Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Романенкова, Майя Леонидовна

• Романенкова, Майя Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Романенкова, Майя Леонидовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом.

1.2. Молекулярная биология, филогения и разнообразие хантавирусов.

1.2Л. Соответствие различных серотипов хантавирусов определенным хозяевам-переносчикам.

1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов.

1.2.3. Синтез вирусной РЖ и созревание вирионов.

1.3. Диагностика ГЛПС.

1.3.1. Метод флюоресцентных антител.

1.3.2. Иммуно-пероксидазное окрашивание.

1.3.3. Иммуноферментный анализ.

1.3.4. Иммунохроматографические тесты.

1.3.5. Полимеразная цепная реакция. 1.3.5.1. ОТ-ПЦР, «гнездовая» ОТ-ПЦР.

1.3.5.2. ПЦР в реальном времени.

1.3.5.3. ЛЦР в реальном времени.

Глава 2. Объект и методы исследований.

2.1. Краткая характеристика объектов исследований.

2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях. 2.4. Выделение и очистка РНК из аутопсийных тканей.

2.5. Синтез кДНК. 2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

2.7. Фосфорилирование 5'-концов олигонуклеотидных праймеров.

2.8. Получение одинарных и двойного олигонуклеотидных дуплексов и определение их температуры плавления.

2.9. ЛЦР или ОТ-ЛЦР в режиме реального времени.

2.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.11. Реактивы и материалы.

2.12. Составы использованных стандартных растворов.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Реакции с плазмидной ДНК.

3.1.1. Характеристика объекта исследований.

3.1.2. Проверка плазмиды pCRII на наличие вставки.

3.1.3. Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР и ЛЦР в реальном времени.

3.1.4. Проведение ПЦР и ЛЦР с оптимизированными параметрами реакций.

3.2. Проведение ОТ-ПЦР и ОТ-ЛЦР на синтетической матрице. 67 ^ 3.2.1. ПЦР с SYBR Green I и FAM/ROX.

3.2.2. ЛЦР с SYBR Green I и FAM/ROX.

3.3. ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК.

3.3.1. Реакции с построением кДНК.

3.3.1.1. ОТ-ПЦР с ST-pol.

3.3.1.2. ОТ-ПЦР с M-MLV-revertase/Tth-pol.

3.3.2. Реакции на РНК-матрице. 3.3.2.1. ЛЦР на РНК (четыре праймера).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом»

Актуальность темы. На территории Российской Федерации с периодичностью раз в три-четыре года происходят эпидемические вспышки заболеваний, вызываемых хантавирусами, а Республика Башкортостан является одним из самых крупных в мире районов-очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Возбудителями ГЛПС являются вирусы рода Hantavirus (семейство Bunyaviridae), которые подразделяются на несколько различных серотипов.

По данным литературы в настоящее время насчитывается более 25 различных серотипов хантавирусов. Из них патогенными для человека являются хантавирусные серотипы Dobrava (DOB), Hantaan (HTN), Seoul (SEO), Puumala (PUU), из которых первые два вызывают тяжелую форму ГЛПС, остальные, соответственно, среднюю и легкую формы. Также патогенными являются серотипы Sin Nombre (SN), Black Creek Canal (BCC), которые вызывают обнаруженное в США заболевание, получившее название "хантавирусный пульмонарный синдром" (Vapalahti, 1996; Schmaljohn et al., 1995; Xiao et al., 1994; Avsic-Zupanc et al., 1995; Chu et al., 1994; Schmaljohn et al., 1985). Изоляты, выделенные в Башкортостане (Tkachenko et al., 1984), относятся к серотипу Puumala, представители которого вызывают менее тяжелые формы ГЛПС, нежели, например, серотип Hantaan. Однако в последнее время все чаще наблюдается более тяжелое течение заболевания, сопровождаемое «стертыми» симптомами, что значительно затрудняет своевременную постановку точного диагноза. ГЛПС по заболеваемости занимает первое место среди природно-очаговых инфекций в Российской Федерации. Число зарегистрированных случаев в отдельные годы может достигать 20 тысяч и более, нередки летальные исходы (Морозов, 2001; Ткаченко, Дроздов, 2002).

Основными переносчиками ГЛПС являются мышевидные грызуны. Передача вируса от грызуна к человеку происходит, в основном, воздушно-капельным путем.

К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и лечения ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в Республике Башкортостан характеризуется эпидемическими вспышками каждые 3-4 года. Подобные вспышки, вероятно, связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированности грызунов хантавирусным серотипом РШ1, основным возбудителем ГЛПС в Башкортостане. Кроме того, подъем заболеваемости ГЛПС в годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе и антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории Республики Башкортостан штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Самый высокий подъем заболеваемости ГЛПС за 40 лет с начала регистрации инфекции в Башкортостане пришелся на эпидемический сезон 1997-1998 гг., когда было зарегистрировано 10 057 случаев заболевания ГЛПС, из них 34 случая (0,4%) со смертельным исходом (Нургалеева и др., 1999). Серологическими методами была установлена принадлежность возбудителя данной вспышки к серотипу РЦи, однако большой интерес представляла генетическая характеристика данного вируса.

