Биологические основы получения и практического применения субклеточных фракций бактерий на модели бруцелл тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, доктор биологических наук Григорьева, Галина Ивановна

• Григорьева, Галина Ивановна
• доктор биологических наук
• 1997

Оглавление диссертации доктор биологических наук Григорьева, Галина Ивановна

ф Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Бруцеллез как зоонозное заболевание и его распространение.

1.2. Биологические свойства и современная таксономия рода Brucella

1.3. Строение клетки бруцелл и ее антигенная структура.

1.4. Сравнительное изучение белковык систем и состава жирных кислот в аспекте идентификации и дифференциации бактерий.

1.4.1. Белковые системы бактерий.

1.4.1.1. Значимость различных белковых систем в сравнительном изучении бактерий.

1.4.1.2.Белковые системы в сравнительной характеристике бруцелл. 52 1.4.2. Изучение спектров жирных кислот в целях идентификации и дифференциации бактерий.

1.4.2.1. Применение газо-жидкостной хроматографии для

Ф идентификации различных групп бактерий.

1.4.2.2. Газо-хроматографический анализ жирных кислот применительно к бруцеллам.

1.5. Некоторые аспекты иммуногенеза при бруцеллезе и проблемы диагностики.

1.5.1. Основные элементы иммунитета.

1.5.2. Стадии инфекционного бруцеллезного процесса и его иммунологические проявления.

1.5.3. Диагностика бруцеллеза.

1.5.3.1. Клиническая и эпизоотологическая диагностика.

1.5.3.2. Серологическая диагностика.

1.5.3.3. Применение иммуноферментного анализа (ИФА) в диагностике бруцеллеза.

1.5.3.4. Аллергическая диагностика. Значение методов in vitro.

1.6. Особенности патогенеза при бруцеллезе. Факторы патогенности бруцелл.

1.7. Разработка средств вакцинопрофилактики бруцеллеза.

1.7.1. Живые вакцины.

1.7.2. Инактивированные корпускулярные вакцины.

1.7.3. Молекулярные вакцины.

1.7.4. Искусственные вакцины.

1.8. Основные биотехнологические подходы к получению субклеточных фракций бруцелл различной функциональной направленности.

1.9. Основные направления национальных и региональных программ по контролю за бруцеллезом.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Эпизоотологические исследования.

2.1.2. Характеристика изучаемых культур бактерий и условия их выращивания.

2.1.3. Методы фракционирования бактерий.

2.1.4. Аналитические методы.

2.1.5. Методы диагностических исследований.

2.1.6. Методы изучения иммуногенной активности препаратов.

2.1.7. Расчеты экономической эффективности от внедрения противобруцеллезных мероприятий.

2.1.8. Методы статистической обработки.

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Субклеточные структуры бактерий в приложении к решению вопросов таксономии, идентификации и дифференциации

2.2.1.1. Сравнительный анализ белковых спектров бактерий.

2.2.1.1.1. Изучение растворимых белков микобактерий.

2.2.1.1.2. Белковые системы стафилококков.

2.2.1.1.2.1. Сопоставление спектров мембранных белков стафилококков.

2.2.1.1.2.2. Сопоставление спектров внеклеточных белков в дифференциации культур стафилококков.

2.2:1.1.2.3. Характеристика белковых систем сальмонелл.

2.2.1.1.4. Белковые системы бруцелл в сравнительном аспекте

2.2.1.1.4.1. Анализ экзобелков бруцелл.

2.2.1.1.4.2. Белки наружной мембраны бруцелл.

2.2.1.1.4.3. Анализ суммарных белков клетки (СБК).

2.2.1.1.5. Перспективные подходы к сравнительному изучениюбелковых спектров бактерий на основе многомерного статистического анализа.

2.2.1.2. Сравнительный анализ жирных кислот бруцелл с применением метода газохроматографического анализа.

2.2.2. Разработка и оптимизация технологической схемы получения из клетки бруцелл субклеточных фракций различной функциональной направленности.

2.2.2.1. Оптимизация технологии получения протективного антигена бруцелл и его применение в составе бруцеллезной искусственной вакцины.

2.2.2.1.1. Изучение структурных и функциональных особенностей экстрацеллюлярного антигена бруцелл.

2.2.2.1.2. Получение протективного антигена бруцелл и его характеристика.

2.2.2.1.3. Получение бруцеллезной искусственной вакцины (БИВ) на основе протективного антигена.

2.2.2.1.4. Изучение иммуногенных свойств БИВ в условиях эксперимента.

2.2.2.2. Фракционирование клетки бруцелл с целью получения антигенных препаратов.

