Генерация активированных кислородных метаболитов и антиоксидантные ферменты в гемолимфе насекомых отряда Lepidoptera при бактериозах, вызываемых бактериями Bacillus thuringiensis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.09, кандидат биологических наук Хвощевская, Марина Федоровна

• Хвощевская, Марина Федоровна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хвощевская, Марина Федоровна

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Классификация гемоцитов.

1.2. Фагоцитоз.

1.3. Инкапсуляция и гранулообразование.

1.4. Меланизация капсулы.

1.5. Образование активированных кислородных метаболитов в гемоцитах.

1.5.1. Строение и свойства АКМ.

1.5.2. Химические свойства АКМ.

1.5.3. Источники АКМ в организме.

1.6. Регуляция цитотоксических механизмов.

1.7. Изменения гемоцитов при патогенезе.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Исследуемые насекомые.

2.2. Заражение насекомых.

2.3. Сбор гемолимфы и получение гемоцитов.

2.4. Определение ферментативной активности в гемоцитах.

2.5. Определение продукции активированных кислородных метаболитов в гемоцитах.

2.6. Ингибиторы.

2.7. Определение влияния СОД на восстановление НСТ в супернатанте разрушенных гемоцитов.

2.8. Определение активности СОД в гемоцитах и лимфе.

2.9. Определение активности ФО в лимфе.

Глава 3. Продукция активированных кислородных метаболитов в гемоцитах насекомых отряда Lepidoptera.

3.1. Люминол-зависимая хемилюминесценция.

3.2. Метод восстановления нитросинего тетразолия.

3.2.1. Восстановление НСТ в гемоцитах насекомых отряда Lepidoptera.

3.2.2. Влияние активаторов фагоцитоза на восстановление НСТ в гемоцитах насекомых отряда Lepidoptera.

3.2.3. Влияние ингибиторов на восстановление НСТ в гемоцитах насекомых представителей отряда Lepidoptera.

ГЛАВА 4. Ферментативная активность в гемоцитах насекомых.

4.1. Фенолоксидаза.

4.2. Пероксидаза.

ГЛАВА 5. Изменение продукции АКМ и антиоксидантов в гемоцитах и лимфе при бактериозах.

5.1 Изменение продукции АКМ и антиоксидантов в гемоцитах и лимфе при инъекции бактерий в гемоцель насекомых

5.2. Изменение продукции АКМ и антиоксидантов в гемоцитах и лимфе

G.mellonella в течение бактериоза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генерация активированных кислородных метаболитов и антиоксидантные ферменты в гемолимфе насекомых отряда Lepidoptera при бактериозах, вызываемых бактериями Bacillus thuringiensis»

К настоящему времени известно, что беспозвоночные, в том числе и насекомые, обладают неадаптивным иммунитетом, для которого характерна низкая специфичность, отсутствие иммунологической памяти и индуцибельных высокоспецифичных иммуноглобулинов. Следует при этом отметить высокую эффективность систем, участвующих в формировании иммунного ответа, в результате которого происходит элиминация чужеродных объектов, в том числе и патогенных, из организма насекомого (Geiger et al.,1977; Ratcliffe et al, 1982; Chino, 1985; Lackie, 1988; Sass, 1994).

Наиболее существенной составляющей в иммунном ответе насекомых является клеточная система, представляющая собой популяцию свободно циркулирующих клеток крови (гемоцитов), перикардиальных клеток и гемопоэтической ткани. Клетки гемолимфы первыми взаимодействуют с проникшими в гемоцель чужеродными объектами и инициируют запуск ряда механизмов иммунитета. Клеточный иммунитет насекомых включает в себя фагоцитоз, инкапсуляцию и гранулообразование, которые могут сопровождаться меланизацией (Ratcliffe et al.,1984; Leonard et al., 1985). Процесс меланогенеза у насекомых представлен каскадными ферментативными реакциями (профенолоксидазный каскад). На первом этапе происходит активация фенолоксидаз (О - оксидоредуктаз), которые являются ключевыми ферментами в меланогенезе и могут также участвовать в механизмах иммунораспознавания (Nappi et al., 1992a,b; 1993). В процессе образования меланина генерируются интермедианты, которые обладают цитотоксической активностью и наряду с другими активированными кислородными метаболитами могут принимать участие в защите насекомых от проникших в них чужеродных организмов (Nappi and Vass, 1993). Активированные кислородные метаболиты (02 НО , Н202, RO ) (АКМ) обладают широким спектром биологического действия. Они могут взаимодействовать с ДНК, белками, липидами, приводя к структурным и, как следствие, к функциональным изменениям последних. В связи с этим АКМ участвуют в различных физиологических процессах организма, в том числе в многочисленных иммунных реакциях. К настоящему времени существует большое количество работ, где рассматривается участие АКМ в иммунных реакциях позвоночных. В первую очередь следует отметить их цитотоксическое действие в фагоцитах позвоночных. Это обусловлено тем, что у активно фагоцитирующего нейтрофила резко возрастает потребление кислорода и соответственно продукция АКМ, которые обладают цитотоксическим действием (Fridovich, 1979; Дугласе, Куи, 1983; Маянский и др., 1987). Подобный процесс называют метаболическим, или респираторным, взрывом. Исследование этого процесса у насекомых ограничивается единичными работами. Имеется ряд исследований, в которых обсуждаются некоторые высокореакционные продукты меланогенеза, которые могут опосредовать киллерный механизм при инкапсуляции (Nappi et al., 1995, Nappi, Ottaviani, 2000; Nappi et al., 2000). Существуют единичные работы, в которых показано усиление перекисного окисление липидов кишечника насекомых при вирозах и бактериозах (Штерншис, 1995). Практически неизученным остается вопрос об изменении соотношения АКМ-антиоксиданты при различных патогенезах у насекомых, в том числе и при бактериозах. Антиоксиданты, в частности супероксиддисмутаза и пероксидаза, имеют ключевое значение для защиты организма от окислительного стресса, вызываемого различными заболеваниями. Имеющиеся работы по изучению антиоксидантов у насекомых ограничиваются изучением распределения активности антиоксидантов по тканям насекомого и изучением изменений активности антиоксидантов при инвазированнии насекомых паразитическими осами (Ahmad et al., 1988; Lee et al., 1981; Felton, Summers 1995).

