Молекулярно-биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Гмыль, Лариса Вениаминовна

• Гмыль, Лариса Вениаминовна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гмыль, Лариса Вениаминовна

Список сокращений.......

Введение.......

1. Обзор литературы.....

1.1. Общая характеристика семейства Bunya viridae.

1.1.1. Таксономия и классификация.

1.1.2. Морфология.

1.1.3. Структура и организация геномов, стратегия кодирования вирусных белков.

1.1.4. Трансляция и процессинг вирусных белков.

1.2. Общая характеристика года найровирусов.

1.2.1. Классификация.

1.2.2. Морфология и физико-химические свойства вирионов найровирусов.

1.2.3. РНК и особенности ее репликации у найровирусов.

1.2.4. Вирусспецифические белки найровирусов.

1.3. Краткие сведения о крымской-конго геморрагической лихорадке и ее возбудителе

1.3.1. Лабораторная диагностика KKTJI.

1.3.2. Экспериментальная инфекция на животных и адаптация вируса KKTJI к различным культурам клеток.

2. Материалы и методы.....

2.1. Вирусы.

2.2. Культура клеток.

2.3. Животные.

2.4. Бактериальный штамм.

2.5. Синтетические олигонуклеотиды.

2.7. Клещи.

2.8. Получение иммунных асцитных жидкостей.

2.9. Титрование инфекционного вируса.

2.10. Выращивание и концентрирование вируса KKTJI.

2.11. Непрямой метод флюоресцирующих антител.

2.12. Непрямой иммуноферментный анализ.

2.13. Электронная микроскопия.

2.14. Получение радиоактовно меченых препаратов вируса ККГЛ.

2.15. иммунопреципитация вирусспецифических белков.

2.16. электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле.

2.17. Двумерный электрофорез вирусспецифических белков.

2.18. Очистка вируса ККГЛ в градиенте плотности сахарозы.

2.19. Выделение нуклеокапсидов.

2.20. Выделение РНК вируса ККГЛ.

2.21. Обратная транскрипция.

2.22. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.23. Базовые методы молекулярного клонирования.

2.24. Аналитический электрофорез в агарозном геле.

2.25. Секвенирование.

2.26. Приготовление секвенирующего геля и проведение электрофореза.

3. Результаты.

3.1. Определение нуклеотидной последовательности S, М и L сегментов штамма Ходжа вируса ККГЛ.

3.1.1. Определение нуклеотидной последовательности S сегмента штамма Ходжа.

3.1.2. Определение нуклеотидной последовательности М сегмента штамма Ходжа.

3.1.3. Определение нуклеотидной последовательности 5 '-концевогоучастка вирионной РНК L сегмента штамма Ходжа вируса ККГЛ.

3.2. Филогенетический анализ полных последовательностей S, М сегментов и фрагментов L сегмента штаммов вируса ККГЛ.

3.2.1. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей S сегментов штаммов вируса ККГЛ.

3.2.2. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей М сегментов штаммов вируса ККГЛ.

3.2.3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности части L сегмента штаммов вируса ККГЛ.

3.3. Компьютерный анализ полученных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей S, М и L сегментов штамма ходжа.

3.3.1. Анализ S сегмента штамма Ходжа.

3.3.2. Анализ М сегмента штамма Ходжа.

3.3.3. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 5-концевой части L сегмента.

3.4. адаптация вируса ккгл штамма ходжа к культуре клеток vero-e6.

3.4.1. Получение варианта штамма Ходжа (Ходжа-А) вируса ККГЛ, адаптированного к культуре клеток Vero-Еб.

3.4.2. Сравнение основных характеристик вариантов Ходжа-М и Ходжа-А.

3.5. Изучение реализации генома вируса ККГЛ в культуре клеток Vero-E6.

3.5.1. Идентификация вирусспецифических белков вируса ККГЛ и определение их молекулярных масс (на модели двух вариантов шт. Ходжа).

3.5.2. Динамика накопления вирусных белков при репродукции в культуре клеток вариантов штамма Ходжа вируса ККГЛ.

3.6. Анализ белкового состава вирионов и нуклеокапсидов вируса ККГЛ.

3.6.1. Очистка вирионов вируса ККГЛ с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы и определение белкового состава вирионов.

3.6.2. Выделение нуклеокапсидов варианта Ходжа-А вируса ККГЛ и анализ белкового состава.

3.7. Изучение гликозилирования вирусспецифических белков вируса ККГЛ.

