Факторы, влияющие на фрагментацию и токсичность амилоидных полимеров в клетках дрожжей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Александров, Александр Иванович

• Александров, Александр Иванович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Александров, Александр Иванович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Свойства амилоидов.

2. Прионм - инфекционные амилоиды.

3. Приины дрожжей.

4. Прионные свойства 8ир35 и

5. Механизм наследования прионов дрожжей.

5 I Механизм фрагментации амилоидов шапсроном Нчр

5 2 Нзр40 и 11зр70 участвую! во фрагментации амилоидных полимеров

6. Полиыу ыминовые болезни.

6 I Токсичность белков с удлиненными полиг лутаминовыми трактами 22 6 2 Дрожжевая модель болезни Гентингтона . 23 6 3 Гены-модификаторы токсичности полиглутамина для клеток дрожжей 25 6 4 Специфические черты дрожжевой модели болезни Гентиштона

7. Структура амилоидных фибрилл.

8. Структурные различия амилоидных полимеров влияют на эффективность их фрагментации.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:.

1. Штаммы дрожжей и кулы ивирование клеток.

2. Конс1 руирование плазмид.

3. Приготовление дрожжевых лизатов.

4. Фракционирование лизатов с помощью ультрацентрифугирования.

5. Электрофорез и блоттинг.

6. Анализ термостабильности полимеров в присутствии БЭЭ.

7. Определение эффективности сквозного прочтения нонсенс-кодонов.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Изучение механизма токсичности полиглугамииовых белков для клеюк дрожжей.

1 1 Влияние прионного состояния на полимеризацию ЮЗС? ОРР

I 2 Полимеризация белков Бир35 и Ипя! в присутствии ЮЗ<3-ОРР

1 3 Роль белков Бир35 и Бир45 в токсичности ШЗС>-ОРР

2. Влияние вставок различных аминокислотных остатков в последовательность ро!у(} на образование ами.ти ты* полимеров и их фра! ментацию.

2 1 Генетические конструкции, кодирующие белки ро1у<ЭХ 59 2 2 Влияние вставок аминокислотных остатков на возникновение' амилоидных полимеров 59 2 3 Влияние вставок аминокислотных остатков на размер амилоидных полимеров 63 2 4 Эффективная фрагментация полимеров 76С}У, 96(}\У и 81(}Р приводит к образованию БОБ-устойчивых отигомеров вплоть до димеров

3. Термостабильность амилоидных полимеров не всегда коррелирует с их размером.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Особенности структуры полимеров ро1у(}Х белков.

2. Влияние различных аминокислотных остатков в составе полш лукшинивой последовательности на образование амилоидных полимеров и их фрагментацию.

3. Факт оры, влияющие на фра1 ментацию амилоидных полимеров.

4. Роль фрагментации в патогенезе амилоидных болезней млекопитающих.

5. Образование макроагрегатов и БОБ-устойчивых полимеров генгиш 1ина.

6. Токсичность агрегированных форм гентингтина.

7. Механизм токсического эффекта гентингтина в клетках дрожжей.

8. Происхождение прионов дрожжей.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Факторы, влияющие на фрагментацию и токсичность амилоидных полимеров в клетках дрожжей»

Некоторые клеточные белки, растворимые в норме, могут полимеризоваться, образуя комплексы, имеющие фибриллярную структуру. Такие полимеры называются амилоидами. Они обычно устойчивы к протеолизу, и поэтому накапливаются внутри или вне клеток в виде крупных агрегатов или бляшек, что может приводить к развитию заболеваний, называемых амилоидозами. У человека известно более 30 белков, способных образовывать патологические амилоиды. Амилоидозы широко распространены, многие из них возникают в пожилом возрасте и на данный момент все они неизлечимы. К амилоидозам относятся, в частности, болезни Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона, Крейтцфельдта-Якоба и сахарный диабет II типа. Большинство амилоидозов неинфекционны, за исключением прионных болезней, связанных с белком РгР.

Белки, способные образовывать прионные амилоиды, также обнаружены у дрожжей БассИаготусез сеге\п$1ае. Во многих случаях присутствие таких прионных полимеров в клетках дрожжей имеет фенотипические проявления, которые могут наследоваться за счет передачи этих полимеров дочерним клеткам при их делении. Таким образом, прионы дрожжей могут выступать в роли генетического материала. В отличие от млекопитающих, у которых прионы вызывают неизлечимые заболевания, прионы дрожжей, скорее всего, имеют адаптивное значение.

В большинстве прионных белков дрожжей за прионные свойства отвечают обособленные домены, богатые глутамином и аспарагином. Сходным образом, удлиненные иолиглутаминовые тракты некоторых белков способствуют их переходу в амилоидную форму при так называемых полиглутаминовых заболеваниях человека и животных. Одна из наиболее известных болезней этого класса - это болезнь Гентингтона, связанная с мутационным удлинением полиглутаминового участка в белке гентингтине. При длине полиглутаминового тракта более 34 остатков гентингтин становится склонным к амилоидной полимеризации. Переход гентингтина в амилоидное состояние приводит к гибели нейронов у человека и других млекопитающих. Полимеризация гентингтина в клетках дрожжей также приводит к токсическим эффектам, что позволяет использовать дрожжи в качестве модели для исследования молекулярных основ болезни Гентиигтона.

Прионы млекопитающих - это инфекционные заболевания, связанные с образованием амилоидов белка РгР. В то же время, дрожжевые прионы не вызывают патологии, а представляют собой генетические детерминанты белковой природы. В силу того, что переход белка из нормального состояния в прионное - это редкое событие, для эффективного поддержания в клеточных делениях прионные полимеры должны размножаться. В клетках дрожжей это происходит путем фрагментации полимеров, осуществляемой шапероном НэрКМ с помощью некоторых других шаперонов. В отсутствие фрагментации при делении клеток происходило бы снижение количества полимеров в каждой клетке и потеря прионного фенотипа, поскольку фиксированное число полимеров должно распределяться между возрастающим числом клеток. Кроме того, из-за непрерывного роста, прионные полимеры становились бы слишком крупными и были бы неспособны попадать в дочерние клетки. В последние годы появилось несколько работ, выполненных на культурах клеток и целых организмах млекопитающих, которые указывают на возможность передачи амилоидных полимеров между клетками при различных неинфекционных амилоидозах, например, при болезнях Паркинсона, Генгингтона и Альцгеймера. По всей видимости, процесс межклеточной передачи амилоидных полимеров может играть роль в распространении амилоидной болезни в пределах организма. Можно полагать, что без эффективной фрагментации полимеров такой механизм существовать не может, поэтому изучение фрагментации амилоидных полимеров имеет не только фундаментально-биологическое, но и медицинское значение.

