Биологическая активность синтетических производных пиперазина и бензопирана в in vitro и in vivo моделях болезни Альцгеймера тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Зернов Никита

• Зернов Никита
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Зернов Никита

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Синаптопатическая природа болезни Альцгеймера

1.2 Роль кальция в механизмах синаптической дисфункции

1.3 Участие TRPC6-каналов в формировании синапса

1.3.1 TRPC6 канал

1.3.2 Возможные TRPC6-регулируемые синаптопротекторные механизмы

1.4 Фармакологическая модуляция TRPC6-канала

1.4.1 Известные активаторы TRPC6

1.4.2 Производное пиперазина стр2 — потенциальный положительный модулятор TRPC6 канала

1.4.3 Производное бензопирана С20 — положительный модулятор TRPC6 канала

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Соединения

2.2 Плазмиды

2.3 Животные

2.4 Культивирование культуры НЕК293Т

2.5 Трансфекция культуры НЕК293Т

2.6 Визуализация Са2+ в клетках НЕК293Т

2.7 Культивирование первичной гиппокампальной культуры

2.8 Трансфекция первичной гиппокампальной культуры

2.9 Анализ морфологии дендритных шипиков с помощью

конфокальной микроскопии

2.10 Приготовление растворов пептидов ß-амилоида 42 для in vitro модели синаптической токсичности

2.11 Методика приготовления срезов гиппокампа и электрофизиологические исследования ДВП

2.12 Определение мутагенности соединений с помощью теста Эймса

2.13 Определение стабильности соединений в плазме крови

2.14 Определение проницаемости соединений через ГЭБ

2.14.1 Определение проницаемости cmp2 через ГЭБ

2.14.2 Определение проницаемости C20 через ГЭБ

2.15 Гистохимическое исследование срезов мозга

2.15.1 Гистохимическое исследование амилоидоза

2.15.2 Гистохимическое исследование астроглиоза

2.16 Определение влияния хронического введения исследуемого вещества на массу мышей

2.17 Метод «Открытое поле»

2.18 Метод «Распознавание нового объекта»

2.19 Водный лабиринт Морриса

2.20 Оценка условно-рефлекторного замирания

2.21 Исследование двигательных функций

2.22 Статистическая обработка

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 cmp2 активирует TRPC6, но не структурно родственные TRPC3 и TRPC7

3.2 Исследование синаптопротекторных эффектов cmp2 и C20 в условиях амилоидной токсичности in vitro

3.2.1 cmp2 способен сохранять морфологию дендритных шипиков при воздействии A042

3.2.2 С20 способен сохранять морфологию дендритных шипиков при воздействии A042

3.3 Характеристика фармакокинетических, мутагенных свойств соединений и их влияние на вес и выживаемость мышей

3.3.1 cmp2 стабилен в плазме крови и способен проникать через ГЭБ

3.3.2 С20 стабилен в плазме крови и способен проникать через ГЭБ

3.3.3 cmp2 и его метаболиты не обладают мутагенной активностью

3.3.4 С20 и его метаболиты практически не обладают мутагенной активностью

3.3.5 Соединение cmp2 при остром и хроническом введении не влияет на массу тела и выживаемость мышей

3.3.6 Отсутствие влияния на вес и выживаемость мышей соединения С20 при остром и хроническом введении

3.4 Исследование влияния соединений на восстановление синаптической пластичности в срезах мозга 5xFAD мышей

3.4.1 Инкубация срезов мозга cmp2 восстанавливает дефицит ДВП у мышей 5xFAD

3.4.2 Инкубация срезов мозга с С20 восстанавливает дефицит ДВП у мышей 5xFAD

3.4.3 стр2 при внутрибрюшинном введении восстанавливает дефицит ДВП у мышей 5xFAD

3.4.4 Внутрибрюшинные инъекции С20 восстанавливают дефицит ДВП у мышей 5xFAD

3.5 Влияние соединений на когнитивные и моторные функции мышей 5xFAD

3.5.1 Введение cmp2 положительно влияет на долговременную память у мышей 5xFAD в тесте распознавания нового объекта

3.5.2 Введение С20 положительно влияет на память узнавания у мышей 5xFAD в тесте распознавания нового объекта

3.5.3 Введение cmp2 положительно влияет на пространственную память в водном лабиринте Морриса у мышей 5xFAD

3.5.4 Введение С20 положительно влияет на пространственную память в водном лабиринте Морриса у мышей 5xFAD

3.5.5 Введение cmp2 положительно влияет на восстановление контекстной и тональной памяти у 8-месячных мышей 5xFAD

3.5.6 Введение С20 положительно влияет на восстановление контекстной и тональной памяти у 6-месячных мышей 5xFAD

3.5.7 Введение С20 положительно влияет на восстановление тональной памяти у 8-месячных мышей 5xFAD

3.5.8 Отсутствие различий между мышами 5xFAD и WT в тесте «Открытое поле»

3.5.9 C20 повышает исследовательский интерес 5xFAD мышей к несоциальному объекту в тесте «Открытое поле»

3.5.10 C20 усиливает исследовательский интерес 5xFAD мышей к социальному объекту в тесте «Открытое поле»

3.5.11 стр2 восстанавливает двигательные функции мышей 5xFAD

3.5.12 C20 не влияет на двигательные параметры мышей 5xFAD в

3.6 Изучение влияния cmp2 и C20 на амилоидоз и астроглиоз

3.6.1 Внутрибрюшинные инъекции cmp2 не влияют на развитие амилоидоза или астроглиоза в гиппокампе мышей

3.6.2 С20 вызывает уменьшение площади и количества амилоидных бляшек в зубчатой извилине гиппокампе мышей 5xFAD

3.6.3 С20 изменяет морфологию реактивных астроцитов в гиппокампе мышей 5xFAD

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологическая активность синтетических производных пиперазина и бензопирана в in vitro и in vivo моделях болезни Альцгеймера»

Актуальность темы исследования

Деменция — зонтичный термин, используемый для описания ряда когнитивных нарушений, которые обычно начинаются в зрелом возрасте и влияют на способность человека самостоятельно выполнять повседневные действия. Болезнь Альцгеймера (БА) — самая распространенная причина деменции, на нее приходится от 60 до 80 % всех случаев деменции [1]. БА представляет собой одну из наиболее серьёзных проблем для современного здравоохранения и общества в глобальном масштабе. Согласно новым оценкам, полученным с помощью Гармонизированного протокола оценки когнитивных способностей (Harmonized Cognitive Assessment Protocol, HCAP), в 2016 году в США деменцией страдали 10% людей в возрасте 65 лет и старше [2]. БА занимает шестое место среди причин смертности в США и влечет за собой значительные экономические издержки [3]. Точной официальной и актуальной статистики по России на данный момент нет. По оценкам на начало 2024 года численность пожилых людей в возрасте 65 лет и старше превысило 17.1% населения России [4]. В США этот показатель составляет 10.9 % [1]. Так как основным фактором риска развития БА является возраст, можно предполагать о соизмеримой с США эпидемиологии БА в России. Однако, конкретные данные по региональным исследованиям могут значительно отличаться. В частности, в эпидемиологическом исследовании лиц старше 60 лет отдельного округа Москвы распространенность деменции составила 10.4%, БА — 4.5% [5]