3.8. Изучение свойств вирусспецифических белков с помощью двумерного электрофореза.

3.la Выявление РНК вируса ККГЛ в различных биопробах с помощью ПЦР.

4,Обсуждение...

4.1 Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей S, М и фрагментов L сегментов штаммов вируса ККГЛ.

4.2. Организация S и м РНК сегментов штамма Ходжа.

4.3. Адаптация вируса ККГЛ к культуре клеток Vero-E6 и изучение свойств полученного варианта Ходжа-А.

4.4. Выявление РНК вируса ККГЛ с помощью метода ОТ-ПЦР.

Выводы.....

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки»

Крымская-Конго геморрагическая лихорадка (ККГЛ) - природно-очаговая вирусная инфекция человека. Вирус ККГЛ вызывает тяжелое острое лихорадочное заболевание, сопровождающееся геморрагическим и интоксикационным синдромом. В природе постоянная циркуляция вируса поддерживается иксодовыми клещами и их прокормителями. Случаи заболевания ККГЛ регистрируются в странах Европы, Азии и Африки. В последние несколько лет наблюдалось значительное увеличение заболеваемости ККГЛ в южных регионах России, таких как Ростовская область, Волгоградская область, Ставропольский край и Республика Калмыкия (1999-2000 гг.).

Заражение человека происходит трансмиссивным путем при присасывании клеща. Кроме того больной человек в период выраженного геморрагического синдрома может быть источником заражения окружающих его лиц через кровь, то есть вирус может передаваться контактным путем.

Заболеваемость при ККГЛ носит спорадический характер, однако, в разные годы были отмечены внутрисемейные и внутрибольничные вспышки с высокой летальностью (до 50%). Такого рода заболевания требуют пристального внимания, поскольку можно ожидать по разным причинам появление новых эпидемически значимых вариантов возбудителя, тем более что для ККГЛ показан не только трансмиссивный путь передачи. Все это показывает важность всестороннего изучения этого вируса.

По существующей классификации вирус ККГЛ относится к роду найровирусов семейства Bunyaviridae. Хотя для вирусов из разных родов этого семейства уже имеются полные нуклеотидные последовательности генома, представленного тремя сегментами, и изучена организация генома, а также хорошо охарактеризованы вирусные белки, очень мало известно о представителях рода найровирусов. На момент начала наших исследований данные по устройству и реализации генома найровирусов были немногочисленны и основывались в основном на изучении генома вируса Дугбе. Трудности в изучении вируса ККГЛ связаны с тем, что это наиболее опасный патоген для человека среди найровирусов (относится ко второму уровню биологической опасности в России и 4 уровню в других странах), и вакцина для защиты от этого возбудителя отсутствует. Кроме того, нет удобной и адекватной биологической модели для поддержания этого вируса в лабораторных условиях, а так же накопления достаточных количеств вирусного материала для изучения его молекулярно-биологических характеристик. В связи с этим, хотя в последнее время наблюдается значительный интерес к этому вирусу, до сих пор не определена полная нуклеотидная последовательность генома вируса ККГЛ и получены только предварительные данные о способах его реализации.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение основных молекулярно-биологических характеристик вируса ККГЛ и вирусспецифических белков, синтезирующихся при репродукции вируса ККГЛ.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить нуклеотидную последовательность РНК S, М сегментов и фрагмента L сегмента прототипного центрально-азиатского штамма Ходжа вируса ККГЛ и определить потенциальные характеристики вирусспецифических белков.

2. Провести сравнение полных нуклеотидных последовательностей S и М сегментов и фрагментов L сегментов и выявить филогенетические взаимоотношения между штаммами вируса ККГЛ из разных регионов мира.

3. Подобрать оптимальные условия для адаптации вируса ККГЛ к культуре клеток Vero-Еб, получить вариант, адаптированный к этой культуре, и изучить его свойства.

4. На модели полученного адаптированного к клеткам варианта штамма Ходжа идентифицировать и охарактеризовать структурные и неструктурные белки вируса ККГЛ, синтезирующиеся в процессе инфекции в культуре клеток Vero-Еб.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые была определена полная нуклеотидная последовательность РНК S и М сегментов прототипного азиатского штамма Ходжа, выделенного в 1967 году в СССР. Впервые для вируса ККГЛ была определена нуклеотидная последовательность фрагмента РНК L сегмента для 4 штаммов, выделенных в разные годы и в разных регионах мира. На основании полных нуклеотидных последовательностей S и М сегментов, а также на основании части последовательности L сегмента были определены филогенетические отношения между штаммами вируса ККГЛ. Было показано, что филогенетические группы формируются соответственно географическому месту циркуляции вируса на основе данных для S и L сегментов. По данным для полных М сегментов штаммы вируса ККГЛ достоверно группируются в три кластера не зависимо от места, времени и источника выделения этих штаммов. Получены указания на возможность реассортации сегментов между природными штаммами вируса ККГЛ.