Данная работа посвящена изучению того, каким образом аминокислотная последовательность амилоидогенного домена белка влияет на способность амилоидных полимеров к фрагментации. В работе также исследованы механизмы токсичности амилоидов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Свойства амилоидов

Амилоиды - это фибриллярные белковые полимеры (Рис. 1), состоящие из белков, которые в норме растворимы. Амилоидогенные белки в растворимой форме обычно слабоструктурированы или в них преобладает альфа-спиральная структура, однако при полимеризации они претерпевают глубокую конформационную перестройку, в ходе которой белок приобретает так называемую кросс-бета структуру. Мономеры белка в составе такого полимера образуют параллельный межмолекулярный р-слой. В амилоидную кросс-бета структуру зачастую вовлечен не весь белок, а лишь его часть, которая называется амилоидогенным доменом. Иными словами, амилоидогенные белки часто имеют блочную структуру, в которой одни домены участвуют в полимеризации, а другие - нет. Благодаря своей необычной структуре, амилоиды обладают рядом специфических физико-химических свойств. В частности, они устойчивы к действию сильных ионных детергентов (например, додецил сульфата натрия, БОБ), протеолитических ферментов (например, протеиназы К), а также специфично связывают ряд красителей (Конго красный, Тиофлавин Т).

Исходно, интерес к амилоидам был связан с тем, что их образование характерно для множества заболеваний человека, в том числе болезней Альцгеймера, Гентингтона, Паркинсона, Крейтцфельдта-Якоба и диабета II типа. При амилоидозах полимеризующийся белок накапливается, поскольку он становится устойчив к действию протеаз и шаперонов, контролирующих укладку белков. Накопление полимеров часто приводит к образованию крупных агрегатов, которые хорошо видны на срезах тканей

2. Прионы - инфекционные амилоиды

Термин "прион" был введен Стэнли Прузинером в конце 20 века, однако прионные болезни, например, екрейпи овец, были известны еще в середине 18 века. Прионные болезни - это губчатые энцефалопатии млекопитающих, такие, как бычья губчатая энцефалопатия (коровье бешенство), екрейпи и некоторые нейродегенеративные заболевания человека - болезни Крейтцфельдта-Якоба и Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, семейная фатальная бессонница и куру, На данный момент все известные прионные заболевания человека неизлечимы и смертельны. Прионные болезни могут быть наследственными (-15% случаев), передаваться инфекционно (< 1% случаев) или возникать спорадически (-85% случаев), но, независимо от этиологии заболевания, оно впоследствии может быть передано инфекционным путем. Оказалось, что в ряде случаев, используя экстракт мозга животного одного вида, можно заразить животное другого вида, например, заболевание можно передать от овец мышам [Chandler, 1961], или от людей обезьянам [Gajdusek, Gibbs, Alpers, 1966]. Это позволило создать модельные системы для изучения прионных заболеваний в животных, что существенно облегчило дальнейшие исследования и помогло выявить природу инфекционного агента. В 1966 году было продемонстрировано, что инфекционный агент болезни екрейпи устойчив к ионизирующей радиации и ультрафиолету [Alper et al., 1967]. Это поставило под сомнение популярную в то время гипотезу о том, что екрейпи вызывается вирусом. В 1967 г. Дж. Гриффит [Griffith, 1967] высказал предположение, что, инфекционный агент, устойчивый к воздействиям, разрушающим нуклеиновые кислоты, может представлять собой измененную форму одного из клеточных белков, и это изменение поддерживается автокаталитическим способом. В начале 80-х годов С. Прузинер выделил и очистил агент, вызывающий екрейпи, из мозга больных животных и описал его свойства [Prusiner, 1982]. Оказалось, что агент устойчив к нагреванию, сохраняет инфекционность после обработки протеиназой К, мочевиной, хаотропными солями, SDS и агентами, повреждающими ДНК - нуклеазами и псораленами. После того, как была определена первичная структуры белка РгР, который был основным компонентом инфекционного материала, был выявлен кодирующий его ген, названный Prnp [Chesebro et al., 1985; Oesch ct al., 1985]. Впоследствии этот ген был обнаружен у всех млекопитающих, а также у птиц [Gabriel et al., 1992], рептилий [Ahn, Son, 2007] и рыб [Rivera-Milla, Stuermer, Málaga-Trillo, 2003].

РгР является мембранным белком, который в основном продуцируется в клетках центральной нервной системы и лимфоретикулярной ткани. Нормальная форма белка РгР обозначается РгРс. Патологическая форма этого белка, обуславливающая инфекционность, была названа PrPSt; (форма РгР, связанная со scrapie). PrPSt неотличим от РгРс по первичной структуре [Stahl et al., 1993], но имеет другую укладку (вторичную и более высокие уровни структуры). Методом ЯМР (ядерно-магнитного резонанса) было определено, что переход РгРс в PrPSc сопровождается потерей a-спиральной структуры и приобретением (3-структуры [Prusiner et al., 1990]. На основании имевшихся, на тот момент, экспериментальных данных, С. Прузинер сформулировал прионную концепцию [Prusiner, 1998], предполагающую, что в основе болезни Крейтцфельдта-Якоба лежит аномальная форма белка РгР.

К настоящему времени прионная концепция подтверждена большим количеством экспериментальных данных (см. обзор [Wadsworth, Collinge, 2011]). В 2010 году, после многих неудачных попыток было продемонстрировано, что фибриллы, полученные ш vitro из рекомбинантного белка РгР, могут вызывать scrapie-подобное заболевание у сирийских хомяков [Makarava et al., 2010]. Таким образом, в настоящий момент окончательно показано, что инфекционным агентом прионных болезней является белок, уложенный в альтернативную, полимерную форму.

Важная особенность прнонов - существование их различных штаммов или вариантов1. Таким образом, помимо того, что белок РгР может существовать в двух альтернативных формах (нормальной и патогенной), патогенная форма может иметь различные варианты, которые различаются по структуре и стабильно воспроизводятся. Эти структурные различия прионной укладки РгР приводят к разным клиническим картинам заболевания, в том числе к разным инкубационным периодам, различиям в поражении тканей (например, для некоторых вариантов PrPSc характерны повышенные титры инфекционного вещества в лимфоидной ткани и т.д. (подробный обзор в [Wadsworth, Collinge, 2011])).

3. Прионы дрожжей

Развитие прионной концепции для РгР позволило объяснить природу необычных дрожжевых генетических детерминантов [fS/*] и [URE3]. Поскольку сверхпродукция белка Ure2 увеличивает вероятность возникновения фенотипа [URE3] и ген URE2 необходим для существования фенотипа [URE3], было выдвинуто предположение, что этот детерминант отражает прионное состояние белка Ure2 [Wickner, 1994], На основании аналогичных данных было предположено, что фенотип [Р5Г] отражает прионное состояние белка Sup35. Это предположение было подтверждено последующими работами [Paushkin et al., 1996; Patino et al., 1996J, и в дальнейшем список дрожжевых прионов был расширен (Таблица 1). Кроме того, прион был обнаружен у мицелиального гриба Р. anserina. Оказалось, что у этого гриба прионные полимеры белка Het-s необходимы для развития реакции несовместимости при слиянии грибов с различным аллельным состоянием гена het-s [Coustou et al., 1997]. Исследователи прионов животных обычно используют термин "прионные штаммы", а исследователи прионов дрожжей - термин "прионные варианты".