2.2.2.2.1. Выделение серологически активных фракций и их использование.

2.2.2.2.1.1. Получение и испытание эритроцитарных антигенных бруцеллезных диагностикумов на основе Б-и Я-антигенов бруцелл.

2.2.2.2.1.2. Разработка и применение метода экспресс-РПГА

Э-РПГА).

2.2.2.2.1.3. Применение выделенных антигенных фракций в иммуноферментном анализе (ИФА).

2.2.2.2.2. Получение белковой фракции клеток бруцелл со свойствами аллергена.

2.2.2.2.2.1. Получение белковых фракций и их характеристика 296 2.2:2.2.2.2. Испытание полученных белковых препаратов в качестве аллергенов.

2.2.2.2.2.3. Применение аллергенных препаратов в непрямой реакции лизиса лейкоцитов как аллерготеста при бруцеллеза.

2.2.2.2.3. Обобщение способа поэтапного фракционирования клетки бруцелл.

2.2.3. Разработка и применение научно-обоснованных систем противобруцеллезных мероприятий в хозяйствах Нечерноземной зоны России.

2.2.3.1. Комплексный подход к диагностике бруцеллеза в неблагополучной зоне как метод эпизоотологического надзора.

2.2.3.1.1. Изучение эпизоотологии бруцеллеза крупного

• рогатого скота ¿Нечерноземной зоне РФ.

2.2.3.1.2. Эпизоотический бруцелезный процесс в Рязанской области.

2.2.3.1.3. Изучение гостальности возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота.

2.2.3.1.4. Комплексный подход к серологической диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота.

2.2.3.1.4.1. Сравнительная оценка некоторых серологических реакций при диагностике бруцеллеза.

2.2.3.1.4.2. Изучение эффективности РБП с молоком при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота.

2.2:3.1.4.3. Изучение влияния гетерогенных вакцин на показатели серологической диагностики бруцеллеза у коров, иммунизированных против бруцеллеза.

2.2.3.2. Вопросы дифференциальной диагностики бруцеллеза в благополучной зоне.

2.2.3.3. Эпизоотологический надзор в конкретных схемах противобруцеллезных мероприятий для зон с различной степенью благополучия по бруцеллезу.

2.2.3.3.1. Разработка и внедрение системы противобруцеллезных мероприятий в хозяйствах Рязанской области

2.2.3.3.2. Разработка и внедрение системы противобруцеллезных мероприятий в хозяйствах Нечерноземной зоны РФ.

2.2.3.3.3. Разработка системы дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза и мер по их профилактике.

3. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические основы получения и практического применения субклеточных фракций бактерий на модели бруцелл»

Бруцеллез как зоонозное заболевание по-прежнему является "мировой" проблемой, несмотря на значительные успехи, достигнутые в различных научных и практических сферах, касающихся этого явления. Много ценных работ было сделано отечественными и зарубежными учеными по изучению эпидемиологии, эпизоотологии, профилактики и диагностики бруцеллезной инфекции. К настоящему времени накоплен значительный научно-практический материал по всестороннему изучению бруцеллеза, на основании которого систематически проводятся широкие плановые мероприятия по борьбе с этой инфекцией человека и животных. Практические работники располагают довольно обширным комплексом научно-обоснованных данных о бруцеллезе, его эпизоото-логических, микробиологических, иммунологических особенностях, с учетом которых разрабатываются системы противобруцеллезных мероприятий, реализация которых направлена на ликвидацию этого заболевания. Однако эта задача по-прежнему представляет достаточно серьезную проблему для решения.

Большинство исследователей считают, что результаты оздоровительных мероприятий во многом определяются качеством эпизоотологического надзора за развитием бруцеллезного процесса в конкретных природно-географических й хозяйственно-экономических условиях (3, 170, 237). Немаловажное значение для достижения эффективности противобруцеллезных мер имеет знание особенностей паразитарной системы бруцеллеза на всех уровнях ее существования: популяционном, организменном, клеточном, молекулярном. Не теряют своей актуальности вопросы эпизоотологического контроля в его специфической части: разработки и применения "идеальной" бруцеллезной вакцины, способной обеспечивать высокий уровень защиты от бруцеллезной инфекции и в то же время не препятствовать диагностике этой болезни. Много нерешенных моментов в вопросах диагностики бруцеллеза. Назрела необходимость создания принципиально нового комплекса серо-аллергических методов с включением небольшого числа простых высокочувствительных и специфичных реакций, обеспечивающих выявление манифестаций всех звеньев иммуногенеза при бруцеллезе как гуморального, так и клеточного, очевидно, что требуется совершенствование бактериологической диагностики бруцеллеза с применением новейших достижений биохимии и молекулярной биологии, обеспечивающих экспресс-идентификацию и дифференциацию бактерий, выделяемых в очагах бруцеллеза, на всех таксономических уровнях: род, вид, штамм.

