Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Колобанова, Светлана Викторовна

• Колобанова, Светлана Викторовна
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Колобанова, Светлана Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СУБТИЛИЗИНЫ

1.1. Общая характеристика субтилизинов

1.1.1. Строение молекулы субтилизинов

1.1.2. Активный центр и механизм катализа

1.1.3. Зона связывания субстрата и специфичность

1.2. Модификация субтилизинов

1.2.1. Модификация активного центра.

1.2.1.1. Тиолсубтшизин и субтшигаза

1.2.1.2. Свленосубт ил из ии

1.2.1.3. Ангидросубтилизин

1.2.1.4. Модификация остатков А$р32, Н1з64, Абп155

1.2.2. Замены аминокислотных остатков вблизи активного

центра и в зоне связывания субстратов

1.2.3. Мутации в участках связывания ионов Са2+

1.2.4. Модификации в областях, удаленных от активного центра

1.3. Заключение

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 63 II. 1.1. Получение и свойства тиолсубтилизина 65 II. 1.2. Тиолсубтилизин как катализатор синтеза различных пептидов 74 II. 2. БВЗ-субтшшзии как возможный катализатор синтеза пептидов

на твердом носителе

II. 2.1. Выбор носителя

II. 2.2. Выбор спейсера

II. 2.3. Модельная реакция

II. 2.4. Двух- и трехстадийная конденсация пептидных сегментов

на аминосилохроме

II.2.5. Отщепление пептида от твердого носителя

II. 3. Заключение 99 III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

III.I. Получение и изучение ферментативных свойств тиолсубтилизина

111,1,1. Получение тиолсубтилизина

III. 1.2. Выделение тиолсубтилизина 104 III, 1,3. Определение ферментативной активности

III. 1.3.1. Определение активности по Glp-Ala-Ala-Leu-pNA

III. 1.3.2. Определение активности по п-нитрофенилацетату

III. 1.3.3. Определение активности по азоказеину

III. 1.4. Определение цистеина

III. 1.5. Определение сульфгидрильных групп 106 III. 1.6. Гидролиз эфиров пептидов и аминокислот

тиолсубтилизином 106 III. 1.7. Синтез пептидов при помощи тиолсубтилизина

(типичная методика)

III. 1.8. Определение выхода пептидов методом ВЭЖХ

III. 1.9. Препаративный синтез Z-Phe-Gly-NIfy

III. 1.10. Препаративный синтез Z-Phe-Ala-Ala-pNA 108 III.2. Конденсация пептидов на твердом носителе под действием SDS-субтилизина

111.2.1. Получение комплекса SDS-субтилизин

111.2.2. Синтез H-Met- Gly-Gly-аминосилохрома

III. 2.2.1. Присоединение Вое-Met-Gly-Gly-ОН к аминосилохрому

III. 2.2.2. Ацетилирование свободных аминогрупп

III. 2.3. Пикриновый тест

III. 2.2.4. Удаление Вос-группы

111.2.3. Синтез Dnp-Alu-Ala-Leu-Met-Gly-Gly-амино-

силохрома

III.2.4. Катализируемый субтилизином гидролиз пептидил-

аминосилохрома

111.2.5. Синтез Dnp-Ala-Ala-Leu-Met-Gly-Gly-aMum-

силохрома

111.2.6. Синтез Boc-Ala-Ala-Leu-Phe-Met-Gly-Gly-аминосилохрома

111.2.7. Отщепление пептида от твердого носителя с

помощью BrCN

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ас - ацетил

ArSH - З-карбокси-4-нитробензилтиол Вое - третбутилоксикарбонил t-Bu (Bu1) - третбутил Bz - бензоил Bzl - бензил

DeD - N - [2 - (2,4 -динитр о ф енил амин о) -этил] - амид

DHA - дегидроаланин

Dnp - 2,4-динитрофенил

ЕН - фермент

Е-ОН - субтилизин

Е-S H - тиол субтилизин

Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил

glc - гликолил (остаток гидроксиуксусной кислоты)

Glp - пироглутаминовая (пирролид-5-он-2-карбоновая) кислота

OEt - этиловый эфир

ОМе - метиловый эфир

ONp - 4-нитрофениловый эфир

OPhCl - 4-хлорфениловый эфир

OSu - N-оксисукцинимидный эфир

PMS F - фенилметансульфонил фторид

pNA - 4-нитроанилид

SBL - субтилизин Bacillus lentus

SBzl (Sbz) - тиобензиловый эфир

SDS - додецилсульфат натрия

Suc - сукцинил

Tos - тозил

Z - бензилоксикарбонил

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ДЦГКД - К^'-дициклогексилкарбодиимид

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА - диметилформамид

ДТТ - дитиотреитол

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Все аминокислоты Ь-ряда, если не указано особо.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов»

ВВЕДЕНИЕ

Биокаталитический способ образования пептидной связи в последнее время рассматривается как перспективный метод для масштабирования и упрощения синтеза коротких пептидов, в том числе биологически активных соединений и лекарственных препаратов. Использование ферментов позволяет проводить пептидный синтез в мягких условиях, без защиты боковых функциональных групп реагентов и опасности рацемизации, исключает применение экологически вредных конденсирующих агентов. Преимущества ферментативного подхода могут быть использованы в синтезе протяженных пептидов при конденсации отдельных сегментов. Разработка новых подходов для проведения ферментативной фрагментной конденсации пептидов, а также расширение круга ферментов, адаптированных к условиям проведения таких реакций, является весьма актуальной проблемой.

Целью данной работы являлось изучение ферментативного метода синтеза пептидов с использованием в качестве катализаторов модифицированных субтилизинов - тиолсубтилизина и Б Б 8 - субтилизина. Задачи исследования включали:

1) получение и разработку метода очистки тиолсубтилизина;

2) изучение функциональных свойств тиолсубтилизина в условиях синтеза различных пептидов;

3) исследование нового подхода к фрагментной конденсации пептидов под действием БВБ-субтилизина на основе сочетания преимуществ ферментативного синтеза пептидов с идеологией твердофазного химического синтеза.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СУБТИЛИЗИНЫ 1.1. Общая характеристика субтилизинов.

Субтилизиноподобные протеиназы, или субтилазы, принадлежат к классу сериновых протеиназ, названных так по аминокислотному остатку, характерному для их активных центров. Они широко распространены в природе и вместе с ферментами других классов обеспечивают глубокое расщепление белков и целый ряд реакций ограниченного протеолиза, имеющих регуляторное значение [1]. Субтилазы особенно характерны для прокариот, но встречаются также в растениях и животных [2]. Попытка систематизировать субтилизиноподобные ферменты была предпринята Сизеном с сотрудниками [3, 4]. В результате сравнения 170 известных первичных аминокислотных последовательностей субтилизиноподобных ферментов авторы предложили деление субтилаз на шесть семейств (субтилизина, термитазы, протеиназы К, лантибиотической пептидазы, кексина, пиролизина), каждое из которых было поделено еще на несколько подгрупп. Сериновые протеиназы из семейства субтилизина пока обнаружены только в микроорганизмах, главным образом это ферменты из Bacillus. Это семейство включает в себя подгруппы типичных субтилизинов, сильнощелочных протеиназ и внутриклеточных протеиназ [4].

1.1.1. Строение молекулы субтилизинов.

