Нуклеозиды, модифицированные периленом и (фенилэтинил)пиренами по 2`-положению: синтез и спектральные свойства в составе флуоресцентных олигонуклеотидных зондов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Астахова, Ирина Владимировна

• Астахова, Ирина Владимировна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Астахова, Ирина Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Нуклеозиды, модифицированные по сахару флуоресцентными полициклическими углеводородами и другими метками: синтез и свойства в составе олигонукпеотидов (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

I. Аналоги нуклеозидов, модифицированные 1-пнрсннлметнлы1ой группой.

II. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через амндную, карбаматную и карбамндную связь.

III. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через тпольиую группу.

IV. Функционалнзнрованные производные конформацнонно-блокнрованных нуклеиновых кислот (LNA).

V. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через трназольнуго группу.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Нуклеозиды, модифицированные периленом и (фенилэтинил)пиренами по 2`-положению: синтез и спектральные свойства в составе флуоресцентных олигонуклеотидных зондов»

В последние годы стремительно развивается химия модифицированных нуклеиновых кислот, что в значительной степени вызвано расширением области их практического применения. Они все чаще используются в молекулярной и физико-химической биологии и смежных областях знания. Для исследования взаимодействий различных биомолекул, в том числе нуклеиновых кислот, все более широкое применение находят нерадиоизотопные люминесцентные метки. Их предел детекции на современном оборудовании сравним с таковым для радиоизотпных меток, и, кроме того, они обладают рядом преимуществ (неограниченная стабильность, возможность автоматизации процедур модификации и детекции, возможность определения в режиме реального времени и др.).

До недавнего времени модифицированные флуоресцентные метки редко использовались в качестве зондов для исследований нуклеиновых кислот, что во многом было связано с трудоемкостью синтеза и отсутствием стабильных конъюгатов красителей с НК. Создание химического автоматизированного синтеза НК подтолкнуло дальнейшее развитие химии модифицированных олиго- и полинуклеотидов - в настоящее время химические и ферментативные методы их синтеза разработаны в такой степени, что путем их комбинирования в короткие сроки могут быть получены фрагменты ДНК любой длины и практически любого состава. При этом возможно направленное введение меток в заданные положения синтезируемых нуклеотидных последовательностей.

Ранее в качестве люминесцентных меток для НК использовались в основном гидрофильные ксантеновые красители (флуоресцеин, родамин и др.). Их флуоресценция в водных растворах зависит от рзависит от полярности микроокружения. Более перспективными для непосредственной детекции гибридизации оказались полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), характеризующиеся стабильностью в условиях автоматизированного олигонуклеотидного синтеза, высокими молярными коэффициентами поглощения и квантовыми выходами флуоресценции. Кроме того, в водных растворах флуоресценция ПАУ в составе НК сильно зависит от ближайшего пространственного окружения, так как полициклические ароматические углеводороды способны к нековалентным взаимодействиям с НК. Например, ПАУ способны интеркалировать между парами оснований или связываться в бороздки двойной спирали ДНК. Их участие в стэкинг-взаимодействиях подтверждается увеличением стабильности дуплексов и изменением спектров флуоресценции. ПАУ могут образовать эксиплексы (сокращ. excited complex — возбужденный комплекс) с гетероциклическими основаниями НК. Помимо этого при сближении двух остатков ПАУ на расстояние ~ 3,5 Á происходит образование эксимера (сокращ. excited dimer - возбужденный димер). Интеркаляция в двойную спираль ДНК, образование эксимеров и эксиплексов вносят существенные изменения в спектры флуоресценции конъюгатов ПАУ с нуклеиновыми кислотами, что делает ПАУ ценным инструментом для изучения изменений пространственной структуры НК в ходе гибридизации с образованием дуплексов и триплексов, взаимодействия с белками, пептидами и смешанными биополимерами. Систему я-сопряжения ПАУ легко расширить путем химической функционализации, что может привести к синтезу соединений с совершенно другими флуоресцентными свойствами, т. е. к новым красителям.

Среди ПАУ, использующихся для детекции взаимодействий НК, лидирующую позицию, бесспорно, занимает пирен — тетрациклический ароматический углеводород. Пирен характеризуется большим временем жизни возбужденного состояния (до нескольких сотен микросекунд в зависимости от окружения и полярности растворителя). В последние годы его все более активно используют для модификации как основания нуклеотида, так и различных положений фуранозного кольца.

Другим ПАУ, обладающим интересными спектральными свойствами, является перилен — пентациклический ароматический углеводород, характеризующийся высоким квантовым выходом флуоресценции, фотостабильностыо и длинноволновым сдвигом спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с пиреном. Последнее свойство является особенно интересным, так как открывает возможность использования биомолекул, меченных периленом, для экспериментов in vivo.

Диссертация посвящена совершенствованию флуоресцентных меток — производных пирена и исследованию флуоресцентных свойств периленовой метки в ДНК. Получены три класса флуоресцентных реагентов для амидофосфитного автоматического твердофазного синтеза на основе а/?абгшоуридин-2'-карбаматов, уридина и LNAQocked nucleic acid)-нуклеозидов, содержащих различные (фенилэтинил)пирены и перилен, присоединенные по положению 2 сахара (2'-положенига нуклеозида). Эти реагенты позволяют получить олигонуклеотиды, при гибридизации которых с НК, красители с улучшенными по сравнению с пиреном спектральными характеристиками располагаются в большой или малой бороздке у дуплексов. Целью работы был синтез олигонуклеотидных зондов с помощью данных реагентов и изучение спектральных свойств полученных конъюгатов.

Литературный обзор посвящен рассмотрению публикаций, в которых нуклеозиды модифицировали ПАУ и другими метками по сахару.

Нуклеозиды, модифицированные по сахару флуоресцентными полициклическими углеводородами и другими метками: синтез и свойства в составе олигонуклеотидов

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

В настоящее время для изучения взаимодействий нуклеиновых кислот с различными биомолекулами как in vitro, так и in vivo широко используются нуклеозиды, модифицированные флуоресцентными красителями и метками различной природы. Для изучения химических и физических взаимодействий, обеспечивающих функционирование нуклеиновых кислот в клетке, широко используются химически модифицированные аналоги нуклеозидов. Для этих целей синтезирован большой набор подобных веществ, среди которых значительное место занимают нуклеозиды с ковалетно присоединенными полициклическими ароматическими углеводородами.

Известно много методов синтеза меченых нуклеозидов и нуклеиновых кислот, но поскольку они находят все более широкое использование, остается актуальной и разработка новых меток и способов их введения в состав нуклеозидов и нуклеиновых кислот.

Долгое время одним из основных препятствий в исследованиях нуклеиновых кислот с помощью флуоресцентных меток было отсутствие специфических стабильных конъюгатов красителей с ДНК. В одной из ранних работ, посвященной синтезу и исследованию свойств подобных конъюгатов, на первой стадии проводилась модификация 3'-концевого сахара в молекулах тРНК и рРНК, выделенных из 70S и löS-субъединиц рибосомы Е. coli [1]. 4-(Пирен-1-ил)масляную кислоту (1) этерифицировали этанолом и полученный эфир 2 обработкой водным гидразином превращали в гидразид 3 (схема 1). Альдегидные группы на РНК получали окислением периодатом натрия З'-конецевого рибонуклеотида. Окисленные РНК 8 вводили во взаимодействие с флуоресцентными реагентами — гидразидом пиренбутановой кислоты (3), моносемикарбазидом профлавина (4), гидразидом (8-амино-бензо-[Ь][1,8]нафтиридин-2-ил)-моноянтарной кислоты (5) и антрацен-9-карбоксальдегидкарбогидразоном (6). В качестве примера на схеме 1 приведен синтез пиренового производного тРНК 9. в он он

Схема 1.

Ю4 рН 5.5

НгМ^НС(СН2)3Руг

5\ 3' О

ГРНО^о-Р-О

N N-1^ О м

Р$ = -МНС(СН2)3Ру|

Для модификации раствор гидразида 1 в БМБО прибавляли к раствору окисленной тРНК в 0.05 М водном №ОАс. В результате реакции было достигнуто соотношение краситель/тРНК 0.62 (определено по изменению поглощения тРНК после конъюгации с красителем). Следует также отметить, что для того чтобы отмыть З'-З-тРНК от нековалентно связанного с ней красителя, потребовалось провести 6 переосаждений из этанола.

Авторы также исследовали спектральные свойства полученных конъюгатов. Максимумы поглощения и флуоресценции присоединенных красителей приведены в табл. 1.

Таблица 1. Свойства конъюгатов тРНК.*

Краситель Краситель/тРНК ^тахВЬ\ НМ е, л-моль^-см"1 ^тах^ НМ Фу

3 0.62 348 36500 397 0.023

4 1.20 445 4600 516 0.021

5 1.20 457 13100 528 0.012

6 0.63 393 8000 456 0.017 ^тах"1" - максимум поглощения, ?чпахСт - максимум флуоресценции, е - молярный коэффициент поглощения, Фу- квантовый выход флуоресценции. Значения е приведены для свободных красителей.

В зависимости от природы хромофора значения "тпах И ^тах ВарЬИрОВЗЛИСЬ В широких пределах. Однако по сравнению с аналогичными тРНК, модифицированными флуоресцеинизотиоцианатом (РГГС), для синтезированых флуорофоров наблюдались значительно более низкие квантовые выходы. Кроме того, в случае конъюгатов 3-тРНК при определенных условиях происходило сильное тушение флуоресценции. Авторы предположили, что эти эффекты вызываются пространственным взаимодействием метки с окружающими ее основаниями [1].

Те же авторы указывают на возможность исследования конфигурации 3'-концевых участков РНК в биополимерах путем введения в их структуру пиреновых флуорофоров [2]. В данной работе описывается синтез конъюгатов, образованных З'-окислеными тРНК E.coli и гидразидами пиренбутановой (3) и пиренуксусной кислот. При введении этих групп в РНК спектр поглощения красителей сдвигался в красную область. Кроме этого, была обнаружена чувствительность РНК-зондов к вторичной структуре РНК. Так, отмечены изменения в спектрах флуоресценции конъюгатов 3-ро1у(А) и 3-ро1у(С) в зависимости от pH, которые при этом переходят из одноцепочечной в двухцепочечную форму, что подтверждает, что пирен, входящий в полинуклеотидную цепь, «чувствует» геометрические изменения ближайшего окружения.

I. Аналоги нуклеозидов, модифицированные 1-пиренилметилыюй группой

С момента выхода в свет работ [1,2] методы синтеза и модификации фрагментов ДНК и РНК были значительно усовершенствованы. С появлением автоматизированного синтеза таких фрагментов стала актуальной разработка реагентов, позволяющих вводить метку в стандартных условиях автоматического синтеза. Так, в сообщениях [3, 4] описывается синтез олигонуклеотидов, содержащих флуорофор в 2'-положении сахара, при помощи амидофосфитного реагента 14, непосредственно использующегося в твердофазном синтезе (схема 2). о о о о

Схема 2,

3 ',5 '-Ди-О-тритилуридин 10 вводили в реакцию с 1-хлорметилпиреном 11 в щелочных условиях. Продукт присоединения деблокировали 80% уксусной кислотой при 100 °С. 5'

Гидроксил полученного с выходом 65% 2'-(1-пиренилметил)уридина защищали 4,4'-диметокситритильной группой. Нуклеозид 13 фосфитилировали по стандартной методике бис(диэтиламино)хлорфосфином.

Эффективность конденсации реагента 14 была заметно хуже, чем стандартных амидофосфитов. Целевые 8-звенные олигонуклеотиды (15-21), содержащие 1-пиренилметильный флуорофор, отщеплялись от подложки и деблокировались в стандартных условиях (водный аммиак, 55°С, 12 ч), после чего были выделены в чистом виде методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Из этих коъюгатов и комплементарной им последовательности ро1у(А) были получены дуплексы и изучены их свойства [3, 4]. Было замечено, что время жизни возбужденного состояния пирена при образовании комплекса с ро1у(А) значительно увеличивалось.