Все вышеизложенное и определило выбор темы и направление наших исследований. •

Цель работы — определить биологические основы получения и практического применения субклеточных фракций бактерий на модели бруцелл, и реализовать разработки в конкретных предложениях, направленных на совершенствование диагностики и профилактики бруцеллеза, способствующих ликвидации этой болезни .

В задачи наших исследований входило:

1. На основании современных достижений микробиологии, молекулярно-ной биологии и биохимии изучить возможность применения новых подходов к бактериологической диагностике бруцеллеза с использованием характеристик субклеточных систем: белковых и липидных.

2. Определить биологические основы разборки клетки бруцелл на субклеточные фракции, несущие определенные антигенные функции и пригодные для конструирования на их основе профилактических и диагностических препаратов.

3. Разработать технологию получения препарата протективного антигена бруцелл, использумого в качестве основы для создания принципиально новой

• искусственной вакцины, обладающей свойствами, приближенными к свойствам "идеальной" бруцеллезной вакцины.

4. Изучить особенности эпизоотического бруцеллезного процесса у крупного рогатого скота в условиях Нечерноземной зоны России, разработать на основе полученных данных научно-обоснованную систему противобруцеллезных мероприятий и внедрить в животноводческие хозяйства Нечерноземной зоны РФ.

Научная новизна

В настоящей работе впервые на модели таксономически отличных групп бактерий (микобактерии, стафилококки, сальмонеллы) изучена значимость электрофоретических характеристик различных белковых систем клеток (экзопродукты, растворимые, суммарные клеточные и мембранные белки) для решения вопросов идентификации и дифференциации бактерий на различных таксономических уровнях: род, вид, штамм (А. с. №1013476). На основании полученных данных впервые разработаны подходы к бактериологической диагностике бруцеллеза с позиций критериев, характеризующих спектры белковых фракций.

Впервые изучен состав жирных кислот пяти видов бруцелл методом со-пиролиза и газо-хроматографического анализа, что позволило определить родовые и видовые особенности бактерий по этому признаку. Комплекс нетрадиционных для бактериологии бруцеллеза методов, характеризующих состав жирных кислот и электрофоретические параметры белковых систем предложен в качестве дополнения к системе традиционных диагностических методов, что позволяет проводить экспресс-идентификацию бактерий в очагах бруцеллеза и дифференцировать вакцинные штаммы от эпизоотически значимых.

Впервые разработана безотходная технология фракционирования бактериальной массы бруцелл на базе представлений о биологических основах строения клетки и механизмах участия антигенных комплексов в процессах па-то- и иммуногенеза (A.c. №1631786). Использованный принцип разборки клетки на субклеточные фракции с сохранением специфических свойств позволил получить антигенные препараты, пригодные для конструирования на их основе серологически и аллергически активных препаратов, хорошо зарекомендовавших себя при испытании в экспериментальных и производственных условиях.

Впервые разработана оригинальная технология получения протективного антигена бруцелл, биологической основой принципа получения которого является представление о его ключевых патогенных функциях и экзоцеллюлярном происхождении. Конъюгация даного антигена с полимерным носителем позволила сконструировать бруцеллезную искусственную вакцину (БИВ), которая обеспечивает достаточно высокую степень защиты от бруцеллезной инфекции и не обладает способностью индуцировать антителогенез и специфическую сенсибилизацию, препятствующих диагностике бруцеллеза (A.c. №1518961).

Впервые разработан ускоренный способ серологической диагностики бруцелеза (Э-РПГА), превышающий по чувствительности и специфичности другие ускоренные методы, и пригодный для дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза у лактирующих коров (A.c. №32387661).

Разработана научно-обоснованная система эпизоотологического надзора и контроля при бруцеллезе крупного рогатого скота для Нечерноземной зоны

России в соответствии с эпизоотической обстановкой и степенью риска болезни. Апробация и внедрение системы позволило улучшить эпизоотическую ситуацию по бруцеллезу в целом по Нечерноземной зоне РФ.