Поиск эффективных способов фармакокоррекции БА является целью многих научных государственных учреждений и фармацевтических компаний. По данным общей онтологии исследований БА (Common Alzheimer's Disease Research Ontology — CADRO) в 2024 году проходят 164 клинических исследований, в которых оценивают 127 препаратов, направленных на терапию БА. Из них 48 испытаний находятся на III фазе клинических исследований (тестируется 32 препарата), 90 испытаний — на II

фазе (тестируется 81 препарат) и 26 испытаний — на I фазе (тестируется 25 препаратов) [6]. Несмотря на значительные финансовые вложения и активные исследования, направленные на поиск методов лечения БА, на сегодняшний день не существует однозначно эффективных лекарственных препаратов, способных остановить или существенно замедлить прогрессирование заболевания. Основные подходы к терапии, основанные на гипотезе амилоидного каскада, не принесли ожидаемых результатов. Клинические испытания ингибиторов у- и в-секретазы, а также моноклональных антител против бета-амилоида (Ав), продемонстрировали ограниченную клиническую эффективность таких препаратов, а также их серьёзные нежелательные эффекты [7,8]. Ограниченную эффективность можно объяснить тем, что накопление токсичного амилоида начинает происходит намного раньше (примерно на 20 лет раньше), чем возникают первые когнитивные нарушения, которые фиксируются окружающими, как причина обратиться к врачам. Таким образом, к моменту возникновения клинически значимых признаков нейродегенерации Ав уже мог реализовать основную часть своего нейротоксического действия. Это указывает на то, что начало терапевтического воздействия на амилоидный патогенез в стадии манифестирующих когнитивных расстройств, вероятно, является слишком поздним для эффективного замедления или остановки прогрессирования болезни.

Таким образом, имеет смысл обратить внимание на альтернативные терапевтические пути, например воздействие непосредственно на дегенирирующие структуры мозга, в частности на дендритные шипики, изменение которых не так сильно отложено по времени от клинической симптоматики, как тот же амилоид.

В связи с этим возникает необходимость в поиске новых стратегий поиска эффективного лечения БА. Современные исследования предлагают новые направления, такие как таргетная терапия тау-белка, модуляция активности микроглии, а также повышение устойчивости синапсов к

токсичному воздействию амилоида [9]. Кроме того, значительный интерес представляют исследования нарушения кальциевого гомеостаза в нейронах. Нарушения кальциевых сигнальных путей могут играть ключевую роль в патогенезе заболевания, а фармакологические способы их восстановления открывают перспективы для разработки новых терапевтических стратегий [9].

Продолжающийся рост числа пациентов с БА, отсутствие эффективных методов лечения и необходимость рассмотрения новых подходов к созданию фармакологического решения БА делают тему данного исследования актуальной и значимой как с научной, так и с практической точки зрения.

Степень разработанности темы

Специфичное воздействие на ионные каналы, участвующие в кальциевой регуляции, является потенциально перспективной стратегией для поиска терапии БА. К возможным молекулярным мишеням можно отнести TRPC6 (TRPC6 — Transient Receptor Potential cation channel, subfamily C, member 6 (транзиентный рецепторный потенциальный катионный канал, подсемейство C, член 6)) [10,11].

Существует определенное генетическое подтверждение роли TRPC6 в патогенезе БА. Уровень мРНК TRPC6 в клетках крови специфически снижен у пациентов с БА и умеренными когнитивными нарушениями [12]. Кроме того, экспрессия TRPC6 в крови связана со степенью деменции [13]. Нейрональный SOCE (SOCE — Store-Operated Calcium Entry (депо-управляемый вход кальция)) играет значительную роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний [14]. Установлено, что нокдаун гена, кодирующего TRPC6, препятствует входу кальция посредством SOCE. Повышенная экспрессия TRPC6 или его фармакологическая активация приводит к восстановлению SOCE в нейронах гиппокампа при БА [15,16]. Также показано, что повышенная экспрессия TRPC6 предотвращает потерю грибовидных шипиков в моделях БА с knock-in мутацией в генах пресенилина и APP (APP — Amyloid-beta precursor protein (предшественник белка амилоида бета)) [15], а также защищает нейроны от ишемического повреждения мозга

[17]. Мыши, сверхэкспрессирующие TRPC6 в мозге, демонстрируют улучшение когнитивных функций и увеличение образования синапсов [18]. Таким образом, вещества-активаторы TRPC6 могут быть предложены в качестве потенциальной фармакологической группы для фармакокоррекции БА.

Известно множество различных соединений, способных активировать TRPC6 канал [11]. Одновременно с этим продолжается открытие новых активаторов канала [19]. Многие из них демонстрируют либо кросс-специфичность, либо токсичность. К примеру, гиперфорин, один из самых известных специфических агонистов TRPC6, был протестирован в клинических испытаниях для лечения легкой и умеренной депрессии [20,21]. Однако данное вещество нестабильно, его трудно синтезировать [22]. Оно обладает серьёзными нежелательными эффектами: протонофорными свойствами [23] и способностью вызывать лекарственное взаимодействие [24]. Протонофорные свойства вызывают закисление цитозоля, что, в свою очередь, приводит в действие натрий-протонный обменник плазматической мембраны. Лекарственное взаимодействие возникает из-за мощной активации ядерного рецептора PXR (NR1I2), ключевого транскрипционного регулятора генов, участвующих в метаболизме и транспорте лекарств [24]. Эти особенности ограничивают его клиническое применение и требуют поиска других агонистов TRPC6.

Производные пиперазина, [4-(5-хлор-2-метилфенил)пиперазин-1-ил] (3-фторфенил)метанон (PPZ1) и 2-[4-(2,3-диметилфенил)-пиперазин-1-ил]-^(2-этоксифенил)ацетамид (PPZ2), описаны как активаторы TRPC6 и проявляют мощный нейротрофический эффект [25]. Однако, PPZ1 и PPZ2 не являются специфичными к TRPC6 каналу и одновременно активируют TRPC3 и TRPC7 каналы [25].

Используя базу данных Integrity (Clarivate Analytics под руководством академика РАН, проф, д.б.н. В.В. Поройкова), в Лаборатории молекулярной нейродегенерации ФГАОУ ВО СПбПУ (зав. лаб., д.б.н., член-корреспондент

РАН И.Б. Безпрозванный) ранее были найдены шесть потенциальных активаторов TRPC6 [16]. Однако большинство из этих молекул были недоступны для экспериментального тестирования. Поэтому проведен поиск химических аналогов этих молекул в химической библиотеке InterBюScreen (г. Черноголовка, Россия). Основываясь на высоком проценте (88%) совпадения со изначальными структурами, отобраны несколько соединений. Далее на первичной гиппокампальной культуре проведены исследования нейропротекторных свойств этих соединений в условиях амилоидной токсичности. По результатам этих исследований определено соединение-лидер — К-(2-хлорфенил)-2-(4-фенилпиперазин-1-ил)ацетамида (51164). Также показано, что 51164 активирует TRPC6 в режиме работы SOCE, восстанавливает грибовидные шипики и вызывает восстановление долговременной потенциации (ДВП) в срезах мозга мышей 5xFAD [16].