Детерминант [Р5/"], являющийся, вероятно, наиболее изученным прионом дрожжей, был обнаружен Б. Коксом как супрессор нонсенс мутаций дрожжей [Сох, 1965]. Для фенотипической детекции [Р574"] обычно используют дрожжи с нонсенс мутациями в генах АЭЕ1 или АЭЕ2. Клетки дрожжей дикого типа образуют колонии белого цвета и способны расти в среде, не содержащей аденина. Нонсенс мутации (образующие преждевременный стоп-кодон) в генах АВЕ1 {айе1-14) или АОЕ2 {ас1е2-1) блокируют синтез аденина, что приводит к неспособности клеток расти в отсутствие аденина и к накоплению промежуточного метаболита красного цвета. Супрессоры нонсенс мутаций, такие, как детерминант [РЗУ4], или мутации в генах 81/Р35 и 5(/Р45 [Инге-Вечтомов, 1970], кодирующих факторы терминации трансляции ^апэНеШ с! а1., 1995; г!юигау1еуа е1 а1., 1995], позволяют с некоторой эффективностью прочесть мутантный стоп-кодон и частично или полностью восстановить исходный фенотип клеток. Подобно мутациям в генах 5(7Р55 и ЗиР45, и в отличие от мугаций тРНК, [Р5/4"] способен супрессировать все типы нонсенс мутаций (стоп-кодоны иАА, иАв и 1ЮА). Как и у РгР^, у [РБГ] существует штаммовая вариация. Независимые изоляты [Р57"'] могут отличаться по эффективности нонсенс супрессии, что проявляется в белом ("сильные" варианты [Р5/4"]) или розовом ("слабые" [Р5Г]) цвете колоний [ОегкагсИ е1 а!., 1996]. Слабые [Р5Т] также отличаются меньшей стабильностью наследования.

Фенотип [РЗГ] также отличается необычными генетическими свойствами, нехарактерными для хромосомных генов. Так, при скрещивании гаплоидных клеток [Р5Г] и [/ш"~] и последующем мейотическом делении диплоида все 4 споры содержат [Р5/], в отличие от стандартного Менделевского расщепления при аналитическом скрещивании (2:2). При цитодукции (скрещивание, в результате которого дрожжевые клетки обмениваются цитоплазмой, но не ядерным материалом) происходит передача [Р5/*], что позволяет предполагать его цитоплазматическую, а не ядерную локализацию. Что еще более необычно, детерминант [Р5/1"] исчезает при росте клеток в присутствии низких концентраций (3-5мМ) гидрохлорида гуанидина (ГуГх) [Сох, е1 а1., 1988] и может возникать вновь при сверхэкспрессии гена 8иР35 [СИетой* е1 а1., 1993], то есгь фенотип является метастабильным. Таблица 1. Приоиы грибов

Белок Организм-хозяин Нормальная функция Прион Прионный фенотип Ссылка

Ure2 S. cerevisiae Репрессор катаболизма азота [URE3] Рост на средах с альтернативными источниками аюта [Wickner, 1994]

Sup35 S cerevisiae Фактор терминации трансляции [PSf] Увеличенный уровень сквозного прочтения стоп-кодонов [Wickner, Masison, Edskcs, 1995]

НЕГ-S Podospora anserma Контроль несовместимости I счсрокариона [HET-s] Программированная гибель гетерокарионов несовмесшмых штаммов [C'oustou et a]., 1997]

Rnql S ce/evisiae Функция неизвестна [PIN'] Способствуе! а1ре1ации других прионогенных белков [Derkalch et al., 2001 ]

Swil S cerevinue Фактор ремодслирования хромаппш [sivr\ Плохой рост на некоторых источниках углерода [Du ct al,, 2008]

Cyc8 S. cerevisiae Транскрипционный репрессор [OCT'] Транскрипционная дерепрессия многих генов [Patel, Gavin-Smyth, Liebman, 2009]

Mol3 S. cerevisiae Транскрипционный фактор [МОТЗ*] Транскрипционная дерепрессия генов анаэробного метаболизма [Alberti et al., 2009]

Sfpl S cerevisiae Глобальный транскрипционный регуля гор [ISP*] Антисупрессор некоторых мутаций в гене БиР35 [Rogoza et al., 2010]

Mod5 S cerevisiae тРНК шопент енили зомераз а [MOD*] Чувствительность к5-фтор урацилу, устойчивость к противогрибковым препарашм [Suzuki, Shimazu, Tanaka, 2012]

4. Прионные свойства 8ир35 и

Прионные свойства белка Бир35 контролируются его 1М-доменом (аминокислоты 1123 из 685) [Тег-Ауапеэуап е1 а1., 1993] (см. Рис. 3). Этот домен не является жизненно-важным, в отличие от С-домена, сходного по структуре с фактором элонгации трансляции ЕР-1А. М-домен Бир35 не консервативен и, подобно большинству других прионных

Поскольку концы прионных полимеров обладают способностью к автокаталитическому присоединению мономерного белка, то разрыв полимера, производимый Hspl04, создает новые активные концы и таким образом ускоряет полимеризацию. Кроме того, при этом происходит увеличение количества прионных частиц, что способствует их стабильному наследованию при делении клеток. Поэтому, в тех случаях, когда фрагментирующая активность шаперонов не может полностью уничтожить прионные комплексы, она фактически размножает их [Paushkin et al., 1996; Kushnirov, Ter-Avanesyan, 1998; Kryndushkin et al., 2003]. В настоящее время гипотеза о роли Hspl04 во фрагментации прионных полимеров и размножении прионных частиц может считаться доказанной, поскольку продемонстрировано, что специфическое ингибирование активности Hspl04 в клетках блокирует фрагментацию [Kryndushkin et al., 2003], и что очищенный рекомбинантный Hspl04 может фрагментировать амилоидные полимеры [Shorter, Lindquist, 2004].

Поскольку Hsp 104 способен разбирать амилоидные комплексы, этот белок вызвал большой интерес исследователей. У млекопитающих, включая человека, нет гомологов Hsp 104, поэтому некоторые исследователи изучали возможность внедрения Hsp 104 в организмы млекопитающих для борьбы с амилоидными болезнями [см. обзор Vashist, Cushman, Shorter, 2010]. Оказалось, что in vitro Hsp 104 может разбирать амилоиды альфа-синуклеина, агрегация которого наблюдается при болезни Паркинсона. При этом продукция Hsp 104 предотвращала гибель дофаминэргических нейронов в крысиной модели этой болезни, однако неясно, происходило ли это за счет фрагментации полимеров или какого-то другого механизма.

5.1 [Механизм фрагментации амилоидов шапероном Hspl04

Hsp 104 входит в семейство белков ClpB/Hsp 100, для которых характерно образование гексамерных или олигомерных кольцевых комплексов, участвующих в АТФзависимом контроле укладки различных белков. Гексамеры НэрКМ фрагментируют амилоидные полимеры путем протягивания полипептидных цепей сквозь свою центральную пору. Проходя сквозь эту пору, белок разворачивается и затем может принять свою нативную конформацию. Аналогичным образом действует бактериальный гомолог Нзр104, С1рВ. Некоторые из шаперонов бактерий, сходных с НэрКМ, например С1рС, работают в комплексе с протеазами, которые сразу подвергают развернутый белок гидролизу [На.ч1Ьег§ег е1 а!., 2008].