Практическая иенность

Биологические основы практического применения субклеточных фракций бруцелл, использованные нами в данной работе, позволили получить и апробировать приближенный до некоторой степени к "идеальному" вариант комплекса профилактических и диагностических приемов и средств, обеспечивающий практически в полом объеме специфическую часть эпизоотологического контроля и надзора при бруцеллезе. Это — специфическая профилактика с применением БИВ, не препятствующая серологической, аллергической и бактериологической диагностике бруцеллеза, плюс истинный диагностический комплекс, состоящий из эффективной экспресс-реакции для массовых скрининговых исследований по сыворотке кров и молоку (Э-РПГА), высокочувствительного им-муноферментного анализа (ИФА), как метода выявления манифестаций гуморального звена иммунитета, и непрямой реакции лизиса лейкоцитов (НРЛЛ), как метода регистрации показателей клеточного звена иммунитета, а также эффективного дополнения к комплексу традиционных бактериологических методов в форме газохроматографического анализа жирных кислот и электрофо-ретического анализа белковых систем (экзопродукты, суммарные белки клетки), позволяющих проводить идентификацию выделяемых культур на уровне рода, вида и штамма. Внедрение и строгое соблюдение рекомендаций, предложенных производству в научно-обоснованной системе противобруцеллезных мероприятий для Нечерноземной зоны России, позволяет поддерживать в целом по зоне уровень стабильного благополучия по этой инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Биологической основой разборки клетки бруцелл на субклеточные фракции, состоящие из отдельных антигенных комплексов, пргодных для конструирования вакцинных и диагностических препаратов, являются конкретные научные знания об их структуре и участии в процессах пато- и иммуногенеза.

• Комплексная характеристика газо-хроматографических спектров жирных кислот и электрофореграмм белковых систем является существенным признаком в идентификации и дифференциации бруцелл на разных уровнях таксономической иерархии.

• Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий, разработанная для хозяйств Нечерноземной зоны России, позволяет поддерживать в ней стойкое благополучие по бруцеллезу крупного рогатого скота.

Пути реализации Результаты исследования могут быть использованы в работе практических и научно-исследовательских лабораторий, осуществляющих бактериологическую и серологическую диагностику бруцеллеза; в производстве бруцеллезных профилактических и диагностических препаратов; в работе эпидемиологических и эпизоотологических служб при разработке противобруцеллезных мероприятий, а также в учебном процессе при подготовке специалистов- микробиологов общебиологического, медицинского и ветеринарного профиля.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Нижегородского государственного университета имени Н. И. Лобачевского (Нижний Новгород, 1977, 1979, 1980 г. г.); конференциях молодых ученых Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (Нижний Новгород, 1975, 1978, 1981 г. г.); симпозиуме молодых ученых "Медико-биологические аспекты патологии человека" (Нижний Новгород, 1979); Московском отделении Всесоюзного биохимического общества (Москва, 1979); межлабораторном совете Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (г. Пущино-на-Оке, 1980); заседании ученого совета НИИИЭМ (1980); IV Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1979); I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1983); научно-практических конференциях по актуальным вопросам ветеринарии (Нижний Новгород, 1984, 1985, 1988, 1992 г. г.); Всероссийском совещании "Интенсификация животноводства и кормопроизводства в Нечерноземной зоне РСФСР (г. Йошкар-Ола, 1986); Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование ветеринарного обслуживания животноводства в условиях интенсификации" (г. Махачкала, 1987); Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным" (г. Новосибирск, 1989); I Всесоюзном иммунологическом съезде (г. Сочи, 1989); Всесоюзной конференции "Теория и практика хроматографии" (г.Нижний Новгород, 1990); Всесоюзном совещании "О перспективах развития животноводства и ветеринарии в XIII пятилетке" (Ленинград-Пушкин, 1990); координационных совещаниях по проблеме бруцеллеза и туберкулеза (г. Москва, ВИЭВ, 1985; г. Омск — ВНИИБТЖ, 1986, 1987, 1991 г.г.); заседани-ях ученого совета НИВИ ИЗ РСФСР (г. Нижний Новгород, 1984—1991 г.г.); заседании профессорско-преподавательского состава кафедры эпизоотологии и микробиологии Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии (г. Нижний Новгород, 1997).

Материалы диссертации опубликованы в 72 научных статьях, отчетах, ре-комендациях, приоритетность результатов исследований подтверждена 4 авторскими свидетельствами на изобретение.

ВНЕДРЕНИЕ

Результаты исследований внедрены в работу лаборатории субклеточных структур микроорганизмов Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии, городской СЭС Нижнего Новгорода, в учебный процесс кафедры молекулярной биологии Нижегородского государственного университета имени Н. И. Лобачевского. Результаты исследований 1983—1997 г. г. под авторским надзором внедрены с положительным эффектом в хозяйствах Рязанской и Архангельской областей, в практику НИР лабораторий бруцеллеза НИВИ НЗ РСФСР,

• в учебный процесс кафедры эпизоотологии и микробиологии Нижегородской сельскохозяйственной академии.