С помощью молекулярного докинга и конформационного анализа взаимодействия 51164 с мономером TRPC6 канала определены ключевые характеристики фармакофора [26]. Эти данные использовали для виртуального поиска структур, схожих с фармакофором [27]. После различных процедур верификации на основании высоких значений биофизических параметров, определенных путем молекулярного докинга и кластеризации пространственно-энергетических параметров

комплексообразования, отобрано 14 соединений [27]. 5 из этих 14 соединений продемонстрировали способность связываться с центральной частью TRPC6 аналогично гиперфорину а также близкие к нему значения энергии связывания. Одним из этих соединений являлось вещество стр2 ((2S)-N-(2,6-дифторфенил)-2-(4-фенилпиперазин-1-ил)пропанамид). На следующем этапе проведена молекулярная динамика для оценки стабильности взаимодействий стр2 с тетрамерными TRPC3 и TRPC6. Комплекс cmp2-TRPC6 продемонстрировал высокую стабильность, в отличие от cmp2-TRPC3, где наблюдались значительные колебания [28].

Недавно было идентифицировано вещество, С20 (3-(3-,4-дигидро-6,7-диметокси-3,3-диметил-1 -изохинолинил)-2Н-1 -бензопирана-2-он), способное вызывать дозозависимое увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция в стабильно экспрессирующих TRPC6 клетках линии HEK293 [29]. С20 проявляет селективное действие на TRPC6: оно активирует специфично TRPC6, но не близкородственный канал TRPC3 [29]. Дальнейшие исследования с использованием кальциевых тестов и электрофизиологических методов показали, что C20 действует скорее как положительный модулятор активации канала, чем как самостоятельный активатор [29].

В 2020 году опубликован комплекс TRPC6 с агонистом AM-0883 [30]. Чтобы сравнить новое соединение, C20, с изученными положительными регуляторами TRPC6, был проведен молекулярный докинг C20 с TRPC6. Молекулярный докинг был выполнен в месте связывания агониста AM-0883 рецептора TRPC6. Результаты докинга показывают, что положение и взаимодействие C20 с TRPC6 аналогично AM-0883 [31]. Таким образом, предполагают, что C20 активирует TRPC6 посредством того же молекулярного механизма стимуляции внеклеточного участка, образованного спиралью пор и трансмембранной спиралью S6 [19,30], что и ранее описанные агонисты TRPC6.

Таким образом TRPC6 каналы представляют собой перспективную молекулярную мишень для разработки лекарственной терапии БА, а химические вещества способные регулировать активность данных каналов активно изучаются. Однако выявление биологической активности этих соединений в трансляционных моделях БА остается актуальной задачей.

Цели и задачи работы

Целью данной работы является определение молекулярно-биологических, синаптопротекторных и фармакологических эффектов производных пиперазина cmp2 и бензопирана C20 на in vitro и in vivo моделях болезни Альцгеймера.

Для достижения данной цели были поставлены и реализованы следующие задачи:

1. Исследовать синаптопротекторные эффекты cmp2 и C20 в условиях амилоидной токсичности in vitro.

2. Охарактеризовать фармакокинетику и токсикологические свойства cmp2 и C20.

3. Исследовать влияние cmp2 и C20 на восстановление синаптической пластичности в трансляционной модели болезни Альцгеймера (мыши 5xFAD).

4. Оценить способность cmp2 и C20 восстанавливать когнитивные и моторные функции у мышей 5xFAD.

5. Сравнить биологические механизмы нейропротекции cmp2 и C20. Научная новизна работы

Впервые доказаны специфичность и эффективность нового активатора TRPC6 канала (cmp2). Также впервые описаны молекулярно-биологические, нейропротекторные и фармакокинетические характеристики cmp2. Впервые показано влияние данных соединения на когнитивные и моторные функции мышей линии 5xFAD.

Впервые исследованы нейропротекторные свойства производное бензопирана (С20), в частности, показано его положительное влияние на морфологию шипиковых структур нейронов гиппокампа, также показана способность С20 восстанавливать ДВП у мышей 5xFAD при инкубации срезов мозга в присутствии 100 нМ С20 и при внутрибрюшинном введении С20 в дозе 10 мг/кг в течение 14 дней. Впервые показано влияние С20 на поведение мышей линии 5xFAD в тестах «Открытое поле», задаче на условно-рефлекторное замирание. Впервые установлено влияние внутрибрюшинных инъекции С20 на амилоидогенез и астроглиоз у мышей 5xFAD с помощью конфокальной микроскопии.

Теоретическая значимость работы

Выполненная работа вносит существенный вклад в понимание молекулярно-клеточных механизмов нейропротекции, опосредованной активацией TRPC6-каналов, и расширяет представления о роли этих каналов в патогенезе и терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности БА.

Впервые продемонстрирована способность нового положительного модулятора TRPC6-канала (С20) восстанавливать структурные и функциональные параметры синапсов при Ав-индуцированной патологии. Показано, что в концентрациях 1 мкМ и 100 нМ С20 нормализует количество грибовидных дендритных шипиков в нейронах гиппокампа, а также восстанавливает нарушенную ДВП у трансгенных мышей линии 5xFAD. Эти эффекты были зарегистрированы как при прямой инкубации мозговых срезов с веществом, так и при его системном введении, что указывает на высокую биодоступность и специфичность действия соединения.

Установлено, что системное применение С20 снижает уровень амилоидогенеза и выраженность астроглиоза у модельных животных, тем самым подтверждена возможность модуляции ключевых патологических процессов БА через регуляцию активности TRPC6-каналов. Для стр2, другого нового активатора TRPC6, также показаны выраженные нейропротекторные эффекты, однако его влияние на амилоидный патогенез не достигло статистической значимости, что может свидетельствовать о различиях в фармакодинамике данных соединений.

Также теоретический интерес представляет отсутствие мутагенного потенциала и хорошая переносимость как однократным, так и повторным введением исследуемых соединений, что подтверждает их безопасность и потенциальную применимость в клинической практике.

Таким образом, результаты исследования углубляют понимание роли кальциевых сигналов, опосредованных TRPC6-каналами, при нейродегенерации. Полученные данные открывают новые перспективы для разработки патогенетически обоснованных подходов к лечению

нейродегенеративных заболеваний и могут служить основой для дальнейших доклинических и клинических исследований.

Практическая значимость работы

Практическая значимость выполненного исследования заключается в выявлении и комплексной характеристике новых активаторов TRPC6-канала (стр2 и С20), обладающих нейропротекторной активностью, что открывает перспективы их применения в качестве основ для разработки инновационных терапевтических средств, направленных на лечение БА и других нейродегенеративных заболеваний.

В ходе работы были получены экспериментальные данные, подтверждающие эффективность соединений стр2 и С20 в восстановлении нарушенных синаптических функций и когнитивных способностей у трансгенных мышей линии 5xFAD.

Также установлено, что соединения стр2 и С20 положительно влияют на параметры у животных в различных поведенческих тестах. Особенно выраженные эффекты на поведение наблюдались при применении стр2, что свидетельствует о его потенциале коррекции когнитивных нарушений.

Дополнительным преимуществом исследованных соединений является их безопасность: хроническое и острое введение не оказывало негативного влияния на массу тела животных и не выявило признаков мутагенности, что свидетельствует о благоприятном токсикологическом профиле.

Таким образом, полученные результаты могут служить основой для создания новых подходов к фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний, а также могут быть использованы в доклинической разработке лекарственных препаратов, направленных на модуляцию TRPC6-сигнального пути.

