симбиозы и азотный метаболизм. Степаньков А.А., Кузнецова Т.А., Умаров М.М., Вечерский М.В., в журнале Природа, издательство Наука, Том 9 , с. 82-85.

2017 Уреазная активность в желудочно-кишечном тракте зайца-русака Lepus europaeus. Степаньков А.А., Кузнецова Т.А., Вечерский М.В., в журнале Известия Российской академии наук. Серия биологическая, издательство Наука, №2, с. 197-201.

2015 Активность уреалитических микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте тетерева-косача Lyrurus tetrix. Вечерский М.В., Кузнецова Т.А., Степаньков А.А., в журнале Доклады Академии наук, издательство Наука, Том 462 , №3, с. 363-365.

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Введение ключевых понятий

Существует путаница в написании термина «уреалитический» и всех его производных. В русскоязычной литературе написание «уреолитический» используется приблизительно в два раза чаще, чем «уреалитический». В англоязычной литературе «игео1уйс» встречается в 3-4 раза чаще, чем «игеа1уйс». При этом академические издания и справочная литература чаще используют «уреалитический» и «игеа1уйс». В то время как в медицинских изданиях используется «уреолитический» и «игео1уйс». Из-за доминирования медицинской литературы такой вариант стал преобладать. В тоже время согласно правилам английского языка, положено писать «игеа1уйс», что обуславливает русскую транслитерацию «уреалитический». В данной работе будет использоваться только такое написание, в том числе при цитировании.

Под термином «геном» будет пониматься вся нуклеотидная последовательность ДНК отдельной клетки рассматриваемого объекта. Под термином «транскриптом» будет пониматься вся совокупность иРНК образца рассматриваемого объекта. Под термином «протеом» будет пониматься вся совокупность белков образца рассматриваемого объекта. Под термином «микробиом» будет пониматься вся совокупность микроорганизмов образца рассматриваемого объекта. Под термином «метагеном» будет рассматриваться вся совокупность геномов микробиома образца

рассматриваемого объекта. Таким образом, прямое английское заимствование «микробиом» будет синонимично русскому понятию «микробиота».

1.2. Роль микробиома в физиологии позвоночных

Любой позвоночный (и беспозвоночный) организм содержит внутри себя и на своей поверхности большое количество прокариотических клеток.

л

Внутренние среды позвоночных заселены обычно незначительно (до 102 кл/г), например бактериальные клетки в норме присутствует в крови, в паренхиматозных органах, и различных полостях (Chai et al., 2018; Wilson et al., 2019). Внешние среды позвоночных наружные покровы, слизистые респираторных путей, ЖКТ (весь просвет ЖКТ относится к внешней среде) — заселены гораздо плотнее (до 1011 кл/г) (Borbon-Garcia et al., 2017). Подавляющее большинство этих микроорганизмов являются комменсалами хозяина. Однако некоторые проявляют паразитические или мутуалистические взаимоотношения с хозяином. Вместе они могут оказывать выраженный физиологический эффект. К ключевым эффектам мутуалистического звена микробиома позвоночных относятся (Dicks et al., 2018, Poussin et al, 2018):

1. Участие в пищеварении, путем ферментирования неперевариваемых компонентов корма.

2. Синтез витаминов, аминокислот и жирных кислот, используемых для питания органов ЖКТ или всего организма в целом.

3. Защита от патогенных микроорганизмов (путем конкуренции).

4. Синтез низкомолекулярных сигнальных веществ, выполняющих регуляторную функцию (на уровне нейромедиаторов и гормонов).

5. Регулирование иммунной системы организма (как в сторону активации, так и в сторону подавления).

К ключевым эффектам паразитического звена микробиома относятся (Yan, Charles, 2017; Malan-Muller et al, 2018; Dicks et al, 2018):

1. Колонизация и разрушение тканей.

2. Синтез токсичных вторичных метаболитов

3. Провоцирование автоиммунных реакций в отношении колонизированных тканей.

Роль паразитических бактерий очевидна в отношении всех позвоночных. А роль мутуалистических бактерий для разных групп животных радикально отличается. Если жвачные быстро гибнут при нарушениях микробиома желудочно-кишечного тракта, то хищники слабо от него зависят. Наибольшее значение имеют микроорганизмы, облигатно вовлеченные в метаболические пути хозяина. Такие бактерии обитают чаще всего в кишечнике и принимают на себя выполнение части биохимических реакций хозяина. Стоит подробнее рассмотреть эти функции, поскольку именно к ним относится предмет данной диссертации.

1.3. Участие микроорганизмов желудочно-кишечного тракта в пищеварении

В качестве кормов для позвоночных выступают живые и мертвые ткани растений и животных. Они механически разрушаются в верхних отделах ЖКТ (рте, зобе и т.д.) и подвергаются гидролизу под действием ферментов в желудке и тонком кишечнике (Наумова, 1981). Этот процесс называется пищеварением. Образовавшиеся в результате низкомолекулярные органические вещества всасываются кишечным эпителием и используются организмом в качестве источника вещества и энергии (Stevens, Hume, 1998). Непереваренные компоненты пищи поступают в дистальные отделы ЖКТ и экскретируются. У некоторых животных непереваренные компоненты пищи могут быть разрушены с помощью ферментов симбиотических микроорганизмов (Stevens, Hume, 1998; Варшавский и др., 2003). Этот процесс называется ферментацией. Как правило, физиологически значимая ферментация происходит в отношении сложных полисахаридов и некоторых простых сахаров. Продуктами микробной ферментации в ЖКТ являются летучие жирные кислоты (молочная, уксусная, пропионовая, масляная), а также этиловый и метиловый спирты, водород, углекислый газ (Vital et al., 2017). Органические продукты брожения активно усваиваются в ЖКТ и используются организмов хозяином. В некоторых случаях количество усвоенных продуктов ферментации сопоставимо с количеством продуктов пищеварения (например, у жвачных животных). Таким образом, кишечный

микробиом может восприниматься как еще один пищеварительный орган животного. Кроме того, нарастающая биомасса бродильщиков содержит витамины группы В, холин, сигнальные моноамины, которые также могут быть усвоены хозяином (Dicks et al., 2018).