Таблица 2. Термическая стабильность дуплексов олигонуклсотлдов, содержащих 2'-0-(пирснилмстил)уридин.

Дуплекс т °г 1 т> ^ сШ(руг)СТАСАСС (15) + dCCTCTAGAGTCGACCT1 22.5 сГГСТАСАСС + ^СТСТАСАСТССАССТ1 22.5 сЮ(руг)ССАСТСТАСАСС (16) + ^СТСТАСАСТССАССТ1 52.5 с1ТССАСТСТАСАСС + сЮСТСТАСАСГССАССТ1 47.5 сЮ(руг)ТТТТТТТ (17)+ ро1у(А)2 13.5 сПТТТПТТ + ро1у(А)2 12.5 с1ТТи(руг)ТТТТТТТ (18) + ро!у(А)3 18.4 с! и(руг)ТТТТТТТТТ (19) + ро!у(А)3 25.1 с1Т'ПТТТТТТТ + ро1у(А)3 23.5

Все измерения проводились для растворов олигонуклеотидов и комплементарных последовательностей 1:1 в 0.1 М ЫаС! и 0.01 М фосфате натрия (рН 7). Значения Тга получены из спектров поглощения при 260 нм. 1 Концентрация 6.0><10"бМ.2 Концентрация 2.0хЮ"4М.3 Концентрация нуклеотида 6.6x10"5 М.

Профиль плавления дуплекса конъюгата 16 с комплементарной ДНК при 260 нм и 350 нм представляет собой такую же сигмоидальную кривую, как и в случае немодифицированного дуплекса, что свидетельствует о том, что пирен, входящий в состав дуплексов, взаимодействует с соседними гетероциклическими основаниями.

Те же авторы опубликовали данные по интенсивности флуоресценции и временам жизни возбужденного состояния олигонуклеотидов с пиренилметильной группой, присоединенной по 2'-0-положению сахара [5].

При образовании дуплексов, содержащих пирен в 5'-концевом сахаре наблюдалось значительное увеличение интенсивности флуоресценции, а также квантовых выходов, особенно в случае дуплекса 22/ро1у(А). Авторы объясняют это тем, что пирен частично интеркалирует между соседними парами оснований.

Конформации дуплексов олигомеров 21, 22 с ро1у(А) олиготимидилата и ро!у(А). Однако дуплекс, образованный олигонуклеотидом 21, имеет совершенно другой профиль. Из этого можно сделать вывод о том, что в дуплексе 22/ро1у(А) пиреновый флуорофор не нарушает конформацию двойной спирали. Обратная ситуация наблюдается для дуплекса 21/ро1у(А).

Дальнейшие исследования олигонуклеотидов, содержащих 2'-0-(1-пиренилметильную) метку, показали, что при образовании дуплексов с РНК происходит резкое возрастание интенсивности флуоресценции, тогда как при гибридизации того же олигомера с комплементарной ДНК возрастание эмиссии не наблюдается [6-8]. Подобный рост интенсивности флуоресценции в РНК-дуплексах можно использовать для отличия РНК от ДНК. Квантовые выходы флуоресценции также были выше в случае дуплексов с РНК (0.098-0.119), чем в дуплексах с ДНК (0.004-0.007) [8].

На примере 9-звенного олигодезоксинуклеотида, содержащего пиреновую модификацию в центральной позиции, была продемонстрирована разница в аффинности подобных конъюгатов по отношению к ДНК и РНК. Введение пиренового флуорофора в двойную спираль не нарушало В-форму, напротив - наблюдалась дополнительная стабилизация (Тш возрастала на 2-13 °С), причем особенно в случае, когда рядом с пиреном были расположены пуриновые основания [9]. Гетеродуплексы ДНК/РНК были дестабилизированы на 1-10 °С. Методами КД, *Н ЯМР (ЪГОЕЗУ) и молекулярного моделирования было показано, что пирен интеркалирует в ДНК-дуплексы и располагается вне РНК/ДНК-дуплексов [9, 10]. Отсутствие или наличие стэкинг-взаимодействия оказывает влияние на флуоресцентные свойства [6-8].

РНК олигомеры, содержащие от двух до четырех 2'-0-(1 -пиренилметильных) групп, образуют прочные дуплексы с комплементарными последовательностями РНК [11]. Спектры поглощения, флуоресценции и КД этих комплексов, а также молекулярное моделирование показали, что введенные пиреновые остатки распологаются вне РНК/РНК дуплексов, образуя спиральные ароматические ассоциаты вдоль малой бороздки. В спектрах флуоресценции таких поли-модифицированных дуплексов наблюдалась интенсивная эксимерная эмиссия были исследованы методом кругового При этом профиль КД дуплекса содержащего и(руг) в 5'-концевом нуклеотиде, схож с профилем КД немодифицированного дуплекса

0-Р=0 о

20 и(руг) I 111111

21 ТТЦ(руг) I I I I I I I

22 и(руг) I I 11 I I I I I О пиреновых агрегатов, интенсивность которой зависела от нуклеотидной последовательности синтезированных олигонуклеотидов.

Пиренилметильные группы присоединялись также по 3'- и 5'-положениям сахара [12]. Для этого были получены 5'-(1-пиренилметил)тимидин З'-фосфобисэтилдиамидофосфит (23) и 5'-диметокситритил 3'-(1-пиренилметил)уридин, связанный с твердой фазой (24).

Для введения пиренового флуорофора в 5'-положение сахара был синтезирован 3'- ОТ) в

ОТ диметокситритилтимидин, который 1 т ° реагировал с 1-хлорметилпиреном в присутствии гидроксида калия. После этого 4,4'-диметокситритильную защиту удаляли 80% уксусной кислотой, а полученный нуклеозид фосфитилировали. Амидофосфитный реагент использовали в твердофазном олигонуклеотидном синтезе.

2',5'-Ди-0-тритилуридин - исходное соединение для синтеза реагента 24 -также алкилировали хлорметилпиреном. Выделенный продукт реагировал с БМТ-С1, после чего БМТ-производное было ковалентно присоединено по 2'-ОН-группе к твердофазному носителю, содержащему аминопропильный линкер. С помощью этого твердофазного носителя были синтезированы олигомеры с пиреновой меткой на 3'-конце.

Были изучены спектральные свойства 1-пиренилметилыюй группы, присоединенной по 3' и 5'-положениям сахара. Известно, что гомопиримидиновые олигонуклеотиды могут связываться с двойной спиралью гомопуриновых и гомопиримидиновых ДНК, располагаясь при этом в большой бороздке. При образовании триплекса ДНК с модифицированным олигонуклеотидом наблюдалось значительное увеличение интенсивности флуоресценции. Авторы объясняют это тем, что короткий (метиленовый) мостик направляет пирен в большую бороздку ДНК, и тушение его флуоресценции не происходит за счет взаимодействия с гетероциклическими основаниями. Кроме этого, у триплексов с 1-пиренилметильной группой наблюдалось увеличение температуры плавления на 2-8 °С по сравнению с немодифицированным триплексом [13]. Отсутствие дестабилизирующего эффекта и изменение флуоресценции при связывании делают пирен-меченные олигопиримидины удобными для распознавания специфических последовательнорстей ДНК.

Ль1 N О

23

0-Рч=0

0-Рч=0 о

-О СЖ' в и

РМТСЦ I

5'-(руг)ТСССАААААССТССС 25, Р = 1^пиренилметил,

Р'=-р-он ,р = Н

5'-СССССТООТС6АСТи(руг) & 5'-ССССЗТССТССАСи(руг) 26& 27, ^ = 1-пиренилметил Р = Н, [Г = ОН

24

Интересно также отметить, что 5'-0-модифицированный 1-пиренилметильной группой гексадезоксирибонуклеотид d(T*(pyr)GGGAG) проявил противовирусную активность по отношению к ВИЧ-1 [14]. Методом спектроскопии КД было установлено, что ароматический заместитель в 5'-0-положении гексамера способствует образованию структуры, состоящей из четырех цепей (G-квадруплекс). При замене Т*(руг) на немодифицированный тимидин в спектре КД квадруплекс не наблюдался; кроме того, немодифицированный гексамер и модифицированный алифатическими заместителями не проявлял противовирусную активность.

Для высокоспецефичного распознавания участков РНК было предложено использовать дважды меченные пиреном 2-О-метилолигорибонуклеотиды (28) [15]. В качестве мишени была выбрана 5S-pPHK Е. coli. Так, при образовании комплементарных комплексов олигомеров 28 наблюдалось возрастание эксимерной эмиссии в 43 раза в сравнении с одноцепочечным 28. На основании этого авторы предполагают, что подобные зонды могут быть использованы для изучения образования вторичной структуры РНК.

Еще одним примером использования флуоресцентно меченных олигонуклеотидов для биохимических исследований является изучение механизма катализа рибозимов на примере взаимодействия пирен-меченных тетра- и пентануклеотидов с L-21 Scal-рибозимом Tetrahynema thermophilic! в зависимости от концентрации 5'-монофосфата гуанозина (pG) и ионов

Mg'" [16]. Было установлено, что pG усиливает связывание CCUC(dU(pyr))A с L-21 Seal. Авторы высказали предположение, что в отсутствие pG связывание 6-нуклеотидных субстратов происходит по одностадийному механизму, включающему только образование двойной спирали, а при прибавлении pG олигонуклеотид образует с комплементарным участком рибозима двойную PI-спираль, а затем происходит ее включение в каталитическое ядро.

В более поздней работе те же авторы описали исследование скоростей ассоциации и диссоциации комплекса пирен-меченого субстрата pyrCUCU с L-21 Seal [17]. Был получен ряд термодинамических и кинетических параметров. Результатом проделанной работы стала дополнительная информация о спецефических третичных взаимодействиях, необходимых для связывания субстрата с каталитическим участком рибозима.

II. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через амидную, карбаматную и карбамидиую связь

При введении флуоресцентной метки в нуклеиновые кислоты посредством ковалентой связи часто используется «гибкий», подвижный линкер между нуклеотидом и флуорохромом (например, метиленовая группа). Однако иногда необходимо наличие жесткого спейсера между между остатком красителя и нуклеотидом, способствующего ограниченной подвижности флуорохрома в двойной спирали. Это способствует сохранению корреляции между нуклеиновой кислотой и флуорохромом при измерении анизотропии флуоресценции, и в некоторых случаях приводит к образованию более прочных дуплексов. Синтез производных нуклеозидов, в которых фиксированное расположение красителя достигается с помощью амидной связи, является одним из первых шагов в этом направлении. Помимо короткой длины, достоинствами амидного линкера являются химическая стабильность, жесткость и незаряженность.

А^-ацилирование 5'-^-защищенного производного 2'-амино-2'-дезоксиуридина 29 использовалось для синтеза модифицированных нуклеотидов 32а-е, содержащих различные заместители в 2'-положении (схема 3) [18]. Для этого исходный нуклеозид 29 вводили в реакцию с соответствующими карбоновыми кислотами в присутствии ЭСС или ЕБС в качестве конденсирующих реагентов с последующим фосфитилированием полученных амидов ЗОа-е. Амидофосфитные реагенты 31а-е использовались в твердофазном синтезе ДНК- и ДНК-КБНК олигонуклеотидов, содержащих дополнительную модификацию 33. о о о о

IТ г\н Г^Г

Н'РСС'ЕРС.>' ^Ь0^™. £5Г"П'ЦНЫЙ> но МН2 но ИНК , О МНР о N41*

А. ом

29 30а-г 31а-Г

Соединение 30а-32а 30Ь-32Ь 30с-32с 30с1-32с1 30е-32е ЗОКШ

Я: н О А/ Т } С<0)(СН2)14СН3 С(0)СН2МН2 п -п

КБНК мономер (33)

Схема 3.