Подготовлены и утверждены методические рекомендации "Методы выделения субклеточных структур микроорганизмов. Электрофоретическое фракционирование из белковой части" (1980); Физико-химические методы анализа макромолекул в биологических исследованиях " (1979); "Рекомендации по профилактике и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота в хозяйства Рязанской области" (1985); "Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий в Нечерноземной зоне РСФСР" (1987, 1991 г. г.); "Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза и меры по их профилактике" (1991); "Нетрадиционные методы исследования при дифференциальной диагностике бруцеллеза животных" (1997); "Организации ветеринарного дела в условиях экономической реформы Российской Федерации" (1997).

Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Григорьева, Галина Ивановна

408 ВЫВОДЫ

1. На основе общебиологических представлений о роли постоянства белкового и липидного состава бактерий, как фенотипического проявления их генотипа, разработаны подходы к практическому применению характеристик данных субклеточных фракций в сравнительных исследованиях бактерий на различных уровнях таксономической иерархии.

1.1. Сравнительное изучение спектров растворимых белков микобактерий способствует уточнению классификационных схем данной группы бактерий.

1.2. На модели стафилококков установлено, что электрофоретические характеристики спектров мембранных белков имеют значение для видовой идентификации этих бактерий, а спектры внеклеточных белков (экзопродуктов) позволяют проводить внутривидовую дифференциацию и идентифицировать бактерии на уровне штамма.

1.3. На модели вида Salmonella typhimurium не выявлено существенного значения характеристик электрофореграмм различных белковых систем для внутривидовой дифференциации этих представителей группы грамотрицатель-ных бактерий.

1.4. Анализ белковых систем бруцелл с применением различных модификаций электрофореза в полиакриламидном геле позволил установить, как видовые особенности белковых спектров наружных мембран и фракций суммарных белков клетки, так и обнаружить штаммовую специфичность, особенно характерную для спектров внеклеточных белков.

1.5. Газо-хроматографический анализ жирных кислот бруцелл показал, что для роза Brucella в целом характерно преобладание в спектре длинноцепо-чечных жирных кислот, что отличает его от представителей других бактериальных родов. Все изученные культуры бруцелл обладают одинаковым качественным составом жирных кислот. Видовые особенности спектров ЖК носят количественный характер и позволяют четко дифференцировать виды Br. abortus — Br. melitensis от Br. ovis и Br. suis.

1.6. Комплекс диагностических приемов, включающий газо-хроматографический анализ жирных кислот и электрофоретический анализ белковых систем бруцелл, является существенным дополнением к системе традиционных методов бактериологической диагностики бруцеллеза и позволяет уточнять идентификацию свежевыделенных культур в очагах бруцеллеза на всех таксономических уровнях: род — вид — штамм.

2. Принцип подхода к поиску протективного антигена бруцелл путем анализа механизмов патогенеза и выявления материальной основы ключевых факторов патогенности позволил разработать технологию получения искомого протективного антигена, являющегося экзопродуктом синтеза клетки бруцелл. Технология включает несколько основных этапов:

2.1. культивирование бруцелл в условиях принципиально моделирующих условия внутрифагоцитарного персистирования бруцелл;

2.2. выделение фракции, содержащей протективный антиген, из среды накопления;

2.3. очистка фракции протективного антигена.

2.4. биохимическая и иммунологическая характеристика протективного антигена, который представляет собой комплекс низкомолекулярных компонентов (М. м. < 10 ООО Д) гликопротеидной природы.

3. На основе химической конъюгации протективного антигена бруцелл и полимерного носителя (градекса) сконструирована бруцеллезная искусственная вакцина (БИВ), не уступающая по протективным свойствам коммерческим вакцинам и обладающая существенным преимуществом в форме отсутствия способности индуцировать синтез специфических антител и специфической сенсибилизации.

4. Принцип подхода к фракционированию клетки брцелл с позиций знания ее химической и антигенной структуры и участия определенных антигенных комплексов в процессах иммуно- и патогенеза позволил определить биологические основы разработки безотходной технологии разборки клетки на биологически активные субклеточные фракции, реализованные в изготовлении диагностических препаратов.

4.1. Получены препараты фракции клеточных стенок бруцелл, на основе которых сконструированы эритроцитарные диагностикумы для реакции пассивной гемагглютинации.

4.2. Получены препараты поверхностных антигенов клетки бруцелл (липополисахарид-белковые), на основе которых сконструированы тест-системы для иммуноферментного анализа.