Существует несколько типичных локализаций микробной ферментации в ЖКТ (рис. 1) (Stevens, Hume, 1998). В первом случае ферментация протекает в основном в преджелудке. Например - в рубце у жвачных. В таком случае говорят о предгастричной или преджелудочной ферментации. Во втором случае она протекает в задних отделах кишечника. Например: в слепом и ободочном отделе кишечника непарнокопытных. В таком случае говорят о постгастричной или заднекишечной ферментации (Bayley, 1978). Отметим, что у большинства животных в той или иной степени реализуются оба принципа (Кучерук, Наумова, 1995; Жарова и др., 1996). Такая ситуация называется смешанным типом ферментации.

small intestine

esophagus

large intestine

Слепая кишка

« Преджелудки»

small intestin«

Рис. 1. Ключевые локусы микробной ферментации у фитофагов.

Отметим, что у ряда животных тонкий кишечник имеет непропорционально большую длину и, вероятно, может иметь осуществлять роль камеры для микробных процессов (Stevens, Hume, 1998).

1.4. Азотный метаболизм позвоночных

1.4.1. Общая характеристика ключевых этапов азотного метаболизма

Азотный метаболизм позвоночных животных затрагивает следующие

группы органических соединений: белки, небелковые пептиды, нуклеиновые

кислоты, амины, амиды, свободные аминокислоты. Животные получают

перечисленные азотсодержащие компоненты либо непосредственно из пищи,

либо сами синтезируют их из безазотистых веществ путем прямого

амминирования кетокислот и непредельных кислот с помощью аммиака,

либо путем трансаминирования непредельных кислот с помощью аланина и

глутамина (Wu, 2013; Salway, 2018). Однако некоторые азотсодержащие

вещества - в первую очередь незаменимые аминокислоты и витамины

группы В - не могут быть синтезированы в требуемом количестве и

обязательно должны поступать с пищей (Shirley, 1986). Азотсодержащие

вещества могут выполнять как специфические функции, так и просто

окисляться в качестве неспецифического энергетического субстрата (Richards,

1975). Окисление азотсодержащих вещества (как в энергетических целях, так

и при утилизации отработавших молекул) сопровождается выделением

19

аммиака. Аммиак проявляет ярко выраженные энцефалотоксические свойства, поэтому должен быть быстро инактивирован в печени (Гиляров, 2012; Braissant, 2013). У млекопитающих все азотсодержащие вещества, кроме пуринов окисляются до аммиака, который связывается в мочевину в орнитиновом цикле (Salway, 2018). У птиц азотсодержащие вещества (а также пурины у млекопитающих) окисляются до мочевой кислоты. Мочевина и мочевая кислота являются конечным продуктом метаболизма и выводятся почками (Wu, 2013).

Разница между количеством потребленного диетарного азота и выведенного с экскретами называется азотным балансом. Эта величина рассчитывается в граммах/сутки, либо в процентах от потребленного азота (Stevens, Hume, 1995). Самый высокий азотный баланс наблюдается у растущих организмов, беременных и лактирующих самок, а также у особей в период активного наращивания биомассы (Karasov et al., 1986). Однако даже у растущих особей азотный баланс очень редко превышает 30%. То есть на 100 г усвоенного азота, минимум 70 г будет потеряно с мочой. У нерастущих животных азотный баланс колеблется в районе нуля, таким образом весь поступивший азот полностью выводиться с мочой. У стареющих, неадекватно питающихся, либо стрессированных особей азотный баланс вообще становится отрицательным (Karasov et al., 1986). Даже при выраженном дефиците диетарного азота суточное выведение азота с экскретами у млекопитающих никогда не опускается ниже 0,05% от массы

тела (Stevens, Hume, 1998). Таким образом даже при отсутствии видимого прироста своей биомассы животные вынуждены потреблять азотсодержащую пищу, чтобы компенсировать потери с экскретами. У некоторых экологотрофических групп, потребляющих пищу с низким количеством белка (типичный пример — фитофаги) доступность белка является более строгим лимитирующим фактором, чем доступность энергии. И, даже несмотря на это, выведение азота у таких животных стабильно остается на высоком уровне, как правило, в два раза превышая азотный баланс.

1.4.2. Регуляция положительных статей азотного метаболизма

Для всех эукариот азотсодержащие вещества должны поступать с

пищей. Только прокариоты способны фиксировать молекулярный азот и

переводить его в аминную форму. Корма сильно отличаются по содержанию

азота, как в качественном, так и в количественном аспектах (Абатуров, 2005;

Karasov et al., 1986). Содержание азота в кормах часто характеризуют

количественным понятием: сырой протеин. Эта величина является

произведением содержания общего азота и коэффициента 6,25, отражающего

среднее содержание азота в белке. Несмотря на наличие термина «протеин»

это понятие включает в себя все азотистые диетарные компоненты, а не

только белки. Необходимо учитывать, что в сыром протеине членистоногих

и грибов существенная часть азота представлена не белками, а

пептидогликанами (хитином). А сырой протеин бактерий содержит

повышенное количество нуклеиновых кислот. Ценность сырого протеина определяется двумя ключевыми параметрами: составом и перевариваемостью (Wu, 2013).