Первые субтилизины были выделены в 40-е - 50-е годы. Сначала в Карлсбергской лаборатории в 1947 году Линдерстром-Ланг и Оттенсен открыли субтилизин, продуцируемый Bacillus licheniformis, и назвали его субтилизин Карлсберг [5]. Несколько позднее в этой же лаборатории из другого вида Bacillus был выделен близкий фермент - субтилизин Novo. В 1958 году в Японии был получен субтилизин BPN' из Bacillus amyloliquefaciens [6]. Было установлено, что субтилизины являются белками

основного характера с положением изоэлектрической точки при pH 8-9 и молекулярными массами порядка 27-29 кДа [7]. Вскоре были определены структуры этих субтилизинов; для субтилизинов Novo и BPN' аминокислотные последовательности оказались одинаковы и содержали 275 аминокислотных остатков. Для субтилизина Карлсберг первичная структура отличалась по 82 различным положениям и содержала на один аминокислотный остаток меньше. На протяжении последующих лет было выделено и охарактеризовано более 50 субтилизинов и их аналогов [4]. В 1979 г. в России в высокоочищенном сосоянии была получена щелочная протеиназа - субтилизин 72, секретируемая Bacillus subtilis штамм 72. N-концевая последовательность (до 35 шага) субтилизина 72 оказалась схожей с N-концевым фрагментом субтилизина Карлсберг за исключением двух аминокислотных остатков в положениях 21 и 30. Значительная степень гомологии говорила о том, что субтилизин 72 очень близок, хотя и не идентичен, субтилизину Карлсберг [8].

Для большинства представителей семейства субтилизина был сделан рентгеноструктурный анализ и проведено сравнение с типичными субтилизинами, такими как Карлсберг и BPN' [9-16]. Данные ретгеноструктурного анализа показали, что молекула субтилизина имеет сферическую форму с диаметром 42 А. Вторичная структура субтилизинов представлена тремя ß-слоями (сильно скрученного параллельного ß-слоя, состоящего из семи цепочек, и двух антипараллельных ß-слоев) и девятью а-спиралями (Рис. 1). Центральный параллельный ß-слой делит молекулу на два неравных по размеру домена [10]. Больший домен содержит связку из семи а-спиралей, пять из которых проходят антипараллельно цепям центрального ß-слоя. В состав меньшего домена входят две оставшиеся ос-спирали, также проходящие параллельно ß-слою. Ядро молекулы состоит из 190 гидрофобных аминокислотных остатков, образующих сильно скрученный ß-складчатый слой и две а-спирали [3]. Остальные а-спирали находятся на поверхности молекулы (Рис. 1) [9].

Рис.1. Схематическое изображение вторичной и третичной структуры субтилизинов [4].

Полипептидная цепь ферментов содержит как консервативные, так и вариабильные области. Во всех известных последовательностях субтилизин-подобных протеиназ полностью консервативными являются важные остатки каталитического центра Аяр32, Н1з64 и Бег221 и остаток 01у219*. Четыре других остатка в1у (34, 65, 83 и 154), входящие в состав петель между спиралями и слоями, также, как правило, консервативны, хотя встречаются одна или две их замены. Обычно замена того или иного остатка происходит на структурно похожий аминокислотный остаток.

"Здесь и в последующих примерах нумерация дается в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина ВРГЧ'.

В основном, остатки двух внутренних спиралей hC и hF являются самыми высоко консервативными во всех субтилазах (Рис. 1). Вариабельные области почти всегда соответствуют петлям, связывающим a-спирали и (3-слои, и в основном расположены на внешней поверхности белка [4]. Различия в аминокислотной последовательности не приводят к изменениям каталитических свойств субтилизинов.

На основании данных рентгеноструктурного анализа было обнаружено, что молекулы субтилизинов содержат области повышенной электронной плотности, в которых находятся ионы Са2+ [9, 10]. На одну молекулу фермента может приходиться от двух до четырех ионов Са2+ [4]. Первый участок связывания иона Са2+ (Cal) расположен внутри петли сегмента из аминокислотных остатков 76-81. Ион Са2+ находится в центре почти правильного восьмигранника, образованного атомами кислорода лигандов. Три из этих атомов кислорода принадлежат карбонильным группам остатков Leu75, Thr79 и Val81 (в субтилизине Карлсберг), два других атома входят в состав боковых функциональных групп остатков 2 и 77, обычно это Gin и Asn. Ориентация боковых групп этих остатков способствует образованию тесных контактов между ионом металла и атомами кислорода. Шестой угол восьмигранника занимает карбоксильная группа остатка Asp41 (в субтилизине Карлсберг) [9]. Участок Cal обнаружен почти у всех представителей семейства субтилизинов [4].

Участок связывания иона Са2+, обозначаемый как Са2, присущ далеко не всем субтилизинам. В субтилизине Карлсберг этот участок окружен петлей, образованной остаками 49-58 [10]. Лигандами иона металла являются атомы кислорода, принадлежащие остаткам 49, 52, 54, 94.

Следующий участок связывания иона металла (СаЗ) находится в центре петли, образованной сегментом Рго168-11е175. Этот участок, так же как и участок Са4, слабо связывает ион Са2+ и формируется лигандами боковых цепей одного или двух аминокислотных остатков [9]. Участок СаЗ имеется у большинства представителей семейства субтилизинов, а Са4 является редким и обнаружен только у протеиназы К [17].

1.1.2. Активный центр и механизм катализа.

Активный центр субтилизинов находится в достаточно обширном N-концевом домене. Он состоит из оксианионной впадины и так называемой каталитической триады - остатков Ser221, His64 и Asp32 - которая расположена в углублении на поверхности молекулы у края центрального ß-слоя [15, 18]. В каталитическом механизме серин выполняет функцию основного нуклеофила, гистидин играет двойную роль: на разных стадиях реакции он может быть и акцептором, и донором протона. Роль аспарагиновой кислоты сводится к тому, чтобы привести остаток гистидина в правильную ориентацию для облегчения нуклеофильной атаки серином [15]. Функциональная значимость каталитической триады и оксианионной впадины в катализе была доказана с помощью сайт-направленного мутагенеза [19-22]. Протонированные состояния каталитических остатков His и Asp были изучены с помощью ЯМР [18, 20, 23, 24], нейтронной дифракции [25], а также посредством методов белковой инженерии [26, 27]. Было показано, что вблизи His каталитической триады наблюдается область пониженной электронной плотности [28-30], которая, по мнению Фрея с сотрудниками [28], обусловлена образованием так называемой "низкобарьерной" водородной связи между His64 и Asp32. Исследователи полагают, что такая водородная связь возникает при образовании ацил-фермента и служит для стабилизации переходного состояния. Однако Кухн с сотрудниками [15] попытались опровергнуть это предположение. Для объяснения подобного явления была предложена версия о существовании водородной связи между His64 и Asp32 не только в переходном ацил-ферменте, айв самом ферменте в отсутствии субстрата. В качестве объекта был выбран субтилизин Bacillus lentus (BLS), который отличается от субтилизина BPN' на 103 аминокислотных остатка из 269 возможных, включая делецию 6 остатков. Исследования с помощью ЯМР показали, что в В LS также наблюдается область пониженной электронной плотности вблизи атома N81 His64 [29]. Кроме того, было обнаружено, что Asp каталитической триады участвует в сложной сети водородных связей с

соседними остатками, и одна из этих водородных связей - водородная связь между АБр32 и Шз64 необычно короткая (Рис. 2) [15].

Рис. 2. Схематическое изображение каталитической триады в субтилизинах

Рентгеноструктурный анализ при высоком разрешении (0,78 А) показал, что расстояние между N51 His64 и 052 Asp32 составляет 2,6 А, и атом водорода расположен на расстоянии 1,2 А от His (дальше, чем определено для обычных N-H и С-Н связей) и 1,5 А от Asp (на 0,3 А ближе, чем обычно). Атом водорода, участвующий в этой короткой водородной связи, находится в плоскости боковых цепей His64 и Asp32. Короткую водородную связь исследователи обозначили как каталитическую водородную связь, существующую внутри каталитической триады. Остаток Asp32 образует водородную связь с растворителем (01059) и с остатком Thr33, эти связи

[15]

имеют нормальную длину. Связь 052-Су имеет более выраженный характер двойной связи, чем связь 051-Су, но значительные различия в длине этих связей не были определены. Было обнаружено, что Оу Ser221 находится на расстоянии 3,1 А от Ne2 и является относительно подвижным.