В связи с этим целью данной работы является изучение генерации АКМ и антиоксидантных ферментов в гемолимфе насекомых при бактериозах, вызываемых кристаллообразующими бактериями Bacillus thuringiensis. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить генерацию активированных кислородных метаболитов в гемоцитах насекомых.

2. Изучить влияние бактериозов на генерацию АКМ в гемоцитах насекомых.

3. Изучить фенолоксидазную активность в гемоцитах и лимфе у нативных насекомых и при бактериозах.

4. Изучить характер распределения пероксидазы и супероксиддисмутазы в гемоцитах и лимфе у нативных насекомых и при бактериозах.

Научная новизна. Впервые при исследовании генерации кислородных радикалов в гемоцитах насекомых представителей отряда Lepidoptera выявлено, что активация продукции АКМ происходит в результате адгезии гемоцитов и в процессе фагоцитоза. Продукция АКМ в гемоцитах осуществляется в результате деятельности ферментов дыхательной цепи и каскада реакций меланогенеза.

Установлено, что характер изменений в продукции АКМ и активности СОД зависит от способа заражения. В частности, при инъецировании бактерий в гемоцель насекомого происходит активация гемоцитов за счет увеличения продукции АКМ, этот процесс сопровождается снижением активности супероксиддисмутазы.

При пероральном заражении насекомых бактериями происходит угнетение продукции АКМ в гемолимфе и повышение активности супероксиддисмутазы.

Научно-практическая ценность. Разработаны подходы для оценки состояния клеточного иммунитета как интегральной характеристики состояния организма насекомого. Данная оценка может позволить проводить прогноз динамики численности насекомых в природных популяциях, что может явиться составной частью интегрированных методов регуляции и контроля численности насекомых вредителей леса и сельского хозяйства.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территории" (Курган, март 1998), на VI Европейском энтомологическом конгрессе (Чехия, август 1998), на Международном симпозиуме "Сохранение и защита горных лесов" (Ош, октябрь 1999), на отчетных сессиях ИСиЭЖ СО РАН (апрель, 1998, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста; состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 1 таблицей. Список литературы включает 144 работы, из них 116 на иностранных языках.

Заключение диссертации по теме «Энтомология», Хвощевская, Марина Федоровна

Выводы

1. В гемоцитах личинок G.mellonella, L.dispar, D.sibiricus, M.brassicae,

A.crataegi продуцируются активированные кислородные метаболиты, способные восстанавливать НСТ. В гемоцитах личинок A.urticae НСТ не восстанавливается.

2. У личинок насекомых из отряда Lepidoptera активация продукции АКМ происходит в результате адгезии гемоцитов и в процессе фагоцитоза.

3. Продукция АЬСМ в гемоцитах личинок насекомых из отряда Lepidoptera осуществляется в результате деятельности ферментов дыхательной цепи и каскада реакций меланогенеза.

4. Фенолоксидаза и пероксидаза регистрируются в гемоцитах у всех исследованных видов Lepidoptera. Характер распределения ферментативной активности по типам гемоцитов является общим для всех исследованных видов насекомых.

5. При попадании бактериальных клеток в гемоцель насекомых происходит активация продукции АКМ в гемоцитах и подавление активности супероксидисмутазы в гемоцитах и лимфе инъецированных личинок.