Впервые применен метод совместного культивирования инфицированных и неинфицированных клеток для адаптации вируса ККГЛ к культурам клеток. Впервые были идентифицированы и охарактеризованы структурные и неструктурные белки вируса ККГЛ. Научно-практическая значимость работы.

1. В данной работе была определена часть нуклеотидной последовательности L сегмента, что облегчит в дальнейшем расшифровку полной последовательности генома возбудителя такого тяжелого заболевания человека, как ККГЛ, и позволит провести функциональное картирование его генома.

2. Получен вариант вируса ККГЛ, адаптированный к культуре клеток, с более быстрым и высоким уровнем репродукции в клетках. Использование такого варианта позволит упростить наработку антигенного материала, удешевляет и облегчает приготовление диагностических наборов. Кроме этого, открываются новые возможности для получения вакцинных препаратов против вируса ККГЛ на культуральном субстрате.

3. Для пополнения коллекции в процессе работы были идентифицированы и закреплены в пассажах 6 новых штаммов вируса ККГЛ, выделенных из клещей, собранных во время вспышки в Ставропольском крае в 2000 г.

4. Был предложен метод по выявлению РНК вируса ККГЛ с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на основе праймеров, подобранных к S и М сегментам. Схема метода позволяет исключить ложноположительные случаи выявления РНК и использовать этот метод как в диагностических целях, так и для молекулярно-эпидемиологических исследований.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Гмыль, Лариса Вениаминовна

Выводы

1. Определены полные нуклеотидные последовательности S и М сегментов РНК прототипного азиатского штамма Ходжа вируса ККГЛ. Впервые для вируса ККГЛ определена часть нуклеотидной последовательности РНК L сегмента 4-х штаммов вируса ККГЛ.

2. По данным филогенетического анализа полные кодирующие последовательности S сегментов 22 штаммов вируса ККГЛ кластеризуются по географическому признаку вне зависимости от источника и времени выделения; штаммы, циркулирующие в Центральной Азии, составляют одну филогенетическую группу с китайскими штаммами. По данным филогенетического анализа полные кодирующие последовательности М сегментов 12 штаммов вируса ККГЛ группируются в три генотипа не зависимо от места, времени и источника выделения этих штаммов. По данным филогенетического анализа фрагментов нуклеотидных последовательностей L сегментов 5 штаммов вируса ККГЛ группирование штаммов идет по географическому признаку. Получены свидетельства о возможности реассортации сегментов в эволюционной истории вируса ККГЛ.

3. Получен вариант штамма Ходжа, адаптированный к клеткам Vero-Еб, который оказывает выраженное ЦПД, а также обладает более быстрым и высоким уровнем репродукции в этих клетках.

4. При репродукции вируса ККГЛ (штамм Ходжа) в культуре клеток Vero-E6 синтезируются вирусспецифические белки с молекулярными массами 180 кДа, 110 кДа, 83 кДа, 78 кДа, 55-57 кДа, 45 кДа, 42кДа, 36 кДа, 23 и 21 кДа. Вирусспецифические белки вируса ККГЛ 110 кДа, 83 кДа, 78кДа, 55-57 кДа являются гликопротеинами, а белки 83 кДа и 78кДа гликозилированы по N-типу. Белок 55 кДа является нуклеокапсидным белком N, гликопротеин 78 кДа - структурным поверхностным белком G1, а белок 36 кДа - структурным поверхностным белком G2.

5. Сконструированы праймеры для специфической идентификации РНК М и S сегментов основных циркулирующих генотипов вируса ККГЛ с помощью метода ОТ-ПЦР. т

БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую благодарность кбн Каргановой Г.Г. и кмн Смирновой С.Е. за научное руководство, постоянное внимание и поддержку. Также благодарю сотрудника ИПиВЭ им. М.П.Чумакова кбн Гмыля А.П. и английского коллегу R.Hewson за помощь и участие в настоящей работе. Я глубоко признательна академику РАМН Лашкевичу В.А. за плодотворные научные дискуссии. 0

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гмыль, Лариса Вениаминовна, 2003 год

1. Василенко С.М., Чумаков М.П., Бутенко A.M. и др. (1968) К вопросу об этиологии Крымской геморрагической лихорадки в Болгарии. Матер. XV научн. Сессии ИПВЭ АМН СССР. М., 3: 56-57.