Несмотря на существующие разногласия [18, 31], каталитический механизм действия субтилизинов в общих чертах можно описать, используя схему, представленную на рис. 3 [32]. Остаток Asp32 образует водородную связь с соседней имидазольной группой. Это взаимодействие стабилизирует определенную электронную структуру имидазольного кольца His64 и увеличивает рКа имидазольной группы [33]. Увеличение рКа оказывается выгодным, так как в противном случае, когда в процессе реакции His "закрывается" субстратом, имидазольная группа могла бы иметь пониженную рКа, и His с трудом бы принимал протон.

Catalytic triad

п г у т е

СН,

Т

н n.

-сн.

-Т

н

JL>

н

°ч>

Substrate

Г'

с=о

I

HN _

\

-СН2- 9 -С—о' I

н NH JLn^ r2

-сн2-#-с=о-н+-он"

п-N

Г > Н Н Vx

Tetrahedral intermediate

H

О. о-

\

Acyl intermediate

X,

г

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Колобанова, Светлана Викторовна

выводы

1.Установлено, что модифицированные субтилизины тиолсубтилизин и 8 Ш - субтилизин - могут служить эффективными биокатализаторами реакций фрагментной конденсации пептидов.

2. Разработан новый эффективный метод выделения тиолсубтилизина с применением аффинной хроматографии на бацитрацин-сефарозе и с использованием в качестве хромогенного субстрата С1р-А1а-А1а- Ьеи-рИА. Показано, что каталитические константы гидролиза этого субстрата субтилизином и тиолсубтилизином отличаются на четыре порядка, что свидетельствует о низкой амидазной активности тиолсубтилизина.

3.С помощью тиолсубтилизина осуществлено получение серии пептидов и пептидамидов различного строения (от ди- до гептапептидов). Показана возможность использования в качестве аминокомпонентов при катализе тиолсубтилизином пептидов со свободной карбоксильной группой.

4.Впервые показана принципиальная возможность проведения сегментной конденсации пептидов на твердом носителе - аминосилохроме с применением в качестве катализатора ЗОБ-субтилизина. Изучена зависимость выхода катализируемой БОЗ-субтилизином реакции на твердом носителе от таких факторов, как длина спейсера, нагрузка спейсера на носителе, концентрация фермента и время реакции.

5.В разработанных условиях впервые проведены успешные двух- и трех-стадийные ферментативные конденсации пептидных фрагментов на твердом носителе, обеспечивающие получение с удовлетворительными выходами гекса- и нонапептидов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор чрезвычайно признателен безвременно ушедшему от нас руководителю работы В.М. Степанову за его постоянный интерес к проводимым исследованиям, внимательное, плодотворное и критическое обсуждение полученных результатов и планирования эксперимента.

Автор выражает глубочайшую благодарность И.Ю. Филипповой и E.H. Лысогорской за обучение практическим навыкам, неоценимую помощь в обсуждении, постановке и проведении эксперимента и огромную моральную поддержку в ходе выполнения и оформления данной работы. Автор особенно благодарен Е.С. Оксенойт, осуществившей синтез исходных пептидов. Автор приносит искреннюю благодарность Г.И. Лавреновой, Г.Н. Баландиной и Г.Н. Руденской за полезные дискуссии и ценные практические советы. Автор благодарен A.B. Бачевой и И.В. Гетун за помощь в проведении экспериментов и оформлении данной работы. Большую помощь при исследовании полученных соединений оказали сотрудники отдела хроматографии Л.А. Баратова, М.Б. Вирясов и А.Л. Ксенофонтов.

1.3. Заключение.

Из литературных данных следует, что субтилизины - довольно доступные ферменты с достаточно широкой специфичностью. Они являются удобными объектами для различных модификаций химическими способами и с помощью методов белковой инженерии. Модификация субтилизинов позволяет исследовать структуру и функциональные особенности этих белков, создавать ферменты с новыми свойствами. Различные замены аминокислотных остатков в субтилизинах приводят к изменению таких свойств, как активность, специфичность, термостабильность, устойчивость в органических растворителях. Модифицированные ферменты находят широкое практическое применение. Несмотря на то, что ферментативный синтез пептидов интенсивно развивается в наши дни и имеет ряд преимуществ по сравнению с химическим, все же существуют некоторые причины, ограничивающие область использования этого метода. Например, при синтезе протяженных пептидов для улучшения растворимости исходных компонентов требуются высокие концентрации органических растворителей, а ферменты, как правило, неустойчивы в таких системах. При проведении ферментативного пептидного синтеза в водно-органической среде возникает проблема, связанная со вторичным гидролизом продуктов реакции. Довольно часто целенаправленное получение необходимого соединения требует определенной специфичности фермента в том или ином положении. Таким образом, создание модифицированных субтилизинов позволяет снять эти ограничения и открывает новые возможности для их использования в пептидном синтезе в качестве катализаторов.

II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сериновые протеиназы, в частности субтилизин, доступны, стабильны, обладают достаточно широкой специфичностью и поэтому могут успешно использоваться при биокаталитическом способе образования пептидной связи. Синтез пептидной связи в присутствии сериновых протеиназ представляет собой многостадийный процесс, протекающий через стадию образования ацил-фермента, в котором субстрат ковалентно связан с ферментом через остаток серина активного центра протеиназы. В общих чертах процесс образования пептидной связи можно представить с помощью следующей схемы [121]: ясо-мня + Е-ОН

ЯСО-Х + Е-ОН где Е-ОН - фермент.

Ацил-фермент, образующийся по одному из трех путей (1), (-2), (-3), подвергается нуклеофильной атаке водой (реакция 3) или аминокомпонентом КН2Я (реакция 2). В первом случае происходит гидролиз ацил-фермента и образование компонента со свободной карбоксильной группой ЯСО-ОН, во втором - аминолиз ацил-фермента и образование пептидной связи продукта ЯСО-ТЧНЯ'. Если ацилирующий компонент ЯСО-Х содержит свободную карбоксильную группу, то образование пептидной связи представляет собой термодинамически контролируемый процесс. Сдвиг равновесия в сторону синтеза достигается

КН2Я (2)

-мн2я (-2)

-1)

ЯСО-О-Е + Х-Н

-Н20 (3) н20 (-3)

ЯСО-ОН + Е-ОН или выведением продукта из сферы реакции или присутствием избытка исходных реагентов. Если в реакции используется соединение с активированной карбоксильной группой, например, эфир 1Ч-защшценной аминокислоты или пептида, то процесс является кинетически контролируемым, и выход продукта в оптимальное время определяется количеством и нуклеофильностью аминокомпонента.

Недавно было показано, что субтилизины способны катализировать реакции синтеза необычных соединений. Так, Вонг с сотрудниками осуществили с помощью субтилизина ВР№ синтез пептидов, содержащих некодируемые аминокислоты [39]. В работе [122] описан катализируемый субтилизином 72 синтез пептидоспиртов и пептидоальдегидов. Таким образом, субтилизины являются крайне перспективными для синтеза различных биологически активных соединений и ингибиторов. Весьма интересным представляется применение сериновых протеиназ для блочной конденсации пептидов, в том числе с использованием твердого носителя для закрепления растущей пептидной цепи. Такой вариант позволил бы сочетать неоспоримые преимущества твердофазного метода синтеза и ферментативного способа конденсации. Однако серьезным осложнением, существенно снижающим эффективность синтеза и ограничивающим применение протеиназ в пептидном синтезе, является вторичный гидролиз продуктов реакции (путь (-2) в вышеописанной схеме). Одним из путей решения этой проблемы может быть использование для катализа образования пептидной связи модифицированных ферментов, либо обладающих пониженной амидазной активностью, либо способных функционировать в средах, где сведена к минимуму вероятность вторичного гидролиза продуктов реакции. Модификация биокатализаторов придает им новые свойства и тем самым способствует расширению возможностей ферментативного пептидного синтеза.