Показано, что введение от одной до трех модификаций 32а-е в 9-мерные олигодезоксирибонуклеотиды заметно снижает их аффинность по отношению к комплементарным ДНК и РНК, в то время как дополнительное введение в те же последовательности трех мономеров 33 значительно увеличивает термическую стабильность дуплексов с РНК.

Наряду с использованием модифицирующих реагентов для введения метки в процессе синтеза олигодезоксирибонуклеотидов широко используется их постсинтетическая модификация. Однако этот подход, как правило, требует предварительного введения в состав олигонуклеотида реакционноспособной группы. Синтез четырех РНК-нуклеотидов, содержащих стандартные РНК основания и 2'-(2-аминоэтокси)-2'-дезокси группу, описан в работе [19] (схема 4, приведен синтез на примере уридина).

0 0 0 0 О м-^^омв [^м-'^-Аэме

Х > ° зХ т 0 зХ т

-»-«Ч 1 Оз 2 СР3С02Е1 Е^М

Ь-О^! риг(<]Ьа)2 и-10-и 2 №ВН, , С > 3 ТВАПНГ

А 1 Г п Д Т-Г 3 МэС!, Е1,М А >-г

У'Ь ^0АОМе у\ уь / 34 ' ' 35 ' I 36 но^ т ОМТО^ I т I 1 омг-и ру ПМТО I

V,0^1 2 (1-Рг2М)гР0С2Н4СЫ йС1 н ^

37 Т" 38

Схема 4.

Защищенный нуклеозид 34 аллилировали по 2'-гидроксилу с последующим озонолизом двойной связи, восстановлением альдегидной группы, синтезом азида 36 и реакцией Штаудингера (РРЬз, Н20). Полученный амин защищали трифторацетильной групой, силильную защиту удаляли обработкой ТВАР, после чего полученный нуклеозид 37 диметокситритилировали и фосфитилировали.

Амидофосфит 38 и три РНК аналога, синтез которых осуществлен в работе [19], являются полезными реагентами для автоматизированного синтеза олигонуклеотидов, содержащих (после удаления трифторацетильной защиты) свободную аминогруппу для постсинтетической модификаци различными заместителями.

В работе [20] приведен синтез амидофосфитного реагента 40 на основе 2'-амино-2'-дезоксиуридина (схема 5). и ô

NH

DMTO. I

OH nh2

39 i. » 56%

NH

Ao

DMTO^ | ОСНз

OCH3

NC' hno. Y

N(i-Pr)2 о

40

R = no2

1. Олигонуклеотидный синтез

2. Фотолиз о с

5-DMTO-d(TGT GAC G)-Ov

NH

N^O d(GTA CGC TA)-О NH2

41

1. Коньюгация

2. Деблокирование Г

N O

R = конъюгированная группа = твердо-фазная подложка

5-DMTO-d(TGT GAC G>-Ck I ^~*d(GTACGCTA)-0 HNVR 0 1

HN NH H

45

42-45

Схема 5. Реагенты и условия: (i) 4,5-диметокси-2-нитробензилхлорформиат, DIPEA, THF; (ii) ClP(i-Pr)2OC2H4CN, DIPEA, DCM.

С использованием этого реагента были получены 16-звенные олигомеры, содержащие 2'-аминогруппу, по которой далее были присоединены различные метки (42-45).

По описанному выше методу был синтезирован ряд конъюгатов пентануклеотидов для исследований ингибирования экспрессии генов [21]. о Ô х = nh

5'-OH4G0Me)-0. I

П3 H

48

Vt?

49

NO2

OMe

A^OMe

Л^о Jl^l о no2

50

Известно, что ингибирование происходит за счет гибридизации короткого нуклеотида с комплементарной последовательностью открытого lac UV5-комплекса, образованного ДНК и РНК-полимеразой (рис. 1). Авторы работы [23] синтезировали пентануклеотиды, содержащие способные к стэкингу и интеркаляции группы X, для того, чтобы увеличить за счет подобных взаимодействий стабильность итекромм* тр^ образующегося дуплекса. Максимальная г-т *к;тт тс*сс.г ингибиругощая способность была отмечена для р.тёН'^Ш щ,ЛПС6,г пентамера, содержащего модификацию 48. р*с 1

Посредством постсинтетической модификации альдегидной группы нуклеотида 52 получен ряд производных, в том числе содержащих модификации 53 и 54 (схема 6) [22]. Показано, что реакционная способность альдегидной группы при 2'-положении арабиноуридина аналогична той для изомерного рибонуклеотида. При этом отмечено, что введение 2'-0-(2-оксоэтил)арабинонуклеотидов в олигомеры не искажает локальной геометрии нуклеиновых кислот, что является ценным свойством, к примеру, для изучения ДНК-связывающих белков. о о о Л

1 г (V (V О

Маю, ^ °\-0~<Уч ЯСОМНМН; пл ? г Чит" » но н о

51 52 53,54

Схема 6.

Как уже упоминалось, флуоресценция ковалентно связанного пирена может быть использована для изучения образования вторичной и третичной структуры РНК. Примером подобного применения конъюгатов олигонуклеотидов с пиреном является исследование 160-нуклеотидной группы I Р4-Р6 домена интрона ТеГгаИупета [23]. В последовательности был выбран нуклеотид, модификация 2'-положения которого не нарушала конформацию структуры РНК, и синтезирован 15-звенный олигомер с 2'-аминогруппой в положении и 107 (схема 7). Модификацию проводили соединениями 55 и 56. олигонуклеотид пинии птп — I 1 ПТГП I' IЧ I |-| нм^^ + . тт1 1

Р4-Рв<руГ|

Схема 7.

При помощи этого зонда были изучены изменения, происходящие в конформации Р4— Р6 домена РНК, и количественные значения энергии активации этого процесса [24].

Для изучения третичной структуры РФ-Р6 домена были синтезированы олигомеры 57— 68, содержащие функционализированные пиреном 2'-амино- и 2'-(2-аминоэтокси)-нуклеотиды [25].

-0-,

О к 57-68

57

58

59

60

61 62 О

Луг но •-'мЛ^руг но

М^-^-руг Н О н о руг

63 -'о

64 ч

65 .

66

67 ч

68 ,

Как и в работе [24], для связывания полученных 15- и 24-звенные олигонуклеотидов, содержащих модификации 57-68 в различных положениях цепи с РФ-Р6-15(24) транскриптом использовалась Т4 ДНК-лигаза. С помощью флуоресценции пиреновой метки была дополнительно изучена зависимость образования третичной структуры РНК от концентрации Кроме того, на примере пирен-меченных последовательностей Р4—Р6

РНК было отмечено влияние длины и химической природы линкера на флуоресценцию хромофора. При образовании третичной структуры РНК максимальное увеличение интенсивности флуоресценции происходило в случае, когда остаток пирена присоединялся к нуклеотиду через длинные линкеры 66 и 68.

Пирен, присоединенный к тимидину по 4'-положению посредством короткого метиламидного линкера, может быть использован для определения мононуклеотидного полиморфизма отдельных генов (БЫР) [26]. Для этого путем постсинтетической модификации 4'-аминометилтимидина были синтезированы последовательности 69, содержащие модифицированный пиреном тимидин. Пирен был выбран в качестве флуорофора ввиду его способности к интеркаляции. Кроме того, флуоресценция пирена активно тушится расположенными рядом й-основаниями. Было установлено, что ° о следствием образования Уотсон-Криковской пары модифицированного тимидина с А является направленность флуорофора в малую бороздку; при этом пирен не может интеркалировать в двойную спираль из-за короткого линкера в 4'-положении. Напротив, когда происходит гибридизация модифицированной последовательности с олигонуклеотидом, содержащим некомплементарное 4'-РугТ основание (Т, О или С), гидрофобной пиреновой группе предпочтительней интеркалировать в спираль ДНК, разрушая ослабленные водородные связи. Эта интеркаляция вызывает сближение флуорофора с гертероароматическими основаниями и следовательно тушение флуоресценции. Авторы работы [26] наблюдали тушение флуоресценции пирена О-основаниями и, напротив, проявления А-типа флуоресценции 4'-РугТ-содержащих ДНК. Таким образом, 4'-Руг-тимидин может быть использован для выявления типов БИР в растворах.

Еще один пример использования зондов, меченных пиреном, описан в работе [27]. Авторы изучили взаимодействие 29-звенной последовательности 0 паромомицин, рибостамицин). Было обнаружено, что при 70 увеличении концентрации неомицина В происходит рост интенсивности флуоресценции пиреновой метки. Это объясняется тем, что в несвязанной ТАЯ-структуре пирен может находиться рядом с пиримидиновыми основаниями, которые тушат его флуоресценцию по известному механизму переноса электрона. При связывании с лигандом в ТАЯ-РНК происходят структурные изменения, в результате которых пирен удаляется от тушащего пиримидина.

ВИЧ-1-TAR РНК, содержащей в различных положениях модифицированный нуклеозид 70, с низкомолекулярными ( лигандами (аминогликозидные антибиотики неомицин В,

71-79

В = C,az или U

Производное R1 R2

71 Thp Н

72 Thp Н

73 Thp DMT

74 Thp DMT

75 Thp DMT

76 Thp H

77 Thp POC2H„CN

78 H олигомер

79 H олигомер

FmocNH

FmocNH

FmocNH

NH2 pyrNH

OH n3 n3 nh2

80 о OH

Схема 8.

Для введения различных меток в состав олигорибонуклеотидов было предложено использовать 5'-амино-5'-дезоксицитидин и 5'-амино-5'-дезоксиуридин с последующей постсинтетической модификацией 5'-аминогруппы (схема 8) [28].

Исходным веществом для синтеза амидофосфита 77 в случае В = С|Вг являлся Л-Ы-(/и/?е/и-бутилбензоил)-2'-0-тетрагидропиранилцитидин 71, из которого через азидопроизводное 73 с последующим востановлением был получен амин 74, далее защищенный флуоренилметоксикарбонильной группой. В результате было получено соединение 75, с З'-гидроксила которого была удалена диметокситритильная защита, после чего соединение 76 фосфитилировали с образованием целевого амидофосфита 77, который использовали в твердофазном олигонуклеотидном синтезе. Синтезированные олигонуклеотиды после деблокирования и очистки модифицировали по 5'-аминогруппе ./V-оксисукцинимидным эфиром карбоксифлуоресцеина, карбокситетраметилродамина или пиренбутановой кислоты. Оказалось, что 5'-пирен-модифицированные олигомеры могут быть использованы в качестве зондов для изучения кинетики структурных изменений РНК [28].

Помимо этого, было описано введение меток по 1'-положению сахара (схема 9) [29].

BzCL О I . BzCk R|

OBz OBz sr° о

NH tAo

OH

Si-0 о

Лг

80

81, R = OH

Г1 ■ S

L>r- - "

Si У

84 83, R = H о ô

NH

A„

TV

-C у"-.h""° 0

85, n = 4, R = H 88, n = 6, R = H

87, n = 4, R = H

88, n = 6, R = H

DMTO

RO.

-p„N(i-Pr)2 О i

О, ^ ^ CN

93, n = 4

94, n = 6

NHFmoc•

0 ÔH С yN^^NHFmoc О

89, n = 4, R = H

90, n = 6, R = H

91, n = 4, R = DMT

92, n = 6, R = DMT

Схема 9. Реагенты и условия: (i) 2Н HCl, DMF (2:5, об.), rt; (ii) А^'-тиокарбонилдиимидазол, DMF; (iii) Bu3SnH, AIBN, толуол; (iv) (1) NaOMe, MeOH, (2) TIPDSC12; (v) А^'-карбонилдиимидазол, диоксан; (vi) 9-флуоренилметилхлорформиат, py; (vii) TBAF, THF; (viii) DMT-C1, py; (ix) ClP(i-Pr)20C2H4CN, DIPEA, DCM.