6. При кишечных бактериозах происходит подавление продукции АКМ в гемоцитах и увеличение активности СОД. Данное снижение продукции АКМ и количества ФО-положительных гемоцитов зависело от вирулентности штамма

B.thuringiensis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Во всех аэробных клетках, в том числе и гемоцитах насекомых, в процессе дыхания и деятельности окислительных ферментов генерируются активированные кислородные метаболиты (АКМ). Так же АКМ могут генерироваться в результате активации профенолоксидазного каскада (Nappi et al, 1995; Nappi and Ottaviani, 2000). Уровень продукции АКМ зависит от интенсивности деятельности ферментов, которая определяется процессами, протекающими в данной клетке. При использовании метода восстановления НСТ до формазана мы зарегистрировали продукцию АКМ в плазматоцитах, гранулоцитах и прогемоцитах всех исследуемых нами видов насекомых, кроме A.urticae. Нельзя утверждать, что продукция АКМ отсутствует в сферулоцитах и эноцитоидах, но, по-видимому, уровень этой продукции намного ниже, чем в прогемоцитах, плазматоцитах и гранулоцитах, поэтому гистохимическими методами данную продукцию невозможно зарегистрировать.

С использованием ингибиторов мы установили, что продукция АКМ в гемоцитах осуществляется в результате деятельности ферментов дыхательной цепи и каскада реакций меланогенеза. Образование высокореакционных АКМ в процессе меланогенеза обсуждалось в ряде работ (Nappi and Vass 1993; Nappi al, 1995; Nappi and Ottaviani, 2000), но экспериментального обоснования приведено не было. Нам впервые удалось установить, что ингибитор фенолоксидазы, ключевого фермента меланогенеза, подавляет образование АКМ в гемоцитах G.mellonella. В дальнейшем Слепневой с соавт. (Slepneva et al, 1999) была проведена работа, в которой было показано, что в гемолимфе сибирского шелкопряда в процессе меланогенеза генерируются АКМ.

В гемоцитах одних видов насекомых могут продуцироваться вещества, способные восстанавливать НСТ, а в гемоцитах других видов такие механизмы отсутствуют. Механизмы активации продукции АКМ в гемоцитах насекомых различаются между отрядами. Так, у изученных нами представителей Lepidoptera активация продукции АКМ происходит в результате адгезии гемоцитов и в процессе фагоцитоза. В тоже время в гемоцитах сверчка Gryllus bimaculatus (Orthpotera) активация продукции АКМ происходит только при адгезии гемоцитов (Glupov et al., 2001). В гемоцитах представителя отряда Blattoptera таракана Blaberus discoidalis активация продукции АКМ происходит во время фагоцитоза (Whitten and Ratcliffe, 1999).

Вероятно, цитотоксические механизмы, опосредуемые АКМ, у изученных нами представителей отряда Lepidoptera, осуществляются как в процессе фагоцитоза, так и в процессе инкапсуляции, основой которого является адгезия гемоцитов к поверхности чужеродного агента (Ratcliffe et al., 1982; Gotz, 1986; Takahashi, Enomoto,1995).

Наличие связи между продукцией АКМ в гемоцитах и каскадом реакций меланогенеза косвенным образом подтверждает тот факт, что количество гемоцитов, содержащих фенолоксидазу и АКМ, изменяется одинаково при бактериальных заболеваниях насекомых. Так, при заражении через гемоцель происходит увеличение количества ФО-положительных гемоцитов и гемоцитов, в которых происходит продукция АКМ. При пероральном заражении наблюдается обратная картина, причем изменения в количестве гемоцитов с данными ферментными маркерами совпадают даже по времени. Похожие результаты были получены при исследовании паразитозов у насекомых (Whitten et al., 2001). Так, при заражении клопа Rhodnius prolixus трипаносомами Trypanosoma rangeli одновременно увеличивается и продукция супероксиданиона и активность ФО в гемолимфе зараженных насекомых, причем исследователи отмечают, что это увеличение имеет обратную корреляцию с выживаемостью трипаносом в гемолимфе хозяина (Whitten et al., 2001).

Увеличение количества гемоцитов с фенолоксидазной активностью и продукцией АКМ при заражении через гемоцель происходит, по-видимому, вследствие того, что нарушение покровов или проникновение патогена непосредственно в гемоцель насекомого ведет к резкому активированию ряда ферментных систем организма, в том числе в свободно циркулирующих клетках гемолимфы. При проникновении в гемоцель насекомого бактерий начинаются процессы фагоцитоза и гранулообразования, в которые вовлекаются плазматоциты и гранулоциты. Увеличение продукции АКМ и активности ФО в гемоцитах позволяет предположить, что ферментные системы, генерирующие АКМ и продукты меланогенеза, принимают участие в цитотоксичеких реакция при фагоцитозе и гранулообразовании.

В силу того, что АКМ не обладают специфичностью, то бесконтрольная продукция подобных соединений может привести к гибели собственных клеток и, в конечном счете, насекомого. Поэтому практически у всех живых организмов, в том числе и насекомых, формируется так называемая антиоксидантная система, которая представлена различными ферментативными и неферментативными соединениями (Fridovich, 1979; Меныцикова и др., 1997). Ключевыми антиоксидантными ферментами являются супероксиддисмутаза и пероксидаза. Мы исследовали характер изменений СОД и пероксидазы при бактериозах. Было установлено, что снижение активности СОД в гемоцитах и лимфе инъецированных Bt личинок совпадает по времени с повышением количества НСТ-положительных гемоцитов и является, вероятно, необходимым условием осуществления микробицидной активности гемоцитов.