Эффективность лечения любого заболевания определяется его правильной и ранней диагностикой. Для диагностики ГЛПС в лабораторной практике используются методы, основанные на детекции специфических антител. В то же время достоверные результаты можно получить только при использовании техники амплификации нуклеиновых кислот. Уже ставший рутинным при проведении научных исследований метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) трудоемок и требует наличия высококвалифицированного лабораторного персонала. Альтернативой традиционным методам может стать разработанная нами модификация метода ОТ-ПЦР, контролируемой в режиме реального времени и использующей эффект резонансного переноса энергии флуоресценции для детекции продуктов амплификации.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени имеет несколько преимуществ перед обычной ПЦР (Klein, 2002; Tse, Capeau, 2003, Mackay, 2004):

1. возможность наблюдения за накоплением целевого продукта в данный момент на любой из стадий реакции амплификации

2. отсутствие постреакционных манипуляций для детекции образования целевого продукта (электрофоретический анализ и пр.), и, вследствие этого

3. сокращение времени от начала проведения ПЦР до получения конечного результата.

При этом, с применением термостабильной ДНК-полимеразы Thermus thermophilics (Tth-полимеразы), появилась возможность проводить построение кДНК и последующую ее амплификацию в одной пробирке (Myers, Gelfand, 1991), опять же, значительно сокращая время проведения реакции.

Цель и задачи исследования: Цель данного исследования заключалась в создании прототипа эффективной тест-системы для быстрого и специфического выявления хантавирусной РНК в биологических материалах на основе полимеразной и лигазной цепных реакций (ПЦР и ЛЦР) с использованием эффекта резонансного переноса энергии флуоресценции.

Были поставлены следующие задачи:

1. Определить физико-химические свойства объекта исследования, провести компьютерный дизайн флуоресцентно меченых и ^модифицированных олигонуклеотидных праймеров, необходимых для экспериментов с использованием ПЦР и ЛЦР.

2. Провести модельные эксперименты с выбранными праймерами с использованием ПЦР и ЛЦР, с целью подбора оптимальных параметров реакции при максимальном сокращении затрат времени.

3. Определить эффективность использования синтезированных праймеров в ПЦР и ЛЦР, совмещенных с обратной транскрипцией, при использовании в качестве матрицы вирусной РНК, выделенной из культур клеток Vero Е6, крови больных людей и легочной ткани грызунов-переносчиков ГЛПС.

4. Определить возможность проведения ЛЦР непосредственно на РНК, исключив из реакции стадию обратной транскрипции.

Научная новизна и практическая значимость. Проведенные эксперименты показали возможность создания прототипа быстрого и высокочувствительного диагностического теста на определение хантавирусной РЖ в биологических препаратах с применением методов ПЦР и ЛЦР, контролируемых в режиме реального времени.

Доказана возможность сближенного расположения на матрице олигонуклеотидных праймеров, используемых в процессе ПЦР и ЛЦР, с целью обеспечения высокой эффективности переноса энергии флуоресценции в паре карбоксифлуоресцеин (FAM) - карбокси-Х-родамин (ROX).

В результате проведенных нами модельных экспериментов разработана методика проведения ПЦР и ЛЦР с помощью ферментов Tth-полимеразы и Tth-лигазы за максимально короткое время.

Показана возможность использования в качестве матрицы для ПЦР и ЛЦР со стадией обратной транскрипции вирусной РНК, выделенной как из культур клеток Vero Е6, инфицированных хантавирусом, так и из крови больных ГЛПС и из крови мышей-переносчиков ГЛПС.

Показаны возможность исключения из ПЦР и ЛЦР стадии обратной транскрипции, что существенно сокращает время на проведение анализа, и, соответственно, возможность проведения ПЦР и ЛЦР непосредственно на РНК-матрице.

Разработанные методики могут быть использованы в дальнейшем для диагностических целей и позволят проводить детекцию хантавирусной РНК в минимальных концентрациях за максимально короткое время на любых стадиях ГЛПС.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005); на 8-ом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005» (Пущино, 2005), на 2-ой Международной конференции «Биотехнология - Биомедицина -Окружающая среда» (Пущино, 2005).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 6 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 184 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 112 страницах и содержит 28 рисунков, 8 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Романенкова, Майя Леонидовна

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны высокочувствительные методы детекции продуктов полимеразной и лигазной цепных реакций в режиме реального времени, использующие эффект резонансного переноса энергии флуоресценции, обеспечиваемый оригинальной схемой максимально сближенного размещения олигонуклеотидных праймеров.