Методология и методы исследования

В работе использован комплекс современных методов молекулярной биологии, нейрофизиологии, поведенческого тестирования и конфокальной микроскопии, направленных на изучение молекулярно-биологических

свойств новых активаторов TRPC6-канала (cmp2 и С20) в условиях нейродегенерации, моделируемой воздействием синтетического A0 и на трансгенных мышах линии 5xFAD.

В эксперименте использовались трансгенные мыши линии 5xFAD, широко применяемые как модель БА, и мыши дикого типа. Животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением всех требований по уходу и биоэтике.

Для подтверждения специфичности cmp2 в отношении TRPC6-каналов применялись методы кальциевого имиджинга in vitro. Оценка токсичности, включала в себя мониторинг веса животных. Мутагенность проверялась с помощью теста Эймса. Для оценки синаптической пластичности проводились эксперименты по регистрации ДВП в гиппокампальных срезах мозга с использованием стандартных электрофизиологических методов регистрации ДВП. Морфологическое состояние дендритных шипиков нейронов первичной гиппокампальной культуры в условиях амилоидной токсичности оценивалось методом конфокальной микроскопии. Также с помощью иммуногистохимического анализа оценивался уровень Thio-T положительных амилоидных бляшек и выраженность астроглиоза (маркер GFAP) на срезах мозга животных.

Для оценки когнитивных и двигательных функций использовался ряд поведенческих тестов:

- тест «Открытое поле» - для оценки общей тревожности, уровня взаимодействия с социальным и несоциальным объектами.

- тест на распознавание нового объекта - для оценки памяти распознавания;

- водный лабиринт Морриса - для изучения пространственного обучения и памяти;

- тест на условно-рефлекторное замирание - для оценки ассоциативной памяти;

- тест «Прогулка по перекладине — для оценки двигательных функций.

Положения, выносимые на защиту:

Производные пиперазина (стр2) и бензопирана (С20):

1. Демонстрируют выраженные синаптопротекторные свойства на первичной гиппокампальной культуре в условиях амилоидной токсичности;

2. Эффективно восстанавливают синаптическую пластичность в экспериментах на переживающих гиппокампальных срезах мозга мышей линии 5xFAD;

3. Значимо улучшают когнитивные функции в поведенческих тестах у мышей линии 5xFAD;

4. Различаются по биологическим механизмам нейропротекции. Личный вклад автора

Личный вклад автора состоит в разработке дизайна исследования, проведении экспериментов, систематизации и обработке результатов, сборе и анализе литературных данных. При активном участии автора сформулированы положения, выносимые на защиту и выводы, подготовлены публикации по результатам диссертационного исследования. Степень достоверности научных результатов.

Степень достоверности полученных научных результатов обеспечивается комплексом факторов, включающих применение современных молекулярно-биологических методов исследования, использование высокотехнологичного лабораторного оборудования, а также тщательным соблюдением методологических подходов на всех этапах эксперимента. Надежность данных подтверждается их воспроизводимостью при повторных экспериментах, а также соответствием результатам, представленным в актуальных научных публикациях.

Дополнительным подтверждением достоверности служат положительные отзывы рецензентов ведущих международных научных журналов, в которых публиковались результаты настоящего исследования, а также факт цитирования этих работ другими исследователями,

использующими полученные данные в собственных научных изысканиях.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены в виде устного сообщения на российских и международных конференциях:

1. Всероссийская научная очно-заочная конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых. Санкт-Петербург, 2023.

2. VIII молодежной школы-конференции по молекулярной биологии и генетическим технологиям института цитологии РАН. Санкт-Петербург, Россия. 2022.

3. XVII Годичная научная конференция РАУ. Ереван, Армения. 2023.

4. XVIII Годичная научная конференция РАУ. Ереван, Армения. 2024.

Кроме того, научные результаты были представлены лично автором в

виде постерного доклада на различных конференциях:

1. Всероссийская конференция Российского нейрохимического общества «RUSNEUROCHEM». Санкт-Петербург, Россия. 2023.

2. V Международная конференция «Volga Neuroscience Meeting 2025». Санкт-Петербург, Россия. 2023.

3. XXIV съезд физиологического общества им. И. П. Павлова. Санкт-Петербург, Россия. 2023.

4. Международная конференция по нейронам и заболеваниям мозга «AND». Циндао, Китай. 2024. Награда — лучший постерный доклад.

Публикации

В ходе выполнения диссертационного исследования автором были подготовлены и опубликованы: 10 статей в рецензируемых журналах, 8 из которых индексируются в международных базах данных; 21 тезис доклада, вошедших в сборники российских и зарубежных конференций; 1 патент на изобретение РФ. Полный перечень публикаций по теме диссертации, а также сведения о патентах представлены в автореферате.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 131 странице, содержит 31 рисунок и 2 таблицы. Список литературы включает 139 библиографических источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Синаптопатическая природа болезни Альцгеймера

Синапсы играют важную роль в функционировании нервной системы, поскольку именно через них обеспечивается передача сигнала между нейронами. Передача сигнала начинается в пресинаптическом окончании, где происходит высвобождение везикул, содержащих различные нейромедиаторы. На другом нейроне постсинаптические окончания, локализованные преимущественно на дендритных шипиках, содержат специфические рецепторы, способные взаимодействовать с нейромедиаторами и запускать молекулярный каскад, который стимулирует передачу поступившего сигнала далее [32].

Синапсы обладают высокой степенью пластичности, что проявляется в изменении их количества, структуры и функциональной активности. Такая синаптическая пластичность лежит в основе когнитивных процессов, включая обучение и память [33]. Нарушения синаптической функции и дегенерация синапсов ассоциированы с БА [34,35]. Дендритные шипики подвергаются выраженной элиминации при БА, и их утрата служит причиной когнитивных нарушений, наблюдаемых в ходе прогрессирования заболевания [36,37]. В частности, существуют данные о снижении плотности грибовидных шипиков (дендритные шипики с характерной крупной головкой, предположительно играющие основную роль в формировании устойчивого синаптического контакта) в гиппокампе в различных экспериментальных моделях БА на мышах, включая линии PS1-M146V-knock-in (KI) [38], APP-KI [39,40], а также при индукции амилоидной синаптотоксичности in vivo и in vitro [41]. Утрата синапсов и нарушение синаптической передачи играют не менее значимую роль в развитии когнитивных нарушений, чем накопление Ав и нейрофибриллярных клубков (NFTs) [42].

Синаптическая дисфункция отчетливо диагностируются уже на стадии умеренного когнитивного нарушения [43]. Более того, экспериментальные данные свидетельствуют о значительном снижении плотности синапсов на

ранних стадиях заболевания у мышей с генетической моделью БА [44,45] и у пациентов с БА [46]. Глубокое понимание механизмов, лежащих в основе синаптической потери при БА, имеет ключевое значение для поиска новых терапевтических мишеней и разработки модифицирующих течение болезни подходов. Несмотря на то, что точные причины синаптической дегенерации при БА остаются не до конца изученными, к основным факторам, вовлечённым в этот процесс, относят Ав, тау-белок, аполипопротеин Е, микроглию и нарушения кальциевого гомеостаза [32].

1.2 Роль кальция в механизмах синаптической дисфункции

Согласно кальциевой гипотезе, нарушения кальциевого гомеостаза играют ключевую роль в нейродегенеративных изменениях, в том числе в синаптической дисфункции [47-49]. При этом изменения в кальциевой (Са2+) сигнализации рассматриваются как результат токсического действия растворимых олигомеров Ав, дисфункции пресенилинов, митохондриальных дефектов и возрастных нарушений [49,50].