4.3. Получены препараты фракции глубинных белков клетки бруцелл со свойствами аллергенов при применении их в аллерготестах: внутрикожной пробе и непрямой реакции лизиса лейкоцитов.

5. В целях совершенствования средств и способов эпизоотологического надзора при бруцеллезе разработаны и испытаны новые методы и подходы в этом направлении.

5.1. Разработан ускоренный способ (экспресс-РПГА, Э-РПГА) обнаружения противобруцеллезных антител в биологических жидкостях (сыворотка крови, молоко), обладающий высокой разрешающей способностью и более специфичный, чем другие экспресс-методы (РБП, РБПМ, КР).

5.2. Разработана тест-система для иммуноферментного анализа , обеспечивающая его наибольшую чувствительность среди других испытанных методов серологической диагностики (РБП, РА, РСК, РПГА).

5.3. Непрямая реакция лизиса лейкоцитов в модифицированном варианте является эффективным аллерготестом in vitro и включение его в общий комплекс диагностических исследований на бруцеллез целесообразно и весьма перспективно.

5.4. Для прижизненной дифференциальной диагностики бруцеллезной и иерсиниозной инфекции крупного рогатого скота целесообразно использовать в общем комплексе диагностических приемов Э-РПГА с молоком, которая не дает положительных результатов при иерсиниозе, и непрямую реакцию лизиса лейкоцитов (НРЛЛ) с бруцеллезным белковым аллергеном, которая также положительна только в случае бруцеллеза.

6. В неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах в бруцеллезный эпизоотический процесс могут вовлекаться и другие виды животных, в том числе и синантропные, но доля их участия в развитии эпизоотии невелика.

7. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах у крупного рогатого скота могут появляться положительные реакции на бруцеллез при серологических исследованиях, обусловленные наличием иерсиниозной инфекции. При этом установлено также присутствие иерсиний в кормах (овощных), где они способны накапливаться, а также в организме мелких свободно живущих млекопитающих, обитающих на пограничных с животноводческими территориях.

8. У крупного огатого скота неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, в которых проводится как средство эпизоотологического контроля специфическая профилактика с применением живых вакцин (Br. abortus 82), могут появляться положительные реакции на бруцеллез под воздйствием введенных гетерогенных по отношению к бруцеллезу вакцин, неспецифически стимулирующих подъем противобруцеллезного поствакцинального антителогенеза.

9. Разработанная и внедренная в хозяйствах Нечерноземной зоны России научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий, основанная на комплексе общих и специальных мероприятий по эпизоотологическому надзору (комплексный эпизоотологической диагностике, дифференцированной оценке степени риска для отдельных подзон и прогнозировании развития бру-целезного эпизоотического процесса) и эпизоотологическому контролю (соответствующей ситуации системе профилактических мер, в том числе и специфической профилактики с применением различных вакцин), является высокоэффективной и позволяет поддерживать стойкое благополучие по этой инфекции на всей территории Нечерноземной зоны РФ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Методы выделения субклеточных структур микроорганизмов. Электро-форетическое фракционирование из белковой части. (Методические рекомендации, утвержденные МЗ РСФСР, Горький, 1980, 24 е.).

2. Физико-химические методы анализа макромолекул в биологических исследованиях (Учебное пособие, Горький, изд. ГГУ имени Н. И. Лобачевского, 1979. 23 е.).

3. Способ идентификации стафилококков (А. с. №1013476, СССР, опубликовано 21.12.1982).

4. Рекомендации по профилактике и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота в хозяйствах Рязанской области (утверждено НТС Агропрома Рязанского облисполкома, Горький, 1985, 37 е.).

5. Определение противобруцеллезных антител в высушенных образцах крови с применением РИГА (Методика, ЦНТИ, 1986, сер. 64, информационный листок № 47—86).

6. Способ определения противобруцеллезных антител в биологических жидкостях (А. с. № 4102882, СССР, опубликовано 08.12.1987).

7. Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий в Нечерноземной зоне РСФСР (Рекомендации, утвержденные Президиумом ВАСХНИЛ НЗ РСФСР, Горький, 1987).

8. Методика проверки бруцеллезной искусственной вакцины на морских свинках (утверждена ГУВ Госагропрома СССР № 433-3 от 23.04. 1988).

9. Методика проверки иммуногенности бруцеллезной искусственной вакцины на крупном рогатом скоте (утверждена ГУВ Госагропрома СССР № 438-3 от 28.04.1988).

10. Методика производственного испытания экспресс-РПГА при диагностике бруцеллеза (утверждена ГУВ Госагропрома СССР от 14.03.1989).