Как и в предыдущей работе, сначала синтезировались амидофосфитные реагенты для введения аминогруппы в олигонуклеотиды, по которой далее можно присоединить какие-либо метки. Так, олигонуклеотиды функционализировали антрахиноном и пиреном. о

МН 95,п = 2,Р! = Н

Г 96, п = 4, Р = Н

N"^0 97, п = 2. Р = Ас

НО^ | 98, п = 2, Р = Ап т Н 99, п = 4, Я = Ап

100, п = 2. Р = Ру

0Н О

Конъюгированные с пиреном олигонуклеотиды проявили устойчивость по отношению к фосфодиэстеразе змеиного яда (З'-экзонуклеаза) и нуклеазе Р1 (эндонуклеаза). Таким образом, авторы указывают на возможность успешного их применения в качестве антисенс-агентов для различных биологических и биофизических исследований в физиологических условиях [29].

Наряду с 2'-модифицированными нуклеозидами (101) также был § Ч^о С ЛГ

1 i м*х>

N14 V о„ осуществлен синтез нуклеозидов, меченных по 3'-положению рибозы * о

102) [30]. 101 ™2

Синтез модифицирующих реагентов (106-109) изображен на схеме 10. о ИН 0 грш но. I гГ омтсц + омтсц |

2. ОМТ-С1 п г и I. ,г

ОО 3 Выделение он Л ? .О ОН

Бп п-Ви 'п-Ви

103 104 105 О

104

N0—°Л

107 О

Айн

105

7 и ОМТО I ♦ СН° о тг

108 109

Схема 10.

2',3'-0-Дибутилстанпилиденуридин, синтезированный по методике Вагнера [31], алкилировали 7У-(6-бромгексил)фталимидом в присутствии Nal в DMFA. Полученную смесь Т- и З'-алкилированных продуктов (соотношение 55:45) обработали DMT-C1 в безводном пиридине, после чего соединения 104 и 105 были разделены колоночной хроматографией. Из этих веществ в стандартных условиях были получены амидофосфитные реагенты 106 и 108, а также твердофазные носители 107 и 109. С помощью этих реагентов был синтезирован ряд олигонуклеотидов, содержащих аминогексильную группу в различных положениях, которые были выделены обычными методами (обращенно-фазовой ВЭЖХ и ПААГ). Далее аминогруппы ацилировались TV-оксисукцинимидным эфиром пиренбутановой кислоты. Исследования показали, что синтезированные олигомеры могут быть олигонуклеотидной последовательности, а также эффективности тушения пирена A, G, Т и С-нуклеозидами [32]. Оказалось, что активность тушения флуоресценции пирена окружающими его ДНК-основаниями уменьшается в ряду С > Т > G > А. Эти данные были получены путем анализа времен жизни возбужденных состояний синтезированных олигонуклеотидов ,.X2U(pyr)X2.(X = С, Т, G, А) и их дуплексов.

Авторы указывают на наличие как минимум трех типов фотохимических процессов, наблюдающихся при введении нескольких пиреновых флуорофоров как в одноцепочечные олигонуклеотиды, так и в их дуплексы:

• Тушение эмиссии пирена основаниями ДНК путем переноса электрона (Electron Transfer). При этом происходит окисление (в случае взаимодействия с Т, U и С) или восстановление (взаимодействие с G) молекулы пирена.

• Образование люминесцентных продуктов флуорофора с ДНК с переносом заряда (charge-transfer products). Примером подобного эффекта является образование соединения пирен +/и(руг)" с максимумом флуоресценции при 475 нм.

Также были определена зависимость времен жизни флуоресценции ковалентно присоединенного пирена 110 от использованы в качестве антисмысловых нуклеотидных последовательностей к ВИЧ.

110

Интересным свойством пирена является способность , л л* I I I I ! I I I И И ! I I образовывать эксимеры (сокращение от excited dimers — возбужденные димеры). Образование эксимера J I I 1 I М^, ^1111111 5 вызывает очень сильные изменения спектра флуоресценции (частично или полностью пропадает пирен структурированная мономерная эмиссия и появляется гибридизация широкая неструктурированная полоса при больших

I II I I II I II II I I I I длинах волн), что может быть легко детектировано. | | | | | | | | | | | || || I

Была изучена возможность использования этого свойства пирена для детекции гибридизации в растворе Схема 11. Зкашср

33, 34]. Авторами предложено использовать два зонда, один из которых содержит пиреновую метку на 3'-, а другой — на 5'-конце олигонуклеотида. В работе [33] изучено образование эксимеров при гибридизации двух пирен-меченных зондов (16-звенные олигодезоксирибонуклеотиды) с комплементарной мишенью (схема 11).

Как и ожидалось, при увеличении концентрации одноцепочечной ДНК-мишени происходит рост эксимерной эмиссии при 495 нм.

Далее была проведена оптимизация условий |

Ск В образования эксимеров. Из синтезированных 1^-0стандартными методами олигомеров 111-114 (число о О нуклеотидов равно 16) были получены дуплексы с 32- 2' или зуприсоединение ^ п - О звенной немодифицированной последовательностью. (гУГ^о 112: п = 1

Тп 113: п = 2

Спектры флуоресценции дуплексов позволили Р*!!^ 114: п = 3 проанализировать зависимость эффективности образования эксимера от длины линкера. Наиболее интенсивная эксимерная флуоресценция была получена при использовании зондов с n = 1. Также была показана возможность использования этих зондов для гомогенного анализа 16S-рРНК в клетках Vibrio mimicus [34].

Кроме этого, было изучено образование эксимеров при гибридизации олигонуклеотида, содержащего от одного до трех пиренов, с комплементарной последовательностью. Синтез меченных олигомеров проводился с использованием амидофосфита 124, полученного как показано на схеме 12 [35].

NH

DMT0. I cbl ■

HO-1 I

OTBDMS

115

DMTO

RN

Yih

Os

OTBDMS 116, R = H dmto. RN/

NH N^O iv

NH

OH 118

DMTO. rn 4n—1

ON

119 117 R = пирен-1-илкарбанил 118-119, R = пирен-1-илкарбонил

Схема 12. Реагенты и условия: (i) 1) Tf20, py, DCM, 2) пиперазин, THF; (ii) 1-пиренкарбоновая кислота, CDI, DCM; (iii) TBAF, THF; (iv) 2-цианоэтил-Л'',Л'-диизопропилфосфорамидохлорид, DIPEA, DCM.

4'-С-Гидроксиметильная группа нуклеозида 115 была превращена в трифлат, который затем обрабатывали пиперазином. Нуклеозид 116 вводили в конденсацию с 1-пиренкарбоновой кислотой, десилилировали З'-гидроксил. Продукт 118 фосфитилировали по стандартной методике.

У одноцепочечных олигонуклеотидов, содержащих три пиреновых остатка, наблюдалась интенсивная эксимерная флуоресценция, которая практически полностью исчезала при образовании дуплекса с комплементарной ДНК.

Интенсивные сигналы эксимерной флуоресценции наблюдались для РНК-дуплексов, содержащих несколько 2'-пиренилметильных групп, расположенных подряд в одной цепи [36]. Было установлено, что в этом случае образование эксимеров происходит вне двухцепочечной РНК, причем интенсивность флуоресценции резко возрастает при увеличении числа остатков пирена, введенных в дуплекс.

Еще одним примером реагента для введения остатка пирена в состав олигонуклеотидов является амидофосфит 125, синтез которого приведен на схеме 13 [37].

NH

--Ц-, H2N 0

120 О

122

-Pr2N)2POC2H4CN, тетразолид диизопропиламмония, DCM

I— 123, R = H DMT-CI,py C-124,R = DUT

Схема 13.

Исходное соединение 3',5'-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)уридин (120) было получено реакцией уридина и 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксана (реагент Маркевича) по стандартной методике. Обработка силильного производного CDI приводила к имидазолиду с количественным выходом. Затем 121 обработали 1-пиренилметиламином, удалили защиту Маркевича триэтиламин тригидрофторидом и полученный нуклеозид 123 вводили в реакцию с Dmt-Cl. Вьщеленный продукт 124 фосфитилировали с образованием целевого реагента 125, который использовали для синтеза модифицированных олигонуклеотидов, несущих одну или две флуоресцентные метки. Из этих олигонуклеотидов были получены дуплексы с комплементарными олигодезоксирибо- и олигорибонуклеотидами. Авторы отмечают отрицательное влияние 2'-карбаматной функции на термическую стабильность ДНК/РНК и ДНК/ДНК дуплексов. Также известно, что 2'-рибо-конфигурация ориентирует флуорофор в малую бороздку ДНК/ДНК дуплекса. Таким образом, карбаматная группа может быть использована для введения различных лигандов в малую бороздку двухцепочечной ДНК.

Было обнаружено, интенсивность флуоресценции при образовании дуплекса монопирен-меченного олигомера с комплементарной ДНК существенно не изменялась. Однако при гибридизации этого же олигонуклеотида с комплементарной РНК происходило 30-кратное увеличение интенсивности флуоресценции [37]. Это говорит о том, что возбужденный пиреновый флуорофор (присоединенный через 2'-карбамат) эффективно тушиться гетероциклическими основаниями как в одноцепочечном ДНК-олигогмере, так и в ДНК/ДНК дуплексе.

Аналогично описанному выше синтезирован модифицирующий реагент 131 на основе ага-уридина [38]. Пиренилметильное карбаматное производное было получено из урацил-1-/i-D-арабинофуранозида 126 (схема 14).

127, R = H

-128, R =С(0)(Ы-имцдазолип) с:

129, R1 = R2 = Si(i-Pr)2OSi(i-Pr)2

130,R1 = R2 = H

Схема 14.

Олигонуклеотиды синтезировались и выделялись по стандартным методикам, после чего были гибридизованы с комплементарными ДНК и РНК. Во всех случаях отмечается отрицательное влияние 2'-ага-карбаматной группы на термическую стабильность дуплексов (ДТ,„ -2.1 - -11.8 °С (дуплекс с ДНК) и -6.3 - -6.9 °С (дуплекс с РНК)). Обнаружена способность пирена, присоединенного к арабиноуридину через карбаматную группу, к образованию эксимеров в большой бороздке ДНК-дуплексов. В случае, когда два пирена, расположенные в разных цепях, разделены одной парой оснований, происходит почти полное исчезновение мономерной флуоресценции, а наблюдается очень интенсивная эксимерная флуоресценция [38].

При взаимодействии двух разных красителей может наблюдаться безызлучательный перенос энергии с одного красителя (донор) на другой (акцептор). Эффективность такого процесса обратно пропорциональна шестой степени расстояния между красителями. Это явление называют «флуоресцентным резонансным переносом энергии» (FRET от англ. fluorescence resonance energy transfer). Для эффективного безызлучательного переноса энергии расстояние между донором и акцептором должно быть в диапазоне 10-100 À, что соответствует различным биомолекулам. Таким образом, FRET может использоваться, например, для определения конформационных изменений в белках, гормонах и нуклеиновых кислотах.

В качестве донора и акцептора была предложена пара пирен-перилен [39]. Для этого были синтезированы два 16-звенных олигонуклеотида, один из которых содержал на 3'-конце пирен, а второй - перилен на 5'-конце. При ° гибридизации этих олигомеров с ДНК-мишеныо происходило сближение красителей (схема 15). о

5'

3' 0 1

3 -AAACTAGGGCCGCGC TCTAGGCTTGCGTTA-5 I

3' 5

2- или 3' -присоединение

Схема 15.