Перевариваемость зависит от многих параметров, в частности от типа белков и степени их ассоциированности с углеводами. Как правило, растительные белки перевариваются принципиально хуже, чем животные. Так, перевариваемость растительных белков у жвачных находится на уровне 50-75%, в то время как для хищных животных эта величина еще ниже (Karasov et al., 1986). Животный белок переваривается лучше — на уровне 80-100%, но некоторые белки (например, кератины волос, перьев, копыт) у большинства животных почти не перевариваются. Наилучшей перевариваемостью, составляющей 100%, обладают протеины молока. Помимо принципиальной переваримости важна и скорость усвоения. Например, сывороточный белок усваивается у большинства млекопитающих в течение десятков минут, в то время как казеин усваивается в течение 2-8 часов. Хотя и тот, и другой усваиваются полностью.

Другим аспектом ценности сырого протеина является наличие незаменимых компонентов. Поскольку основная масса диетарных азотных компонентов (как растительных, так и животных) представлена белками, то наибольшим значением обладает аминокислотный состав пищи (Stevens, Hume, 1998). Тем более что подавляющая часть незаменимых азотистых компонентов являются аминокислотами. Из 20 протеиногенных аминокислот

приблизительно половина является незаменимыми. Этот список варьирует от вида к виду (Wu, 2013). Так, для большинства млекопитающих и птиц незаменимыми являются аминокислоты с разветвленной цепью (лейцин, изолейцин, валин), серосодержащие (метионин), ароматические (триптофан, фенилаланин), а также некоторые алифатические (лизин и треонин). Для птиц незаменимой аминокислотой является также и глицин. В период развития для многих млекопитающих незаменимыми становятся аргинин и гистидин. В сыром протеине разных источников могут отсутствовать или содержаться в недостаточном количестве некоторые из перечисленных аминокислот. Например, сырой протеин злаков отличается пониженным содержанием аминокислот с разветвленной цепью, а протеин сои беден серосодержащими аминокислотами. Идеальным составом обладает молочный белок. Как правило, к нему близок по этим параметрам белок мышечной массы. Но в целом, животный сырой протеин обладает также неидеальным составом, поскольку белковая биомасса животного на треть представлена коллагеном. Коллаген, в свою очередь, на треть состоит из гидроксипролина и гидроксилизина, и еще на треть - из глицина. Такой состав является очень несбалансированным, поэтому только мышечная часть животной биомассы содержит полноценный белок. Важной незаменимой частью азотного питания являются витамины группы В: цианкобаламин, фолиевая кислота, пиридоксин, пантотеновая кислота, рибофлавин, тиамин, никотиновая кислота, а также рутин и холин.

Известно, что всасывание многих диетарных компонентов регулируется в соответствии с текущими потребностями организма (Stevens, Hume, 1995). Например, интенсивность абсорбции кальции и железа находится в обратной зависимости от концентрации этих элементов в плазме крови. Предполагается, что усвоение азота также может регулироваться исходя из концентрации аминокислот в крови (Шмидт-Ниельсен, 1982). Усвояемость азота сильно варьирует у разных животных. Например, у овец она составляет около 75% от сырого протеина корма (Marini et al., 2004). При изменении содержании азота в корме, усвояемость не падает, а наоборот, заметно возрастает. При этом рост усвояемости связан не с увеличением степени абсорбции, а со стабилизацией азота экскрементов (Karasov et al., 1986). Было показано, что у овцы при изокалорийной диете (с постоянной калорийностью, но разным содержанием белка), всегда выводится приблизительно одно и то же количество азота (несмотря на четырехкратное колебание содержания азота в корме). Поэтому при увеличении количества поступающего азота при сохранении количества выводящегося азота наблюдается четкое возрастание степени абсорбции (Singer, 2003. Данная зависимость верна не только для жвачных, но и для хищных. Например, коты, обладающие наиболее контрастными показателями азотного метаболизма по сравнению с овцами, демонстрируют аналогичную тенденцию (Green et al., 2008). При очень высокой базовой усвояемости животного белка (порядка 95%) коты при изокалорийной диете сохраняют приблизительно одинаковую

интенсивность выведения азота. Наблюдается лишь двукратный, но недостоверный тренд роста содержания азота в экскрементах (при четырехкратном увеличении содержания азота в корме), что обеспечивает двукратный рост усвояемости. Отметим, что данная зависимость верна только при сопоставимом объеме потребляемых кормов и, соответственно, экскрементов (Karasov et al., 1986). Вероятно, остаточный азот экскрементов представляет собой не недопереваренные азотные компоненты пищи, а белки и нуклеиновые кислоты микробной биомассы, а также материал слущивающегося эпителия кишечника. В противном случае остаточный азот находился бы в соответствии с количеством потребленного азота. Таким образом, усвоение азота в ЖКТ у млекопитающих не меняется от степени аминокислотного обеспечения животного и находится на максимально возможном для каждого конкретного животного уровне.

Еще одной положительной статьей азотного метаболизма является азотфиксация симбиотическими прокариотами в желудочно-кишечном тракте (Elleway et al., 1971; Li, Satter, 1975; Manaeva et al., 2012, Kuznetsova et al., 2014). У большинства животных количество симбионтных прокариотических клеток сопоставимо с количеством собственных эукариотических, а их масса составляет порядка 2% от массы животного. Поэтому процессы, осуществляемые кишечными симбионтами, могут оказывать существенное влияние на жизнедеятельность макроорганизма в целом. Многие прокариоты способны фиксировать атмосферный азот,

переводить его в аминную форму и синтезировать белок (Granhall, Ciszuk, 1971; Naumova et al., 2000). Было неоднократно показано, что у животных (в том числе млекопитающих) симбионты ЖКТ обладают очень высокой нитрогеназной активностью, многократно превышающей нитрогеназную активность фоновых субстратов (Smith, 1948; Bergersen et al., 1970; Granhall, Ciszuk, 1971). Очевидно, что наращиваемый в результате азотфиксации микробный белок может быть усвоен организмом-хозяином наравне с диетарным. Физиологическая значимость подобных внутренних цепей питания привлекает много внимания (Наумова и др, 2000). Известно, что, например, у термитов атмосферный азот составляет важную часть азотного питания (Sapountzis, 2016). Представляет большой интерес, какую долю азотного баланса млекопитающих составляет атмосферный азот, зафиксированный микробными симбионтами.