11. Методика дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза (утверждена ГУВ Госагропрома СССР от 14.03.1989).

12. Способ получения вакцины против бруцеллеза (А. с. № 1518961, СССР, опубликовано 01.07.1989).

13. Способ получения антигенов из бактерий рода Brucella (А. с. № 1631786, СССР, опубликовано 01.11.1990).

14. Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий в Нечерноземной зоне РСФСР (Рекомендации, Москва, 1991, 27 е.).

15. Дифференциальная диагностика бруцеллеза и персиниоза и меры по их профилактике (Рекомендации, утверждены НТС Госагропрома ИЗ РСФСР, Москова, Росагропромиздат, 1991, 32 с).

16. Нетрадиционные методы исследования при дифференциальной диагностике бруцеллеза животных (Учебно-методическое пособие, Нижний Новгород, 1997).

17. Организация ветеринарного дела в условиях экономической реформы Российской Федерации (Нижний Новгород, 1997, 126 е.).

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Григорьева, Галина Ивановна, 1997 год

1. Абдуллин Х.Х. Серологическая диагностика бруцеллеза и пути повышения ее эффективности // Научные труды КазНИВИ. 1980. -135. - с. 16-20.

2. Абуталипов A.A. Изучение диагностической ценности реакции иммунофлуоресценции при бруцеллезе животных: Автореф. дисс .канд. вет. наук. Алма-Ата, 1983, - 24 с.

3. Авилов В.М. Эпизоотологический надзор при бруцеллезе крупного рогатого скота в современных условиях: Автореф. дисс. доктора вет. наук. С-Пб., 1977. - 49 с.

4. Айвазян С.А., Бешаева З.И., Староверов О.В. Классификация многомерных наблюдений // М.: Статистика, 1974. 128 с.

5. Акатов А.К., Хатеневер М.Л. Коагулазоотрицательные стафилококки, выделенные от больных. Сообщение II. Видовое разнообразие штаммов // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1981. - № 3. - С. 45-50.

6. Аманжолов Б.А. Специфическая профилактика инфекционного эпидидимита баранов: Автореф. дисс. канд. вет. наук. М., 1978. - 16 с.

7. Андреев Л.В., Склифас А.Н. О хемотаксономических аспектах липидного обмна бактерий // Биохим. и биофиз. микроорг. Горький, 1977. - Вып. 5.- С. 3-9.

8. Анина-Радченко Н.Д. Фактор распространения и гиалуронидаза при бруцеллезе //Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1956. 10.- С. 9-14.

9. Анина-Радченко Н.Д. О наличии антигиалуронидазы в противобруцелленых сыворотках // Там же. 1965. 12. - 671-676.

10. Артемов Б.Т. Экспериментальное изучение иммуногенных свойств противобруцеллезной вакцины из штамма В-1 // Иммунитет сельскохозяйственных животных. 1973. - С. 178-183.

11. Асланян Р.Г. К географии бруцеллеза: Автореф. дисс. канд. мед. наук, -М., 1967. 24 с.

12. Атарова Г.Т. Сравнительное изучение протеинограмм вибрионов и близкородственных микроорганизмов методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле //Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1976. N 6. - С. 89-94.

13. Бадин В.А. Гомология ДНК и спектры рибосомных белков коагулазоотрицательных стафилококков: Автореф. дисс. канд. биол. наук.- Киев, 1987. 16 с.

14. Баженов И.И. Опыт предохранительных прививок против бруцеллеа различными вакцинами //Тр. Воронежск. ВОС. 1955. -4. С. 81-87.

15. Бажин М.А. Иммунологическая память и толерантность у телят при бруцеллезе // Ветеринария. 1984. - N 1. - С. 29-30.

16. Базанова Е.А., Лямперт И.М. Выделение марофагами цитотоксина при гиперчувствительности замедленного типа к антигенам микроорганизмов // Иммунология. 1983. - N 1. - С. 52-55.

17. Базиков И.А., Бондаренко А.И. // Ультраструктура L-форм бруцелл и культур-ревертантов // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1991. N 1. - С 17-20.

18. Бароян О.В. Итоги полувековой борьбы с инфекциями в СССР и некоторые актуальные вопросы овременной эпидемиологии // Вестник АМН СССР. -М., 1968. С. 12-18.

19. Беклемишев Н.Д. Инфекционная аллергия //Алма-Ата, 1968. -374 с.

20. Белокрысенко С.С., Домбровский A.M. Электрофорез бактериальных белков в полиакриламидном геле как метод идентификации бактерий кишечной группы // Тр. 2-го Московского мединститута. М., 1974. - 32, N 2 - С. 16—18.