Целью настоящей работы являлся синтез пептидов посредством сегментной конденсации, катализируемой производными субтилизина 72 -тиолсубтилизином и ЗОБ-субтилизином. Работа состоит из двух частей:

1) получение и изучение свойств тиолсубтилизина как катализатора образования пептидной связи;

2) изучение возможности блочной конденсации пептидов на твердом носителе под действием SDS-субтилизина.

II. 1.1. Получение и свойства тиолсубтилизина.

Как указывалось в литературном обзоре, тиолсубтилизин представляет собой производное субтилизина, в активном центре которого остаток Ser-221 заменен на Cys. Этот фермент проявляет крайне низкую амидазную активность - при катализе тиолсубтилизином скорость аминолиза эфиров более чем в 1000 раз превышает скорость гидролиза пептидной связи [66]. Несмотря на то, что тиолсубтилизин уже давно описан в литературе, он до настоящего времени редко использовался в качестве катализатора синтеза пептидов ввиду трудоемкости выделения и малой изученности ферментативных свойств. Поэтому перед нами встала задача получить тиолсубтилизин и изучить его функциональные свойства в условиях синтеза различных пептидов.

Тиолсубтилизин был получен из субтилизина 72 методом химического модифицирования. Этот метод использовался в работах Полгара с сотрудниками [48] и Нита с сотрудниками [49] для модификации субтилизинов Карлсберг и Novo. Превращение проходило в три стадии: c6h5ch2so2f

- Е-0S02CH2C6H5 (I)

Е-ОН

-HF

Е-0S02CH О

Е-SCCH3 н2о

Е-SH

-СН,СО 5

Ш) 2

Субтилизин обрабатывали фенилметансульфонилфторидом. Полученный неактивный фенилметансульфонилфермент (I) реагировал с тиолацетатом калия, в результате чего образовывался ацетилтиолсубтилизин (II). Далее проходил спонтанный гидролиз ацетилтиолсубтилизина с последующим образованием тиолсубтилизина (III). Однако самопроизвольный гидролиз фенилметансульфонилсубтилизина приводил к частичной регенерации субтилизина, поэтому в реакционной смеси наряду с тиолсубтилизином присутствовал и субтилизин - фермент, который гораздо эффективнее гидролизует пептидные связи. Даже небольшая его примесь обесценивала препарат, что требовало дополнительной очистки тиолсубтилизина от немодифицированного фермента. В работе Полгара [53] описано хроматографическое разделение субтилизина и тиолсубтилизина на меркурфенилагарозе (см. лит. обзор). Однако данный способ очистки многостадиен и трудоемок, что приводит к потерям тиолсубтилизина и создает угрозу его инактивации.

Мы нашли более удобный метод разделения субтилизина и тиолсубтилизина - аффинную хроматографию на бацитрацин-сефарозе [123]. Бацитрацин - полипептид циклического строения - является ингибитором некоторых протеиназ. Входящие в его состав остатки гидрофобных аминокислот играют существенную роль в образовании комплексов с ферментами. Структура бацитрацина А представлена на рис. 11. Бацитрацин-сефароза была впервые получена в нашей лаборатории и успешно использовалась для разделения протеиназ, в том числе и для очистки субтилизина [125, 126].

СНз /Б-СНг

У СН СН I I ^-СН-СО-Ь-Ьеи С2Н5 Мн2 |

Ь-Б^з —Б-Аяр —Ь-Авп Б-Ии

Б-РЬе \

Ы1е-*— Б-Огп-«— Ь-Ьув-«— Ь-11е

Рис. 11. Структура главного компонента бацитрацина - бацитрацина А [124]

Выделение тиолсубтилизина осуществляли в две стадии [123]. После проведения химической модификации реакционную смесь обессоливали на колонке с сефадексом G-25. Профиль элюции представлен на рис. 12. После гель-фильтрации на сефадексе G-25 было получено тиолпроизводное субтилизина, содержащее некоторое количество нативного фермента. Известно, что тиолсубтилизин практически не гидролизует азоказеин, тогда как немодифицированный субтилизин расщепляет данный субстрат [55]. Этот факт использовался нами для оценки чистоты тиолсубтилизина. Наличие активности по гидролизу азоказеина во фракциях, собранных после гель-фильтрации на сефадексе G-25 при выделении тиолсубтилизина, указывало на присутствие некоторого количества субтилизина в полученном тиол-ферменте (Рис. 12, Табл. 10). Очистку тиолсубтилизина от примеси немодифицированного субтилизина прводили на колонке с бацитрацин-сефарозой (Рис. 13). В условиях, когда субтилизин практически полностью связывался с бацитрацин-сефарозой, тиолсубтилизин проходил через колонку (фракция А). Сорбировавшийся субтилизин элюировали 25%-ным изопропиловым спиртом (фракция Б). Содержание активного субтилизина в этой фракции подтверждалось определением активности по Glp-Ala-Ala-Leu-pNA, я-нитрофенилацетату и гидролизу азоказеина. В то же время белок фракции А - тиолсубтилизин - не обнаруживал активности по гидролизу азоказеина, но расщеплял Glp-Ala-Ala-Leu-pNA и п-нитрофенилацетат (Табл. 10). Таким образом, хроматография на бацитрацин-сефарозе позволила легко освободить тиолсубтилизин от примеси субтилизина.

Различие в связывании тиолсубтилизина и субтилизина с бацитрацин-сефарозой, возможно, объясняется тем, что замена остатка Ser на Cys в активном центре изменяет строение субстратсвязывающего участка фермента, что способствует ослаблению взаимодействий с бацитрацином.

А 280 Активпость,%

Рис. 12. Гель-фильтрация реакционной смеси после химической модификации субтилизина. Колонка (объем 80 мл) с сефадексом С-25 уравновешена 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,0, содержащим 1 мМ ЭДТА, 0,07 М КС1, 3 мМ ДТТ. 1 - поглощение при 280 нм, 2 - активность по гидролизу С1р-А1а-А1а-Ьеи-рКА, 3 - активность по гидролизу азоказеина.

А28у Активность,%

Рис. 13. Разделение субтилизина и тиолсубтилизина на бацитрацин-сефарозе. Колонка (объем 4 мл) уравновешена 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,0, содержащим 1 мМ ЭДТА, 0,07 М КС1, 3 мМ ДТТ. Элюцию проводили 1 М КС1 (стрелка I) и 25%-ным изопропиловым спиртом с 1 М КС1 в фосфатном буфере, рН 7,0 (стрелка II). А - фракция тиолсубтилизина; Б - фракция субтилизина. 1 - поглощение при 280 нм, 2 -активность по гидролизу 01р-А1а-А1а-Ьеи-рКА, 3 - активность по гидролизу азоказеина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Колобанова, Светлана Викторовна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Степанов В.М. Структура и функции белков. // Молекулярная биология. Под ред. Спирина А.С. Москва. Высшая школа. 1996. С.220-233.

2. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов. // Биоорган, химия. 1994. Т.20. No 5. С.475-484

3. Siezen R.J., Vos W.M., Leunissen J.A.M., Dijkstra B.W. Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteases. // Protein Eng. 1991. V.4. P.719-737.