1.4.3. Регуляция отрицательных статей азотного метаболизма

Азотный баланс в значительной мере зависит от скорости деградации

свободных аминокислот, то есть от активности окислительного

дезаминирования (Salway, 2018). Представляется логичным, что в условиях

дефицита диетарного азота будет происходить снижение темпов

окислительного дезаминирования аминокислот, чтобы сократить

потребность в белке. В респирометрическом эксперименте исследователи

продемонстрировали, что при критическом сокращении азота в рационе у

котов (кошачьи обладают одной из самых высоких потребностей в диетарном азоте, составляющей порядка 30%, но не менее 16% от общей калорийности) происходит четырехкратное уменьшение интенсивности окислительного дезаминирования (Green et al., 2008). Однако эти данные сложно совместить с результатами балансовых экспериментов, в которых было показано, что степень удержания азота находится приблизительно на одном и том же уровне, как у хищных, так и у травоядных млекопитающих и отличается не более чем на 50%, а не в четыре раза (Marini et al., 2004). Таким образом, несмотря на азотный дефицит, организм млекопитающих продолжает использовать углеродные скелеты преимущественно алифатических аминокислот в энергетических целях даже при избытке углеводов, а образующийся аммиак выводить из организма в виде мочевины (Karasov et al., 1986). Некоторые органы избирательно используют в катаболизме отдельные аминокислоты, например, мозг активно окисляет валин (Wu, 2013). Хотя этот же валин активно используется мышечной тканью в анаболических целях.

На настоящий момент не ясно, с чем может быть связана такая метаболическая консервативность растительноядных млекопитающих, поскольку очевидно, что возможное снижение темпов окислительного дезаминирования принесло бы четко выраженное эволюционное преимущество. Однако этого не наблюдается. Более того, около половины азота мочевины, который вернулся в кровь в результате рециклизации, вновь

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Степаньков Александр Александрович, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абатуров Б.Д., Лопатин В.Н. Связь уровня потребления пищи с размерами тела у растительноядных млекопитающих // Журнал общей биологии. 1987. Т. 66. Вып. 6. С.763-770.

2. Абатуров Б.Д., Магомедов М.-Р.Д. Питательная ценность и динамика кормовых ресурсов как фактор состояния популяции растительноядных млекопитающих // Зоол. журнал. 1988. Т. 67. Вып. 2. С. 223-234.

3. Абатуров Б.Д. Кормовые ресурсы, обеспеченность пищей и жизнеспособность популяций растительноядных млекопитающих // Зоологический журнал. 2005. T. 84. № 10. C. 1251-1271.

4. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ, 1989. С.49-51.

5. Варшавский А.А., Пузаченко А.Ю., Наумова Е.И., Костина Н.В. Ферментативная активность микрофлоры пищеварительного тракта обыкновенного слепыша Spalax microphtalmus (Spalacidea, Rodentia) // Доклады Академии наук. 2003. Т. 392. № 4. С. 564-567.

6. Вечерский М.В., Наумова Е.И., Костина Н.В., Умаров М.М. Ассимиляция биологического азота у европейского бобра // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2009. № 1. С. 108-112.

7. Вечерский М.В., Кузнецова Т.А., Костина Н.В., Горленко М.В., Голиченков М.В., Умаров М.М., Наумова Е.И. Роль микробиоценоза

желудочно-кишечного тракта в питании тетеревиных // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2014. № 3. С. 281-285.

8. Вечерский М.В., Кузнецова Т.А., Степаньков А.А. Активность уреалитических микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте тетерева-косача // Доклады Академии наук. 2015. Т. 462. № 3. С. 363

9. Гиляров М.С. Экологические принципы эволюции наземных животных. Избранные труды. М. Товарищество научных изданий КМК. 2012.

10. Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. М.: МАКС Пресс. 2005.

11. Жарова Г.К., Наумова Е.И., Чистова Т.Ю. Динамика прохождения пищи по пищеварительному тракту рыжей полёвки // Доклады Академии наук. 1996. Т. 349. № 5. С. 712-714.

12. Здорик О.В. Материалы по изучению микробов рубца, расщепляющих мочевину: Автореф. дис. канд. вет. наук. М.: Мос. ветеринар. акад., 1964.

13. Исаев А.П. Тетеревиные птицы Якутии: распространение, численность, экология: Дис. докт. биол. наук. Якутск. 2014.

14. Касаткин М.В., Неронов В.В. Пространственная структура поселений и размножение общественной полевки (Microtus socialis Pallas, 1773) при распространении пожаров в полупустынях // Бюл. МОИП. 2005. Т. 110. № 4. С. 92-97.

15. Кузнецова Т.А., Вечерский М.В., Голиченков М.В., Костина Н.В., Умаров М.М., Наумова Е.И. Активность азотфиксирующих

микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте зайца-русака // Доклады Российской академии наук. 2014. Т. 456. № 4. С. 499-501.

16. Кучерук В.В., Наумова Е.И. Методика изучения интенсивности прохождения различных кормов по пищеварительному тракту грызунов на примере большой песчанки //Зоол. журнал. 1995. Т.74. Вып.12. С. 116-120.