Известно, что для протягивания субстрата сквозь пору Нзр104 не требуется свободный конец полипептидной цепи, то есть, по всей видимости, сквозь центральную пору гсксамера Нвр 104 может быть протянута полипептидная цепь, сложенная вдвое. Сам процесс протягивания осуществляется посредством скоординированных действий нуклеотид-связывающих доменов, расположенных в каждом мономере Нзр104. Непосредственное связывание субстрата происходит посредством тирозин-содержащих петель, которые направлены внутрь центральной поры фермента. Предполагается, что остатки тирозина захватывают субстрат и передают его между петлями, расположенными на разных мономерах Нзр104 [НаяИзе^ег, Викаи, 2010). В результате шаперон движется по белковой цепи, разворачивая ее. Интересно отметить, что Нэр 104 и его бактериальный гомолог С1рВ могут перестать разворачивать белок при встрече с нормально свернутым глобулярным доменом, тогда как С1рС разворачивает такие белки полностью [НаэПэе^ег а1., 2008]. Такая остановка, по всей видимости, позволяет избегать разворачивания правильно свернутых доменов.

Эффективность фрагментации полимеров должна зависеть от эффективности связывания шаперонов с амилоидами. Поэтому представляется важным вопрос о том, каким образом амилоидные полимеры распознаются шаперонами, участвующими во фрагментации. На момент начала нашей работы о специфичности Нзр104 была известно лишь то, что он предпочтительно связывается с пептидами, содержащими остатки ароматических и положительно-заряженных аминокислот [Lum, Niggeman, Glover, 2008].

5.2 Hsp40 и Hsp70 участвуют во фрагментации амилоидных полимеров

Помимо Hspl04, во фрагментации прионных полимеров дрожжей принимают участие и другие шапероны, которые, по всей видимости, способствуют распознаванию прионных полимеров. Наиболее изучена роль белков Hsp70 и Hsp40, в особенности шаперона Sis 1 (Hsp40). Было показано, что при репрессии гена, кодирующего белок Sis 1, эффективность фрагментации полимеров Sup35, Rnql и Ure3 снижается [Higurashi et al., 2008]. Эти данные были подтверждены в другой работе, в которой было показано, что S is 1 необходим для фрагментации амилоидных полимеров, причем он взаимодействует с полимером до Hsp 104 [Tipton, Verges, Weissman, 2008]. Также недавно было продемонстрировано, что шаперон Ssal, который является партнером S is i, связывается с прионными полимерами и участвует во взаимодействии Hspl04 с прионными полимерами Sup35 [Winkler et al., 2012].

Специфичность дрожжевых шаперонов Sis 1 и Ssal к субстратам на данный момент не изучена, однако имеются данные о специфичности их бактериальных аналогов, DnaJ и DnaK, к различным пептидным мишеням. Было обнаружено, что, DnaJ и DnaK узнают небольшие участки субстратов, содержащие гидрофобные аминокислотные остатки. Для DnaK это в основном алифатические остатки (Leu, 11с, Val), в то время как DnaJ имеет предпочтение к ароматическим остаткам (Туг, Trp, Phe), хотя он также связывается с сайтами содержащими Leu и Не [Rüdiger et al., 1997; Rüdiger, Schneider-Mergener, Bukau, 2001]. Было также показано, что DnaJ и DnaK могут связываться с одними и теми же сайтами и конкурировать друг с другом за их связывание. Особенно интересно, что данные шапероны отличались по своему сродству к остову полипептидной цепи. Используя пептиды с одной и той же аминокислотной последовательностью, но состоящие из комбинации Э- и Ь-аминокислот, авторы показали, что ЭгЫ может связывать субстраты, у которых совпадает последовательность аминокислот, но различается структура остова. Таким образом, можно сделать вывод, что шаперон связывается только с боковыми радикалами полипептидной цепи. В то же время связывание ЭпаК зависит и от структуры радикалов, и от структуры остова полипептидной цепи. На основании этих данных авторы делают вывод, что DnaJ является сканирующим шапероном, который быстро анализирует белковые поверхности для выявления сигналов для связывания.

6. Полиглутаминовые болезни

Поскольку основной темой данной работы являются амилоиды белков с глутамин-богатыми доменами, то остановимся более подробно на моделировании болезни Гентингтона и сходных с ней полиглутаминовых болезнях, которые связаны с удлинением полиглутаминовых трактов в некоторых белках.

Болезнь Гентингтона является аутосомно-доминантным нейродегенеративным заболеванием, которое вызывается увеличением длины повторяющейся области гена НТТ (также называемого 1Т15), и соответствующим удлинением полиглутаминового тракта в кодируемом белке гентингтине. При длине этого тракта более 36 белок начинает неправильно сворачиваться и агрегировать, что приводит к цитотоксичности и развитию патологии. Симптомы заболевания - это различные двигательные нарушения, изменения психики и постепенное нарушение восприятия. При болезни Гентингтона в мозгу образуются агрегаты гентингтина, и наблюдается гибель нейронов. Помимо болезни Гентингтона существуют и другие полиглутаминовые болезни, которые перечислены в Таблице 2.

При длине полиглугаминового тракта от 35 до 39 остатков болезнь проявляет неполную пенетрантность, однако люди, у которых полиглутаминовый тракт имеет длину более 39 рано или поздно заболевают.

Продукция белков с протяженными полиглутаминовыми трактами (в том числе и гентингтина) приводит к нарушению метаболизма клетки на многих уровнях, в том числе на уровне транскрипции, деградации белков, функционирования митохондрий, везикулярного транспорта и автофагии. В совокупности эти нарушения принято называть токсичностью. Изначально считалось, что одной из причин токсичности при болезни Гентингтона может быть инактивация гентингтина, поскольку мыши с делецией соответствующего гена демонстрировали некоторые нарушения, аналогичные наблюдаемыми при болезни Гентингтона [С1аЬо1^Ь, геИИп, 2006]. Однако на данный момент в литературе превалирует мнение, что патологические проявления связаны не с потерей нормальной функции гентингтина, а приобретением новой функции белком с удлиненным полиглутаминовым трактом. При этом основная масса литературных данных указывает на то, что эта новая функция или функции характерны только для аномально уложенной формы гентингтина. Таблица 2. Полиглутамииовые болезни

Болезнь Белок

Болезнь Гентингтона Гентингтин

Спинобульбулярная мускульная атрофия Андрогенный рецептор

Дентаторубро-паллидо- лыоисова атрофия Атрофии-1

Спиномозжечковая атаксия 1 Атаксин-1

Спиномозжечковая атаксия 2 Атаке ин-2

Спиномозжечковая атаксия 3. Атаксин-3

Болезнь Мачадо-Иозефа

Спиномозжечковая атаксия 6 а1 А-субьединица потенциал-зависимого кальциевого канала

Спиномозжечковая атаксия 7 Атаксин-7

Спиномозжечковая атаксия 17 ТАТА-связывающий белок

6.1 Токсичность белков с удлиненными полиглутаминовыми трактами

На данный момент нет единого мнения, какая именно форма неправильно свернутого белка является основным источником токсичности. На основании экспериментов in vitro и in vivo известно, что белки, содержащие полиглутаминовый тракт, могут образовывать различные неправильно свернутые структуры. Это могут быть мономеры с необычной вторичной структурой, олигомеры с различными свойствами, или более крупные комплексы, представляющие собой макроагрегаты, состоящие из амилоидных фибрилл и других белков, которые взаимодействуют с этими фибриллами [см. обзор Takahashi, Katada, Onodera, 2010].