134

Для синтеза перилен-содержащего олигомера был получен 7У-(перилен-3-илметил)иодацетамид (PeMIA). На первой стадии перилен обрабатывали Nметилформанилидом и РОС1з в ССЦ, после чего выделеный 3-формилперилен реагировал с концентрированным водным аммиаком. Продукт реакции восстанавливался водородом над палладиевым катализатором, и полученный амин ацилировали иодуксусной кислотой с образованием целевого продукта. С использованием этого реагента был получен олигонуклеотид 133.

Для синтеза пирен-модифицированных олигонуклеотидов 134 использовали 1-пиренбутановую кислоту.

Исследования этой пары показали, что она может быть использована для гибридизационного анализа в растворе благодаря высокому квантовому выходу, простоте детекции вследствие большого Стоксова сдвига между флуоресценцией пирена и перилена, и широкому диапазону определяемых концентраций.

Была показана возможность использования 4-метиламино-1,8-нафталимида как акцептора энергии для пирена [40]. Производное нуклеозида 139 было синтезировано из 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 2-(4-метиламино-1,8-нафталимид)уксусной кислоты 137. Продукт реакции 139 превращали в амидофосфитный реагент 140 стандартным методом (схема 16).

135 и 6

NH

DMTCX I vy 0

ОН НМ-^" о

139

NHCH3

NH

DMTO^ I и 6

NHCH3

140

Схема 16. Реагенты и условия: (i) глицин, DMA; (ii) CH3NH2, CuS04-5H20, DMA; (iii) 2'-амино-2'-дезоксиуридин, DCC, HOBt, DMF; (iv) DMT-C1, py; (v) (i-Pr)2NP(OCH3)Cl, DIEA, py.

Пирен-модифицированные олигонуклеотиды 141 были получены методом, разработанным Yamana и сотр. Из меченных олигомеров были получены дуплексы, причем между метками располагались от 0 до 3 А-Т пар, что соответствовало расстоянию 14—24 А. Включение 141 в структуру ДНК не вызывавало уменьшения термической стабильности дуплексов. При этом для конъюгатов, содержащих остаток 4-метиламино-1,8-нафталимида, с ДНК наблюдался высокий квантовый выход флуоресценции - 0.40-0.46. Эффективность переноса энергии также была довольно высока. Максимальный перенос энергии наблюдался в том случае, когда красители были разделены тремя парами оснований [40].

Также была предложена донорно-акцепторная пара 1-фенилэтинилпирен (1-РЕРу) — 9,10-бис(фенилэтинил)антрацен, присоединенные к уридину через 2'-карбаматы [41]. Синтез амидофосфитов для введения этих красителей в состав олигонуклеотидов приведен на схеме 17.

Си1,РИ(РРИз)4 ЁЫЧРМР*"

142

ТВАР.ТНР

143 ьРг^гРОСзН^М, тетраэолид диизопропилаыыоння, □СМ

N О ОМТО. I о

146

Схема 17.

На первой стадии исходный иодид 142 вводили в реакцию с 1-этинилпиреном в условиях конденсации Соногоширы, после чего продукт сочетания 143 обработали триэтиламин тригидрофторидом. 5'-Гидроксил нуклеозида 144 защитили DMT-группой, а 3'-фосфитилировали по стандартной методике с образованием амидофосфитного реагента 146. Модифицирующий реагент 150 был получен по аналогичной схеме с использованием 9-этинил-10-фенилэтинилантрацена. Полученные амидофосфиты 146 и 150 использовались в синтезе олигонуклеотидов, содержащих флуоресцентные уридин-2'-карбаматы. Из синтезированных олигомеров были получены дуплексы. Введение этих меток вызвало увеличение Тт. Изучение спекральных свойств дуплексов показало небольшую эффективность безызлучательного переноса энергии. Предполагается, что красители, направленные в малую бороздку ДНК, имеют невыгодную для FRET пространственную ориентацию.

Олигонуклеотиды, содержащие урацил, 5 il NH С К I j ° модифицированный пиреном (141) и { ^n^o фенотиазином (151), использовались для f^f^li n^o изучения явления переноса положительного

• о ОН заряда в ДНК. Для этого были синтезированы иру $ дуплексы, содержащие пиреновую группу в 141 151 одной цепи и фенотиазиновую - в другой. Обработка окислителем, полученным методом импульсного радиолиза водного раствора Т1г804, насыщенного N20, приводила к образованию Ру + и Р^* . Авторы установили, что перенос заряда от Ру + к Р1г зависит от расстояния и нуклеотидной последовательности между метками [42].

Было изучено образование катион-радикала пиренового димера Руг +. Для этого дважды модифицированные пиреном дуплексы вводили во взаимодействие с 804 ", генерированным методом импульсного радиолиза КгБгОв. Было установлено, что образующийся во внутренней области двухцепочечной ДНК Ру2 + характеризуется большим временем жизни. Это позволяет использовать системы на основе катион-радикала Руг+ для получения информации о конформационных изменениях в ДНК в интервале от 1 мкс до 1 мс [43, 44]. Предположительно, Руг+ имеет такую же сэндвичевую структуру, как и эксимер [Ру/Ру]*. При отсутствии флуоресценции эксимера в неокисленном дуплексе, содержащем два остатка пирена, наблюдалась небольшая скорость образования Руг+. Это указывает на то, что взаимное расположение двух молекул пирена в дуплексе оказывает решающее влияние на скорость образования Руг + [44].

III. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через тиольную группу

Еще одним примером постсинтетической модификации олигонуклеотидов является синтез олигомеров, содержащих в 2'-0-положении сахара гексил-Б-тиольную группу [45]. Синтез амидофосфита 155 показан на схеме 18. мн2 он он 152

2. Вг 3 Защита основания tes

DMT-Cl.py A J

DMTCX

1.ОтделениеотЗ-иэомера n""^ ^

-DMTO I N

2. Фосфктилироваиие V^O-^J

ГГ

154

155

Схема 18.

Аденозин алкилировали S-тритил-б-меркаптогексилбромидом, после чего смесь 2'- и 3'-изомеров защищалась по ^-положению бензоильной группой по методу Джонса (с использованием промежуточного силилирования гидроксилов). Смесь 153 и 3'-изомера обработали DMT-C1, после чего выделили индивидуальный продукт 154, который фосфитилировали по стандартной методике с образованием реагента 155. Затем были синтезированы олигонуклеотиды d(GAA СТ) и d(GsAsAs CST). Свободная сульфгидрильная группа, полученная после детритилирования, была модифицирована фосфолипидмалеимидом (156), тУ-(фенантролин-5-ил)иодацетамидом (157), флуоресцеинмалеиимидом (158) или пиренмалеиимидом (159) (схема 19). nh2

А 3 о=Р-О s-r

156

159

Схема 19.

Кроме этого, амидофосфит 155 был использован для синтеза антисмысловых последовательностей для ингибирования экспрессии генов ICAM (intraçelluar adhesion molecule).

IV. Функционализированные производные Коиформационно-Блокнрованных Нуклеиновых Кислот (КБНК)

В последние годы активно развивается создание высокочувствительных детекторных систем для молекулярной диагностики на основе модифицированных рибонуклеотидов. В качестве альтернативы было предложено использовать меченные конформационно-блокированные нуклеиновые кислоты, в состав которых входит аминогруппа, по которой легко может быть введен остаток флуоресцентного красителя. Кроме того, они обладают способностью к высокоаффинной гибридизации. Эти два факта делают КБНК удобным инструментом для реализации приведенных выше задач.

В работе [46] синтезированы различные мономеры TV-алкилированных и N-ацилированных производных 2'-амино-КБНК (схема 20). но.

I--NH

ОН

NH tAo

160

NH

Л,

ROVoJ

N О

DMTO

ОН |— 161а, R2 = H " 162а, R2 = DMT

I— 163b, R2= DMT 163с, R2 = DMT

-Pr)2N'p~~oc2h4CN

164а,с

J ^О

165, R = пирен-1-илметил

166, R = пирен-1-илкарбонил

161-164 R: а пирен-1-илметил Ь трифторацетал с пирен-1-илкарбонил

Схема 20. Реагенты и условия: (0 пиренил-1-карбальдегид, АсОН, №СЫВН3, МеОН; (п) ОМТ-С1, ру; (ш) NHз в МеОН, 2) пирен-1 -илкарбонил хлорид, Ка2С03, МеОН, 0 °С; (¡V) С1Р(^Рг'2)ОС2Н4СЫ, 01РЕА, ОСМ; (у) олигонуклеотидный сиитез.

Бициклический нуклеозид 160 был >1-алкилирован с образованием продукта 161а, который диметокситритилировали и фосфитилировали стандартными методами. В результате был получен модифицирующий реагент 164а.

Для синтеза амидофосфита 164с аминогруппу бициклического нуклеозида трифторацетилировали, защищали 5'-гидроксил диметокситритильной группой с образованием 163Ь, снимали трифторацетильную защиту, ацилировали пиренил-1-карбонил хлоридом, после чего фосфитилировали стандартным методом [46]. С использованием реагентов 164а,с были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие пирен-модифицированные КБНК-фрагменты 165 и 166. Из них были получены дуплексы с комплементарными ДНК и РНК, температуры плавления которых были заметно выше, чем немодифицированного дуплекса сравнения [46, 47]. Также была показана возможность использования модифицированных таким образом олигонуклеотидов для гомогенного флуоресцентного анализа (т.е. анализа в растворе без разделения компонентов). Олигонуклеотиды, модифицированные остатками 2'-А^-(пирен-1-илметил)-2'-амино-КБНК (165) по принципу «двойного» зонда (схема 12), являются перспективными инструментами для детекции БЫР, так как гибридизация меченных олигонуклеотидов с комплементарными ДНК и РНК приводит к интенсивной эксимерной эмиссии пирена, которая заметно снижается при наличии некомплементарных оснований в ДНК и РНК мишенях [48, 49].

Помимо этого показано, что детекция гибридизации в растворе может быть осуществлена при помощи РЯЕТ-пары 2'-амино-КБНК ? комплементарных цепях, продемонстрировали сильную зависимость эффективности FRET от расстояния между метками, которая достигала 90% при близком расположении остатков красителей.

У дуплексов, содержащих модификацию 166, наблюдалась интенсивная флуоресцентная эмиссия с высокими квантовыми выходами от 0.29 до 0.99. Кроме того, при образовании дуплекса трижды меченного олигонуклеотида с комплементарной ДНК и еще в большей степени с РНК происходило сильное возростание интенсивности флуоресценции (33-кратное для ДНК и 69-кратное для РНК) [47].

Далее были изучены свойства дуплексов, у которых в каждой цепи содержалось по нескольку пиреновых остатков. Полимеченные пиреном олигонуклеотиды способны гибридизоваться с комплементарными цепями с очень высокой эффективностью — в некоторых случаях наблюдалось увеличение температуры плавления на 22 °С по сравнению с немодифицированным дуплексом. В таких дуплексах пирены взаимодействуют между собой, что подтверждается сильной эксимерной флуоресценцией, а также согласуется с данными, полученными при молекулярном моделировании [51, 52].

Изучены свойства олигомеров, содержащих нуклеозидный остаток 168. Их дуплексы проявили большую термическую стабильность (на 20—40 °С) по сравнению с двойными нуклеотидов, модифицированных пирен-1-метальным и перилен-3-метальным остатками по ^'-положению [50]. Так, ДНК-дуплесы, содержащие донор и акцептор энергии 165 и 167 в

167 спиралями ДНК и РНК, модифицированными в тех же положениях 2'-амино-2'-дезоксиуридином 32а [53].

Для 2'-амино-мономера ДНК было подтверждено преобладание S-типа конформации фуранозного кольца. Можно предположить, что мономеры 168 и 33 имеют такую же конформацию сахара. Дестабилизирующий эффект мономера 32а объясняется стерическими препятствиями, возникающими при введении аминогруппы в углеводный цикл, сохраняющий при этом S-конформацию. Однако введение мономера 168 вызывает увеличение температуры плавления за счет интеркаляции пирена.