Если при попадании бактерий в гемоцель происходит непосредственный контакт гемоцитов с чужеродными объектами, то при пероральном заражении гемоциты и лимфа подвергаются опосредованному воздействию метаболитов бактерий, по крайней мере, до проникновения бактерий в гемоцель в результате разрушения кишечника. Снижение клеток с фенолоксидазной активностью при пероральном заражении личинок, вероятно, связано с определенными дисфункциями кишечника. Не исключено, что это может привести к выработке или активированию ряда ингибиторов протеаз, которые в свою очередь могут ингибировать ограниченный протеолиз профенолоксидазы, т.е. инактивировать весь ферментативный каскад, связанный с активированием фенолоксидазы. Следует отметить, что уровень понижения количества ФО-положительных гемоцитов и гемоцитов, в которых генерируются АКМ, зависел от вирулентности штамма В. thuringiensis. При заражении высоковирулентным штаммом отмечалось практически полное исчезновение ФО-положительных клеток, в то время как при заражении не вирулентным штаммом ФО-положительные гемоциты регистрировались, хотя их количество было ниже контрольных в 3 раза. Подобное соотношение наблюдалось и в гемоцитах, продуцирующих АКМ.

У позвоночных животных повышается уровень ферментативных антиоксидантов, в том числе и СОД, при различных патологиях (Bryan et al., 1992; Dhaunsi et al., 1993). Этот факт напрямую связывают с устойчивостью к окислительному поражению. Как воздействие эндотоксина, так и воздействие вторичных метаболитов вызывает увеличение активности СОД в гемоцитах зараженных личинок, это повышение сопровождается снижением количества гемоцитов, генерирующих АКМ. По-видимому, это следует рассматривать как защиту гемоцитов личинок от окислительного стресса, вызванного повреждением организма личинок эндотоксинами Bt. Следует отметить, что воздействие высокопатогенного штамма В. thuringiensis приводит к значительно большему увеличению активности СОД, чем в случае воздействия непатогенного штамма 280.

Трудно интерпретировать отсутствие изменений в количестве пероксидазоположительных гемоцитов при бактериозах. Следует отметить, что при изучении воздействия на организм насекомого растений, содержащих

87 высокое количество прооксидантов, также отмечалось отсутствие изменений активности пероксидазы (Pritsos et al., 1990; Kim et al., 1997). Исследователи объясняют этот факт тем, что конституциональный уровень пероксидазы достаточно высок у всех групп насекомых (контрольных и опытных) и не изменяется в ответ на воздействие.

Продукция кислородных радикалов и ферментативные антиоксиданты являются перспективными показателями состояния организма насекомых в силу того, что они изменяются в ответ на патологическое воздействие, и этот же факт указывает на их важную роль в иммунных реакциях гемоцитов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хвощевская, Марина Федоровна, 2003 год

1. Ado А.Д. Патофизиология фагоцитов. М.: Медгиз. 1961. 295 с.

2. Албертс Б., Брей Д., Лъис Дж., Рэфф М.,Роберте К, Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М.: "Мир". 1987. Т. 3. С. 107-110.

3. Азизбекян P.P., Смирнова Т.А. Споро- и кристаллообразование у Bacillus thuringiensis //Успехи микробиологии. 1988. № 22. С. 81-108.

4. Бартникайте И.С., Крищюнене Р. А. Морфология и функциональная активность клеток гемолимфы колорадского жука в онтогегнезе // Тр. АН ЛитССР. Сер. биол. 1986. Т. 1. № 93. С. 42.

5. Бахвалов С.А., Бахвалова В.К, Ларионов Г.В. О поликариоцитах в гемолимфе гусениц непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) при ядерном полиэдрозе // Изв. СО АН СССР., сер. биол. наук. 1982. Т. 2. С. 125-129.

6. Бахвалов С.А., Бахвалова В.Н., Ларионов Г.В. Ядерный полиэдроз у непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.): Развитие вирусной инфекции в гемоцитах и динамика изменения гемограммы // Изв. СО АН СССР., сер. биол. наук. 1981. Т. 31. С. 132-140.

7. Бурцева Л.И. Биологические особенности бактерий Bacillus thuringiensis // Дис. канд. биол. наук. Л. 1970. 115 С.

8. Бурцева Л.И., Скворцова М.М., Шашшна Н.И. О выборе штаммов Вас. thuringiensis var. galleriae для производства энтобактерина // Сиб. вестник с.х.науки. 1973. Т. 2. С. 33.

9. Глупое В.В. Фенолоксидазная и агглютинирующая активности гемолимфыхлопковой совки Heliothis armigera // Сибирский биол. журн. 1993. Т. 1. С. 3-7.

10. Глупое В.В., Бахвалов С.А. Механизмы резистентности насекомых при патогенезе // Успехи совр, биол. 1998. Т. 118. Вып. 4. С. 466 482.