Са2+ — универсальный внутриклеточный мессенджер, участвующий практически во всех аспектах клеточной жизни нейронов. Са2+-связывающие белки являются ключевым компонентом кальциевой буферной системы клетки. Их основная функция заключается в быстром связывании свободных ионов Са2+, резко возрастающих в цитоплазме при поступлении сигнала. Это позволяет мгновенно снижать концентрацию Са2+ до фонового уровня, ограничивая длительность и распространение сигнала Са2+ в пространстве, тем самым обеспечивая его точную локализацию и предотвращая возможную токсичность высоких концентраций этого мессенджера для клетки. Регуляция кальциевой сигнализации также осуществляется через вход ионов извне и перераспределение между внутриклеточными депо — эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) и митохондриями. Нарушения этих путей приводят к дисрегуляции, которые способствуют запуску нейротоксичных каскадов, ведущих в том числе к синаптопатиям.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зернов Никита, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Rajan K.B. et al. Population estimate of people with clinical Alzheimer's disease and mild cognitive impairment in the United States (2020-2060) // Alzheimer's & Dementia. 2021. Vol. 17, № 12. P. 1966-1975.

2. Manly J.J. et al. Estimating the Prevalence of Dementia and Mild Cognitive Impairment in the US: The 2016 Health and Retirement Study Harmonized Cognitive Assessment Protocol Project // JAMA Neurol. American Medical Association. 2022. Vol. 79, № 12. P. 1242-1249.

3. 2022 Alzheimer's disease facts and figures // Alzheimer's & Dementia. 2022. Vol. 18, № 4. P. 700-789.

4. Щербакова Е.М. Демографические итоги I полугодия 2024 года в России (часть I) // Демоскоп Weekly. 2024. Vol. № 1043-10442.

5. Чердак М.А. М.Э.А., Ш.Н.В., и др. Распространенность когнитивных расстройств у пациентов старшего возраста в Российской Федерации // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски. 2024. Vol. 124, № (4-2). P. 5-11.

6. Cummings J. et al. Alzheimer's disease drug development pipeline: 2024 // Alzheimer's & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions. 2024. Vol. 10, № 2. P. e12465.

7. Asher S., Priefer R. Alzheimer's disease failed clinical trials // Life Sci. Pergamon. 2022. Vol. 306. P. 120861.

8. Karran E., De Strooper B. The amyloid hypothesis in Alzheimer disease: new insights from new therapeutics // Nature Reviews Drug Discovery. 2022. Vol. 21, № 4. P. 306-318.

9. Bezprozvanny I. Alzheimer's disease - Where do we go from here? // Biochem Biophys Res Commun. 2022. Vol. 633. P. 72-76.

10. Zernov N., Popugaeva E. Role of Neuronal TRPC6 Channels in Synapse Development, Memory Formation and Animal Behavior // International Journal of Molecular Sciences. 2023. Vol. 24. P. 15415.

11. Prikhodko V. et al. Potential Drug Candidates to Treat TRPC6 Channel Deficiencies

in the Pathophysiology of Alzheimer's Disease and Brain Ischemia // Cells. 2020. Vol. 9, P. 2351.

12. Lu R. et al. Reduced TRPC6 mRNA levels in the blood cells of patients with Alzheimer's disease and mild cognitive impairment // Molecular Psychiatry. 2017. Vol. 23, № 3. P. 767-776.

13. Chen J.M. et al. TRPC6 mRNA levels in peripheral leucocytes of patients with Alzheimer's disease and mild cognitive impairment: A case-control study // Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2019. Vol. 92. P. 279-284.

14. Pchitskaya E., Popugaeva E., Bezprozvanny I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases // Cell Calcium. 2018. Vol. 70. P. 87-94.

15. Zhang H. et al. Store-Operated Calcium Channel Complex in Postsynaptic Spines: A New Therapeutic Target for Alzheimer's Disease Treatment // Journal of Neuroscience. 2016. Vol. 36, № 47. P. 11837-11850.

16. Popugaeva E. et al. Derivatives of Piperazines as Potential Therapeutic Agents for Alzheimer's Disease // Mol Pharmacol. 2019. Vol. 95, № 4. P. 337-348.

17. Li H. et al. TRPC6 inhibited NMDA receptor activities and protected neurons from ischemic excitotoxicity // J Neurochem. 2012. Vol. 123, № 6. P. 1010-1018.

18. Zhou J. et al. Critical role of TRPC6 channels in the formation of excitatory synapses // Nature Neuroscience. 2008. Vol. 11, № 7. P. 741-743.

19. Yang P.L. et al. GSK1702934A and M085 directly activate TRPC6 via a mechanism of stimulating the extracellular cavity formed by the pore helix and transmembrane helix S6 // Journal of Biological Chemistry. 2021. Vol. 297, № 4. P. 101125.

20. Laakmann G., Dienel A., Kieser M. Clinical significance of hyperforin for the efficacy of Hypericum extracts on depressive disorders of different severities // Phytomedicine. 1998. Vol. 5, № 6. P. 435-442.

21. Ng Q.X., Venkatanarayanan N., Ho C.Y.X. Clinical use of Hypericum perforatum (St John's wort) in depression: A meta-analysis // J Affect Disord. 2017. Vol. 210. P. 211-221.

22. Gaid M. et al. Biotechnological production of hyperforin for pharmaceutical

formulation // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2018. Vol. 126. P. 10-26.

23. Sell T.S. et al. Protonophore properties of hyperforin are essential for its pharmacological activity // Scientific Reports. 2014. Vol. 4, № 1. P. 1-12.

24. Kandel B.A. et al. No Activation of Human Pregnane X Receptor by Hyperforin-Related Phloroglucinols // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2014. Vol. 348, № 3. P. 393-400.

25. Sawamura S. et al. Screening of Transient Receptor Potential Canonical Channel Activators Identifies Novel Neurotrophic Piperazine Compounds // Mol Pharmacol. 2016. Vol. 89, № 3. P. 348-363.

26. Hunanyan L. et al. Computer-Based Drug Design of Positive Modulators of Store-Operated Calcium Channels to Prevent Synaptic Dysfunction in Alzheimer's Disease // International Journal of Molecular Sciences. 2021. Vol. 22, № 24. P. 13618.

27. Zernov N. et al. Discovery of a novel piperazine derivative, cmp2: a selective TRPC6 activator suitable for treatment of synaptic deficiency in Alzheimer's disease hippocampal neurons // Scientific Reports. 2024. Vol. 14, № 1. P. 1-15.

28. Zernov N. et al. N-N-Substituted Piperazine, Cmp2, Improves Cognitive and Motor Functions in 5xFAD Mice // International Journal of Molecular Sciences. 2025. Vol. 26, № 10. P. 4591.

29. Häfner S., Urban N., Schaefer M. Discovery and characterization of a positive allosteric modulator of transient receptor potential canonical 6 (TRPC6) channels // Cell Calcium. 2019. Vol. 78. P. 26-34.

30. Bai Y. et al. Structural basis for pharmacological modulation of the TRPC6 channel // Elife. 2020. Vol. 9.

31. Zernov N. et al. New Positive TRPC6 Modulator Penetrates Blood-Brain Barrier, Eliminates Synaptic Deficiency and Restores Memory Deficit in 5xFAD Mice // International Journal of Molecular Sciences. 2022. Vol. 23, № 21. P. 13552.