17. Лактионов К.С. Физиология питания кроликов и пути повышения степени использования кормов. Орел: Орловск. ГАУ. 2007.

18. Лактионов К.С. Симбионтное пищеварение у кроликов и пути увеличения использования углеводов кормов: Дис. докт. биол. наук. Белгород. 2009.

19. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Звягинцев Д. Г. (ред.). Методы почвенной микробиологии и биохимии: учеб. пособие. М.: МГУ. 1991.

20. Наумова Е.И. Функциональная морфология пищеварительной системы грызунов и зайцеобразных. М.: Наука. 1981.

21. Наумова Е.И. Морфологические и функциональные ограничители трофических ниш у млекопитающих-фитофагов // Актуальные проблемы морфологии и экологии высших позвоночных. 1988. С. 181-213.

22. Наумова Е.И., Ушакова Н.А., Мещерский И.Г., Костина Н.В., Умаров М.М. Азотфиксация - новый феномен в питании грызунов // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2000. № 3. С. 329-331.

23. Пшенников А.Е., Борисов З.З., Васильев И.С. Копрофагия и ее ритмика у зайца-беляка (Lepus timidus) в Центральной Якутии // Зоологический журнал. 1988. Т. 67. № 9. С. 1357-1362.

24. Омаров К.З., Омаров Р.Р., Магомедов М.Ш. Состояние популяции и особенности питания полуденной песчанки (Meriones meridianus) в северозападном Прикаспии // Вестн. ДагНЦ РАН. 2015. № 58. С. 15-18.

25. Степаньков А.А., Кузнецова Т.А., Умаров М.М., Вечерский М.В. Вечерский Зоомикробные симбиозы и азотный метаболизм у фитофагов. Природа. 2017а. № 9 (1225). С. 82-85.

26. Степаньков А.А., Кузнецова Т.А., Вечерский М.В. Уреазная активность в желудочно-кишечном тракте зайца-русака Lepus europaeus. Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2017б. № 2. С. 197-201

27. Умаров М.М., Добровольский Г.В. Почва, микробы и азот в биосфере // Природа. 2001. №6. С. 15-22.

28. Формозов Н.А., Кизилова А.К., Пантелеева А.Н., Наумова Е.И. Азотфиксация - возможная физиологическая основа копрофагии у пищух (Ochotona, Lagomorpha, Mammalia) // Доклады Российской академии наук. 2012. Т. 443. № 5. С. 646-649.

29. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир. 1987.

30. Шмидт-Ниельсен К. Физиология животных. Приспособление и среда. М.: Мир. 1982.

31. Allali I., Arnold J.W., Roach J., Cadenas M.B., Butz N., Hassan H.M., Koci M., Ballou A., Mendoza M., Ali R., Azcarate-Peril M.A. A comparison of sequencing platforms and bioinformatics pipelines for compositional analysis of the gut microbiome // BMC Microbiol. 2017. 17(1): 194. Doi: 10.1186/s12866-017-1101-8

32. Allison M.J. Microbiology of the rumen and small and large intestines. In: Dukes' Physiology of Domestic Animals (10th ed.). Edited by M.J. Swenson. Ithaca, NY: Cornell Univ. Press. 1984. P. 340-350.

33. Alonso-Saez L., Waller A.S., Mende D.R., Bakker K., Farnelid H., Yager P.L., Lovejoy C., Tremblay J.E., Potvin M., Heinrich F., Estrada M., Riemann L., Bork P., Pedros-Alio C., Bertilsson S. Role for urea in nitrification by polar marine Archaea // Proc Natl Acad Sci USA. 2012. 109(44):17989-17994. Doi: 10.1073/pnas.1201914109

34. Aoyagi T., Engstrom G., Evans W., Summerskill W. Gastrointestinal urease in man. I. Activity of mucosal urease // Gut. 1966. 7(6):631-635.

35. Bayley H.S. Comparative physiology of the hindgut and its nutritional significance. // J. Anim. Sci. 1978. 46(6):1800-1802.

36. Bates S.T., Berg-Lyons D., Caporaso J.G., Walters W.A., Knight R., Fierer N. Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil // ISME J. 2010. 5:908-917. Doi: 10.1038/ismej.2010.171

37. Bergersen F.J., Hipsley E.H. The presence of N2-fixing bacteria in the intestines of man and animals // J Gen Microbiol. 1970. 60(1):61-5.

38. Borbon-Garcia A., Reyes A., Vives-Florez M., Caballero S. Captivity Shapes the Gut Microbiota of Andean Bears: Insights into Health Surveillance // Front Microbiol. 2017. 8:1316. Doi: 10.3389/fmicb.2017.01316

39. Braissant O., McLin V.A., Cudalbu C. Ammonia toxicity to the brain // J Inherit Metab Dis. 2013. 36(4):595-612. Doi: 10.1007/s10545-012-9546-2

40. Brosh, A., Shkolnik A., Choshniak I.. Effects of infrequent drinking on the nitrogen metabolism of Bedouin goats maintained on different diets // J. Agric. Sci. Camb. 1987.109:165-169. Doi: 10.1017/S0021859600081107

41. Caporaso J.G., Kuczynski J., Stombaugh J., Bittinger K., Bushman F.D., Costello E.K., Fierer N., Pena A.G., Goodrich J.K., Gordon J.I., Huttley G.A., Kelley S.T., Knights D., Koenig J.E., Ley R.E., Lozupone C.A., McDonald D., Muegge B.D., Pirrung M., Reeder J., Sevinsky J.R., Turnbaugh P.J., Walters W.A., Widmann J., Yatsunenko T., Zaneveld J., Knight R. QIIME allows analysis of highthroughput community sequencing data // Naturemethods. 2010. 7(5):335-336. Doi: 10.1038/nmeth.f.303

42. Castelino M., Eyre S., Moat J., Fox G., Martin P., Ho P., Upton M., Barton A. Optimisation of methods for bacterial skin microbiome investigation: primer selection and comparison of the 454 versus MiSeq platform // BMC Microbiol. 2017. 17(1):23. Doi: 10.1186/s12866-017-0927-4.