11. Глупое В.В., Хвощевская М.Ф., Щепеткин И.А., Крюкова Н.А. Морфофункциональная структура популяции гемоцитов Galleria mellonella при инфекционном процессе // Известия РАН, сер.биол. 1997. № 6. С. 645-653.

12. Голованова О.В., Глупое В.В., Хвощевская М.Ф. Агглютинины гемолимфы капустной совки Mamestra brassicae(L.) 1758 (Lepidoptera:Noctuidae)// Известия РАН, сер.биол. 1998. № 6. С.

13. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1982. 1120 с.

14. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М: "Мир". 1991. 544 с.

15. Дуглас С.Д., Куи П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике. М.:

16. Медицина". 1983. 110 с. Заполъских О.В. Морфологический и цитохимический анализ клетокгемолимфы рабочей пчелы // Цитология. 1976. Т. 18. № 8. С. 956-963. Зенков Н.К., Панкин В.З., Менъщикова Е.Б. Окислительный стресс. М.: МАИК

17. Наука/Итерпериодика". 2001. 342 с. Зенков Н.К., Менъщикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи соврем, биологии. 1993. Т. 113. Вып. 3. С. 286-289.

18. Королев Н.П. Функции лектинов в клетках // Итоги науки и техники // Сер.

19. Успехи совр. биол. 1997. Т. 117 Вып. 2. С. 155-171. Пирс Э. Гистохимия. М: Издательство иностранной литературы. 1962. 929 с.

20. Роговин В.В., Бут П.Г. Цитохимические доказательства эндогенной генерации перекиси водорода в нейтрофилах мазков крови человека // Изв.АН СССР. Сер.биол. 1994. Т. 5. С. 833.

21. Роговин В.В., Мигдал Т.П., Подовинникова Е.А., Ломоносов В. А. Цитохимический тест для определения активности системы пероксидаза эндогенная перекись водорода в нейтрофилах крови человека // Изв.АН СССР. Сер.биол. 1976. Т. 3. С. 453.

22. Тамарина Н.А. Техническая энтомология новая отрасль прикладной энтомологии // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Энтомология. 1987. Т. 7. 248 с.

23. Хрусцелевская Н.М. Изменение форменных элементов в гемолимфе блох после контакта с чумными микробами. Состояние и перспективы профилактики чумы // Тез. докл. всесоюзн. конф. Саратов. 1978. С.44-46.

24. Штерншис М.В. Повышение эффективности микробиологической борьбы с вредными насекомыми. Новосибирск: Новосиб. гос. аграр. ун-т. 1995. 194 с.

25. Abe R., Shimosegawa Т., Moriizumi S. Lipopolysaccharide induces manganese superoxide dismutase in the rat pancreas: its role in caerulein pancreatitis // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1995. V. 217. P. 1216-1222.

26. Ahmad S., Duval D.L., Weinhold L.C., Pardini R.S. Cabbage looper antioxodant enzymes: tissue specificity // J. Insect Biochem. 1991. V. 21. № 5. P. 563572.

27. Amirante G.A., Basso V. Le lectine come recettori di membrana negli emociti di Sguilla mantis L. (Crustacea, Stomatopoda). // Biol. Zool. 1984. V. 51. P. 3.

28. Amirante G.A., Mazzalai F.G. Synthesis and localization of hemoagglutinins in hemocytes of the cockroach Leucophaea maderae L. // Dev.Comp.Immunol. 1978. V. 2. P. 735.

29. Anderson R.S., Chain B.M. Macrophage function in insect. In: Hemocytic and humoral immunity in arthropods. Ed. A.P. Gupta. New York: John Wiley and Sons. 1986. P. 77-88.

30. Anderson R.S., Holmes В., Good R.A. Comparative biochemistry of phagocytizing insect hemocytes // Сотр. Biochem. Physiol. 1973. V. 46B. P. 595.

31. Anneren G., Bjorksten B. Low superoxide levels in blood phagocytic cells in Down's syndrome // Acta Pediatr. Scand. 1984. V. 73. P. 345-348.

32. Arakawa T. Possible involvement of an enzymatic system for superoxide generation in lepidopteran larvae haemolymph // Arch.Insect Biochem. Physiol. 1995a. V. 29. P. 281.

33. Arakawa T. Superoxide generation in vitro in lepidopteran larval haemolymph // J.Insect Physiol. 1994. V. 40. P. 165.

34. Arakawa T. Superoxide generative reaction in insect haemolymph and its mimic model system with surfactants in vitro // Insect Biochem.Molec.Biol. 1995b. V. 25. P. 247.

35. Ashida M., Yamazaki H.I. Biochemistry of the phenoloxidase system in insects: with special reference to its activation. In: Molting and Metamorphosis. Ed. Ohnishi E., Ishizaki H. Japan Sci. Soc. Press, Tokyo; Springer Verlag. Berlin. 1990. P. 239.

36. Babior В. M., Kipnes R. M. and Curnutte J.T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent // J. Clin. Invest. 1973. V. 52. P. 741-44.