2. Предложены прототипы эффективных диагностических систем, использующих методы ПНР и ЛЦР для быстрой и высокочувствительной диагностики хантавирусной РНК в биологических препаратах различного происхождения, в том числе и выделенных из крови больных ГЛПС.

3. Проведена оптимизация параметров реакций ПЦР и ЛЦР за счет подбора температурного режима и концентраций олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающая высокую чувствительность при сокращении общей продолжительности процессов.

4. Показана возможность исключения при проведении лигазной цепной реакции стадии конверсии РЖ в ДНК, за счет лигирования на них олигонуклеотидов при использовании в качестве матрицы непосредственно молекул РНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Актуальность проблемы ГЛПС обусловлена постоянным ростом заболеваемости, увеличением числа тяжелых клинических форм и регистрирующимися случаями смертности. Отдельную проблему составляет отсутствие в России вакцин, разработанных на основе региональных штаммов-возбудителей. Поэтому актуальной является разработка и внедрение в медицинскую практику новых эффективных методов ранней диагностики ГЛПС.

Нами были проведены модельные эксперименты ПЦР и ЛЦР с отработкой температурных условий проведения реакций, в результате чего созданы методики проведения ПЦР и ЛЦР для диагностики хантавирусов серотипа Пуумала с помощью ферментов Tth-полимеразы и Tth-лигазы.

С помощью тщательного подбора температур денатурации и элонгации время проведения ПЦР и ЛЦР существенно сокращено (до 35-40 минут). Этот показатель является немаловажным для клинической диагностики ГЛПС.

Нами была подтверждена возможность использования в качестве матрицы для ПЦР и ЛЦР со стадией обратной транскрипции вирусной РНК, выделенной как из культур клеток Vero Е6, инфицированных хантавирусом, так и из крови больных ГЛПС и из легочной ткани мышей-переносчиков ГЛПС вне зависимости от давности взятых образцов. Важным обстоятельством является то, что разработанная система диагностикумов рассчитана на присутствие в исследуемых образцах даже обломков молекул РНК.

Показаны возможность исключения из ПЦР и ЛЦР стадии обратной транскрипции, что существенно сокращает время на проведение анализа, и, соответственно, возможность проведения ПЦР и ЛЦР непосредственно на РНК-матрице.

Разработанные методики могут быть использованы в дальнейшем для диагностических целей и позволят проводить высокочувствительную детекцию хантавирусной РНК за максимально короткое время на ранних стадиях ГЛПС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Романенкова, Майя Леонидовна, 2006 год

1. Берета JI.A., Елисова Т.Д., Воронкова Г.М. Детекция антител к хантавирусу в моче больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом // Вопросы вирусологии. 1993. - Т. 38(1). - С. 18-21.

2. Гловер. Д. Новое в клонировании ДНК. Методы М.: Мир. - 1989. -346 с.

3. Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А. Хантавирусы и хантавирусные инфекции // Вопросы вирусологии. 2004. - Т. 49(3). - С. 40-44.

4. Магазов Р.Ш., Кулагин В.Ф., Хайбуллина С.Ф. ГЛПС некоторые современные аспекты лечения и профилактики // В сборнике статей "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - пути решения проблемы". - Уфа. - 1995. - С. 5-9.

5. Морозов В.Г. Применение индуктора эндогенного интерферона амиксина для лечения геморрагической лихорадки с почечным синдромом//РМЖ-2001.- Т. 9.- №15.-С. 656-660.

6. Морозов В.Г., Морзунов С.П., Ткаченко Е.А. // IV Всероссийская науч.-практ. конф. «Генодиагностика инфекционных заболеваний»: Тезисы. М. - 2002. - С. 229.

7. Нго Т.Т. Иммуноферментный анализ: общий обзор // В кн.: Иммуноферментный анализ: Пер с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа -М.: Мир. 1988.-446 с.

8. Петров Р.В. Иммунология и иммуногенетика. М.: Медицина. - 1976. -316с.

9. Петров Р.В., Чередяев А.Н., Ковальчук JI.B. Принципы исследований иммунной системы // Сов. Мед. 1985. - №3. - С. 61-64.

10. Рощупкин В.И., Суздальцев А.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом Саратов. - 1990. - 102 с.

11. Смородинцев А.А., Альтшуллер И.С., Дунаевский М.И., и др. Этиология и клиника геморрагического нефрозо-нефрита. М.: Медгиз. - 1944. - 47 с.

12. Ткаченко Е.А., Дроздов С.Г. Хантавирусы и хантавирусные лихорадки // Эпидемиология и вакцинопрофилактика 2002. - №6. - С. 14-18.

13. Фазлыева Р.М., Хунафина Д.Х., Камилов Ф.Х. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Республике Башкортостан. Уфа. - 1995.- 242 с.

14. Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А., Харрисон С., Уайли Д., Ройзман Б., Холланд Д.Дж., Рэмиг Р.Ф., Шоуп Р., Кауфман Р., Пенмен Ш., Грин М., Лоуи Д.Р.: Вирусология. М.: Мир. - 1989. - 492 с.

15. Халберт С.П., Лин Т.М. Иммуноферментный анализ антител // В кн.: Иммуноферментный анализ: Пер с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа -М.: Мир. 1988. -446 с.

16. Ahn С., Cho J.T., Lee J.G., Lim C.S., Kim Y.Y., Han J.S., Kim S., Lee J.S. Détection of Hantaan and Séoul viruses by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and restriction fragment length polymorphism

17. RFLP) in renal syndrome patients with hemorrhagic fever // Clin. Nephrol. -2000. V. 53.-P. 79-89.

18. Alexeyev 0., Elgh F., Zhestkov A., Wadell G., Juto P. Hantaan and Puumala virus antibodies in blood donors in Samara, an HFRS-endemic region in European Russia // Lancet. 1996. - V. 347. - P. 1483.

19. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Molecular characterization of the M genomic segment of the Seoul 80-39 virus: nucleotide and amino acid sequence comparisons with other hantaviruses reveal the evolutionary pathway // Virus Res. 1991. - V. 19. - P. 47-58.

20. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Nucleotide sequence and coding capacity of the large (L) genomic RNA segment of Seoul 80-39 virus a member of the hantavirus genus // Virus Res. 1991. - V. 19. - P. 59-66.

21. Antic D., Wright K.E., Kang C.Y. Maturation of Hantaan virus glycoprotein G1 and G2 // Virology. 1992a. - V. 189. - P. 324-328.

22. Antic D., Yong Kang C., Kristin S., Schamaljohn C., Vapalahti O., Vaheri A. Comparison of the deduced gene of the L, M, S genome segments of hantaviruses // Virus Res. 1992b. - V. 24. - P. 35-46.

23. Avsic-Zupanc T., Toney A., Anderson K., Chu Y.K., Schmaljohn C. Genetic and antigenetic properties of Dobrava virus: a unique member of the Hantavirus genus, family Bunyaviridae // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 2801-2808.

24. Baek L.J., Lee H.W., Hantavirus infection in wild birds and bats in Korea // Proceedings of the IXth International Congress of Virology. Glasgow, Scotland. - 8-13 Aug., 1993. - W52-2. - P. 84.

25. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991. V. 88. - P. 189-193.

26. Bengtsson M., Karlsson H.J., Westman G., Kubista M. A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR // Nucl. Acids Res.-2003.-V. 31.-P. 45.

27. Botten J., Mirowski K., Ye C., Gottlieb K., Saavedra M., Ponce L., Hjelle B. Shedding and intracage transmission of Sin Nombre hantavirus in the deer mouse (Peromyscus maniculatus) model // J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 7587-7594.

28. Bowen M.D., Kariwa H., Rollin P.E., Peters C.J., Nichol S.T. Genetic characterization of a human isolate of Puumala hantavirus from France // Virus Res. 1995. - V. 38. - P. 279-289.

29. Cairns M.J., Turner R., Sun L.Q. Homogeneous real-time detection and quantification of nucleic acid amplification using restriction enzyme digestion // Biochem. Biophys. Res. Comm. 2004. - V. 318. - P. 684-690.

30. Cardullo R.A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P.C., Wolf D.E. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 8790-8794.

31. Carey D.E., Reuben R., Panicker K.N., Shope R.E., Myers R.M. Thottapalayam virus: a presumptive arbovirus isolated from a shrew in India // Indian J. Med. Res. 1971. - V. 59. - P. 1758-1760.

32. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. -1987.-V. 162. P. 156-159.

33. Chow L, Shu P.Y., Huang J.H., Wang H.C, Chang S.F., Lu H.Y., Lin T.H. A retrospective study of hantavirus infection in Kinmen, Taiwan // J. Microbiol. Immunol. Infect. 2005. - V. 38. - P. 343-349.

34. Chu Y.K., Jenning G., Leduc J.W., Lee H.W., Schmaljon C.S., Dalrymple J.M. Serological relationships among viruses in the Hantavirus genus, family Bunyaviridae // Virology. 1994. - V. 198. - P. 196-204.

35. Crockett A.O., Wittwer C.T. Fluorescein-labeled oligonucleotides for realtime PCR: using the inherent quenching of deoxyguanosine nucleotides // Anal. Biochem. 2001. - V. 290. - P. 89-97.

36. Cvetko L., Markotic A., Plyusnina A., Margaletic J., Miletic-Medved M., Turk N., Milas Z., Avsic-Zupanc T., Plyusnin A. Puumala virus in Croatia in the 2002 HFRS outbreak // J. Med. Virol. 2005. - V. 77. - P. 290-294.