32. Peng L., Bestard-Lorigados I., Song W. The synapse as a treatment avenue for Alzheimer's Disease // Molecular Psychiatry. 2022. Vol. 27, № 7. P. 2940-2949.

33. Migaud M. et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein // Nature. 1998. Vol. 396, № 6710. P. 433-439.

34. Davies C.A. et al. A quantitative morphometric analysis of the neuronal and synaptic content of the frontal and temporal cortex in patients with Alzheimer's disease // J Neurological Sci. 1987. Vol. 78, № 2. P. 151-164.

35. Boros B.D. et al. Dendritic spines provide cognitive resilience against Alzheimer's disease // Ann Neurol. 2017. Vol. 82, № 4. P. 602-614.

36. Tackenberg C., Ghori A., Brandt R. Thin, Stubby or Mushroom: Spine Pathology in Alzheimers Disease // Curr Alzheimer Res. 2009. Vol. 6, № 3. P. 261-268.

37. Popugaeva E., Pchitskaya E., Bezprozvanny I. Dysregulation of neuronal calcium homeostasis in Alzheimer's disease - a therapeutic opportunity? // Biochem Biophys Res Commun. 2018. Vol. 483, №4. P. 998-1004

38. Sun S. et al. Reduced synaptic STIM2 expression and impaired store-operated calcium entry cause destabilization of mature spines in mutant presenilin mice // Neuron. 2014. Vol. 82, № 1. P. 79-93.

39. Zhang H. et al. Neuronal Store-Operated Calcium Entry and Mushroom Spine Loss in Amyloid Precursor Protein Knock-In Mouse Model of Alzheimer's Disease // Journal of Neuroscience. 2015. Vol. 35 №39. P. 13275-13286.

40. Saito T. et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease // Nat Neurosci. Nat Neurosci, 2014. Vol. 17, № 5. P. 661-663.

41. Popugaeva E. et al. STIM2 protects hippocampal mushroom spines from amyloid synaptotoxicity. // Molecular Neurodegeneration. 2015. Vol. 10, № 1. P. 37.

42. Terry R.D. et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment // Ann Neurol. 1991. Vol. 30, № 4. P. 572-580.

43. Scheff S.W. et al. Hippocampal synaptic loss in early Alzheimer's disease and mild cognitive impairment // Neurobiol Aging. 2006. Vol. 27, № 10. P. 1372-1384.

44. Mucke L. et al. High-level neuronal expression of Aß(1-42) in wild-type human amyloid protein precursor transgenic mice: Synaptotoxicity without plaque

formation // Journal of Neuroscience. 2000. Vol. 20, № 11. P. 4050-4058.

45. Harris J.A. et al. Transsynaptic progression of amyloid-beta-induced neuronal dysfunction within the entorhinal-hippocampal network // Neuron. 2010. Vol. 68, № 3. P. 428-441.

46. Jack C.R. et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade // Lancet Neurol. 2010. Vol. 9, № 1. P. 119-128.

47. Khacaturyan Z.S. Introduction and Overview // Ann N Y Acad Sci. 1989. Vol. 568, № 1. P. 1-4.

48. Berridge M.J. Calcium hypothesis of Alzheimer's disease // Pflugers Arch. 2010. Vol. 459, № 3. P. 441-449.

49. Ge M. et al. Role of Calcium Homeostasis in Alzheimer's Disease // Neuropsychiatr Dis Treat. 2022. Vol. 18. P. 487.

50. Bezprozvanny I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases // Trends Mol Med. 2009. Vol. 15, № 3. P. 89-100.

51. Popugaeva E., Pchitskaya E., Bezprozvanny I. Dysregulation of Intracellular Calcium Signaling in Alzheimer's Disease // Antioxid Redox Signal. 2018. Vol. 29, № 12. P. 1176.

52. Rizzuto R. et al. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2012. Vol. 13, № 9. P. 566-578.

53. Spät A. et al. High- and low-calcium-dependent mechanisms of mitochondrial calcium signalling // Cell Calcium. 2008. Vol. 44, № 1. P. 51-63.

54. Bhatia S. et al. Mitochondrial Dysfunction in Alzheimer's Disease: Opportunities for Drug Development // Curr Neuropharmacol. 2022. Vol. 20, № 4. P. 675.

55. Deshpande A. et al. Different conformations of amyloid ß induce neurotoxicity by distinct mechanisms in human cortical neurons // Journal of Neuroscience. 2006. Vol. 26, № 22. P. 6011-6018.

56. Ferreira I.L. et al. Amyloid beta peptide 1-42 disturbs intracellular calcium homeostasis through activation of GluN2B-containing N-methyl-d-aspartate receptors in cortical cultures // Cell Calcium. 2012. Vol. 51, № 2. P. 95-106.

57. Ferreira S.T., Klein W.L. The Aß oligomer hypothesis for synapse failure and

memory loss in Alzheimer's disease // Neurobiol Learn Mem. 2011. Vol. 96, № 4. P. 529-543.

58. Ferreiro E., Oliveira C.R., Pereira C.M.F. Involvement of endoplasmic reticulum Ca2+ release through ryanodine and inositol 1,4,5-triphosphate receptors in the neurotoxic effects induced by the amyloid-P peptide // J Neurosci Res. 2004. Vol. 76, № 6. P. 872-880.

59. Goussakov I., Miller M.B., Stutzmann G.E. NMDA-mediated Ca2+ influx drives aberrant ryanodine receptor activation in dendrites of young Alzheimer's disease mice // Journal of Neuroscience. 2010. Vol. 30, № 36. P. 12128-12137.

60. Gavello D. et al. Early Alterations of Hippocampal Neuronal Firing Induced by Abeta42 // Cerebral Cortex., 2018. Vol. 28, № 2. P. 433-446.

61. Foster T.C., Kyritsopoulos C., Kumar A. Central role for NMDA receptors in redox mediated impairment of synaptic function during aging and Alzheimer's disease // Behavioural Brain Research. 2017. Vol. 322. P. 223-232.

62. Green K.N. et al. SERCA pump activity is physiologically regulated by presenilin and regulates amyloid P production // Journal of Cell Biology. 2008. Vol. 181, № 7. P. 1107-1116.

63. I. Bezprozvanny. Presenilins and calcium signaling // Systems biology to the rescue. 2013. Vol. 6. P. 24.

64. Tu H. et al. Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations // Cell. 2006. Vol. 126, № 5. P. 981-93.

65. Nelson O. et al. Familial Alzheimer disease-linked mutations specifically disrupt Ca2+ leak function of presenilin 1 // The Journal of Clinical Investigation. 2007. Vol. 117, № 5. P. 1230-1239.

66. Zhu X. et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry // Cell. 1996. Vol. 85, № 5. P. 661-671.

67. Okada T. et al. Molecular and Functional Characterization of a Novel Mouse Transient Receptor Potential Protein Homologue TRP7: Ca2+-permeable cation channel that is constitutively activated and enhanced by stimulation of g proteincoupled receptor // Journal of Biological Chemistry. 1999. Vol. 274, № 39. P.

27359-27370.

68. Boulay G. et al. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein // J Biol Chem. 1997. Vol. 272, № 47. P. 29672-29680.