Изучение этих различных форм и их роли в токсических эффектах белков с протяженными полиглутаминовыми трактами - одна из центральных задач многих исследований. Первоначально наибольшее внимание было приковано к крупным внутриклеточным комплексам гентингтина. Были получены данные, что крупные агрегаты могут нарушать процессы транспорта в нейронах [Lee, Yoshihara, Littleton, 2004]. Кроме того, оказалось, что в состав этих комплексов входят различные функциональные клеточные белки [Mitsui, Doi, Nukina, 2006; Wang et al., 2007]. Это указывало на то, что потеря функции этих белков могла приводить к токсическому эффекту. Однако в последние годы в литературе превалирует мнение, что слипание олигомеров в агрегаты на самом деле снижает токсичность, и агрегаты не являются основной причиной токсичности [Takahashi et al., 2008].

Олигомеры и полимеры полиглутаминовых белков могут слипаться в крупные агрегаты [Kawai-Noma et al., 2010], но могут существовать и обособленно. В клетках млекопитающих [Schaffar et al., 2004; Mitsui, Doi, Nukina, 2006; Wang et al., 2007], и дрожжей [Urakov et al., 2010] было показано, что полимеры полиглутамина могут служить матрицами для полимеризации глутамин-богатых клеточных белков, что могло бы приводить к ингибированию роста клеток, если такие белки являются жизненно-важными.

Кроме того, имеются данные о том, что олигомеры полиглутаминовых белков могут встраиваться в липидные мембраны и нарушать их структуру, тем самым вызывая дисфункцию митохондрий и дисрегуляцию ионного гомеостаза, выявленные в моделях с использованием животных и дрожжей [С1аЬе, 2006].

Токсичность мономерных форм неправильно свернутых полиглутаминовых белков рассматривается в некоюрых работах [№§а1 е1 а1., 2007; ЗсЬаНаг е1 а1., 2004]. Тем не менее, осталось неясным, стабильны ли такие мономеры и не превращаются ли они в олигомерные комплексы внутри или снаружи клеток.

6.2 Дрожжевая модель болезни Гентингтона

В качестве модельного объекта дрожжи имеют ряд важнейших преимуществ -быстрый рост клеток, хорошо изученный геном и удобство для генетических манипуляций. Поэтому они были использованы для создания моделей нейродегенеративных заболеваний человека. Хотя моделировать ответ нервной системы на различные болезни в клетках дрожжей невозможно, многие клеточные процессы у дрожжей аналогичны таковым у млекопитающих. Поэтому в дрожжах можно изучать молекулярные основы патогенеза, в том числе проводить систематические скрининги на роль тех или иных генов в патогенезе различных амилоидных заболеваний, в том числе и болезни Гентингтона, и тестировать различные химические и биологические ингибиторы токсичности.

В большинстве дрожжевых моделей болезни Гентингтона используется первый экзон гена Н'ГТ, кодирующий 17 первых аминокислот белка, после которых идет полиглутаминовый тракт (Рис. 5А). Исходно в дрожжевой модели можно было изучать агрегацию гентиштина, однако эта агрегация не приводила к очевидным токсическим эффектам, которые характерны для моделей в клетках или организмах млекопитающих. Разработка дрожжевой модели с сильной клеточной токсичностью гентингтина позволила провести эффективный полногеномный поиск генов, влияющих на токсичность гентингтина, поскольку имелся легко фиксируемый фенотип (восстановление роста клеток).

Создать дрожжевую модель болезни Гентингтона, в которой полимеризация гентингтина вызывала бы заметный токсический эффект, удалось в 2002 году [Meriin et al., 2002]. Белок, использованный в упомянутой работе и целом ряде последующих исследований, схематично изображен на Рис. 5Б. Он содержит на N-конце FLAG-эпитоп (DYKDDDK), после которого расположены первые 17 аминокислот 1-го экзона НТТ (MATLEKLMKAFESLKSF) и полиглутаминовый тракт. В С-концевой части белок содержит GFP (Green Fluorescent Protein). Кроме того, из первого экзона гентингтина удален полипролиновый участок, о котором будет сказано ниже. Важно, что для проявления сильной клеточной токсичности требовались очень высокие уровни продукции данного белка (соответствующий ген находился под контролем промотора гена GAL1).

Рисунок 5. Дрожжевая модель болезни Гентингтона (А) Схематическое изображение первого экзона гентингтина (Б) Схематическое изображение модельного гентингтина, вызывающего токсичность в клетках дрожжей. Ntl7 - первые 17 а. к. первого экзона (MATLEKLMKAFESLKSF), FLAG - флаг эпитоп (DYKDDDK). (В) Флуоресценция белков 25Q-GFP и 103Q-GFP в клетках дрожжей, содержащих [PIN] [Khurana, Lindquist, 2010]. дефекты эндоцитоза и мутации в генах, связанных с эндоцитозом, приводит к усилению токсичности. Важно, что некоторые из этих белков связываются с агрегатами гентингтина и имеют домены богатые глутамином и аспарагином (Entl, Panl). В работе [Giorgini et al., 2005] при скрининге делеционной библиотеки было обнаружено, что в присутствии 103Q-GFP активирован кинурениновый путь метаболизма триптофана, что приводит к увеличению количества активных форм кислорода. При этом инактивация некоторых компонентов этого метаболического пути существенно снижала токсичность полимеров 103Q-GFP. Также имеются данные о том, что агрегация 103Q-GFP приводит к нарушениям деградации белков, ассоциированных с эндоплазматическим ретикулумом [Duennwald, Lindquist, 2008] и с циклосомой [Bocharova et al., 2008]. В недавней работе [Manogaran et al., 2011] было выявлено, что гены, снижающие эффективность возникновения приона [PSÍ], также могут модулировать токсичность 103Q-GFP. Один класс генов (Las 17, Vps5, и Sac6) предположительно способствовал образованию токсических олигомерных форм, и делеции этих генов ослабляли токсичность 103Q-GFP и препятствовали образованию крупных агрегатов 103Q-GFP. Делеции второго класса генов (Beml, Bugl, Arfl, и Högl) усиливали токсичность и не препятствовали образованию крупных клеточных агрегатов. Механизм влияния этих генов на токсичность гентингтина на данный момент не ясен, однако индивидуальные делеции 6 из 7 выявленных генов приводили к фрагментации вакуолей, и большая часть из этих генов так или иначе связана с организацией актинового цитоскелета.

Таким образом, в настоящий момент неясно, что является основной причиной токсичности мутантного гентиштина, ни в клетках дрожжей, ни в клетках млекопитающих. Из имеющихся данных создается впечателние, что инактивация целого ряда белков, вызванная мутантным гентингтином, приводит к нарушениям целого ряда клеточных процессов, которые вносят тот или иной вклад в общую токсичность. только при полимеризации продуктов его протеолиза, тогда как полноразмерный белок менее склонен агрегировать и/или не проявляет столь сильной токсичности.