37. Dekonenko A., Ibrahim M.S., Schmaljohn C.S. A colorimetric PCR-enzyme immunoassay to identify hantaviruses. // Clin. Diagn. Virol. 1997. - V. 8. -P. 113-121.

38. Drosten C., Gottig S., Schilling S., Asper M., Panning M., Schmitz H., Gunther S. Rapid detection and quantification of RNA of Ebola and Marburg Viruses, Lassa Virus, Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,

39. Rift Valley Fever Virus, Dangue Virus and Yellow fever Virus by real-time reverse transcription-PCR. // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - P. 23232330.

40. Elliot R.M. Molecular biology of the Bunyaviridae // J. Gen. Virol. 1990. -V.71-P. 501-522.

41. French D.J., Archard C.L., Brown T., McDowell D.G. HyBeacon probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination // Mol. Cell. Probes. 2001.-V. 15.-P. 363-374.

42. Frohman M.A., Dush M.K., Martin G.R. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85, №23.-P. 8998-9002.

43. Galeno H., Mora J., Vilagra E., Fernandez J., Hernandez J., Mertz G., Ramirez E. First human isolate of Hantavirus (Andes virus) in the Americas. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8. - P. 657-661.

44. Garcin D., Lezzi M., Dobbs M., Elliot R.M., Schmaljohn C., Kang C.Y., Kolakofsky D. The 5-ends of Hantaan virus (Bunyaviridae) RNAs suggest a prime-and-realign mechanism for the initiation of RNA synthesis // J. Virol. 1995. - V. 69. - P. 5754-5762.

45. Garin D., Peyrefitte C., Crance J.M., Le Faou A.,' Jouan A., Bouloy M. Highly sensitive Taqman PCR detection of Puumala hantavirus. // Microbes Infect. -2001. -V. 3. P. 739-745.

46. Gingeras T.R., Higuchi R., Kricka L.J., Lo Y.M., Wittwer C.T. Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics // Clin Chem. 2005. - V. 51. - P. 661-671.

47. Gott P., Stohwasser R., Schnitzler P., Darai G., Bauts E.K. RNA binding of recombinant nucleocapsid proteins of hantaviruses // Virology. 1993. - V. 194.-P. 332-337.

48. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - V. 6. - P. 986-994.

49. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences // Biotechnology. -1992.-V.10.-P. 413-417.

50. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Kinetic PCR analysis: realtime monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993. -V. 11.-P. 1026-1030.

51. Hjelle B., Chavez-Giles G., Torrez-Martinez N., Yates S., Sarisky J., Webb J., Ascher M. Genetic identification of a novel hantavirus of the harvest mouse Reithrodontomys megalotis II J. Virol. 1994b. - V. 68. - P. 67516754.

52. Hooper J., Larsen T., Custer D., Schmaljohn C. A lethal disease model for hantavirus pulmonary syndrome // Virology. 2001. - V. 289. - P. 6-14.

53. Horling J., Lundkvist A., Persson K., Mullaart M., Dzagurova T., Dekonenko A., Tkachenko E., Niklasson B. Detection and subsequent sequencing of Puumala virus from human specimens by PCR // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33. - P. 277-282.

54. Isegawa Y., Ohshima A., Sokawa Y., Yamanishi K. Strand-specific detection of Hantaan virus RNA sequences by in vitro DNA amplification // Microbiol. Immunol. 1994. - V. 38. - P. 905-908.

55. Kandimalla E.R., Agrawal S. "Cyclicons" as hybridization-based fluorescent primer-probes: Synthesis, properties and application in real-time PCR // Bioorg. Med. Chem. 2000. - V. 8. - P. 1911 -1916.

56. Kim E.C., Kim I.S., Choi Y., Kim S.G., Lee J.S. Rapid differentiation between Hantaan and Seoul viruses by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis // J. Med. Virol. 1994. - V. 43. - P. 245-248.

57. Kim G.R., Lee Y.T., Park C.H. A new natural reservoir of Hantavirus: isolation of hantaviruses from lung tissues of bats // Arch. Virol. 1994. -V. 134.-P. 85-95.

58. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations // Trends Mol. Med. 2002 - V. 8 - P.257-260.

59. Klempa B., Schmidt H.A., Ulrich R., Kaluz S., Labuda M„ Meisel H., Hjelle B., Kriiger D.H. Genetic interaction between distinct Dobrava hantavirus subtypes in Apodemus agrarius and A. flavicolis in nature // J. Virol. 2003. - V. 77. - P. 804-809.

60. Klempa B., Schiitt M., Auste B., Labuda M., Ulrich R., Meisel H., Kriiger D.H. First molecular identification of human Dobrava virus infection in Central Europe // J. of Clin. Microbiol. 2004. - V. 42(3). - P. 1322-1325.