21. Белоусов Е.С., Ощепков В.Г. Иммуноферментный метод для диагностики бруцеллеза КРС //Сельскоозяйственная биология. -1986. N 11. - С. 122

22. Беляков В.Д. Учение Л.В. Громашевского об эпидемическом процессе и развитие этого учения на современном этапе // Журнал микробиол., эпидемиолог, и иммунобиол. 1984. - N 7. - С. 115-119.

23. Бельченко В.Б. РИГА для диагностики бруцеллеза телят // Ветеринария. -1973. № 1. - С. 16-19.

24. Бельченко В.Б., Сайдашева С.Е. Роз-бенгал проба при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота // Вестник с.-хоз. науки Казахстана. 1980. - № 4. - С. 66-68.

25. Березин И.В. ИФА как новый метод массового обследования населения и его возможный социальный эффект // Биология и медицина, философские и социальные проблемы взаимод. М., 1985. - С. 53-57.

26. Бернет Ф.М. Клеточная иммунология. М., 1971. - 230 с.

27. Бирюзова В.И. Мембранные структуры микроорганизмов. М.: Наука. -1973. - 180 с.

28. Блохина И.Н., Дегтева Г.К. Сопоставление белковых спектров стафилококков с помощью некоторых математических приемов // Стафил. инфекции: Материалы III межвуз. научной конференции. —Л., 1972. С. 28-36.

29. Блохина И.Н., Добротина H.A., Григорьева Г.И. и другие. Физико-химические методы анализа микромолекул в биологических исследованиях // Учебное пособие. Горький: ГГУ. - 1979. - 84 с.

30. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф. Геносистематика бактерий и ее прикладное значение // Успехи микробиологии. М .: Наука. -1990. - 24 - с. 3-25.

31. Божко Г.К. Опыт применения вакцины из штамма 19 в Украинской ССР // Ветеринария. 1958. - № 10. - С. 6-8.

32. Брауде Н.И. Роль клеточных и изморальных факторов противобруцелленого иммунитета в фагоцитозе: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1965. - 46 с.

33. Брикач Г.Е., Клюшин Б.А. Автоматический ввод и обработка данных диск-электрофореза в полиакриламидном геле на ЭВМ // Биохим. и биофиз. микроорг. Горький, 1977. - С. 35-38.

34. Бруснигина Н.Ф., Волчкевич Ж.А., Белова Т.Н. Белки наружной мембраны сальмонелл различного происхождения //Журнал микробиол., эпидемиол.и иммунобиол. 1988. - № 8, - с. 10-13.

35. Вагина Л.А. Диагностика бруцеллеза северных оленей методом иммунофлуоресценции // Ветеринария. 1972. - № 1. - С. 14-17.

36. Вагина Л.А., Никулина В.И., Гоппе A.C. Стабильость свойств Br. rangifere В 209 // Диагностика, профилактика и терапия болезней животных на крайнем Севере: Сборник научных трудов. -Новосибирск, 1983. С. 3-8.

37. Васюреко З.П. Циклопропановые жирные кислоты микроорганизмов // Успехи современной биологии. М: Наука. - 1980. - 90. - С. 179-192.

38. Васюренко З.П. Жирнокислотный состав энтеробактерий как таксономический признак // Биохим. и биофиз. микроорганизмов. -Горький, 1982. С. 54-59.

39. Васюренко З.П., Синяк K.M., Корошич A.C. // Состав жирных кислот бруцелл различных видов и его связь со средою выращивания // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1977. - № 8. -С. 53-59.

40. Васюренко З.П., Фролов А.Ф., Смирнов В.В. Жирнокислотные профили бактерий, патогенных для человека и животных. Киев: Наукова Думка., -1992. - 264с.

41. Вашкевич Р. Напряженность и длительность иммунитета у северных оленей, привитых вакциной из штамма 19 // Ветеринария. 1960. - N 6. -С. 18-22.

42. Вашкевич Р. К эпизоотологии бруцеллеза северных оленей // Труды НИСХ Северного Зауралья. 1975. - Вып. 18. - С. 107-125.

43. Вашкевич Р.Б., Касьянов И.А. Изучение противобруцелленой вакцины из штамма Rev-1 на северных оленях // Диагностика, профилактика и терапия болезней животных на крайнем Севере. -1983. С. 13-16.

44. Векслер И.Г. Сравнительное изучение влияния некоторых специфических стимуляторов на иммунный ответ организма // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1980. - 90, № 7. - С. 64-67.

45. Вершилова П.А. Бруцеллез. М.: Медицина. - 1972. - 439 с.49