7. Структура амилоидных фибрилл

Амилоидная полимеризация сопровождается глубокой конформационной перестройкой белка, что отличает амилоидные полимеры от других клеточных филаментов, например, актиновых или тубулиновых. Анализ рентгеновской дифракции амилоидных фибрилл различных белков свидетельствует, что эти белки образуют так называемую кросс-бета структуру, в которой (3-тяжи расположены перпендикулярно оси фибриллы. Из-за того, что амилоидные полимеры плохо поддаются анализу с помощью кристаллографических методов, основными инструментами для подробного изучения структуры амилоидных фибрилл служат различные типы электронной микроскопии, ЯМР, и рентгеновская дифракция. Кроме того, активно применяются различные типы мутационного анализа, позволяющие наблюдать за изменениями структуры фибрилл в результате тех или иных мутаций [см. обзор Тоуата, \Veissman, 2011]. На Рисунке 6 представлены предполагаемые структуры амилоидных полимеров нескольких белков, которые были получены благодаря применению этих методов.

Рисунок 6. Укладка различных белков в составе амилоидных полимеров. (A) Het-S, мономеры уложены в (¿-спираль, (Б) Afi(l-4Q), (В) Ure2, суперскладчатая (i-структура. Изображение взято с изменениями из [Goldsbury et al., 2011].

Для прионных амилоидов, состоящих из белков Sup35 и Ure2, на данный момент предполагается образование параллельной супер-складчатой |3-структуры (parallel super-pleated beta-structure, Рис. 6В), предложенной А. Каявой [Kajava et al., 2004]. Эта модель опирается на следующие экспериментальные факты:

1) На длину фибриллы в 0.47 нм приходится одна молекула белка [Ваха et al., 2003; Diaz-Avalos et al., 2005; Chen et al., 2009], т.е. одна молекула в составе полимера располагается в один слой, перпендикулярно оси фибриллы.

2) Аминокислотные остатки прионных доменов в составе полимеров расположены в регистре, то есть каждый остаток одного домена расположен напротив аналогичного остатка в соседней молекуле [Shewmaker, Wickner, Tycko, 2006; Wickner et al., 2008; Wickner, Dyda, Tycko, 2008].

3) Случайное перемешивание аминокислотной последовательности прионного домена Sup35 не мешало возникновению прионов [Ross et al., 2005; Shewmaker et al., 2008], то есть способность к образованию амилоидов не зависит от первичной структуры амилоидогенного домена, а только от его состава.

Предложенная структура может объяснять способность прионных белков находиться в различных амилоидных конформациях, то есть образовывать структурные варианты, поскольку в рамках этой модели варианты отличаются друг от друга по расположению поворотов цепи и протяженности тех или иных неуложенных участков.

О структуре полиглутаминовых полимеров известно меньше, однако считается, что она принципиально сходна со структурой прионных полимеров. Модель параллельной супер-складчатой Р-структуры достаточно хорошо объясняет структурные особенности полимеров полиглутаминовых белков. Однако важно учитывать, что молекулы полиглутаминовых белков в составе полимера взаимодействуют вне регистра [Bugg et al., 2012], поскольку они имеют гомогенную последовательность.

8. Структурные различия амилоидных полимеров влияют на эффективность их фрагментации

Структурные варианты прионов были выявлены по своим различным фенотипическим проявлениям. Прионы животных характеризуются разными инкубационными периодами и симптомами болезни, тогда как у дрожжей варианты прионов различаются, в том числе, по степени супрессии стоп-кодонов (для [AS/1"]) и эффективности индукции фенотипа [AST^] (для [А/Д^]). Если сравнить между собой фенотипически различающиеся клетки с "сильным" (высокий уровень супрессии) и "слабым" (низкий уровень супрессии) фенотипом [PSf], то выявляются и другие различия: сильный фенотип обычно наследуется более эффективно, т.е. имеет большую митотическую стабильность. Это коррелирует с тем, что полимеры сильных штаммов обычно лучше фрагментируются [Kryndushkin et al., 2003; Tipton, Verges, Weissman, 2008]. Эффективная фрагментация полимеров в клетках с сильным фенотипом [AST1"] также объясняет более высокий уровень нонсенс-супрессии, который наблюдается в клетках с такими полимерами, поскольку из-за большого числа фибрилл они могут более эффективно присоединять к себе мономерный Sup35.

Полимеры "сильного" [PSf~] обладают меньшей физической стабильностью по сравнению с полимерами "слабого" [AS/1]. Это продемонстрировано с помощью различных методов оценки стабильности полимеров (устойчивость к распаду при нагревании в присутствии SDS [Tanaka et al., 2004], ломкость длинных фибрилл при гидродинамической нагрузке [Тоуаша et al., 2007] и анализ прочности на разрыв при помощи микроманипулятора с лазерной ловушкой [Castro et al., 2011; Dong et al., 2010]). Примечательно, что физическая прочность дрожжевых прионных фибрилл чрезвычайно высока и единичные фибриллы разрываются только при усилиях не меньше 250 пиконьютонов [Dong et al., 2010]. Для сравнения, разрыв связи между стрептавидином и биотином требует усилия около 160 пиконьютонов, а разрыв одинарной ковалентной связи между двумя атомами углерода - около 1600 пиконьютонов.

Эти различия в физических свойствах согласуются с данными об укладке полипептидной цепи в составе прионных полимеров Sup35, которые были получены с помощью множества различных методов, в том числе: а) делеционного анализа белков, входящих в состав полимеров [Shkundina et al., 2006]; б) цистеинового картирования -введения единичных остатков цистеина, которые затем были использованы для оценки экспонирования этих остатков в раствор или участия во внутренней структуре полимера [Krishnan, Lindquist, 2005]; в) водородно-дейтериевого обмена, который позволяет оценить, насколько тот или иной остаток в белке доступен для контакта с растворителем [Тоуагпа et al., 2007]; г) картирования с помощью единичных замен и вставок различных аминокислот в прионный домен [Chang et al., 2008].

Перечисленные работы указывают на то. что в полимерах слабого варианта в состав плотно упакованной структуры (т.н. амилоидного ядра) входит большая длина прионного домена, чем в полимерах слабого варианта [PSi]. На рис. 7 схематично изображены эти структурные различия. Несмотря на то, что в настоящее время тонкие детали строения прионных полимеров не известны, можно сформулировать общую закономерность; чем большая часть прионного домена вовлечена в амилоидное ядро, тем хуже фрагментируются прионные полимеры, что затрудняет их наследование.

Многие исследователи склонны считать, что шаперон Hspl04 фрагментирует полимеры слабого и сильного [Р5Г] с разной эффективностью по той причине, что прочные полимеры труднее разрушить. Однако помимо наблюдения корреляции между эффективностью фрагментации полимеров и их прочностью, на данный момент нет данных о том, что прочность действительно определяет частоту фрагментации

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ

В последние годы использование дрожжей в качестве модельного объекта позволило найти ответы на многие вопросы, касающиеся фундаментальных процессов, происходящих в эукариотической клетке. Кроме того, несмотря на то, что дрожжи сеге\чя1ае являются одноклеточным организмом, в последнее время их все чаще используют для решения не только общебиологических, но и медицинских проблем. Ключевыми факторами, определяющими удобство сеге\>шае в качестве модельного объекта для изучения молекулярных основ амилоидных болезней человека, являются особенности их биологии и прекрасная разработанность как молекулярно-биологического объекта. Исследованию амилоидозов также способствует существенный прогресс в изучении прионов дрожжей.