61. Koo K., Jaykus L.A. Detection of single nucleotide polymorphisms within the Listeria genus using an 'asymmetric' fluorogenic probe set and fluorescence resonance energy transfer based-PCR // Lett. Appl. Microbiol. -2002. V. 35.-P. 513-517.

62. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1979. - V. 227. - P. 680-685.

63. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique. // Science. 1988. -V. 241. - P. 1077-1080.

64. Lee H.W., Baek L.J., Johnson K.M. Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever with renal syndrom in humans // Arch. Virol. Suppl. 1982. - V. 1. - P. 35-47.

65. Lee H.W., Lee P.W. Korean hemorrhagic fever. I. Demonstration of causative antigen and antibodies // Korean J. Internal Medicine. 1976. - V. 19.-P. 371-383.

66. Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes // Nucl. Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 37613766.

67. Lee M.A., Siddle A.L., Page R.H. ResonSense®: simple linear fluorescent probes for quantitative homogenous rapid polymerase chain reaction // Anal. Chim. Acta. 2002. - V. 457. - P. 61-70.

68. Lee P.W., Amyx H.L., Gajdusek D.C., Yanagihara R.T., Goldgaber D., Gibbs CJ. New hemorrhagic fever with renal syndrome-related virus in rodents in the United States // Lancet. 1982. - V. 2. - P. 1405.

69. Lee P.W., Gibbs C.J., Gajdusek D.C., Yanagihara R.T. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests // J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 22. -P. 940-944.

70. Letertre C., Perelle S., Dilasser F., Arar K., Fach P. Evaluation of the performance of LNA and MGB probes in 5-nuclease PCR assays // Mol. Cell Probes. -2003. -V. 17. P. 307-311.

71. Li Q., Yang Z.Q., Qu H., Xiao H. Variability of G1 gene of hantaviruses occurring in the Hubei Province, P.R. China from 1985 to 2000 // Acta Virol. 2005. - V. 49. - P. 51-57.

72. Liang M., Li D., Xiao S.Y., Hang C., Rossi C.A., Schmaljohn C. Antigenic and molecular characterization of hantavirus isolates from China // Virus. Res. 1994.-V. 31.-P. 219-33.

73. Lundkvist A., Bjorsten S., Niklasson B. Immunoglobulin G subclass responses against the structural components of Puumala virus // J. Clin. Microbiol. 1993. -V. 31. -P. 368-372.

74. Luo J., Bergstrom D.E., Barany F. Improving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 30713078.

75. Mackay I.M. Real-time PCR in microbiology laboratory // Clin. Microbiol. Infect.-2004-V. 10.-P.190-212.

76. Mir M.A., Panganiban A.T. The hantavirus nucleocapsid protein recognizes specific features of the viral RNA panhandle and is altered in conformation upon RNA binding // J. Virol. 2005. - V. 79. - P. 1824-1835.

77. Morzunov S.P., Rowe J.E., Ksiazek T.G., Peters C.J., St. Jeor S.C., Nichol S.T. Genetic analysis of he diversity and origin of hantaviruses in Peromyscus leucopus mice in North America // J. Virol. 1998. - V. 72. -P. 57-67.

78. Myers T.W., Gelfand D.H. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase // Biochemistry 1991. - V. 30. -P. 7661-7666.

79. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 2516-2521.

80. Nazarenko I., Lowe B., Darfler M., Ikonomi P., Schuster D., Rashtchian A. Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeled with a single fluorophore // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - e37.

81. Nicacio C., Sallberg M., Hultgren C., Lundkvist A. T-helper and humoral responses to Puumala hantaviruses nucleocapsid protein: identification of T-helper epitopes in a mouse model // J. Gen. Virol. 2001. - V. 82. - P. 129138.

82. Nilsson M., Barbany G., Antson D.-O., Gertow K., Landegren U. Enhanced detection and distinction of RNA by enzymatic probe ligation // Nature Biotechnol. 2000. - V. 18. - P. 791-793.

83. Novotny N., Weissenboeck H., Aberle S., Hinterdorfer F. Hantavirus infection in the domestic cat // J.A.M.A. 1994. - V. 4. - P. 1100-1101.

84. Nordstrom H., Johansson P., Li Q.G., Lundkvist A., Nilsson P., Elgh F. Microarray technology for identification and distinction of hantaviruses // J. Med. Virol. 2004. - V. 72. - P. 646-655.

85. Nuovo G.J., Hohman R.J., Nardone G.A., Nazarenko I.A. In situ amplification using universal energy transfer-labeled primers // J. Histochem. Cytochem. 1999. - V. 47. - P. 273-279.

86. Parrington M.A., Kang C.Y. Nucleotide sequence analysis of the S genome segment of Prospect Hill virus: comparison with the prototype Hantavirus // Virology.- 1990.-V. 175. P. 167-175.