Следует также отметить, что при образовании дуплекса с олигомером, содержащим КБНК-мономер 33, наблюдается уменьшение температуры плавления, что объясняется тем, что КБНК-нуклеозиды вызывают переход В-ДНК в А-ДНК спираль [53].

Также были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие 2'-Аг-(пирен-1-ил)метил- и 2'-Аг-(пирен-1-ил)ацетил-2'-амино-а-Ь-КБНК 174 и 175 (схема 21) [54, 55]. Известно, что такие a-L-КБНК обладают высокой аффинностью по отношению к комплементарным ДНК-и РНК-дуплексам. о о

КБНК мономер (33)

169

170, R1 = Н, R2 =СН2Руг

171, R1 = Н, R2 = С(0)Руг

Мономер 174, R = СН2Руг Мономер 175, R = С(0)Руг

172, R1 = (i-Pr)2POC2H4CN,

R2 = СН2Ру

173, R1 = (i-Pr)2POC2H4CN,

R2 = С(0)Ру

Схема 21. Реагенты и условия: (¡) (для соединения 170) пирен-1-карбальдегид, КаВН(ОАс)3, 1,2-дихлороэтан, (для соединения 171) РугСН2С02Н, ЕОС-НС1; (¡¡) С^О^Р^ОСгН^, 01РЕА, ОСМ, (ш) олигонуклеотидный синтез.

Так же как и в случае КБНК, a-L-КБНК 174 увеличивали термическую стабильность дуплексов. Кроме того, у этих дуплексов при наличии пиреновых флуорофоров рядом в соседних цепях наблюдалась интенсивная эксимерная флуоресценция [54]. Олигодезоксирибонуклеотиды и дуплексы, содержащие два мономера 175 в одной цепи, также продемонстрировали интенсивную эксимерную эмиссию, которая оказалась чувствительной к присутствию некомплементарных оснований в комплементарных ДНК и РНК [55]. Таким образом, 2'-А^-(пирен-1 -ил)ацетил-2'-амино-а-Ь-КБНК 175 является перспективным красителем для детекции SNP.

V. Аналоги нуклеозидов, модифицированные через триазольную группу

В настоящее время в связи с активным развитием химии модифицированных нуклеиновых кислот представляется актуальной разработка методов эффективного и селективного введения различных меток в нукпеозиды и нуклеотиды. Одним из таких методов является Си(1)-катализируемое 1,3-диполярное циклоприсоединение азидов с алкинами, приводящее к образованию производных тетразола («клик» реакция). Достоинством «клик» химии является возможность ее проведения в водной среде, что очень удобно для мечения биомолекул.

Осуществлен синтез ряда 2'-0-алкильных производных аденозина (176—179), являющихся исходными соединениями для 1,3-циклоприсоединения различных азидов и терминальных алкинов [56, 57].

Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения использовалась для введения остатка пирена по З'-положению риботимидина [58]. Для этого исходный азид 181, полученный в 11 стадий из 1,2-0-изопропилидин-а-0-ксилофуранозы 180, обрабатывали 1-этинилпиреном в присутствии C11SO4 и аскорбиновой кислоты с последующим диметокситритилированием и фосфитилированием полученного нукпеозида 182 (схема 22).

176

177

178

179

-„ и %

ЧГ°Н

N3

N4

180

181 N4

1А0 йМТО^ I О, ,0СгН4СМ

V«!

183

184

Схема 22. Реагенты и условия: (0 1-этинилпирен, СиБОд, аскорбиновая кислота, ОМР-вода; (И) ОМТ-С1, ру; (Ш) (¡-РггК^РОСгЬ^С!^, тетразолид диизопропиламмония, ОСМ; (¡у) олигонуклеотидный синтез.

Амидофосфитный реагент 183 использовался для синтеза гомопиримидиновых модифицированных олигонуклеотидов 184, проявивших заметное возрастание интенсивности флуоресценции пирена при образовании триплексов с двухцепочечной ДНК.

Заключение

Таким образом, во многих работах в качестве флуоресцентной метки использовался 1-пиренилметильный остаток [1—17]. Помимо этого известны модифицированные НК, связанные с пиреновым хромофором посредством карбаматной, карбамидной, амидной и тиольной связей [18-45]. При этом в большинстве работ модификации проводились по 2'- и З'-положениям фуранозного кольца, реже - по положениям 5', 4' и 1'.

Известно, что взаимодействие флуорофора с гетероциклическими основаниями НК может вызывать заметное тушение флуоресценции, на несколько порядков снижая квантовые выходы. Для того чтобы минимизировать такое взаимодействие, в ряде работ флуорофор присоединяли к фуранозному кольцу при помощи довольно длинного линкера [20-24, 27-34, 39, 45]. При этом происходило разобщение остатка пирена и гетероциклического основания нуклеозида. В то же время значительный интерес представляют модифицированные нуклеозиды, в которых нуклеиновое основание тс-сопряжено с флуорофором. Примером подобных соединений являются нуклеозиды, в которых пирен присоединен через алкинильный спейсер. Известны нуклеозиды, содержащие пирен-1-илэтинильную группу, присоединенную к гетероциклическому основанию. Дополнительно расширив систему я-сопряжения, получили 1-РЕРу, который присоединяли по 2'-положению уридина через карбаматную связь [41]. Как и ожидалось, флуоресцентные свойства 1-РЕРу в составе олигонуклеотидов заметно отличались от свойств 1-пиренилметильного хромофора.

Для изучения пространственных изменений в ДНК путем наблюдения эксимерной флуоресценции желательно, чтобы остатки пирена были направлены в большую бороздку двойной спирали. Ранее было показано, что подобное пространственное расположение красителей происходит в том случае, когда они присоединены через 2'-карбаматную связь к арабино-ураципу [38].

Для создания высокоафинных антисмысловых НК наиболее эффективными являются производные конформационно-блокированных нуклеиновых кислот (КБНК) [46-55]. При введении модифицированных пиреном КБНК-мономеров в олигонуклеотиды термическая стабильность их дуплексов увеличивается на 20-40 °С по сравнению с аналогичными дуплексами ДНК и РНК, не содержащими КБНК-звеньев [51]. Это объясняется интеркаляцией остатков пирена, конъюгированных с КБНК, в двухцепочечные нуклеиновые кислоты. Модификация КБНК остатками ПАУ привела к конъюгатам, обладающим интересными флуоресцентными свойствами и продемонстрировавшим высокую эффективность для детекции гибридизации в различных форматах гомогенного флуоресцентного анализа [47-50, 55].

Новым перспективным методом введения красителей в нуклеозиды и нуклеиновые кислоты является реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения азидов с алкинами, приводящая к образованию производных триазола [56, 57]. Введение остатка пирена в 3'-положение риботимидина через триазольное кольцо привело к получению нового чувствительного красителя для детекции двухцепочечных ДНК [58].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Астахова, Ирина Владимировна

выводы

1. Разработан ряд новых флуоресцентных красителей - фенилэтинильных производных пирена: функционализированные 2- и 4-фенилэтинилпирены, а также различные бис-и трис(фенилэтинилпирены). Эти красители демонстрируют длинноволновый сдвиг максимумов эмиссии и увеличенные квантовые выходы флуоресценции по сравнению с пиреном, но сохраняют способность к образованию эксимеров (кроме 2-фенилэтинилпиреновых соединений).

2. Синтезированы рибо-, арабино- и конформационно-блокированные (LNA) нуклеозиды, модифицированные по 2'-положению флуоресцентными производными полициклических ароматических углеводородов (перилена, различных moho-, бис- и трис(фенилэтинил)пиренов), и амидофосфитные реагенты, позволяющие вводить эти нуклеозиды в состав олигонуклеотидов.

3. Синтезированы олигонуклеотиды, содержащие различные флуоресцентные нуклеозиды в заданных положениях. Изучены гибридизационные, спектральные и фотофизические свойства полученных конъюгатов; продемонстрирована возможность их применения в качестве ДНК-зондов для детекции гибридизации с ДНК и РНК в растворе, а также для детекции однонуклеотидных замен в ДНК-мишени.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность В.А. Коршуну за руководство диссертационной работой; своим коллегам из Лаборатории химии нуклеиновых кислот за постоянную поддержку; З.О. Шенкареву за регистрацию ЯМР-спектров; В.В. Шманаю и М.В. Квачу (Институт физико-органической химии HAH Беларуси) за помощь в синтезе модифицированных олигонуклеотидов; Д.Г. Алексееву за регистрацию MALDI-TOF масс-спектров; С.Л. Бондареву (Лаборатория фотоники молекул Института молекулярной и атомной физики HAH Беларуси) за проведение спектральных и фотофизических исследований модифицированных нуклеозидов, олигонуклеотидов и дуплексов; И.В. Ямпольскому (Лаборатория генов регенерации, ИБХ РАН) за помощь в регистрации спектров флуоресценции. Автор признателен Есперу Венгелю за руководство работой, посвященной флуоресцентно-меченным LNA, и своим коллегам из Центра Нуклеиновых кислот (Университет Южной Дании, Оденсе) за постоянную поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Астахова, Ирина Владимировна, 2009 год

1. Reims, S. A.; Cantor C. R. New fluorescent hydrazide reagents for the oxidiezed 3'-terminus of RNA. Nucleic Acids Res. 1974,1, 767-786.

2. Koenig, P.; Reines, S. A.; Cantor, C. R. Pyrene derivatives as fluorescent probes of conformation near the 3' termini of polyribonucleotides. Biopolymers 1977,16, 2231—2242.

3. Yamaha, K; Ohashi, Y.; Nimota, K; Kitamura, M.; Nakano, H.; Sangen, O.; Shimudzu, T. Synthesis of oligonucleotide derivatives with pyrene group at sugar fragment. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6347-6350.

4. Yamaha, K; Gokota, T.; Ozaki, H.; Nakano, H.; Sangen, O.; Shimudzu, T. Enhanced fluorescence in the binding of oligonucleotides with a pyrene group in the sugar fragment to complementary polynucleotides. Nucleosides Nucleotides 1992,11, 383-390.

5. Iwase, R.; Tsuchida, H.; Yamaoka, T.; Yamana, K; Murakami, A. Study of RNA structure by pyrene-labeled oligonucleotides. Nucleic Acids Symp. Ser. 1997, 37, 205-206.

6. Mahara, A.; Iwase, R.; Sakamoto, T.; Yamaoka, T.; Yamana, K; Murakami, A. Detection of acceptor sites for antisense oligonucleotides on native folded RNA by fluorescence spectroscopy. Bioorg. Med. Chem. 2003,11, 2783-2790.

7. Yamana, K; Zako, H.; Asazuma, K; Iwase, R.; Nakano, H.; Murakami, A. Fluorescence detection of specific RNA sequences using 2'-pyrene-modified oligoribonucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 1104-1106.

8. Yamana, K; Iwase, R; Furutani, S.; Tsuchida, H.; Zako, H.; Yamaoka, T.; Murakami, A. 2'-Pyrene modified oligonucleotide provides a highly sensitive fluorescent probe of RNA. Nucleic Acids Res. 1999, 27, 2387-2392.

9. Nakamura, M.; Shimomura, Y.; Ohtoshi, Y.; Sasa, K.; Hayashi, H.; Nakano, H.; Yamana, K. Pyrene aromatic arrays on RNA duplexes as helical templates. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 1945-1951.

10. Yamana, K.; Nimota, K.; Nakano, H.; Sangen, O. A new method for introduction of a pyrene group into a terminal position of an oligonucleotide. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2555-2558.

11. Yamana, K.; Kumamoto, S.; Nakano, H. Homopyrimidine oligonucleotides modified by a pyrenylmethyl group at the terminal position: enhanced fluorescence upon binding to double helical DNA. Chem. Lett. 1997, 26, 1173-1174.