43. Chai Z.Y., He Z.L., Deng Y.Y., Yang Y.F., Tang Y.Z. Cultivation of seaweed Gracilaria lemaneiformis enhanced biodiversity in a eukaryotic plankton

community as revealed via metagenomic analyses // Mol Ecol. 2018. 27(4): 1081— 1093. Doi: 10.1111/mec.14496

44. Clooney A.G., Fouhy F., Sleator R.D., O' Driscoll A., Stanton C., Cotter P.D., Claesson M.J. Comparing Apples and Oranges?: Next Generation Sequencing and Its Impact on Microbiome Analysis // PLoS One. 2016. 11(2):e0148028. Doi: 10.1371/journal.pone.0148028

45. Collins C.M., D'Orazio S.E. Bacterial ureases: structure, regulation of expression and role in pathogenesis // Mol Microbiol. 1993. 9(5):907-13.

46. Conrads G., Abdelbary M.M.H. Challenges of next-generation sequencing targeting anaerobes // Anaerobe. 2019. 58:47-52. (pii: S1075-9964(19)30029-0, дата обращения 18.02.2019). Doi: 10.1016/j.anaerobe.2019.02.006

47. Christensen W.B. Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella types // J. Bact. 1946. 52:461-466.

48. Crouch N.M.A., Lynch V.M., Clarke J.A. A re-evaluation of the chemical composition of avian urinary excreta // J Ornithol. 2019. https://doi.org/10.1007/s10336-019-01692-5

49. Dicks L.M.T., Geldenhuys J., Mikkelsen L.S., Brandsborg E., Marcotte H. Our gut microbiota: a long walk to homeostasis // Benef. Microbes. 2018. 9(1):3-20. Doi: 10.3920/BM2017.0066

50. Egan A., Boda K., Verady G. Regulation of nitrogen metabolism and recycling. In: Control of Digestion and Metabolism in Ruminants. Edited by L.P.

Milligan, W.L. Grovum, and A. Dobson. Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall. 1986.

51. Elleway R.F., Sabine J.R., Nicholas D.J. Acetylene reduction by rumen microflora // Arch Mikrobiol. 1971. 76(4):277-91.

52. Fouhy F., Clooney A.G., Stanton C., Claesson M.J., Cotter P.D. 16S rRNA gene sequencing of mock microbial populations- impact of DNA extraction method, primer choice and sequencing platform// BMC Microbiol. 2016. 16(1): 123. Doi: 10.1186/s12866-016-0738-z

53. Granhall U., Ciszuk P. Nitrogen fixation in rumen contents indicated by the acetylene reduction test // J Gen Microbiol. 1971. 65(1): 91-93.

54. Green A.S., Ramsey J.J., Villaverde C., Asami D.K., Wei A., Fascetti A.J. Cats are able to adapt protein oxidation to protein intake provided their requirement for dietary protein is met // J. Nutr. 2008. 138:1053-1060. Doi: 10.1093/jn/138.6.1053

55. Hirakawa H. Coprophagy in leporids and other mammalian herbivores // Mammal. Rev. 2001. 31(1):61-80. Doi: 10.1046/j.1365-2907.2001.00079.x

56. Hoopen T.P., Finn R.D., Bongo L.A., Corre E., Fosso B., Meyer F., Mitchell A., Pelletier E., Pesole G., Santamaria M., Willassen N.P., Cochrane G. The metagenomic data life-cycle: standards and best practices // Gigascience. 2017. 6(8): 1-11. Doi: 10.1093/gigascience/gix047

57. Houpt T.R. Utilization of blood urea in ruminants // Am. J. Physiol. 1959. 197:115-120.

58. Houpt T.R., Houpt K.A. Transfer of urea nitrogen across the rumen wall // Am. J. Physiol. 1968. 214:1296-1303.

59. Hu Y., Sanders J.G., Lukasik P., D'Amelio C.L., Millar J.S., Vann D.R., Lan Y., Newton J.A., Schotanus M., Kronauer D.J.C., Pierce N.E., Moreau C.S., Wertz J.T., Engel P., Russell J.A. Herbivorous turtle ants obtain essential nutrients from a conserved nitrogen-recycling gut microbiome // Nat Commun. 2018. 9(1):964. Doi: 10.1038/s41467-018-03357-y

60. Hume I., Rubsamen R., Engelhardt W. Nitrogen metabolism and urea kinetics in the rock hyrax (Procavia habessinica) // J. Comp. Physiol. 1980. 138:307-314.

61. Igai K., Itakura M., Nishijima S., Tsurumaru H., Suda W., Tsutaya T., Tomitsuka E., Tadokoro K., Baba J., Odani S., Natsuhara K., Morita A., Yoneda M., Greenhill A.R., Horwood P.F., Inoue J., Ohkuma M., Hongoh Y., Yamamoto T., Siba P.M., Hattori M., Minamisawa K., Umezaki M. Nitrogen fixation and nifH diversity in human gut microbiota // Sci Rep. 2016. 6:31942. Doi: 10.1038/srep31942

62. Israely, H., Choshniak I., Stevens C.E., Shkolnik A. Energy digestion and nitrogen economy of the domesticated donkey (Equus asinus asinus) in relation to food quality // J. Arid Environ. 1989. 17:97-101.