87. Parrington M.A., Lee P.W., Kang C.Y. Molecular characterization of the Prospect Hill virus M RNA segment: a camparison with the M RNA segment of other hantaviruses // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72. - P. 18451854.

88. Piccirilli J. A., Krauch T., Moroney S.E., Benner S.A. Enzymatic incorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alphabet // Nature. 1990. - V. 343. - P. 33-37.

89. Plyusnin A. Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy // Arch. Virol. 2002. - V. 147. - P. 665-782.

90. Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Tordo N. Identification of four conserved motif among the RNA-dependent polymerare encoding elements // EMBO J. 1989. -V. 8.-P. 3867-3879.

91. Puthavathana P., Lee H.W., Kang C.Y. Typing of Hantaviruses from five continents by polymerase chain reaction // Virus Res. -1992. V.26. - P. 114.

92. Ririe K.M., Rasmussen R.P., Wittwer C.T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 1997. - V. 245. - P. 154-160.

93. Rizvanov A.A., Khaiboullina S.F., St. Jeor S. Development of reassortant viruses between pathogenic hantavirus strains // Virology. 2004. - V. 327. -P. 225-232.

94. Rowe J.E., St. Jeor S.C., Riolo J., Otteson E.W., Monroe M.C., Henderson W.W., Ksiazek T.G., Rollin P.E., Nichol S.T. Coexistence of several novel hantaviruses in rodents indigenous to North America // Virology. 1995. -V. 213.-P. 122-130.

95. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. 1989. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Gold Spring Harbor.

96. Schmaljohn A.L., Li D.L., Negley D.L., Bressler D.S., Turell M.J., Korch G.W., Ascher M.S., Schmaljohn C.S. Isolation and initial characterization of a newfound Hantavirus from California // Virology. 1995. - V. 206. - P. 963-972.

97. Schmaljohn C., Hasty S., Harrison S., Dalrymple J. Characterization of Hantaan virions, the prototype virus of HFRS // J. Infect. Dis. 1983. - V. 148.-P. 1005-1012.

98. Schmaljohn C.S., Jennings G.B., Hay J., Dalrymple J.M. Coding strategy of the S genome segment of Hantaan virus // Virology. 1986. - V. 155. - P. 633-643.

99. Schmaljohn C., Chu Y., Schamaljohn A., Dalrymple J. Antigenic subunits of Hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virs recombinants // J. Virol. 1990. - V. 64. - P. 3162-3170.

100. Schmaljohn C.S., Schmaliohn A., Dalrymple J.M. Hantaan virus M RNA coding strategy nucleotide sequence and gene order // Virology. 1987. -V. 157.-P. 31-39.

101. Shengqi W., Xiaohong W., Suhong C., Wei G. A new fluorescent quantitative polymerase chain reaction technique // Anal. Biochem. 2002. -V. 309.-P. 206-211.

102. Sherrill C.B., Marshall D.J., Moser M.J., Larsen C.A., Daude-Snow L., Prudent J.R. Nucleic acid analysis using an expanded genetic alphabet to quench fluorescence // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126. - P. 4550-4556.

103. Sironen T., Vaheri A., Plyusnin A. Molecular evolution of Puumala hantavirus // J. Virol. 2001. -V. 75. - P. 11803-11810.

104. Slonova R.A., Tkachenko E.A., Kushnarev E.L., Dzagurova T.K., Astakhova T.I. Hantavirus isolation from birds // Acta Virol. 1992. - V. 32.-P. 493.

105. Solinas A., Brown L.J., McKeen C., Mellor J.M., Nicol J., Thelwell N., Brown T. Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - e96.

106. Song J.W., Baek L.J., Nagle J.W., Schlitter D., Yanagihara R. Genetic and pathogenetic hantavirus from white-footed mouse (Peromyscus leucopus) latter//Lancet. 1996. V. 344. - P. 1637.

107. Stohwasser R., Raab K., Darai G., Bautz E.K. Primary structure of the large (L) RNA segment of nephropathia epidemica virus strain Hallnas B1 coding for the viral RNA polymerase // Virology. 1991. - V. 183. - P. 386-391.

108. Svanvik N., Stahlberg A., Sehlstedt U., Sjoback R., Kubista M. Detection of PCR products in real time using light-up probes // Anal. Biochem. 2000. -V. 287. - P. 179-182.

109. Switzer C.Y., Moroney S.E., Benner S.A. Enzymatic recognition of the base pair between isocytidine and isoguanosine // Biochemistry. 1993. - V. 32. -P. 10489-10496.

110. Terajima M., Hendershot J.D., Kariwa H., Koster F.T., Hjelle B., Goade D., DeFronzo M.C., Ennis F.A. High levels of viremia in patients with the Hantavirus pulmonary synrome // J. Infect. Dis. 1999. - V. 180. - P. 20302034.