12. Mahara, A.; Iwase, R.; Sakamoto, T.; Yamana, K.; Yamaoka, T.; Murakami, A. Bispyrene-conjugated 2'-0-methyloligonucleotide as a highly specific RNA-recognition probe. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 3648-3650.

13. Karla, N.; Parlato, M. C.; Parmar, V. S.; Wengel, J. DNA and LNA oligonucleotides containing N2'-functionalised derivatives of 2'-amino-2'-deoxyuridine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006,3166-3169.

14. Jin, S.; Miduturu, C. V.; McKinney, D. C.; Silvermann, S. K. Synthesis of amine- and thiol-modified nucleoside phosphoramidites for site-specific introduction of biophysical probes into RNA. J. Org. Chem. 2005, 70, 4284-4299.

15. Hwang, J.; Greenberg, M. M. Synthesis of modified oligodeoxyribonucleotides on a solidphase support via derivatization of a selectively revealed 2'-amino-2'-deoxyuridine. Org. Lett. 1999,1, 2021-2024.

16. Hwang, J.; Baltasar F. E.; Cole D. L.; Sigman D. S.; Chen, C. B.; Greenberg, M. M. Transcription ingibition using modified pentanucleotides. Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 2321-2328.

17. Silverman, S. K.; Cech, T. R. RNA tertiary folding monitored by fluorescence of covalently attached pyrene. Biochemistry 1999, 38, 14224-14237.

18. Silverman, S. K.; Cetch, T. R. An early transition state for folding of the P4-P6 RNA domain. RNA 2001, 7, 161-166.

19. Smalley, M. K.; Silverman, S. K. Fluorescense of covalently attached pyrene as a general RNA folding probe. Nucleic Acids Res. 2006, 34, 152-166.

20. Dohno, C.; Saito, I Discrimination of single-nucleotide alterations by G-specific fluorescence quenching. ChemBioChem 2005, 6, 1075-1081.

21. Blount, K. F.; Tor, Y. Using pyrene-labeled HIV-1 TAR to measure RNA-small moleculebinding. Nucleic Acids Res. 2003, 31, 5490-5500.

22. Kierzek, R.; Li, Y.; Turner, D. H.; Bevilacqua, P. C. 5'-Amino pyrene provides a sensitive, nonperturbing fluorescent probe of RNA secondary and tertiary structure formation. J. Am. Chem. Soc. 1993,115, 4985-4992.

23. Ono, A.; Matsuda, A. Synthesis of oligonucleotides carryng linker groups at the 1'-position of sugar residues. Bioconjugate Chem. 1993, 4, 499-508.

24. Manoharan, M; Tivel, K. L.; Andrade, L. K.; Cook, P. D. T-O and 3'-0-pyrimidine aminotether-containing oligonucleotides: synthesis and conjugation chemistry. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3647-3650.

25. Wagner, D.; Verheyden, J. P. H.; Moffat, J. G. Preparation and synthetic utility of some organotin derivatives of nucleosides. J. Org. Chem. 1974, 39, 24-30.

26. Ebata, K; Masuko, M.; Ohtani, H.; Jibu, M. Excimer formation by hibridizationusing two pyrene-labeled oligonucleotide probes. Nucleic Acids Symp. Ser. 1995, 34, 187-188.

27. Masuko, M; Ohtani, H.; Ebata, K; Shimadzit, A. Optimization of ecximer-forming two-probe nucleic acid hybridization method with pyrene as a fluorophore. Nucleic Acids Res. 1998, 26, 5409-5416.

28. Bryld, T.; Hojland, T.; Wengel, J. DNA-selective hybridization and dual strand invasion of short double-stranded DNA using pyrene-1-ylcarbonyl-functionalized 4'-C-piperazinomethyl-DNA. Chem. Commim. 2004, 1064-1065.

29. Nakamura, M.; Ohtoshi, Y.; Yamana, K. Helical pyrene-array along the outside of duplex RNA. Chem. Commim., 2005, 5163-5165.

30. Korshun, V. A.; Stetsenko, D. A.; Gait, M. J. Novel uridin-2'-yl carbamates: synthesis, incorporation into oligodeoxyribonucleotides, and remarkable fluorescence properties of 2'-pyren-l-ylmethylcarbamate. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 2002, 1092-1104.

31. Dioubankova, N. N.; Malakhov, A. D.; Stetsenko, D. A.; Gait, M. J.; Volynsky, P. E.; Efremov, R. G.; Korshun, V. A. Pyrenemethyl ara-uridine-2'-carbamate: a strong interstrand excimer in the major groove of a DNA duplex. ChemBioChem 2003, 4, 841-847.

32. Masuko, M.; Ohitchi, S.; Sode, K; Ohtani, H.; Shimadzu, A. Fluorescence resonance energy transfer from pyrene to perylene labeles for nucleic acid hybridization assays under homogeneous solution conditions. Nucleic Acids Res. 2000, 28, e34.

33. Kawai, K.; Kmvabata, K.; Tojo, S.; Majima, T. Synthesis of ODNs containing 4-methylamino-l,8-naphtalimide as a fluorescence probe in DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002,12, 2363-2366.

34. Takada, T.; Kawai, K; Tojo, S.; Majima, T. Hole transfer in DNA: DNA as a scaffold for hole transfer between two organic molecules. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3851—3854.

35. Kawai, K.; Yoshida, H.; Takada, T.; Tojo, S.; Majima, T. Formation of pyrene dimer radical cation at the internal site of oligodeoxynucleotides. J. Phys. Chem. B 2004, 108, 13547— 13550.

36. Kawai, K.; Miyamoto, K; Tojo, S.; Majima, T. Formation of pyrene dimer radical cation in DNA reflecting DNA dynamics in the time range of 1 jis ao 1 ms. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 912-915.

37. Manoharan, M.; Johnson, L. K.; Tivel, K L.; Springer, R. H.; Cook, P. D. Introduction of a lipophilic thioether in the minor groove of nucleic acids for antisense applications. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993,13, 2765-2770.

38. Sorensen, M. D.; Petersen, M.; Wengel, J. Functionalized LNA (locked nucleic acid): high-affinity hybridization of oligonucleotides containing N-acylated and N-alkylated 2'-amino-LNA monomers. Chem. Commim. 2003, 2130-2131.

39. Hrdlicka, P. J.; Babu, B. R.; Sorensen, M. D.; Harrit, N.; Wengel, J. Multilabeled pyrene-functionalized 2'-amino-LNA probes for nucleic acid detection in homogenous fluorescence assays .J. Am. Chem. Soc. 2005,127, 13293-13299.

40. Umemoto, Т.; Hrdlichka, P. J.; Babu, B. R.; Wengel, J. Dual-probe system using pyrenylmethyl-modified amino-LNA for mismatch detection. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2007, 26, 1261-1263.

41. Umemoto, Т.; Hrdlichka, P. J.; Babu, B. R.; Wengel, J. Sensitive SNP dual-probe assays based on pyrene-functionalized 2'-amino-LNA:lessons to be learned. ChemBioChem 2007, 8, 2240-2248.

42. Lindegaard, D.; Madsen, A. S.; Astakhova, I. V; Malakhov, A. D.; Babu, B. R.; Korshun, V. A.; Wengel, J. Pyrene-perylene as a FRET pair couples to the N2'-functionality of 2'-amino-LNA. Bioorg. Med. Chem. 2008,16, 94-99.

43. Wengel, J. Nucleic acid nanotechnology towards Angsrtom-scale engineering. Org. Biomol. Chem. 2004, 2,277-280.

44. Kalra, N.; Babu, B. R.; Parmar, I. S.; Wengel, J. Conformationally controlled high-affinity targeting of RNA or DNA by novel 2'-amino-DNA/LNA mixmers and pyrenyl-functionalized 2'-amino-DNA Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2885-2887.

45. Hrdlicka, P. J.; Kumar, T. S.; Wengel, J. Targeting of mixed sequence double-stranded DNA using pyrene-functionalized 2'-amino-a-L-LNA Chem. Commun. 2005, 4279^1281.

46. Kumar, T. S.; Wengel, J.; Hrdlicka, P. J. 2'-N-(Pyrene-l-yl)acetyl-2'-amino-a-L-LNA: synthesis and detection of single nucleotide mismatches in DNA and RNA targets. ChemBioChem 2007, 8, 1122-1125.

47. Wenska, M.; Milton, S.; Stromberg, R. Clickable 2'-O-alkuladenosine building blocks. Nucleic Acids Symp. Ser. 2007, 51, 149-150.

48. Jawalekar, A. M.; Meeuwenoord, N.; Cremens, J. S. G. O.; Ovekleeft, H. S.; van der Mar el, G. A.; Rutjes, F. P. J. Т.; van Delft, F. L. Conjugation of nucleosides and oligonucleotides by 3+2. cycloaddition. J. Org. Chem. 2008, 73, 287-290.

49. Van Daele, I.; Bomholt, N.; Filichev, V. V.; Van Calenbergh, S.; Pedersen, E. B. Triplex formation by pyrene-labelled probes for nucleic acid detection in fluorescence assays. ChemBioChem 2008, 9, 791-801.

50. Rist, M.; Amann, N.; Wagenknecht, H.-A. Preparation of 1-ethynylpyrene-modified DNA via Sonogashira-type solid-phase couplings and characterization of the fluorescence properties for electron-transfer studies. Eur. J. Org. Chem. 2003, 2498-2504.

51. Mayer, E.; Valis, L.; Wagner, C.; Rist, M.; Amann, N.; Wagenknecht, H.-A. 1-Ethynylpyrene as a tunable and versatile molecular beacon for DNA. ChemBioChem 2004, 5, 865-868.

52. Hwang, G. Т.; Seo, Y. J.; Kim, S. J.; Kim, В. H. Fluorescent oligonucleotide incorporating 5-(l-ethynylpyrenyl)-2'-deoxyuridine: sequence-specific fluorescence changes upon duplex formation. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3543-3546.

53. Hwang, G. Т.; Seo, Y. J.; Kim, В. H. Pyrene-labeled deoxyuridine and deoxyadenosine: fluorescent discriminating phenonema in their oligonucleotides. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 1475-1477.

54. Wagner, C.; Rist, M.; Mayer-Enthart, E.; Wagenknecht, H.-A. 1-Ethynylpyrene-modified guanine and cytosine as optical labels for DNA hybridization. Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 2062-2063.

55. Gaballah, S. Т.; Collier, G.; Netzel. T. L. Charge transfer excited-state dynamics in DNA duplexes substituted with an ethynylpyrenyldeoxyuridine electron source and a fluorodeoxyuridine electron trap. J. Phys. Chem. B. 2005; 109, 12175-12181.

56. Okamoto, A.; Ochi, Y.; Saito, I. Fluorometric sensing of the salt-induced B-Z DNA transition by combination of two pyrene-labeled nucleobases. Chem. Commun. 2005, 1128-1130.

57. Nakasuji, K; Akiyama, S.; Nakagawa, M. Linear conjugated systems bearing aromatic terminal groups. VII. Syntheses and electronic spectra of 1,11- and 2,2'-dipyrenylpoly-ynes. Bull Chem. Soc. Japan 1972, 45, 875-882.

58. Hopkins, N. E; Foroozesh, M. K; Alworth, W. L. Suicide inhibitors of cytochrome P450 1A1 and P450 2B1. Biochem. Pharmacol. 1992, 44, 787-796.

59. Foroozesh, M.; Primrose, G.; Gito, Z.; Bell, L. С./ Ahvorth, W. L.; Guengerich, F. P. Aryl acetylenes as mechanism-based inhibitors of cytochrome P450-dependent monooxygenase enzymes. Chem. Res. Toxicol 1997,10, 91-102.