2. Василенко С.М., Кацаров Г., Михайлов А. и др. (1971) Изучение Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) в Болгарии. «Вирусные геморрагические лихорадки», М., 100-111.

3. Вышемирский О.И. (1993) Анализ антигенной структуры штаммов вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью моноклональных антител. Автореф. дис. к.м.н., М.

4. Дзагурова Т.К, Ткаченко Е.А., Петров В.А. (1988) Эффективность применения культуральных антигенов для серодиагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом с помощью метода иммунофлюоресценции. Вопр. Вирусол., 6: 71-75.

5. Маркешин С.Я., Смирнова С.Е., Евстафьев И.П. (1991) Оценка состояния природного очага крымской-конго геморрагической лихорадки в Крыму. ЖМЭИ, 9: 47-50.

6. Остерман Л. А. (1981) Исследование белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Наука, М., с. 286. Пак Т.П. и Михайлова Л.И. (1973) Крымская геморрагическая лихорадка в Таджикистане. Инфорн, Душанбе, с. 153.

7. Пак Т.П. (1980) Обзор контактных заражений Крымской геморрагической лихорадкой и лихорадкой Конго. «Экология вирусов Казахстана и Средней Азии», Алма-Ата: 26-29.

8. Прокудина Е.Н., Семенова Н.П., Чумаков В.М., Руднева И.А. (2001) Внеклеточный иммунореактивный нуклеопротеин вируса гриппа, не связанный с вирионами. Вопр. вирусол., 3:21-26.

9. Татарская Г.А., Резников О.Ю., Милютин В.Н., Кухарчук О.Н. (1972) Изучение Крымской геморрагической лихорадки на клеточной культуре лейкоцитов человека. ИПВЭ АМН СССР. Науч. Сессия, 17-я: Тезисы докладов: 371.

10. Чумаков М.П., Бутенко A.M., Шалунова Н.В. и др. (1968) Новые данные о вирусе возбудителе крымской геморрагической лихорадки (КГЛ). Ж. Вопр. вирусол., 3:37.

11. Чумаков М.П. (1971а) Некоторые итоги изучения этиологии и иммунологии крымской геморрагической лихорадки. Труды ИПВЭ АМН СССР. М., том XIX: 7-20.

12. Чумаков М.П. (1979) Вирусные геморрагические лихорадки (научный обзор). ВНИИМИ. М.: 10-33.

13. Шанмугам Д. (1974) Распространение вируса группы ККГЛ-Конго, Брахджа и Дрохи в некоторых штатах Индии (по серологическим данным). Автореф. дис. к.м.н., М.

14. Begum F., Wisseman C.L., Casals J. (1970) Tick-borne viruses of West Pakistan. II. Hazara virus, a new agent isolated from Ixodes redikorzevi tick from the Kaghan Valley, W. Pakistan. Amer. J. Epidemiol, 92: 192-194.

15. Booth Т., Gould E., Nuttall P. (1991) Structure and morphogenesis of Dugbe virus (Bunyaviridae, Nairovirus) studied by immunogold electron microscopy of ultrathin cryosections. Virus. Res., 21: 199-212.

16. Buckley A., Higgs S., Gould E.A. (1990) Dugbe virus susceptibility to neutralization by monoclonal antibodies as a marker of neurovirulence in mice. Arch. Virol. (Suppl.l), 197-205.

17. Cash P., Vezza A., Gentsch J., et al. (1979) Genome complexities of the three mRNA species of snowshoe hare bunyavirus and in vitro translation of S mRNA to viral N polypeptide. J. Virol., 31: 685-694.

18. Cash P. (1985) Polypeptide synthesis of Dugbe virus, a member of the Nairovirus genus of the Bunyaviridae. J.Gen. Virol., 66: 141-148.

19. Chandler L.J., Hogge G., Endres M., Jacoby, D. R., Nathanson, N., Beaty, B. J. (1991). Reassortment of La Crosse and Tahyna bunyaviruses in Aedes triseriatus mosquitoes. Virus Res. 20: 181-191.