37. Barracco M.A., Loch C.T. Phagositosis of different biological particles by the plasmatocyte (immunocyte) of Panstrongylus megistus (Hemiptera: Reduviidae). // Proc. 18th Int. Congr. Entomol., Vancouver. 1988. P. 260.

38. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

39. Bradley R.S., Stuart G.S., Stiles В., Hapner K.D. Grasshopper haemagglutinin: immunochemical localization in haemocytes and investigation of opsonic properties // J. Insect Physiol. 1989. V. 35. P. 353.

40. Brehelin M., Hoffmann J.A. Phagocytosis of inert particles in Locusta migratoria and Galleria mellonella: study of ultrastructure and clearence // J.Insect Physiol. 1980.V. 26. P. 103.

41. Brehelin M., Zachary D. Insect haemocytes: new classification to rule out the controversy. Immunity in invertebrates. Ed. Brehelin. Berlin: Heidelberg: Springer Verlag. 1986. P. 36 - 48.

42. Brookman J.L., Ratcliffe N.A., Rowlly A.F. Studies on the activation of the prophenoloxidase system of insects by bacterial cell wall components. // Insect Biochem. 1989. V. 19. P. 47.

43. Bryan C.L., Campbell G.D., Lawrence R.A., Jenkins on S.G. Diphosphoryl lipid A protects rats from lethal hyperoxia // J. Lab. and Clin. Med. 1992. V. 120. P. 444-452.

44. Carter J.В., Green E.J. Hemocytes of baculovirus-infected Tipula paludosa larvae (Diptera: Tipidae) // J. Invertebr. Pathol. 1988. V. 52(3). P. 393-400.

45. Chain B.M., Anderson R.S. Observations on the cytochemistry of the hemocytes of an insect, Galleria mellonella II J. Histochem. Cytochem. 1983. V.31. P.601.

46. Cheng Т. C. Aspects of substrate utilization and energy requirement during molluscan phagocytosis // J. Invertebr. Pathol. 1976. V. 27. P. 263.

47. Chino H. Lipid transport; biochemistry of hemolymph lipophorin. In: Comprehensive biochemistry, physiology and pharmacology of insects. Ed. Kerkut G.A., Gilbert L.I. // Pergamon Press. Oxford, 1985. V. 10. P. 115.

48. Choi J, Roche Д Caquet T. Characterization of superoxide dismutase activity in Chironomus riparius Mg. (Diptera, Chironomidae) larvae—a potential biomarker // Comp Biochem Physiol. 1999. V. 124. № 1. P. 73-81.

49. Dhaunsi G.S., Singh I., Hanevold C.D. Peroxisomal participation in the cellular responce to the oxidative stress of endotoxin // Mol. and Cell. Biochem. 1993. V. 126. P. 25-35.

50. Dikalov S., Skatchkov M., Bassenge E. Quantification of peroxynitrite, superoxide, and peroxyl radicals by a new spin trap hydroxylamine 1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-oxo-piperidine // Biochem Biophys Res Commun. 1997b. V. 230. P. 54-57.

51. Dikkeboom R. TijnagelJ. M. G. H., Mulder E. C., van der Knaap W.P.W. Hemocytes of the pond snail, Lymnaea stagnalis generate reactive forms of oxygen // J. Invert. Path. 1987. V. 49. P. 321-31.

52. Dikkeboom R., van der Knaap W.P.W., van den Bovenkamp W., Tijnagel J.M.G.H., Bayne C.J. The production of toxic oxygen metabolites by hemocytes of different snail species // Dev. Сотр. Immunol. 1988. V. 12. P. 509.

53. Donovan E., Jons on B. Cellular toxicities and membrane binding characteristic of insectcidal crystal proteins from Bacillus thuringiensis toward cultured insect cells // J. Invert. Pathol. 1994. V. 63. № 2. P. 123-129.

54. Essawy M., Maleville A., Brehelin M. The hemocytes of Heliothis armigera: ultrastructure, functions and evolution in the course of larval development // J. Morphol. 1985. V. 186. P. 255.

55. Farmer K. Y, Sohal R.S. Relationship between superoxide anion radical generation and aging in the housefly, Musca domestica // Free Radic. Biol. Med. 1989. V. 7. № l.P. 23-29.

56. Felton G. W., Summers С. B. Antioxidant systems in insects // Arch. Insect Biohem. Physiol. 1995. V. 2. P. 187-97.

57. Fridovichl Superoxide dismutase // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 7761-7764.

58. Fridovich I. Superoxide radicals, superoxide dismutases and the aerobic lifestyle // Photochem. Photobiol. 1979. V. 28. P. 733-741.

59. Gagen S.J., Ratcliffe N.A. Studies on the in vivo cellular reactions and fate of injected bacteria in Galleria mellonella and Pieris brassicae larvae // J.Invertebr. Pathol. 1976. V. 28. P. 17-24.

60. Geiger J.C., Krolak J.M., Mills R.R. Possible involvement of cocroach haemocytes in the storage and synthesis of cuticle proteins // J. Insect Physiol. 1977. V. 23. P. 227.