60. Inouye, M.; Hyodo, Y.; Nakazumi, H. Nucleobase recognition by artificial receptors possessing a ferrocene skeleton as a novel modular unit for hydrogen bonding and stacking interactions. J. Org. Chem. 1999, 64, 2704-2710.

61. Harvey, R. G.; Konieczny, M.; Pataki, J. Synthesis of the isomeric mono- and bisoxiranylpyrenes. J. Org. Chem. 1983, 48, 2930-2932.

62. Bukowska, M.; Harvey, R. G. Synthesis of 2-hydroxybenzoa.pyrene, a tumorigenic phenol derivative of benzo[a]pyrene. Poly cyclic Aromatic Compounds 1992, 2, 223-228.

63. Masa, A.; Sridharan, В.; Lee, H.; Mattern, D. L. 7-Amino-2-pyrenecarboxylic Acid. J. Org. Chem. 1996, 61, 5481-5484.

64. Connor, D. M.; Allen, S. D.; Collard, D. M.; Liotta, C. L.; Schiraldi, D. A. Efficient synthesis of 4,5,9,10-tetrahydropyrene: a useful synthetic intermediate for the synthesis of 2,7-disubstituted pyrenes. J. Org. Chem. 1999, 64, 6888-6890.

65. Герасименко, 10. E.; Шевчук, И. H. Ж. Орган, химии 1968, 4, 2198-2201; Gerasimenko, Y. Е.; Sevcuk, I. N. J. Org Chem. USSR 1968, 4, 2120-2123.

66. Sangaiah, R.; Gold, A. Synthesis of cyclopentacd.pyrene and its benzannelated derivative naphtho [1,2,3 -mono]acephenanthrylene. J. Org. Chem. 1988, 53, 2620-2622.

67. Fu, P. P., Lee, H. M.; Harvey, R. G. Regioselective catalytic hydrogenation of polycyclic aromatic hydrocarbons under mild conditions. J. Org. Chem. 1980, 45, 2797-2803.

68. Klassen, S. E.; Daub, G. H.; Van der Jagt, D. L. Carbon-13 labeled benzoa.pyrenes and derivatives. 4. Labeling the 7-10 positions. J. Org. Chem. 1983, 48, 4361-4366.

69. Walker, D.; Hiebert, J. D. 2,3-Dichloro-5,6-dicianodenzoquinone and its reactions. Chem. Rev. 1967, 67,153-195.

70. Vollmann, H.; Becker, H.; Cor ell, M.; Streck, H. Beitrage zur Kenntnis des Pyrens und seiner Derivate. Justus Liebigs Ann. Chem. 1937, 531, 1-159.

71. Korshun, V.A.; Manasova, E.V.; Balakin, K.V.; Malakhov, A.D., Perepelov, A.V., Sokolova, T.A., Berlin, Y.A. New fluorescent nucleoside derivatives 5-alkynylated 2'-deoxyuridines. Nucleosides Nucleotides 1998,17, 1809-1812.

72. Cook, P. D.; Manoharan, M. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides. US Pats. 2000, 6,111,085; 6,166,188.

73. Prhavc, M.; Lesnik, E. A.; Mohan, V.; Manoharan, M. 2'-0-Carbamate-containing oligonucleotides: synthesis and properties. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 8777-8780.

74. Sproat, B. S.; Brown, D. M. A new linkage for solid phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides. Nucl. Acids Res. 1985,13, 2979-2987.

75. Rahim, S. G.; Purifoy, D. J. M. Antiviral compounds Eur.Paths 0272065, Bl.

76. Beijer, В.; Grotli, M.; Douglas, M. E.; Sproat, B. S. Simplified and cost effective synthesis of fully protected phosphoramidite monomers suitable for the assembly of oligo(2'-0-allylribonucleotides). Nucleosides Nucleotides 1994,13, 1905-1927.

77. Sproat, B. S.; Lamond, A. I. 2'-0-Methyloligoribonucleotides: synthesis and applications. In: Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford, New York, Tokyo, 1991, 49-86.

78. Dieck, H. A.; Heck, F. R. Palladium catalyzed synthesis of aryl, heterocyclic and vinylic acetylene derivatives. J. Organometal. Chem. 1975, 93, 259-263.

79. Cassar, L. Synthesis of aryl- and vinyl-substituted acetylene derivatives by the use of nickel and palladium complexes. J. Organometal. Chem. 1975, 93, 253-257.

80. Sonogashira, K.; Tohda, Y.; Hagihara, N. A convenient synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkenes, iodoarenes, and bromopyridines. Tetrahedron Lett. 1975, 50, 4467-4470.

81. Rosenbohm, C.; Christensen, S. M.; Sorensen, M. D.; Pedersen, D. S.; Larsen, L.; Wengel, J.; Koch, T. Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy. Org. Biomol. Chem. 2003,1, 655-663.

82. Christensen, S. M.; Rosenbohm, C.; Sorensen, M. D.; Larsen, L.; Wengel, J.; Koch, T. Improved synthesis of 2'-amino-LNA. Nucleotides Nucleotides Nucleic Acids 2003, 22, 1131— 1133.

83. Asseline, U.; Cheng, E. Synthesis and binding properties of perylene-oligo-2'-deoxyribonucleotide conjugates. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 9005-9010.

84. Trahanovsky, W. C. Oxidation in Organic Chemistiy, Part C, chapter V, Academic Press, New York, 1978.

85. Okamoto, A.; Tainaka, K.; Nishiza, K.; Saito, I. Monitoring DNA structures by dual fluorescence of pyrene derivatives. J. Am. Chem. Soc. 2005,127, 13128-13129.

86. Zieger, H. E. Alkynylperylenes. The isomeric ethylperylenes. J. Org. Chem. 1966, 31, 29772981.

87. Sorensen, M. D.; Petersen, M.; Wengel, J. Functioanalized LNA (locked nucleic acid): high affinity hybridization of oligonucleotides containing N-acylated and N-alkylated 2'-amino-LNA monomers. Chem. Comman. 2003, 2130-2131.

88. Karla, N.; Babu, B. R.; Parmar, V. S.; Wengel, J. Conformationally controlled high-affinity targeting of RNA or DNA by novel 2'-amino-DNA/LNA mixmers and pyrenyl-functioanalized 2'-amino-DNA Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2885-2887.

89. Babu, B. R.; Hrdlichka, P. J.; McKenzie, C. J.; Wengel, J. Optimized DNA targeting using jV,jV-bis(2-pyridylmethyl)-ß-alanyl 2'-amino-LNA. Chem. Commun. 2005, 1705-1706.

90. Marras, S. A. E.; Kramer, F. R.; Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 2002, 30, el22.

91. Massey, M.; Algar, W. R.; Knill, U. J. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) for DNA biosensors: FRET pairs and Förster distances for various dye-DNA conjugates. Anal. Chim. Acta 2006, 528, 181-189.

92. Liu, X.; Tan, W. A fiber-optic evanescent wave DNA biosensor based on novel molecular beacons. Anal. Chem. 1999, 71, 5054-5059.

93. Frutos, A. G.; Pal, S.; Quesada, M.; Lahiri, J. Method for detection of single-base mismatches using molecular beacons. J. Am. Chem. Soc. 2002,124, 2396-2397.

94. Hwang, G. T.; Seo, Y. J.; Kim, B. H. A highly discrimination quencher-free molecular beacon for probing DNA. J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 6528-6529.

95. Hwang, G. T.; Seo, Y. J.; Kim, S. J.; Kim, B. H. Fluorescent oligonucleotide incorporating 5-(l-ethynylpyrenyl)-2'-deoxyuridine: sequence-specific fluorescence changes upon duplex formation. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 3543-3546.

96. Brunner, J.; Kraemer, R. Couper(II)-quenched oligonucleotide probes for fluorescent DNA sensing. J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 13626-13627.

97. Köfler, O.; Jarikonte, D. V.; Seitz, O. Extended target sequence specificity of PNA-minor-groove binder conjugates. ChemBioChem 2005, 6, 66-79.

98. Dohno, C.; Saito, I. Discrimination of single-nucleotide alterations by G-specific fluorescence quenching. ChemBioChem 2005, 6, 1075-1081.

99. Valis, L.; Amann, N.; Wagenknecht, H. Detection of single base mismatches and abasic sites using phenanthridium as an artificial DNA base and charge donor. Org. Biomol. Chem. 2005, 3, 36-38.

100. Bag, S. S.; Saito, Y.; Hanawa, K; Hayasi, K; Kodate, S.; Sazuka, I.; Saito, I. Synthesis of perylene-labeled base-discriminating fluorescent (BDF) nucleoside and its fluorescence properties. Nucleic Acids Symposium Series 2006, 50, 179-180.

101. Asseline, U.; Chassignol, M.; Aabert, Y.; Roig, V. Detection of terminal mismathes on DNA duplexes with fluorescent oligonucleotides. Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 1949-1957.

102. Shaner, N. C.; Campbell, R. E.; Steinbach, P. A.; Giepmans, B. N. G.; Palmer, A. E.; Tsien, R. Y. Improved monomelic red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 1567-1572.

103. Grimshaw, J.; Trocha-Grimshaw, J. Characterization of 1,6- and 1,8-dibromopyrenes. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1622-1623.

104. Ogino, K.; Iwashima, S.; Inokuchi, H.; Harada, Y. Photoelectric emission and electrical conductivity of the cesium complex with pyrene derivatives. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1965, 38, 473-477.

105. Benniston, A. G; Harriman, A.; Howell, S. L.; Sams, G A.; Zhi, Y.-G. Intramolecular excimer formation and delayed fluorescence in sterically constrained pyrene dimers. Chem. Eur. J. 2007,13,4665-4674.

106. Bannwarth, W.; Trzeciak, A. A simple and effective phosphorylation procedure for biomolecules. Helv. Chim. Acta 1987, 70, 175-186.

107. Coulson, D. R. Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0). Inorg. Synth. 1972,13, 121-124.

108. Carutherc, M. H.; Barone, A. D.; Beausage, C. L.; Dodds, D. R.; Ficher, E. F.; McBride, L. J.; Matteucci, M; Ctabesky, Z.; Tang, J.-Y. Chemial synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Meth. Enzymol. 1987,154, 287-313.

109. Melhuish, W. H. Quantum efficiencies of fluorescence of organic substances: effect of solvent and concentration of the fluorescent solute. J. Phys. Chem. 1961, 35, 229-235.

110. Goldschmiedt, G. Ueber die Structur des Pyrens. Justus Liebigs Ann. Chem. 1907, 351, 218— 250.

111. Graebe, C. Ueber Pyren. Justus Liebigs Ann. Chem. 1871,158, 285-302.

112. Langstein, E. Beitraege zur Kenntnis der Struktur des Pyrens. Monatsh. Chem. 1910, 31, 861— 870.

113. Cook, J. W.; Hewett, C. L.; Hieger, I. Isolation of a cancer-producing hydrocarbon from Coal Tar. J. Chem. Soc. 1933, 395^105.

114. Atkinson, T.; Smith, M. Solid-phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides by the phosphite-triester method. In Gait, M. J. (Ed.), Oligonucleotide synthesis: a Practical Approach, IRL Press: Oxford, 1984, 35-81.

115. Cantor, C.R.; Warshaw, M. M. Oligonucleotide interactions. IV. Conformational differences between deoxy- and ribonucleoside phosphates. Biopolymers 9, 1079-1103.

116. Warshaw M.M., Tinoco I. Optical properties of sixteen dinucleoside phosphates. J. Mol. Biol. 20, 29-38.

117. Nijegorodov, N.; Mabbs, R.; Downey, W. S. Evolution of absorption, fluorescence, laser and chemical properties in the series of compounds perylene, benzo(ghi)perylene and coronene. Spectrochim. Acta A 2001, 57, 2673-2685.