111. Todd A.V., Fuery C.J., Impey H.L., Applegate T.L., Haughton M.A. DzyNA-PCR: use of DNAzymes to detect and quantify nucleic acid sequences in a real-time fluorescent format // Clin. Chem. 2000. - V. 46. -P. 625-630.

112. Tse C., Capeau J. Real time PCR methodology for quantification of nucleic acids. // Ann. Biol. Clin. 2003. -V. 61. - P. 279-293.

113. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluorescence upon hybridization // Nat. Biotechnol. 1996. - V. 14. - P. 303-308.

114. Tyagi S., Manas S.A., Kramer F.R. Wavelength-shifting molecular beacons //Nat. Biotechnol.-2000.-V. 18.-P. 1191-1196.

115. Vahlenkamp M., Muller T., Tackmann K., Loschner U., Schmitz H., Schreiber M. The muskrat (iOndatra zibethicus) as a new reservoir for puumala-like hantavirus strains in Europe // Virus Res. 1998. - V. 57. - P. 139-150.

116. Vapalahti O. Dis. Genetic and antigenic properties of Puumala and Tula viruses d-r. Helsinki: 1996. 90 P.

117. Vapalahti 0., Lundkvist A., Kallio-Kokko H., Paukku K., Julkunen I., Lankinen H., Vaheri A. Antigenic properties and diagnostic of Puumala virus nucleocapsid protein expressed in insect cells // J. Clin. Microbiol. -1996.-V. 34. -P.l 19-125.

118. Vaughn C.P., Elenitoba-Johnson K.S. Hybridization-induced dequenching of fluorescein-labeled oligonucleotides: a novel strategy for PCR detection and genotyping // Am. J. Pathol. 2003. - V. 163. - P. 29-35.

119. Vaughn C.P., Elenitoba-Johnson K.S. Intrinsic deoxyguanosine quenching of fluorescein-labeled hybridization probes: a simple method for real-time PCR detection and genotyping // Lab. Invest. 2001. - V.81. - P. 15751577.

120. Verhagen R., Van der Groen G., Ivanov A., Van Rompaey J., Leirs H., Verheyen W. Occurence and distribution of Hantavirus in wild living mammals in Belgium // Acta Virol. 1987. - V. 31. - P. 43-52.

121. Weidmann M., Rudaz V., Nunes M.R., Vasconcelos P.F., Hufert F.T. Rapid detection of human pathogenic orthobunyaviruses // J. Clin. Microbiol. -2003.-V. 41.-P. 3299-3305.

122. Wichmann D., Slenszka W., Alter P., Boehm S., Feldmann H. Hemorrhagic fever with renal syndrome: diagnostic problems with a known disease // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 3414-3416.

123. Whitcombe D., Brownie J., Gillard H.L., McKechne D., Theaker J., Newton C.R., Little S. A homogenous fluorescence assay for PCR amplicons: its application to real-time, single-tube genotyping // Clin. Chem. 1998. - V. 44.-P. 918-923.

124. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification // Biotechniques. 1997. -V. 22.-P. 130-131, 134-138.

125. Wittwer C.T., Reed G.H., Gundry C.N., Vandersteen J.G., Pryor R.J. Highresolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen // Clin. Chem. 2003. - V. 49. - P. 853-860.

126. Wu D.Y., Wallace R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989. - V. 76. - P. 245-254.

127. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR) -amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 560-569.

128. Xiao S., Chu Y., Knauert F., Lofts R., Dalrymple J., LeDuc J.W. Comparison of hantavirus isolates using a genus-reactive primer pair polymerase chain reaction. // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73. - P. 567-573.

129. Xiao S.Y., Liang M., Schmaljohn C.S. Molecular and antigenic characterization of HV114, a hantavirus isolated from a patient with renal syndrom in China // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 1675-9.

130. Xiao S.Y., Leduc J.W., Chu Y.K., Schmaljohn C.S. Phylogenetic analyses of virus isolates in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae // Virology. -1994.-V. 198.-P. 205-217.

131. Yamasaki K., Weihl C., Roos R. Alternative translation initiation of Theiler's murine encephalomyelitis virus // J. Virol. -1999. V.73. - P. 8519-8526.

132. Yanagihara R., Svedmyr A., Amyx H.L., Lee P., Goldgaber D., Gajdusek D.-C., Gibbs Jr., Nystrom K. Isolation and propagation of nephropathia epidemica virus in bank voles // Scand. J. Infect. Dis. 1984. - V. 16. - P. 225-228.

133. Yashina L.N., Patrushev N.A., Ivanov L.I., Slonova R.A., Mishin V.P., Kompanez G.G., Zdanovskaya N.I., Kuzina I.I., Safronov P.F., Chizhikov