4. Siezen R.J., Leunissen J.A.M. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteases. // Protein Science. 1997. V.6. P.501-523.

5. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. // Microbol. Molecul. Biol. Rev. 1998. V.62. P.597-635.

6. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. // Москва. Наука. 1971.

7. Руденская Т.Н., Ревина Л.П., Грязнова Ю.Б., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Филиппова И.Ю., Степанов В.М., Иванова И.И. Сериновая протеиназа архебактерий Halobacterium mediterranei - аналог субтилизина эубактерий. // Биохимия. 1992. Т.57. С. 1230-1241.

8. Акпаров В.Х., Белянова Л.П., Баратова Л.А., Степанов В.М. Субтилизин 72 - сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамм 72, близкая субтилизину Карлсберг. // Биохимия. 1979. Т.44. No 5. С.886-891.

9. Bode W., Papamokos Е., Musil J. The high-resolution X-ray crystal structure of the complex formed between subtilisin Carlsberg and eglin c, an elastase inhibitor from the leech Hirudo medicinalis. // Eur. J. Biochem. 1987. V.166. P.673-692.

10.McPhalen C.A., James M.N.G. Structural comparison of tow serin proteinase-protein inhibitor complexes: eglin-c-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo. // Biochemistry. 1988. V.27. P.6582-6598.

11.Gilliland G.L., Howard A.J., Winbornes E.L., Poulos T.L., Stewart D.B., Durham D.R. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of subtilisin GX from Bacillus sp. GX6644. // J. Biol. Chem. 1987. V.262. No 9. P.4280-4283.

12.Betzel C., Klupsch S., Papendorf G., Hastrap S., Branner S., Wilson K. S. Crystal structure of the alkaline proteinase Savinase™ from Bacillus lentus at 1.4 A resolution. // J. Mol. Biol. 1992. V.223. P.427-445.

13.Goddette D.W., Paech C., Yang S.S., Mielenz J.R., Bystroff C., Wilke M.E., Fletterick R.J. The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease, subtilisin BL, at 1.4 A resolution. // J. Mol. Biol. 1992. V.228. P.580-595.

14.Chu N.M., Chao Y., Bi R.C. The 2 A crystal structure of subtilisin E with PMSF inhibitor. // Protein Eng. 1995. V.8. No 3. P.211-215.

15.Kuhn P., Knapp M., Soltis S.M., Ganshaw G., Thoene M., Bott R. The 0.78 A structure of a serine protease: Bacillus lentus subtilisin. // Biochemistry. 1998. V.37. P. 13446-13452.

16.Jain S.C., Shinde U., Li Yu., Inouye M., Berman H.M. The crystal structure of an autoprocessed Ser221Cys-subtilisin E-propeptide complex at 2.0 A resolution. //J. Mol. Biol. 1998. V.284. P.137-144.

17.Betzel C., Pal G.P., Saenger W. Three-dimensional structure of proteinase K at 0.15 nm resolution. // Eur. J. Biochem. 1988. V.178. P.155-171.

18.Bachovchin W.W. 15N NMR Spectroscopy of hydrogen-bonding interection in the active site of serine proteases: evidence for a moving histidine mechanism. // Biochemistry. 1986. V.25. P.7751-7759.

19.Bryan P., Pantoliano M.W., Quill S.G., Hsiao H.-Yu, Poulos T. Site-directed mutagenesis and the role of the oxyanion hole in subtilisin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V.83. P.3743-3745.

20.Carter P., Wells J.A. Dissecting the catalytic triad of a serine protease. // Nature. 1988. V.332. P.564-568.

21.Carter P., Abrahmsen L., Wells J.A. Probing the mechanism and improving the rate of substrate-assisted catalysis in subtilisin BPN\ // Biochemistry. 1991. Y.30. P.6142-6148.

22.0'connel T.P., Day R.M., Torchilin E.V., Bachovchin W.W., Malthouse J.G. A 13C-NMR study of the role of Asn-155 in stabilizing the oxyanion of a subtilisin tetrahedral adduct. // Biochem. J. 1997. Y.326. No 3. P.861-866.

23.Bachovchin W.W., Roberts J.D. Nitrogen-15 nuclear magnetic resonance spectroscopy. The state of histidine in the catalytic triad of a-lytic protease. Implications for the charge-relay mechanism of peptide-bond cleavage by serine proteases. // J. Am. Chem. Soc. 1978. V.100. P.8041-8047.

24.Jordan F., Polgar L., Tous G. Proton magnetic resonance studies of the states of ionization of histidines in native and modified subtilisins. // Biochemistry. 1985. V.24. P.7711-7717.

25.Kossiakoff A.A., Spencer S.A. Direct determination of the protonation states of aspartic acid-102 and histidine-57 in the tetrahedral intermediate of the serine proteases: neutron structure of trypsin. // Biochemistry. 1981. V.20. P.6462-6474.

26.Russell A.J., Thomas P.G., Fersht A.R. Electrostatic effects on modification of charged groups in the active site cleft of subtilisin by protein engineering. //J. Mol. Biol. 1987. V.193. P.803-813.

27.Carter P., Wells J.A. Engineering substrate specificity by substrate assisted catalysis. // Science. 1987. V.237. P.394-399.

28.Frey P.A., Whitt S.A., Tobin J.B. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases. // Science. 1994. V.264. P. 1927-1930.

29.Halkides C.J., Wu Y.Q., Murray C.J. A low-barrier hydrogen bond in subtilisin: 1H and 15N NMR studies with peptidyl trifluoromethyl ketones. // Biochemistry. 1996. Y.35. P.15941-15948.

30.Ash E.L., Sudmeier J.L., De Fabo E.C., Bachovchin W.W. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases? Theory versus experiment. // Science. 1997. V.278. P.l 128-1132.

31.Uoet D., Uoet J.G. Biochemistry. // New York. J. Wiley & Sons, Inc. 1995.

32.Dobson G., Wlodawer A. Catalitic triads and their relatives. // Trends Biochem. Sci. 1998. Y.23. P.347-352.

33.Moult J. Electrondensity calculations as an extension of protein structure refinement. Streptomyces griseus protease A at 1.5 A resolution. // J. Mol. Biol. 1985. V.182. P.555-556.

34.Shaw W.V. Protein engineering. // Biochem. J. 1987. V.246. P.l-17.

35.Pugniere M., San Juan C., Previero A. Specific esterase activity of subtilisin toward esters of a-haloacids. // Tetrahedron Lett. 1990. V.31. No 34. P.4883-4886.

36.Gron H., Meldal M., Breddam K. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching. // Biochemistry. 1992. V.31. P.6011-6018.

37.Shechter J., Berger A. Size of the active site in proteinases. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V.27. No 2. P.157-162.

38.Fastrez J., Fersht A.R. Demonstration of the acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrypsin. // Biochemistry. 1973. V.12. P.2025-2034.

39.Moree W.J., Sears P., Kawashiro K., Witte K., Wong C.-H. Exploitation of subtilisin BPN' as catalyst for the synthesis of peptides containing noncoded amino acids, peptide mimetics and peptide conjugates. //J. Am. Chem. Soc. 1997. V.119. P.3942-3947.

40.Zaks A., Klibanov A.M. Substrate specificity of enzymes in organic solvents vs water is reverssed. // J. Am. Chem. Soc. 1986. V.108. P.2767-2768.

41.Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Воюшина Т.Л., Тимохина E.A., Степанов В.М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56. С.230-239.

42.Gololobov M.Yu., Morozova I.P., Vojushina T.L., Timokhina E.A., Stepanov V.M. Subtilisin from Bacillus subtilis strain 72. The influence of substrate structure, temperature and pH on catalytic properties. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.1118. P.267-276.