61. Geng Ch., Dunn P.E. Plasmatocytes in larvae of Manduca sexta following injection of bacteria// Dev. Сотр. Immunol. 1989. V. 13. P. 17-23.

62. Gill S.S., Cowles E.A., Pietrantonio P.V. The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins // Annu. Rev. Entomol. 1992. V. 37. P. 661-636.

63. Goldstein I.J., Hughes R.C., Monsigny M., Osawa Т.,Sharon N. What should be called a lectin? //Nature. 1980. V. 285. P. 66.

64. Gotz P. Encapsulation in Arthropods. In: Immunity in Inverte-brates. Ed. Brehelin. Berlin; Heidelberg: Springer Verlag. 1986. P. 153 - 172.

65. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of absorption of injected horsradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. and Cytochem. 1966. V. 14. P. 291.

66. GuX., ZeraA.J. Developmental profiles and characteristics of haemolymph juvenile hormone esterase, general esterase and juvenile hormone binding in the cricket, Gryllus assimilis II Сотр. Biochem. Physiol. 1994. V. 107. P. 553560.

67. Guo X, Beerntsen ВТ, Zhao X, Christensen BM. Hemocyte alterations during melanotic encapsulation of Brugia malayi in the mosquito Armigeres subalbatus // J. Parasitol. 1995. V. 81. P. 200-7.

68. Gupta A.P. Hemocyte type: their structure, synonymies, interrelationschips and taxonomie significance. In: Insect hemocytes: development, form, functions and techniques. Ed. Gupta A.P. Cambridge University Press, Cambridge. London. 1979. P. 85 127.

69. Hanschke R., Mohrig W., Groth J. Einfluss von Injection particularer Suspensionen auf Sofort und Spatreaktionen der Haemozyten bei Larven der Grossen Wachmotte (Galleria mellonella) II Zool. Jb. Physiol. 1980. B. 84. S. 184.

70. Hinton A.C., Hammock B.D. Purification of juvenile hormone esterase and molecular cloning of the cDNA from Manduca sexta И Insect. Biochem. Mol. Biol. 2001. V. 32. P. 57-66.

71. Hoffmann D., Brehelin M., Hoffmann J. Modifications of the hemogram and of the hemocytopoietic tissue of male adults of Locusta migratoria (Orthoptera) after injection of Bacillus thuringiensis // J. Invertebr. Pathol. 1974. V. 24. P. 238 247.

72. Hynes R. O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion // Cell.1992. V. 69. P. 11-25.

73. Joanisse D.R., Storey K.B. Oxidative stress and antioxidants in overwintering larvae of cold-hardy goldenrod gall insects // J. Experiment. Biol. 1996. V. 199. P. 1483-1491.

74. Matha V., Grubhoffer L., Weyda F., Hermanov6 L. Detection of b 1,3-glucanspecific lectin on the surface of plasmatocytes, immunocompetent cells of great wax moth, Galleria mellonella L. // Cytobios. 1990. V. 64 P. 34 .

75. Marklund S.L. Expression extracellular superoxide dismutase by human cell lines // Bichem. J. 1990. V. 266. P. 213-219.

76. Marklund S.L. Extracellular superoxide dismutase in human tissues and human cell lines // J. Clin. Invest. 1984. V. 74. P. 1398-1403.

77. Marmaras V.J., Charambidis N.D., Lambropoulou M. Cellular defense machanisms in C.capitata: recognition and entrapment of E.coli by hemocytes // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1994. V. 26. P. 1-14.

78. Mazet I., Pendland J. and Boucias D. Comparative analysis of phagocytosis of fungal cells by insect hemocytes versus horse neutrophils // Dev. Сотр. Immunol. 1994. V. 18. P. 455-466.

79. McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein) // J. Biol. Chem. 1969. V. 244. P. 6049-6055.

80. Minnick M.F., Rupp R.A., Spence K.D. A bacterial-induced lectin which triggers hemocyte coagulation in Manduca sexta // Biochem. Biophys. Res. Commun.1986. V. 137. P. 729-735.

81. Nappi A. J., Vass E. Melanogenesis and the generation of cytotoxic molecules during insect cellular immune reactions // Pigment Cell Res. 1993. V. 3. P. 117-126.

82. Nappi A. J., Vass E., Frey F. and Carton Y. Superoxide anion generation in Drosophila during melanotic encapsulation of parasites // Europ. J. Cell Biol. 1995. V. 68. P. 450-456.

83. Nappi A.J., Ottaviani E. Cytotoxicity and cytotoxic molecules in invertebrates // BioEssay. 2000. V. 22. P. 469-480.

84. Nappi A.J., Vass E. Hydrogen peroxide production in immune-reactive Drosophila melanogaster // J. Parasitol. 1998. V. 84. № 6. P. 1150-1157.

85. O'kongo O., Fernando K. A., Rwegellera G. G. and Tsirkin R. S. Normal values for the nitroblue tetrazolium test (NBT test) // Med. J. Zambia. 1977. V. 3. P. 7173.

86. Pardini R.S. Toxicity of oxygen from naturally occurring redox-active prooxidants // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1995. V. 29. P. 101-118.