Использование дрожжевой модели позволяет идентифицировать факторы, участвующие в конформационной перестройке некоторых амилоидогенных белков, выяснять причины токсичности амилоидных агрегатов, идентифицировать факторы, которые участвуют в их передаче в процессе клеточных делений.

Важно отметить, что белки, участвующие в формировании некоторых амилоидов млекопитающих и большинства прионов дрожжей содержат глутамин-богатые домены. В этой связи примечательно, что при исследовании молекулярных основ амилоидозов в животных моделях достаточно часто обнаруживают колокализацию агрегатов полиглутаминовых белков с клеточными белками, содержащими домены, обогащенные глутамином и/или аспарагином. Данные, полученные в нашей лаборатории, указывают на то, что амилоидные полимеры полиглутаминовых белков могут индуцировать полимеризацию клеточных белков с полиглутаминовыми и глутамин-богатыми доменами. Можно предположить, что если подобные клеточные белки являются жизненно-важными, то индукция их полимеризации будет приводить к ингибированию роста клеток дрожжей.

Такой механизм может лежать в основе клеточной токсичности гентингтина для клеток дрожжей, а также для нейронов млекопитающих.

В отличие от амилоидов прионогенных белков дрожжей, амилоиды белков с протяженными полиглутаминовыми доменами плохо фрагмснтируются. Выяснение причин этого отличия представляется важной задачей, поскольку фрагментация амилоидных полимеров с участием Нзр104 является единственным доказанным механизмом размножения внутриклеточных амилоидных полимеров. Изучение процесса фрагментации амилоидов необходимо для понимания механизмов инфекционное™ прионов млекопитающих. Несмотря на то, что ранее в нашей лаборатории получены данные о том, что вставки остатков тирозина в полиглутаминовые последовательности стимулируют фрагментацию образуемых этими белками амилоидных полимеров, природа этого эффекта осталась не выясненной. Кроме того, на данный момент неясно, какие именно структурные элементы амилоидных полимеров обеспечивают их способность к фрагментации.

Целью данной работы являлось изучение причин токсичности амилоидов полиглутаминовых белков и выявление факторов, определяющих частоту фрагментации таких амилоидов в клетках дрожжей. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать роль жизненно-важных белков 8ир35 и 8ир45 в токсичности мутантного гентингтина человека для клеток дрожжей;

2) Изучить влияние различных аминокислотных остатков в составе полиглутаминовых доменов модельного белка на способность этих белков к полимеризации и на степень фрагментации полимеров этих белков;

3) Исследовать корреляцию между эффективностью фрагментации амилоидных полимеров и их прочностью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

1. Штаммы дрожжей и культивирование клеток

Белки polyQX продуцировали в клетках штамма дрожжей S. cerevislae 74-D694/AS35 [/VAT], который был получен из 74-D694 {МАТа ura3-52 Ieu2-3,112 trp 1-289 his3-A200 adel-14) [PINпутем разрушения хромосомного гена SUP35 вставкой гена TRP1. Жизнеспособность штамма обеспечивалась одной из центромерных плазмид pRS315-Sup35C или pRS313-Sup35C [Alexandrov et al., 2008], которые кодируют С-домен Sup35 (сокращенно Sup35C). Для культивирования клеток использовали среды YPD (1% дрожжевой экстракт (Oxoid), 2% пептон (Sigma), 2% глюкоза), или SC (0.67% yeast nitrogen base, 2% глюкоза, а также необходимые аминокислоты). Твердые среды также содержали 2% агара (Рапгеас). Дрожжи выращивали при 30°С. Влияние делеций в прионном домене Sup35 на размер и термостабильность полимеров исследовали в клетках штамма 22V-H63AS (MAT a ade2-l SUQ5 karl lysl his3 игаЗ leu2 cyhR sup35 : : TRP I) pRS316-Sup35. Как и у штамма 74-D694/AS35, хромосомный ген SUP35 этого штамма также разрушен вставкой TRPI, Жизнеспособность 22V-H63AS поддерживалась за счет плазмиды pRS316-Sup35, которая кодирует белок Sup35 дикого типа. Для изучения влияния делеций прионного домена Sup35 на размер и свойства прионных полимеров этого белка эту плазмиду заменяли плазмидой, кодирующей версии белка Sup35 с укороченным прионным доменом.

Для изучения токсичности модельного гентингтина (103Q-GFP) использовали варианты штамма 74-D694 \psr][PIN*] и \psi][piri], а также 74-D694/AS35 [PIN*]. Для индукции синтеза белков 103Q-GFP и 25Q-GFP, культуры соответствующих клеток переносили в жидкую селективную среду, содержавшую в качестве единственного источника углерода 2% раффинозу, где их инкубировали до достижения средней логарифмической фазы. Далее культуры переносили в среду с галактозой (2%) и инкубировали в ней в течение указанного времени (для биохимических экспериментов) или высевали на среду, в которой единственным источником углерода была галактоза (для проверки токсичности). Тест на токсичность на твердой среде с галактозой проводился следующим образом: после переноса культуры в жидкую среду с раффинозой и достижения ею середины логарифмической фазы, культура разводилась до А = 1.0 (при Х=600 нм), после чего в стерильных условиях делали 4 последовательных разведения в 5 раз, после чего аликвоты каждого разведения (Змкл) наносили на чашки со средой, содержащей галактозу (условия, обеспечивающие индукцию синтеза 103Q-GFP и 25Q-GFP) и на чашки с глюкозой (репрессия синтеза этих белков) для контроля количества нанесенных клеток.

2. Конструирование плазмид

Все генетические конструкции, использованные в данной работе, перечислены в Таблице 3. Панель конструкций, кодирующих polyQX белки, была создана с использованием двух различных стратегий. Согласно первой стратегии, фрагменты ДНК, кодирующие polyQX последовательности, были получены путем лигирования двух пар комплементарных олигонуклеотидов (Рис. 8А) (последовательности олигонуклеотидов указаны в Таблице 4). Олигонуклеотиды, которые служили концами фрагмента («терминаторы») кодировали участок начала трансляции и содержали сайты для клонирования Bglll и Есо255. Олигонуклеотиды "элонгаторы" кодировали последовательность QQQXQQQQXQ, где X - любой аминокислотный остаток, отличный от глутамина. Весь кодирующий фрагмент собирали следующим образом: пару элонгаторов (QX10-D и QX10-R) смешивали с парой терминаторов в соотношении (Terml-D и Terml-R) 10:1. Смесь нагревали до 80°С для отжига комплементарных олигонуклеотидов и медленно охлаждали до комнатной температуры на выключенной водяной бане. Далее смесь обрабатывали полинуклеотид-киназой фирмы NEB в соответствии с протоколом производителя, затем лигировали. В результате получали длинные поли-олигомеры, у которых протяженные тракты лигированных элонгаторов перемежались терминаторами. Цитированную ДНК обрабатывали рестриктазами BglII и Есо255, в результате чего получались фрагменты, на концах которых оставались обрезанные участки терминаторов, а между ними некоторое число лигированных элонгаторов. Такие фрагменты лигировали с вектором pSBSE, линеаризованным рестриктазами ВатШ и Ес1\Ъ(>\\. Полученная плазмида кодировала химерный белок Sup35, у которого N-домен был заменен на polyQX последовательность. pSBSE -многокопийная плазмида, полученная из плазмиды pEMBLyex4-SUP35 (Ter-Avanesyan et al., 1993), заменой фрагмента ДНК, кодирующего первые 124 аминокислоты Sup35, на полилинкер, содержащий сайты для клонирования Sma\, ВатШ, Ecl\3611, Ehel. Промотор SUP35 был сохранен.