43.Morichara K. Comparative specificity of microbial proteinases. // Adv. Enzymol. 1974. V.41. P. 179-243.

44.Morichara K., Tsuzuki M., Oka T. Comparison of various types of subtilisins: size and properties of the active site. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. V.42. No 6. P. 1000-1006.

45.Kraut J. Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. // Annu. Rev. Bichem. 1977. V.46. P.331-358.

46.Takeuchi Y., Noguchi S., Satow Y., Kojima S., Kumagai I., Miura K., Nakamura K.T., Mitsui Y. Molecular recognition at the active site of subtilisin BPN': crystallographic studies using genetically engineered proteinaceous inhibitor SSI (Streptomyces subtilisin inhibitor). // Protein. Eng. 1991. V.4. P.501-508.

47.Wells J.M., Ferrari E., Henner D.J., Estell D.A., Chen E.Y. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis. 11 Nucleic Acids Res. 1983. V.ll. P.7911-7925.

48.Polgar L., Bender M.L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. //J. Am. Chem. Soc. 1966. V.88. P.3153-3154.

49.Neet K., Koshland D. The convertion of serine at the active site of subtilisin to cystein: a "chemical mutation". // Proc. Nat. Acad. Sci. 1966. V.56. P.1606-1611.

50.Photaki I., Bardacos V. Transformation of L-serine peptides to L-cysteine peptides. // J. Amer. Chem. Soc. 1965. V.87. P.3489-3492.

51.Polgar L., Bender M.L. The reactivity of thiol-subtilisin, an enzyme containing a syntetic functional group. // Biochemistry. 1967. V.6. P.610-620.

52.Polgar L., Bender M.L. Chromatography and activity of thiol-subtilisin. // Biochemistry. 1969. V.8. P.136-141.

53.Polgar L. Modified preparation of thiolsubtilisin and their purification on agarose-mercurial column. // Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1976. V.ll. P.81-86.

54.Polgar L., Sajgo M. Peptic peptide of thiolsubtilisin. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 667. P. 351-354.

55.Neet K.E., Nanci A., Koshland D.E. Properties of thiol-subtilisin. // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 6392-6401.

56.Philipp M., Tsai I.H., Bender M.L. Comparison of the kinetic specificity of subtilisin and thiolsubtilisin toward p-nitrophenyl esters. // Biochemistry. V.18. P.3769-3773.

57.Tsai I.-H., Bender M.L. Conformation of the active site of thiolsubtilisin: reaction with specific chloromethyl ketones and arylacryloylimidazoles. // Biochemistry. 1979. V.18. P.3764-3768.

58.Jordan F., Polgar L. Proton nuclear magnetic resonance evidence for the absence of a stable hydrogen bond between the active site aspartate and histidine residues of native subtilisins and for its presence in thiolsubtilisins. // Biochemistry. 1981. V.20. P.6366-6370.

59.Brocklehurst K., Malthouse J.P.G. Evidence that the lack of high catalytic activity of thiolsubtilisin towards specific substrates may be due to an inappropriately located proton-distribution system. // J. Biochem. 1981. V.193. P.819-823.

60.Plou F.J., Kowlessur D., Malthouse J.P.G., Mellor G.W., Hartshorn M.J., Pinitglang S., Patel H., Topham C.M., Thomas E.W., Verma C., Brocklehurst K. Characterization of the electrostatic perturbation of a catalytic site (Cys)-S' /(His)-Im+H ion-pair in one type of serine proteinase architecture by kinetic and computational studies on chemically mutated subtilisin variants. // J. Mol. Biol. 1996. V.257. P.1088-1111.

61.Polgar L. Common feature of the four types of the protease mechanisms. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1990. V.371. P.327-331.

62.Philipp M., Bender M.L. Kinetics of subtilisin and thiolsubtilisin // Mol. Cell. Biochem. 1983. V.51. P.5-32.

63.Halasz P., Polgar L. Use of methyl iodide for probing the polarity of the immediate environment of -SH groups in thiolenzymes. Reaction of methyl iodide with thiolsubtilisin. // Eur. J. Biochem. 1976. V.71. P.563-569.

64.Halasz P., Polgar L. Negatively charged reactants as probes in the study of the essential mercaptide-imidazolium ion-pair of thiolenzymes. // Eur. J. Biochem. 1977. V.79. P.491-494.

65.Nakatsuka T., Sasaki T., Kaiser E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiolsubtilisin // J. Am. Chem. Soc. 1987. V.109. P.3808-3810.

66.Abrahmsen L., Tom J., Burnier J., Butcher K.A., Kossiakoff A., Wells J.A. Engineering subtilisin and its substrates for efficient ligation of peptide bonds in aqueous solution // Biochemistry. 1991. V.30. P.4151-4159.

67Jacson D.Y., Burnier J., Quan C, Stanley M., Tom J., Wells J.A. A designed peptide ligase for total synthesis of ribonuclease A with unnatural catalytic residues. // Science. 1994. V.266. P.243-247.

68.Chang T.K., Jackson D.Y., Burnier J.P., Wells J.A. Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. No 26. P. 12544-12548.

69.Braisted A.C., Judice J.K., Wells J.A. Synthesis of proteins by subtiligase. // Methods Enzymol. 1997. Y.289. P.298-313.

70.Welker E., Sheraga H.A. Use of benzyl mercaptan for direct preparation of long polypeptide benzylthio esters as substrates of subtiligase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V.254. No 1. P. 147-151.

71.Jacson D.Y., Burnier J., Wells J.A. Enzymatic cyclization of linear peptide ester using subtiligase. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.117. P. 189-820.

72.Wu Z.-P., Hilvert D. Conversion of a protease into an acyl transferase: selenolsubtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1989. V.lll. No 12. P.4513-4514.

73.Wu Z.-P., Hilvert D. Selenosubtilisin as a glutathione peroxidase mimic. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V.112. No 14. P.5647-5648.

74.Bell I.M., Fisher M.L., Wu Z.-P., Hilvert D. Kinetic studies on the peroxidase activity of selenosubtilisin. // Biochemistry. 1993. V.32. P.3754-3762.

75.Bell I.M., Hilvert D. Peroxide dependence of the semisynthetic enzyme selenosubtilisin. // Biochemistry. 1993. V.32. P. 13969-13973.

76. Peterson E.B., Hilvert D. Nonessential active site residues modulate selenosubtilisin's kinetic mechanism. // Biochemistry. 1995. V.34. No 20. P.6616-6620.

77.House K.L., Dunlap R.B., Odom J.D., Wu Z.-P., Hilvert D. Structural characterization of selenosubtilisin by 77Se NMR spectroscopy. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V.114. No 22. P.8573-8579.

78.House K.L., Garber A.R., Dunlap R.B., Odom J.D., Hilvert D. 1H NMR spectroscopic studies of selenosubtilisin. // Biochemistry. 1993. V.32. No 13. P.3468-3473.

79.Syed R., Wu Z.-P., Hogle J.M., Hilvert D. Crystal structure of selenosubtilisin at 2.0-A resolution. // Biochemistry. 1993. V.32. No 24. P.6157-6164.

80.Tanizawa K., Sugimura A., Kanaoka Y. Anhydrosubtilisin-catalyzed peptide synthesis // FEBS. 1992. V.296. No 2. P. 163-165

81.Weiner H., White W.N., Hoare D.G., Koshland D.E. The formation of ahydrochymotrypsin by removing the elements of water from the serine at the active site. // J. Am. Chem. Soc. 1966. V.88. No 16. P.3851-3859.