20. Chumakov M. P. (1963) Study of viral haemorrhagic fevers. J. Hyg. Epidemiol., 7: 125-140.

21. Chumakov M.P., Smirnova S.E., Tkachenko E.A. (1970) Relationship betweenstrains of Crimean haemorrhagic fever and Congo viruses. Acta Virol., 14: 82-85.

22. Clerx J.P.M. and Bishop D.H.L. (1981a) Qalyub Virus, a Member of the Newly

23. Proposed Nairovirus Genus (Bunyaviridae) Virology, 108: 361-372.

24. Clerx J.P.M. and Bishop D.H.L. (1981b) Structural Characteristics of Nairoviruses

25. Genus Nairovirus, Bunyaviridae). J.Gen. Virol., 55:165-178.

26. Collett M.S., Purchio A.F., Keegan K., et al. (1985) Complete nucleotide sequenceof the M RNA segment of Rift Valley fever virus. Virology, 144:228-245.

27. Cousey J.O.R., Kemp G.E., Madbouly M.H., David-West T.S. (1970) Congo virusfrom domestic livestock, african hedgehog and arthropods in Nigeria. Amer. J. Trop.

28. Med. and Hyg., 19: 846-850.

29. El-Ghorr A.A., Marriot A.S., Ward V.K., Booth T.F., Higgs S., Gould E.A., Nuttall P.A. (1990) Characterization of Dugbe virus by biochemical and immunochemical procedures with monoclonal antibodies. Arch. Virol. (Suppl.l): 169-179.

30. Elliott R.M. (1985) Identification of nonstructural proteins encoded by viruses of the Bunyamwera serogroup (family Bunyaviridae). Virology, 143: 119-126.

31. Elliott R.M. (1989) Nucleotide sequence analysis of the large (L) genomic RNA segment of Bunyamwera virus, the prototype of the family Bunyaviridae. Virology, 173:426-436.

32. Elliott R.M. (1990) Molecular biology of the Bunyaviridae. J.Gen. Virol., 71: 501522.

33. Ellis D.S., Shirodaria P.V., Fleming E., et al. (1988) Morphology and development of Rift Valley fever virus in Vero cell cultures. J. Med. Virol., 24:161-174. Fenner R. (1975) The classification and nomenclature of viruses. Intervirology., 6: 1-12.

34. Fazakerley J.K. and Ross A.M. (1989) Computer analysis suggests a role for signal sequences in processing polyproteins of enveloped RNA viruses and as a mechanism of viral fusion. Virus Genus, 2:223-239.

35. Foulke R.S., Rosato R.R., French G.R. (1981) Structural polypeptides of Hazara virus. J.Gen. Virol., S3: 169-172.

36. Jin H. and Elliott R.M. (1991) Expression of functional Bunyamwera virus L protein by recombinant vaccinia viruses. J. Virol., 65:4182-4189.

37. Jin H. and Elliott R.M. (1993) Characterization of Bunyamwera virus S RNA that is transcribed and replicated by the L protein expressed from recombinant vaccinia virus. J. Virol., 67:1396-1404.

38. Kitajima E.W., Resende R.D., de Avila A.C., et al. (1992) Immuno-electron microscopical detection of tomato spotted wilt virus and its nucleocapsids in crude plant extracts. J. Virol. Meth., 38: 313-322.

39. Klenk H.D. and Garten W. (1994) Host cell proteases controlling virus pathogenicity. Trends in Microbiol., 2(2): 39-43.

40. Kormelink R., de Haan P., Meurs C., et al. (1992) The nucleotide sequence of the M RNA segment of tomato spotted wilt virus, a bunyavirus with two ambisense RNA segments. J. Gen. Virol., 73:2795-2804.

41. Marriott A.C., Polyzoni Т., Antoniadis A., Nuttall P.A. (1994) Detection of human antibodies to Crimean-Congo haemorrohagic fever virus using expressed viral nucleocapsid protein. J.Gen. Virol., 75:2157-2161.

42. Marriott A.C. and Nuttall P.A. (1996a) L RNA segment of Dugbe nairovirusencodes the putative RNA polymerase. J.Gen. Virol., 77: 1775-1780.

43. Marriott A.C. and Nuttall P.A. (1996b) Moleculare biology of nairovirus. In "The

44. Bunyaviridae". (Elliot R.M., ed.)New York: Plenum Press: 91-104.

45. Montreuil J. (1995) The history of glycoprotein research, a personal view. In

46. Glycoproteins". New comprehensive biochemistry. (A. Neuberger and L.L.M.

47. Deenen, ed.) 29a, Elsevier: 1-23.

48. Morikawa S., Qing Т., Xinqin Z., Saijo, M., Kurane, I. (2002) Genetic diversity of the M RNA segment among Crimean-Congo hemorrhagic fever virus isolates in China. Virology, 296:159-164.