87. Pjister H. W., Kodel U., Lorenzl S., Tomasz A. Antioxidant attenuate microvascular in the early phase of experimental pneumococal meningitis in rat // Stroke. 1992 V. 23. P. 1798-1804.

88. Pipe R.K. Generation of reactive oxygen metabolites by the haemocytes of the mussel Mytilus edulis II Dev. Сотр. Immunol. 1992. V. 16. P. 111.

89. Pritsos C.A., Ahmad S., Eliot A.J., Pardini R.S. Antioxidant enzyme level response to prooxidant allelochemicals in larvae of southern army worm moth, Spodoptera cridania // Free Radic. Res. Commun. 1990. V. 9. № 2. P. 127-133.

90. Pye A.E. Activation of prophenoloxidase and inhibition of melanisation in thehaemolymph of immune Galleria mellonella larvae // Insect Biochem.1978. V. 8. P. 117.

91. Ratcliffe N.A., Leonard C., Rowley A.F. Prophenoloxidase activation: non self recognition and cell cooperation in insect immunity // Science. 1984. V. 226. N. 4674. P. 557-559.

92. Rizki T.M., Rizki R.M. The cellular defense system of Drosophila melanogaster. N: Insect ultrastructure by ed. King R.C.,Akai H. I1 1984. V. 2. P. 579.

93. Sass M., Kiss A., Locke M. Integument and hemocyte peptides // J. Insect Physiol. 1994. v. 40. p. 407.

94. Saul S. J., Sugumaran M. Protease mediated prophenoloxidase activation in thehemolymph if the tobacco hornworm, Manduca sexta II Arch. Insect Biochem. Physiol. 1987. V. 5. P. 1-11.

95. Schwarze S.R., Weindruch R., Aiken J.M. Oxidative stress aging reduce COX/RNA and cytoxromeoxidase activity in Drosophila // Free Radic. Biol. Med. 1998. V. 25. № 6. P. 740-747.

96. Soderhall K., Ajaxon R. Effect of quinones and melanin on mycelial growth of Aphanomyces spp. and extracellular protease of Aphanomyces astaci a parasite on crayfisch // J. Invertebr. Pathol. 1982. V. 39. P. 105 109.

97. Sohal R.S., Sohal B.H., Orr W.L. Mitochondrial superoxide and hydrogen peroxide generation, protein oxidative damage and longevity in different species of flies // Free Radic. Biol. Med. 1995. V. 19. № 4. P. 499-504.

98. Stanley-Samuelson D. W., Ogg C.L. Prostaglandin biosynthesis by fat body from the tobacco hornworm, Manduca sexta 11 Insect Biochemist. Biol. 1994. V. 24. P. 481-491.

99. Sugumaran M, Saul SJ, Ramesh N. Endogenous protease inhibitors prevent undesired activation of prophenolase in insect hemolymph // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. V. 132. P. 1124-1129.

100. Takahashi S., Enomoto G. Scanning electron microscopic study of the initial phase of encapsulation in Samia cynthia ricini II Develop. Growth and Differ. 1987. V. 29. P. 249-256.

101. Takahashi S., Enomoto G. The initial phase of encapsulation of silicone oil injected in Samia cynthia (Lepidoptera, Saturniidae): the innermost structure of the developing capsule I/Zoolog. Sci. 1995. V. 12. P. 303-309.

102. Terriere L. C. Induction of detoxication enzymes in insects // Ann. Rev. Entomol. -1984. V. 29. P. 71-88.

103. Tovo P. A. and Ponzone A. Cellular and humoral factors involvement in the enchanced NBT reduction by neutrophil leukocytes of newborn infants // Acta Paediatr. Scand. 1977. V. 5. P. 549-552.

104. Uscian J. M., Stanley-Samuels on D. W. Phospholipase A2 activity in the fat body of the tobacco hornworm, Manduca sexta // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1993. V. 24. P. 187-201.

105. Weiss S. J., King G.W. and LoBuglio A. F. Superoxide generation by human monocytes and macrophages // Am. J. Hematol. 1978. V. 1. P. 1-8.

106. Whitmore D. Jr., Whitmore E., Gilbert L.I. Juvenile hormone induction of esterases: a mechanism for the regulation of juvenile hormone titre // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 1592-1595.

107. Whitten M.M.A., Ratcliffe N.A. In vitro superoxide activity in the haemolymph of the West Indian leaf cockroach, Blaberus discoidalis // J. Insect Physiol. 1999. V. 45. P. 667-675.

108. Zera A. J., Sanger Т., Hanes J., Harshman L. Purification and characterization of hemolymph juvenile hormone esterase from the cricket, Gryllus assimilis II Arch. Insect Biochem. Physiol. 2002. V. 49. P. 41-55.

109. Zhao X, Ferdig MT, Li J, Christensen BM. Biochemical pathway of melanotic encapsulation of Brugia malayi in the mosquito, Armigeres subalbatus II Dev. Сотр. Immunol. 1995. V. 19. P. 205-15.