63. Jones M.B., Highlander S.K., Anderson E.L., Li W., Dayrit M., Klitgord N., Fabani M.M., Seguritan V., Green J., Pride D.T., Yooseph S., Biggs W., Nelson K.E., Venter J.C. Library preparation methodology can influence genomic and

functional predictions in human microbiome research // Proc Natl Acad Sci USA. 2015. 112(45): 14024-14029. Doi: 10.1073/pnas.1519288112

64. Karasov W.H., Petrossian E., Rosenberg L., Diamond J.M. How do food passage rate and assimilation differ between herbivorous lizards and nonruminant mammals // J Comp Physiol B. 1986. 156:599-609. Doi: 10.1007/BF00691047

65. Kennedy P., Hume I. Recycling of urea nitrogen to the gut of the tammar wallaby (Macropus eugenii) // Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 1978. 61:117121.

66. Kiran D., Mutsvangwa T. Effects of partial ruminal defaunation on urea-nitrogen recycling, nitrogen metabolism, and microbial nitrogen supply in growing lambs fed low or high dietary crude protein concentrations // J Anim Sci. 2010. 88(3):1034-47. Doi: 10.2527/jas.2009-2218

67. Kizilova A.K., Kravchenko I.K. Diversity of diazotrophic gut inhabitants of pikas (Ochotonidae) revealed by PCR-DGGE analysis // Mikrobiologiia. 2014. 83(3):366-74.

68. Koper T.E., El-Sheikh A.F., Norton J.M., Klotz M.G. Urease-encoding genes in ammonia-oxidizing bacteria // Appl Environ Microbiol. 2004. 70(4):2342-2348. Doi: 10.1128/AEM.70.4.2342-2348.2004

69. Kuznetsova T.A., Vechersky M.V., Golichenkov M.V., Kostina N.V., Umarov M.M., Naumova E.I. Nitrogen-fixing microorganisms in the hare gastrointestinal tract // Dokl Biol Sci. 2014. 456(1):203-205. Doi: 10.1134/S0012496614030119

70. Li Pun H.H., Satter L.D. Nitrogen fixation in ruminants // J Anim Sci. 1975. 41:1161-1163. Doi: 10.2527/jas1975.4141161x

71. Ludden P.A., Harmon D.L., Huntington G.B., Larson B.T., Axe D.E. Influence of the novel urease inhibitor N-(n-butyl) thiophosphoric triamide on ruminant nitrogen metabolism: II. Ruminal nitrogen metabolism, diet digestibility, and nitrogen balance in lambs // J Anim Sci. 2000. 78(1): 188-198. Doi: 10.1023/A: 1005116911788

72. Malan-Muller S., Valles-Colomer M., Raes J., Lowry C.A., Seedat S., Hemmings S.M.J. The gut microbiome and mental health: implications for anxiety-and trauma-related disorders // OMICS. 2018. 22(2):90-107. Doi: 10.1089/omi.2017.0077

73. Manaeva E.S., Naumova E.I., Kostina N.V., Umarov M.M., Dobrovol'skaia T.G. [Functional features of microbial communities in the digestive tract of field voles (Microtus rossiaemeridionalis and Clethrionomys glareolus)]. Izv Akad Nauk Ser Biol. 2012. 4:415-419.

74. Marini J.C., Van Amburgh M.E. Nitrogen metabolism and recycling in Holstein heifers // J Anim Sci. 2003. 81(2):545-552. Doi: 10.2527/2003.812545x

75. Marini J.C., Klein J.D., Sands J.M., Van Amburgh M.E. Effect of nitrogen intake on nitrogen recycling and urea transporter abundance in lambs // J Anim Sci. 2004. 82(4): 1157-1164. Doi: 10.2527/2004.8241157x

76. Mead G.C., Adams B.W. Some observations on caecal microflora of the chick during the first two weeks of life // Br. Poult. Sci. 1975. 16:169-176.

77. Michnova E., Boda K., Tomas J., Havassy I. Urease activity in the contents and tissues of the sheep, pig and chicken gastrointestinal apparatus // Physiol. Bohem. 1979. 28(6):545-550.

78. Minami T., Anda M., Mitsui H., Sugawara M., Kaneko T., Sato S., Ikeda S., Okubo T., Tsurumaru H., Minamisawa K. Metagenomic Analysis Revealed Methylamine and Ureide Utilization of Soybean-Associated Methylobacterium // Microbes Environ. 2016. 31(3):268-278. Doi: 10.1264/jsme2.ME16035

79. Mobley H.L., Hausinger R.P. Microbial ureases: significance, regulation, and molecular characterization // Microbiol Rev. 1989. 53(1):85-108.

80. Mobley H.L., Island M.D., Hausinger R.P. Molecular biology of microbial urease // Microbiol Rev. 1995. 59(3):451-480.

81. Mortensen A., Tindall A. Caecal decomposition of uric acid in captive and free-ranging willow ptarmigan (Lagopus lago lagopus) // Acta Physiol. Scand. 1981. 111:129-133. Doi: 10.1111/j.1748-1716.1981.tb06923.x

82. Mousa H.M., Ali K.E., Hume I.D. Effects of water deprivation on urea metabolism in camels, desert sheep and desert goats fed dry desert grass // Comp. Biochem. Physiol. A Comp Physiol. 1983. 74(3):715-720. Doi: 10.1016/0300-9629(83)90574-1

83. Naumova E.I., Ushakova N.A., Meshcherskii I.G., Kostina N.V., Umarov M.M. [Nitrogen fixation--new fenomenon in rodent feeding]. Izv Akad Nauk Ser Biol. 2000 May-Jun;(3):329-31.