49. Miiller R., Poch O., Delarue M., et al. (1994) Rift Valley fever virus L segment: Correction of the sequence and possible functional role of newly identified regions conserved in RNA-dependent polymerases. J. Gen. Virol., 75:1345-1352.

50. Mtiller R., Saluzzo J.F., Lopez N., et al. (1995) Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg., 53:405-411.

51. Papa A., Bozovi В., Pavlidou V., Papadimitrou E., Pelemis M., Antoniadis A. (2002a) Genetic detection and isolation of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Kosovo, Yugoslaia. Emerg. Infect. Dis., 8(8): 852-854.

52. Papa A., Ma В., Kouidou S., Tang Q., Hung C., Antoniadis A. (2002b) Genetic characterization of the M RNA segment of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus strains. Chine. Emerg. Infect. Dis., 8: 50-53.

53. Petrova I.D., Seregin S.V., Kuzina I.I., Vyshemirski O.I., Lvov D.K., Tyunnikov G.I., Gutorov V.V., Yashina L.N., Netesov S.V., Petrov V.S. (2003) Direct Genebank Submission (14-JUL-2003).

54. Pettersson R.F. and Melin L. (1996) Synthesis, assembly and intracellular transport of Bunyaviridae membrane proteins. In The Bunyaviridae. (Elliot R.M., ed.) New York: Plenum Press: 159-188.

55. Plyusnin A., Vapalahti O., Vaheri A. (1996) Hantaviruses: genome structure, expression and evolution. J. Gen. Virol., 77: 2677-2687.

56. Ronnholm R. and Pettersson R.F. (1987) Complete nucleotide sequence of the M RNA segment of Uukuniemi virus encoding the membrane glycoproteins G1 and G2. Virology, 160: 191-202.

57. Schmaljohn C.S. and Hooper J.W. (2001) Bunyaviridae: the viruses and their replication. In "Fields virology", vol. 2, (D.M. Howley, ed.), Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.: 1581-1602.

58. Shepherd A.J., Swanepoel R., Shepherd S.P. (1987a) Field and laboratory investigation of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (Nairovirus, family Bunyaviridae) infection in birds. Truns. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 81: 1004-1007.

59. Shepherd A.J., Swanepoel R., Shepherd S.P., Lemon P.A., Mathee O. (1991) Viraemic transmission of Crimean-Congo haemorrhagic fever virus to ticks. Epidemiol. Infect., 106:373-382.

60. Smirnova S.E., Zubri G.L., Savinov A.P., Chumakov M.P. (1973) Pathogenesis of experimental Crimean haemorrhagic fever infection in newborn white mice. Acta Virol., 17:409-415.

61. Smirnova S.E. (1979) A comparative study of the Crimean hemorrhagic fever -Congo group of viruses. Arch. Virol., 62:137-143.

62. Smirnova S.E. and Karavanov A.S. (1985) Detection of Crimean haemorrhagic fever virus antigen by solid phase enzyme immunosorbent assay. Acta Virol., 29: 87-90.

63. Swanepoel R., Struthers J.K., Shepherd A.J., McGillivray G.M., Nel M.J., Jupp P.G. (1983) Crimean-Congo hemorrhagic fever in South Africa. Am. J. Trop. Med. Hyg., 32: 1407-1415.

64. Swanepoel R., Shepherd A.J., Leman P.A., Shepherd S.P., McGillivray G.M., Erasmus M.J., Searle L.A., Gill D. (1987) Epidemiologic and clinical features of Crimean-Congo hemorrhagic fever in southern Africa Am. J. Trop. Med. Hyg., 36: 120-132.

65. Swanepoel R., Leman P.A., Burt F.J., Jardine J., Verwoerd D.J., Cpua I., Bruckner G.K., Burger W.P. (1998) Experimental infection of ostriches with Crimean-Congo haemorrhagic fever vims. Epidemiol. Infect., 121(2): 427-432.

66. Ward V.K., Marriott A.C., El-Ghorr A.A., Nuttall P.A. (1990) Coding strategy of the S RNA segment of Dugbe virus (Nairovirus; Bunyaviridae). Virology', 175: 518524.