82.Zhong Z., Bibbs J.A., Yuan W., Wong C.-H. Active-site directed modification of subtilisin. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V.113. P.2259-2263.

83.Takagi H., Morinaga Y., Ikemura H., Inouye M. Mutant subtilisin E with enhanced protease activity obtained by site-directed mutagenesis. // J. Biol. Chem. 1988. V.263. No 36. P. 19592-19596.

84.Takagi H., Morinaga Y., Ikemura H., Inouye M. The role of Pro-239 in the catalysis and heat stability of subtilisin E. // J. Biochem. 1989. V.105. P.953-956.

85.Rheinnecker M., Baker G., Eder J., Fersht A.R. Engineering a novel specificity in subtilisin BPN'. // Biochemistry. 1993. V.32. No 5. P.l 199-1203.

86.Rheinnecker M., Eder J., Pandey P.S., Fersht A.R. Variants of subtilisin BPN' with altered specificity profiles. // Biochemistry. 1994. V.33. P.221-225.

87.Rollence M.L., Filpula D., Pantoliano M.W., Bryan Ph.N. Enguneering thermostability in subtilisin BPN' by in vitro mutagenesis. // CRC Critical Reviews in Biotechnology. 1988. V.8. P.217-224.

88.Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. Significance of hydrophobic S4-P4 interactions in subtilisin 309 from Bacillus lentus. // Biochemistry. 1993. V.32. P.2845-2852.

89.Schiodt J., Sorensen S.B., Osten C., Breddam K. Changing the substrate preference of the hydrophobic S4 binding pocket of subtilisin 309 from Bacillus lentus. I I Prot. Pept. Lett. 1996. V.3. No 1. P.29-44.

90.Bech L.M., Sorensen S.B., Breddam K. Mutational replacements in subtilisin 309. Vall04 has a modulating effect on the P4 substrate preference. // Eur. J. Biochem. 1992. V.209. P.869-874.

91.Bonneau P.R., Grayacar T.P., Estell D.A., Bryan J.J. Alteration of the specificity of subtilisin BPN' by site-directed mutagenesis in its SI and SI' binding sites. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V.113. P.1026-1030.

92.Wangikar P.P., Grayacar T.P., Estell D.A., Clark D.S., Dordick J.S. Protein and solvent engineering of subtilisin BPN' in nearly anhydrous organic media. //J. Am. Chem. Soc. 1993. V.115. No 26. P. 12231-12237.

93.Takagi H., Maeda Т., Ohtsu I., Tsai Y.C., Nakamori S. Restriction of substrate specificity of subtilisin E by introduction of a side chain into a concerved glycine residue. // FEBS Lett. 1996. V.395. P. 127-132.

94.Takagi H., Maeda Т., Ohtsu I., Nakamori S. Construction of novel subtilisin E with high specifity, activity and pruductivity through multiple amino acid substitutions. // Protein Eng. 1997. V.10. P.985-989.

95.Takagi H., Maeda Т., Ohtsu I., Nakamori S. Random mutagenesis into the conserved Gly 154 of subtilisin E: isolation and characterization of the revertant enzymes. // Protein Eng. 1998. V.ll. P.1205-1210.

96.Mei H.-C., Liaw Y.-C., Li Y.-C., Wang D.-C., Takagi H., Tsai Y.-C. Engineering subtilisin YaB: restriction of substrate specificity by the substitution of Gly 124 and Gly 151 with Ala. // Protein Eng. 1998. V.ll. P.109-117.

97.Estell D.A., Graycar T.P., Wells J.A. Engineering an enzyme by site-directed mutagenesis to be resistant to chemical oxidation. // J. Biol. Chem. 1985. V.260. No 11. P.6518-6521.

98.Zhu L., Ji Y. Protein engineering on subtilisin E. // Chin J. Biotechnol. 1997. V.13. P.9-15.

99.Plettner E., Khumtaveerporn K., Shang X., Jones J. B. A combinatorial approach to chemical modification of subtilisin Bacillus lentus. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. V.8. P.2291-2296.

100.De Santis G., Berglund P., Stabile M.R., Gold M., Jones J.B. Site-directed mutagenesis combined with chemical modification as a strategy for altering the specificity of the SI and SI' pocket of subtilisin Bacillus lentus. // Biochemistry. 1998. V.37. P.5968-5973.

101.Berglund P., DeSantis G., Stabile M.R., Shang X., Gold M., Bott R.R., Graycar T.P., Lau T.H., Mitchinson C., Jones J.B. Chemical modification of cysteine mutants of subtilisin Bacillus lentus can create better catalyst than the wild-type enzyme. //J. Am. Chem. Soc. 1997. V.119. P.5265-5266.

102.Dickman M., Lloyd R.C., Jones J.B. Chemically modified mutants of subtilisin Bacillus lentus catalyze transesterification reactions better than wild type. // Tetrahedron: Asymmetry. 1998. Y.9. P.4099-4102.

103.Ballinger M.D., Tom J., Wells J.A. Designing subtilisin BPN' to cleave substrates containing dibasic residues. // Biochemistry. 1995. V.34. P. 1331213319.

104.Ballinger M.D., Tom J., Wells J.A. Furilisin: a variant of subtilisin BPN' engineered for cleaving tribasic substrates. // Biochemistry. 1996. V.35. P.13579-13585.

105.Pantoliano M.W., Whitlow M., Wood J.F., Rollence M.L., Finzel B.C., Gilliland G.L., Poulos T.L., Bryan P.N. The engineering of binding affinity at metal ion binding sites for the stabilization of proteins: subtilisin as a test case. // Biochemistry. 1988. V.27. P.8311-8317.

106.Strausberg S.L., Alexander P.A., Gallagher D.T., Gilliland G.L., Barnett B.L., Bryan P.N. Directed evolution of a subtilisin with calcium-independent stability. // Biotechnology. 1995. V.13. P.669-673.

107.Tange T., Taguchi S., Kojima S., Miura K., Momose H. Improvement of a useful enzyme (subtilisin BPN') by an experimental evolution system. // Appl. Microb. Biotechnol. 1994. V.41. No 2. P.239-244.

108.Fagain C.O. Understanding and increasing protein stability. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V.1252. No 1. P.l-14.

109.Shaw A., Bott R. Engineering enzymes for stability. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. Y.6. No 4. P.546-550.

110.Pantoliano M.W., Ladner R.C., Bryan P.N., Rollence M.L., Wood J.F., Poulos T.L. Protein engineering of subtilisin BPN': enhanced stabilisation through the introduction of two cysteines to form a disulfide bond. // Biochemistry. 1987. V.26. P.2077-2082.

111.Mitchinson C., Wells J.A. Protein engineering of disulfide bonds in subtilisin BPN'. // Biochemistry. 1989. Y.28. P.4807-4815.

112.Takagi H., Takahasi T., Momose H., Inouye M., Maeda Y., Matsuzawa H., Ohta T. Enhancement of the thermostability of subtilisin E by introduction of a disulfide bond engeneered on the basis of structural comparison with a thermophilic serine protease. // J. Biol. Chem. 1990. V.265. P.6874-6878.

113.Kwon S.T., Matsuzawa H., Ohta T. Determination of the positions of the disulfide bonds in aqualysin I (a thermophilic alkaline serine protease) of Thermus aquaticus YT-1. // J. Biochem. 1988. V.104. P.557-559.

114.Chen K.Q., Robinson A.C., Van Dam M.E., Martinez P., Economou C., Arnold F.H. Enzyme engineering for nonaqueous solvents. II. Additive effects of mutations on the stability of subtilisin E in polar organic media. // Biotechnol. Prog. 1991. V.7. P. 125-129.

115.Chen K., Arnold F.H. Tuning the activity of an enzyme fpr unusial enviroments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. No 12. P.5618-5622.