84. Ngara T.R., Zhang H. Recent Advances in function-based metagenomic screening // Genomics Proteomics Bioinformatics. 2018. 16(6):405—415. Doi: 10.1016/j.gpb.2018.01.002

85. Oshiki M., Araki M., Hirakata Y., Hatamoto M., Yamaguchi T., Araki N. Ureolytic Prokaryotes in Soil: Community Abundance and Diversity // Microbes Environ. 2018. 33(2):230-233. Doi: 10.1264/jsme2.ME17188

86. Poussin C., Sierro N., Boué S., Battey J. Scotti E., Beicastro V., Peitsch M.C., Ivanov N.V., Hoeng J. Interrogating the microbiome: experimental and computational considerations in support of study reproducibility // Drug Discov. Today. 2018. 23(9): 1644-1657. Doi: 10.1016/j.drudis.2018.06.005

87. Prior R.L., Hintz H.F., Lowe J.E., Visek W.J. Urea recycling and metabolism of ponies // J. Anim. Sci. 1974. 38:565-571.

88. Ranjan R., Rani A., Metwally A., McGee H.S., Perkins D.L. Analysis of the microbiome: Advantages of whole genome shotgun versus 16S amplicon sequencing // Biochem Biophys Res Commun. 2016. 469(4):967-977. Doi: 10.1016/j.bbrc.2015.12.083

89. Regoeczi E., Irons L., Koj A., Mcfarlane A.S. Isotopic studies of urea metabolism in rabbits // Biochem. J. 1965. 95:521-535.

90. Rey M., Enjalbert F., Monteils V. Establishment of ruminal bacterial community in dairy calves from birth to weaning is sequential // J. Dairy Sci. 2012. 95(3):1500-1512. Doi: 10.3168/jds.2011-4902

91. Richards P. Protein metabolism in uraemia // Nephron. 1975. 14(2): 134-152.

92. Salway J.G. The Krebs uric acid cycle: a forgotten Krebs cycle // Trends Biochem Sci. 2018. 43(11):847-849. Doi: 10.1016/j.tibs.2018.04.012

93. Sapountzis P., de Verges J., Rousk K., Cilliers M., Vorster B.J., Poulsen M. Potential for nitrogen fixation in the fungus-growing termite symbiosis // Front Microbiol. 2016. 7:1993. Doi: 10.3389/fmicb.2016.01993

94. Sinclair L., Osman O.A., Bertilsson S., Eiler A. Microbial community composition and diversity via 16S rRNA gene amplicons: evaluating the Illumina platform // PLoS One. 2015. 10(2):e0116955. Doi: 10.1371/journal.pone.0116955

95. Shirley R. Animal feeding and nutrition. Academic Press, INC. 1986.

96. Singer M.A. Do mammals, birds, reptiles and fish have similar nitrogen conserving systems? // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2003. 134(4):543-558. Doi: 10.1016/s1096-4959(03)00027-7

97. Smith J.D. Symbiotic micro-organisms of aphids and fixation of atmospheric nitrogen // Nature. 1948. 162(4128):930.

98. Stevens C.E., Hume I.D. Contributions of microbes in vertebrate gastrointestinal tract to production and conservation of nutrients // Physiological reviews. 1998. 78(2):393-427. Doi: 10.1152/physrev.1998.78.2.393

99. Stevens C.E., Hume I.D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. New York: Cambridge Univ. Press. 1995.

100. Suchodolski J., Camacho J., Steiner J. Analysis of bacterial diversity in the canine duodenum, jejunum, ileum, and colon by comparative 16S rRNA gene

analysis // FEMS Microbiol. Ecol. 2008. 66(3):567-578. Doi: 10.1111/j.1574-6941.2008.00521.x

101. Titgemeyer E., Spivey K., Parr S., Brake D., Jones M. Relationship of whole body nitrogen utilization to urea kinetics in growing steers // J. Anim. Sci. 2012. 90(10):3515-3526. Doi: 10.2527/jas.2011-4621

102. Vital M., Karch A., Pieper D.H. Colonic butyrate-producing communities in humans: an overview using omics data // mSystems. 2017. 2(6). Doi: 10.1128/mSystems.00130-17

103. Wiebler J.M., Kohl K.D., Lee R.E. Jr., Costanzo J.P. Urea hydrolysis by gut bacteria in a hibernating frog: evidence for urea-nitrogen recycling in Amphibia // Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 2018. 285(1878):20180241. Doi: 10.1098/rspb.2018.0241

104. Wilson J.J., Brandon-Mong G.J., Gan H.M., Sing K.W. High-throughput terrestrial biodiversity assessments: mitochondrial metabarcoding, metagenomics or metatranscriptomics? // Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal. 2019. 30(1):60-67. Doi: 10.1080/24701394.2018

105. Wu G. Amino Acids: Biochemistry and Nutrition. CRC Press. 2013. Doi: 10.1201/b14661

106. Xue Z., Kable M.E., Marco M.L. Impact of DNA Sequencing and Analysis Methods on 16S rRNA Gene Bacterial Community Analysis of Dairy Products // mSphere. 2018. 3(5). Doi: 10.1128/mSphere.00410-18.

107. Yahav S., Choshniak I. Energy metabolism and nitrogen balance in the fat jird (Meriones crassus) and Levant vole (Microtus guentheri) // J. Arid Environ. 1989. 16:315-322.

108. Yan J., Charles J.F. Gut microbiome and bone: to build, destroy, or both? // Curr. Osteoporos Rep. 2017.15(4):376-384. Doi: 10.1007/s11914-017-0382-z

109. Zaheer R., Noyes N., Ortega Polo R., Cook S.R., Marinier E., Van Domselaar G., Belk K.E., Morley P.S., McAllister T.A. Impact of sequencing depth on the characterization of the microbiome and resistome // Sci Rep. 2018. 8(1):5890. Doi: 10.1038/s41598-018-24280-8