69. Hofmann T. et al. Direct activation of human TRPC6 and TRPC3 channels by diacylglycerol // Nature. 1999. Vol. 397, № 6716. P. 259-263.

70. Clapham D.E., Runnels L.W., Strubing C. The trp ion channel family // Nature Reviews Neuroscience. 2001. Vol. 2, № 6. P. 387-396.

71. Tang Q. et al. Structure of the receptor-activated human TRPC6 and TRPC3 ion channels // Cell Research. 2018. Vol. 28, № 7. P. 746-755.

72. Dietrich A., Gudermann T. TRPC6: Physiological function and pathophysiological relevance // Handb Exp Pharmacol. 2014. Vol. 222. P. 157-188.

73. Sattler R. et al. Distinct Influx Pathways, Not Calcium Load, Determine Neuronal Vulnerability to Calcium Neurotoxicity // J Neurochem. 1998. Vol. 71, № 6. P. 2349-2364.

74. Szydlowska K., Tymianski M. Calcium, ischemia and excitotoxicity // Cell Calcium. 2010. Vol. 47, № 2. P. 122-129.

75. Xia P. et al. Memantine Preferentially Blocks Extrasynaptic over Synaptic NMDA Receptor Currents in Hippocampal Autapses // Journal of Neuroscience. Society for Neuroscience, 2010. Vol. 30, № 33. P. 11246-11250.

76. Stocca G., Vicini S. Increased contribution of NR2A subunit to synaptic NMDA receptors in developing rat cortical neurons // J Physiol. 1998. Vol. 507, № 1. P. 1324.

77. Rumbaugh G., Vicini S. Distinct synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in developing cerebellar granule neurons // J Neurosci. 1999. Vol. 19, № 24. P. 1060310610.

78. Tovar K.R., Westbrook G.L. Mobile NMDA Receptors at Hippocampal Synapses // Neuron. 2002. Vol. 34, № 2. P. 255-264.

79. Chen M. et al. Differential roles of NMDA receptor subtypes in ischemic neuronal

cell death and ischemic tolerance // Stroke. 2008. Vol. 39, № 11. P. 3042-3048.

80. Qu Z. et al. TRPC6 expression in neurons is differentially regulated by NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors // J Neurochem. 2017. Vol. 143, № 3. P. 282293.

81. Shen H. et al. TRPC6 inhibited NMDA current in cultured hippocampal neurons // Neuromolecular. 2013. Vol. 15, № 2. P. 389-395.

82. Bardell T.K., Barker E.L. Activation of TRPC6 channels promotes endocannabinoid biosynthesis in neuronal CAD cells // Neurochem Int. 2010. Vol. 57, № 1. P. 76-83.

83. Xu J.Y., Chen C. Endocannabinoids in Synaptic Plasticity and Neuroprotection // Neuroscientist. 2015. Vol. 21, № 2. P. 152.

84. Bensinger S.J., Tontonoz P. Integration of metabolism and inflammation by lipid-activated nuclear receptors // Nature. 2008. Vol. 454, № 7203. P. 470-477.

85. Walton M.R., Dragunow M. Is CREB a key to neuronal survival? // Trends Neurosci.. 2000. Vol. 23, № 2. P. 48-53.

86. Tai Y. et al. TRPC6 channels promote dendritic growth via the CaMKIV-CREB pathway // J Cell Sci. 2008. Vol. 121, № 14. P. 2301-2307.

87. Heiser J.H. et al. TRPC6 channel-mediated neurite outgrowth in PC12 cells and hippocampal neurons involves activation of RAS/MEK/ERK, PI3K, and CAMKIV signaling // J Neurochem. 2013. Vol. 127, № 3. P. 303-313.

88. Courjaret R., Prakriya M., Machaca K. SOCE as a regulator of neuronal activity // Journal of Physiology. 2023. Vol. 602, № 8. P. 1449-1462.

89. Lisman J., Yasuda R., Raghavachari S. Mechanisms of CaMKII action in long-term potentiation // Nat Rev Neurosci. 2012. Vol. 13, № 3. P. 169.

90. Barria A. et al. Regulatory phosphorylation of AMPA-type glutamate receptors by CaM-KII during long-term potentiation // Science. 1997. Vol. 276, № 5321. P. 2042-2045.

91. Malinow R., Malenka R.C. AMPA Receptor Trafficking and Synaptic Plasticity // https://doi.org/10.1146/annurev.neuro.25.112701.142758. Annual Reviews. 2003. Vol. 25. P. 103-126.

92. Collingridge G.L., Isaac J.T.R., Yu T.W. Receptor trafficking and synaptic plasticity

// Nature Reviews Neuroscience. 2004. Vol. 5, № 12. P. 952-962.

93. Shi J. et al. Multiple regulation by calcium of murine homologues of transient receptor potential proteins TRPC6 and TRPC7 expressed in HEK293 cells // Journal of Physiology. 2004. Vol. 561, № 2. P. 415-432.

94. Shi J. et al. Molecular determinants for cardiovascular TRPC6 channel regulation by Ca 2+ /calmodulin-dependent kinase II // The Authors. The Journal of Physiology. 2013. Vol. 591. P. 2851-2866.

95. Basora N. et al. 20-Hydroxyeicosatetraenoic Acid (20-HETE) Activates Mouse TRPC6 Channels Expressed in HEK293 Cells // Journal of Biological Chemistry. 2003. Vol. 278, № 34. P. 31709-31716.

96. Cross J.L. et al. Modes of neuronal calcium entry and homeostasis following cerebral ischemia // Int J Alzheimers Dis. 2010.

97. Aires V. et al. Activation of TRPC6 calcium channels by diacylglycerol (DAG)-containing arachidonic acid: A comparative study with DAG-containing docosahexaenoic acid // Biochimie. 2007. Vol. 89, № 8. P. 926-937.

98. Belayev L. et al. Docosahexaenoic Acid Therapy of Experimental Ischemic Stroke // Transl Stroke Res. 2011. Vol. 2, № 1. P. 33-41.

99. Yao C. et al. Neuroprotectin D1 attenuates brain damage induced by transient middle cerebral artery occlusion in rats through TRPC6/CREB pathways // Mol Med Rep., 2013. Vol. 8, № 2. P. 543-550.

100. Guinamard R., Simard C., Del Negro C. Flufenamic acid as an ion channel modulator // Pharmacol Ther. Pergamon, 2013. Vol. 138, № 2. P. 272-284.

101. Lin Y. et al. Neuroprotective effect of resveratrol on ischemia/reperfusion injury in rats through TRPC6/CREB pathways // Journal of Molecular Neuroscience. 2013. Vol. 50, № 3. P. 504-513.

102. Guo C. et al. Neuroprotective effect of calycosin on cerebral ischemia and reperfusion injury in rats // J Ethnopharmacol. 2012. Vol. 144, № 3. P. 768-774.

103. Yao C. et al. Neuroprotection by (-)-epigallocatechin-3-gallate in a rat model of stroke is mediated through inhibition of endoplasmic reticulum stress // Mol Med Rep. 2014. Vol. 9, № 1. P. 69-72.

104. N. Kumar, G. M. Husain, P. N. Singh V.K. Antiaggressive activity of hyperforin: A preclinical study // Antiaggressive activity of hyperforin: A preclinical study. // Drug Discov Ther. 2009. Vol. 3, № 4. P. 162-167.