116.You L., Arnold F.H. Directed evolution of subtilisin E in Bacillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide. // Protein Eng. 1996. V.9. P.77-83.

117.Wong C.-H., Chen S.-T., Hennen W.J., Bibbs J.A., Wang Y.-F., Liu J.L.-C., Pantoliano M.W., Whitlow M., Bryan P.N. Enzymes in organic synthesis: use of subtilisin and a highly stable mutant derived from multiple site-specific mutations. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V.112. P.945-953.

118.Zhong Z., Liu J.L.-C., Dinterman L.M., Finkelman M.A.J., Mueller W.T. Engineering subtilisin for reaction in dimethylformamide. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V.113. P.683-684.

119.Wong C.-H., Schuster M., Wang P., Sears P. Enzymatic synthesis of N- and O-linked glycopeptides. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V.115. P.5893-5901.

120.Sears P., Schuster M., Wang P., Witte K., Wong C.-H. Engineering subtilisin for peptide coupling: Studies on the effects of counterions and site-specific modifications on the stability and specificity of the enzyme. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V.116. P.6521-6530.

121.Potetinova J.V., Voyushina T.L., Stepanov V.M. Enzymatic synthesis of peptidyl amino alhohols and peptidyl amino aldehydes - serine proteinase inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997. V.7. No 6. P.705-710.

122.Fruton J. Protease-catalyzed synthesis of peptide bonds. // Adv. Enzymol. 1982. V.53. P.239-306.

123.Колобанова C.B., Лысогорская E.H., Филиппова И.Ю., Анисимова В.В., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. Тиолсубтилизин как инструмент пептидного синтеза. Получение и свойства. // Биохимия. 1997. Т.62. No 3. С.384-393.

124.Степанов В.М., Руденская Г.Н., Янонис В.В., Остославская В.И., Гончар М. В. Котлова Е. К., Стронгин А. Я. Аффинная хроматография протеиназ на сорбентах, содержащих бацитрацин в качестве специфичиского лиганда. // Биоорган, химия. 1978. Т.4. No 9. С. 12561263.

125.Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. L-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine - p-nitroanilide - a chromogenic substrate for thiol proteinase assay. // Anal. Biochem. 1984. V.143. P.293-297.

126.Stepanov V.M. Proteinases as catalysts in peptide synthesis. // Pure & Appl. Chem. 1996. V.68. No 6. P. 1335-1339.

127.Воюшина Т.Л., Люблинская Л.А., Степанов B.M. Синтез пептидов, катализируемый сериновыми протеиназами. Применение эфиров ацилпептидов в качестве карбоксильных компонентов. // Биоорган, химия. 1985. Т.2. С.738-744.

128.Воюшина Т.Л., Терентьева Е.Ю., Позднев В.Ф., Гайда А.В., Гололобов М.Ю., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Ферментативный синтез ацилпептидов, содержащих п -нитроанилиды основных аминокислот. // Биоорган, химия. 1991. Т.17. No 8. С.1066-1073.

129.K6nnecke A., Dettlaff S., Jakubke H-D. Model studies on the utility of nucleophyles bound insoluble supports for enzymatic peptide synthesis. // Monatsh. Chem. 1982. V.113. P.331- 337.

130.Slomczynska U., Albericio F., Cardenas F., Giralt E. Studies on the enzymatic coupling of peptide segments on the solid support. // Biomed. Biochim. Acta. 1991. V.50. P.67-73.

131.Meyer J.D., Kendric B.S., Matsuura J.E., Ruth J.A., Bryan P.N., Manning M. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotrypsin in organic solvents via hydrophibic ion pairing. // Int. J. Peptide Protein Res. 1996. V.47. P.177-181.

132.Kendric B.S., Meyer J.D., Matsuura J.E., Carpenter J.F., Manning M. Hydrophobic ion pairing as a method for enhancing structure and activity of lyophilized subtilisin BPN' suspended in isooctane. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V.347. No 1. P.113-118.

133.Wangikar P.P., Michels P.C., Clark D.S., Dordick J.S. Structure and function of subtilisin BPN' solubilized in organic solvents. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V.119. P.70-76.

134.Getun I.V., Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Anisimova V.V., Kolobanova S.V., Bacheva A. V., Stepanov V.M. SDS-subtilisin complex efficiently catalyzed synthesis of peptides in ethanol and 2-propanol. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997. V.7. No 20. P.2691-2696.

135.Kolobanova S.V., Lysogorskaya E. N., Filippova I. Yu., Anisimova V. V., Oksenoit E. S., Bacheva A. V., Stepanov V. M.. SDS- subtilisin catalyzed coupling of peptide segments on the solid support. // Peptides-1998. Proceedings of the 25th European Peptide Symposium, Eds.S.Bajusz, F.Hudecz. Akademiai Kiado, Budapest. 1999. P.106-107.

13 6. Стюарт Дж., Янг Дж. Твердофазный синтез пептидов. // Под ред. Швачкина Ю.П. Москва. Мир. 1971.

137.Renil М., Ferreras М., Delaisse J.M., Foged N.T., Meldal М. PEGA supports for combinatorial peptide synthesis and solid-phase enzymatic library assays. // J. Peptide Sci. 1998. Y.4. P. 195-210.

138.Meldal M., Svendsen I., Juliano L., Nery E.D., Scharfstein J.J. Inhibition of cruzipain visualized in a fluorescence quenched solid-phase inhibitor library assay. D-Amino acid inhibitors for cruzipain, cathepsin В and cathepsin L. // J. Peptide Sci. 1998. V.4. P.83-91.

139.Spetzler J.C., Westphal V., Winther J.R., Meldal M. Preparation of fluorescence quenched libraries containing interchain disulphide bonds for studies of protein disulphide isomerases. // J. Peptide Sci. 1998. V.4. P. 128137.

140.Морозова О.В., Воюшина Т.JI., Степанов В.М. О взаимодействии с носителями протеолитических ферментов, используемых для энзиматического синтеза пептидов в органических растворителях. // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. Т.30. С.786-793.

141.Люблинская Л.А., Юсупова М.П., Ваганова Т.И., Иванова Н.М., Степанов В.М. Твердофазный синтез биоспецифического сорбента для аминопептидаз. // Биоорган, химия. 1984. Т. 10. No 11. С. 1490-1495.

142.Kullmann W. Enzymatic peptide synthesis. // Boca Raton. Florida. CRC Press Inc. 1987.

НЗ.Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Степанов В.М. Выделение протеиназы Bacillus subtilis штамм 72. // Биохимия. 1991. Т.56. С.33-40.

144.Stepanov Y.M., Rudenskaya G.N., Gaida A.V., Osterman A.L. Affinity chromatography of proteolytic enzymes on silica-based biospecific sorbents. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1981. V.5. P. 177-186.

145.Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н., Филиппова И.Ю., Маркарян А.Н., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. п-Нитроанилиды пироглутамилпептидов - хромогенные субстраты сериновых протеиназ. // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. No 6. С.748-753.

146.Гершкович А.А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. // Киев. Наукова Думка. 1992.

147.Байков А. А. Определение основных кинетических параметров ферментативных реакций. // В кн.: Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Под ред. Прокофьева М.А. Москва. Изд. Моск. университета. 1985. С.72-73.

148.Гульник С.В., Лавренова Г.И., Степанов В.М. Внеклеточная металлопротеиназа Legionella pneumophila. // Биохимия. 1987. Т.52. No 8. С.1387-1396.

149.Дарбре А. Практическая химия белка. // Москва. Мир. 1989. С. 101.

150.Ellman G. Tissue sulfhydryl groups. // Arch. Biochem. Biophys. 1959.

V.82. P.70-77.