105. Dinamarca M.C. et al. Hyperforin prevents P-amyloid neurotoxicity and spatial memory impairments by disaggregation of Alzheimer's amyloid-P-deposits // Molecular Psychiatry. 2006. Vol. 11, № 11. P. 1032-1048.

106. Zhu M. et al. Hyperforin alleviates mood deficits of adult rats suffered from early separation // Neurosci Lett. 2015. Vol. 608. P. 1-5.

107. Klusa V. et al. Hypericum extract and hyperforin: Memory-enhancing properties in rodents // Pharmacopsychiatry.. 2001. Vol. 34, № SUPPL. 1. P. 61-69.

108. El Hamdaoui Y. et al. Analysis of hyperforin (St. John's wort) action at TRPC6 channel leads to the development of a new class of antidepressant drugs // Molecular Psychiatry. 2022. Vol. 27, № 12. P. 5070-5085.

109. Cerpa W. et al. The Hyperforin Derivative IDN5706 Occludes Spatial Memory Impairments and Neuropathological Changes in a Double Transgenic Alzheimers Mouse Model // Curr Alzheimer Res. 2010. Vol. 7, № 2. P. 126-133.

110. Callizot N. et al. AZP2006, a new promising treatment for Alzheimer's and related diseases // Scientific Reports. 2021. Vol. 11, № 1. P. 1-17.

111. Singh A., Bodakhe S.H. Resveratrol attenuates behavioural impairment associated with learning and memory in rats with diabetes induced by a high-fat diet and streptozotocin // Br J Pharmacol. 2022. Vol. 179, № 19. P. 4673-4691.

112. Brito A.F. et al. Piperazine derivatives with central pharmacological activity used as therapeutic tools // Fundam Clin Pharmacol. 2019. Vol. 33, № 1. P. 13-24.

113. Lewis D.B. et al. Oxygenated analogues of 1-[2-(diphenylmethoxy)ethyl]- and 1-[2- [bis (4-fluorophenyl)methoxy]ethyl]-4-(3-phenylpropyl)piperazines (GBR 12935 and GBR 12909) as potential extended-action cocaine-abuse therapeutic agents // J Med Chem. American Chemical Society. 1999. Vol. 42, № 24. P. 50295042.

114. Rodriguez A. et al. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images // PLoS One. 2008. Vol.

3, № 4.

115. Levet F. et al. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology // Methods. 2020. Vol. 174. P. 49-55.

116. Poteser M. et al. PKC-dependent coupling of calcium permeation through transient receptor potential canonical 3 (TRPC3) to calcineurin signaling in HL-1 myocytes // Proc Natl Acad Sci U S A. 2011. Vol. 108, № 26. P. 10556-10561.

117. Wang J. et al. TRPC3 suppression ameliorates synaptic dysfunctions and memory deficits in Alzheimer's disease // bioRxiv (preprint)., 2024. doi: 10.1101/2024.09.16.611061.

118. Wang Z. et al. Soluble P-Amyloid Oligomers Selectively Upregulate TRPC3 in Excitatory Neurons via Calcineurin-Coupled NFAT // Cells. 2025. Vol. 14, № 11. P. 843.

119. Hering H., Sheng M. Dentritic spines: structure, dynamics and regulation // Nat Rev Neurosci. 2001. Vol. 2, № 12. P. 880-888.

120. Chidambaram S.B. et al. Dendritic spines: Revisiting the physiological role // Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 2019. Vol. 92. P. 161-193.

121. Segal M. Dendritic spines: Morphological building blocks of memory // Neurobiol Learn Mem. 2017. Vol. 138. P. 3-9.

122. Padua M.S., Guil-Guerrero J.L., Lopes P.A. Behaviour Hallmarks in Alzheimer's Disease 5xFAD Mouse Model // International Journal of Molecular Sciences. 2024. Vol. 25, Page 6766.

123. Wirths O., Bayer T.A. Motor impairment in Alzheimer's disease and transgenic Alzheimer's disease mouse models // Genes Brain Behav. 2008. Vol. 7, № SUPPL. 1. P. 1-5.

124. Cai J. et al. Upregulation of TRPC6 inhibits astrocyte activation and proliferation after spinal cord injury in rats by suppressing AQP4 expression // Brain Res Bull. 2022. Vol. 190. P. 12-21.

125. Crusio W.E. Genetic dissection of mouse exploratory behaviour // Behavioural Brain Research. 2001. Vol. 125, № 1-2. P. 127-132.

126. Dahlgren K.N. et al. Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-P Peptides Differentially Affect Neuronal Viability // Journal of Biological Chemistry. 2002. Vol. 277, № 35. P. 32046-32053.

127. Kim J.H. et al. Capacitative Ca2+ entry is involved in regulating soluble amyloid precursor protein (sAPPa) release mediated by muscarinic acetylcholine receptor activation in neuroblastoma SH-SY5Y cells // J Neurochem. 2006. Vol. 97, № 1. P. 245-254.

128. Tao R. et al. Probing the therapeutic potential of TRPC6 for Alzheimer's disease in live neurons from patient-specific iPSCs // J Mol Cell Biol. 2020. Vol. 12, № 10. P. 807-816.

129. Wyss-Coray T. et al. Adult mouse astrocytes degrade amyloid-P in vitro and in situ // Nature Medicine. 2003. Vol. 9, № 4. P. 453-457.

130. Garwood C.J. et al. Astrocytes are important mediators of AP-induced neurotoxicity and tau phosphorylation in primary culture // Cell Death & Disease. 2011. Vol. 2, № 6. P. e167-e167.

131. Wang J. et al. TRPC6 specifically interacts with APP to inhibit its cleavage by y-secretase and reduce AP production // Nature Communications. 2015. Vol. 6, № 1. P. 1-12.

132. Liu L. et al. TRPC6 Attenuates Cortical Astrocytic Apoptosis and Inflammation in Cerebral Ischemic/Reperfusion Injury // Front Cell Dev Biol. 2021. Vol. 8. P. 594283.

133. Singh D. Astrocytic and microglial cells as the modulators of neuroinflammation in Alzheimer's disease // Journal of Neuroinflammation 2022. Vol. 19, № 1. P. 1-15.

134. De Sousa R.A.L. Reactive gliosis in Alzheimer's disease: a crucial role for cognitive impairment and memory loss // Metab Brain Dis. Springer, 2022. Vol. 37, № 4. P. 851-857.

135. Ghamaryan, V.S.; Hunanyan, L.S. Molecular docking and dynamic simulations of n-n-disubstituted piperasins with AChE and BuChE. Electron. J. Nat. Sci. 2024. Vol. 43. P. 4-11.

136. Santin S. et al. TRPC6 mutational analysis in a large cohort of patients with focal

segmental glomerulosclerosis // Nephrology Dialysis Transplantation. 2009. Vol. 24, № 10. P. 3089-3096.

137. Cahalan M.D. STIMulating store-operated Ca2+ entry // Nature Cell Biology, 2009. Vol. 11, № 6. P. 669-677.

138. Woelk H., Burkard G., Grunwald J. Benefits and Risks of the Hypericum Extract LI 160: Drug Monitoring Study with 3250 Patients // J Geriatr Psychiatry Neurol. 1994. Vol. 7, № SUPPL. 1.

139. Khan S.U. et al. The Multifunctional TRPC6 Protein: Significance in the Field of Cardiovascular Studies // Curr Probl Cardiol. 2024. Vol. 49, № 1. P. 102112.