С помощью вышеописанной стратегии были получены плазмиды, кодирующие белки polyQY, -Q [Alexandrov et al., 2008], a также polyQL, -QA, -QW и -QV. Вторая использованная стратегия отличалась от первой тем, что были использованы измененные терминаторные олигонуклеотиды, которые не могли продолжать расти с одного конца, и образуемый ими конец был готов для лигирования в линеаризованный вектор (Рис. 8Б). Модифицированный вектор для этой стратегии был изготовлен следующим образом: Комплементарные олигонуклеотиды Bx2B-D: ATTACTTTGGATCCAGTCAAATGG и Bx2B-R: CGCCATTTGACTGGATCCAAAGTAAT были отожжены и вставлены в плазмиду pSBSE [Alexandrov et al., 2008], обработанную рестриктазами Smal и Nar\. В результате была получена плазмида рВх2В, содержащая два близкорасположенных сайта BstX\ для клонирования вставок, кодирующих polyQX.

Получение кодирующей вставки происходило следующим образом: смешивали олигонуклеотиды Term2-D и Term2-R в соотношении 1:1, QXI0-D и QXI0-R в соотношении 1:1 и QX10D+ и QX10-R в соотношении 1:1. Попарные смеси далее были подвергнуты отжигу и фоефорилированию. После этого они были смешаны в соотношении 1:20:1 (Тегш2-0/Тегш2-К^Х10-0/дХ10-Я:дХ-100+/дХ-10К) и данная смесь была подвергнута лигированию. Таким образом, были созданы вставки, кодирующие ро1у(}Х, которые имели уникальные липкие концы. Эти ставки были клонированы в Вь^Х I сайты вектора Вх2В. Данная стратегия оказалась более эффективной, поэтому большая часть конструкций была получена именно этим способом.

Таблица 3. Плазмиды, использованные в работе

Плазмида Сокращенное название, свойства Вставочная 1 а.к. Происхождение pSBSE мультикопийная плазмида, содержит промотор 5иР35 и ген иЯАЗ Плазмида является векюром для продукии ро1уОХ белкой, сосюящих из ро1уОХ домена и МС доменов Бир35 [Alexandrov et al., 2008] рВХ2В мультикопийная плазмида, содержит промотор БиРЗЗ и ген С'/МЗ Плазмида является вектором для продукии ро1уОХ белков, состоящих т ро1уОХ домена и МС доменов 5ир35 Данная работа pSBSE-50Q зоо - [Alexandrov et al., 2008] pSBSE-70Q 700 - [Alexandrov et al., 2008] pSBSE-85Q - [Alexandrov et al., 2008] pSBSE-131Q 1310 - [Alexandrov et al., 2008] pSBSE-56QY 560У Тирозин [Alexandrov et al, 2008] pSBSE-76QY 760У Тирозин [Alexandrov et al , 2008] pSBSE-120QY 1200У Тирозин [Alexandrov et al, 2008] pSBSE-71QA 71ЦА Алании Данная работа pSBSE-91QA 91<ЗА Алании Данная работа pSBSE-110QA ПООА Алании Данная работа pSBSE-96QW 96QW Триптофан Данная работа pSBSE-91QV 910У В алии Данная работа pSBSE-8IQS 810Й Серии Данная работа pSBSE-121QL 1210Ь Лейцин Данная работа pBX2B-8IQF 810И Фенилалани н Данная работа pBX2B-91QH 91011 Гистидин Данная работа pBX2B-l 01QT 101 ОТ Треонин Данная работа pBX2B-81QC H1QC Цисте и н Данная работа

PBX2B-1Ü1QM 101QM Мегионин Данная работа pBX2B-101QN 101QN Аспарагин Данная работа рВХ2В-81QI 81QI Изолейцин Даннаяработа pBX2B-8lQP 8IQP Пролин Данная работа pBX2B-81QR 8IQR Аргинин Данная работа pBX2B-91QE 91QE Глутаминова я кислота Данная работа pBX2B-141QG 141QG Глицин Данная работа pBX2B-101QG 1Ü1QG Глицин Данная работа

YEplac 181-85Q-M-GFP 85Q-GFP, мультиконийная плазмида, содержит аромогор SUP35 и ген LEU2. Отличается о г 85Q заменой С-домена Sup35 на GFP Данная работа pRS3I5 Центромерная плазмида, содержащий ген LEU2 - [Sikorski, Hieter, 1989] pRS315-Sup35C Центромерная плазмида, промотор SUP35, кодирует С-домен белка Sup35. Содержит ген LEU2 - [Shkundina et al., 2006] pRS315-Sup45 Центромерная плазмида с геном SUP45,. Содержит ген LEU2 - [Valouev et ai., 2004] pRS313-Sup35C Аналогична pRS315-SUP35C, но содержит ген HIS3. - [Shkundina et al„ 2006] pRS315-Sup35Rl-6.5 Центромерная плазмида, промотор SUP35, кодирует делеционный мутант белка Sup35 с 6.5 олигопептидными повторами. Содержит ген LEU2 [Parham, Resende, Tuite, 2001] pRS3l5-Sup35Rl-5 Аналогична pRS315-SUP35R1 -6.5, но содержит 5 олигопептидных повторов - [Parham, Resende, Tuite, 2001] pRS3I5-Sup35Rl-3 Аналогична pRS315-SUP35R1-6.5, но содержит 3 олигопептидных повтора - [Parham, Resendc, Tuite, 2001] pI03Q-GFP Мультикопийная плазмида (вектор pYES2), промотр GAL1, кодирует гентингтин, содержащий 103 остатка глу гамина. Содержит ген UJiA3 [Meriin et al,, 2002] p25Q-GFP Аналогична pl03Q-GFP, но гентингтин содержит 25 остатков глутамина. - [Meriin et al., 2002]

Свойства плазмид, кодирующих pulyQX белки совпадают со свойствами векторов, на основе которых они сконструированы (pSBSE и рВХ2В).

Таблица 4. Олигонуклеотиды, использованные в работе

Название Последовательность

Term ! -D 5'-AGTACTG ATCAGCATGTCTGGCC-3 '

Term 1 -R 5'-ATGACTAGTCGTACAGACCGGTC-3'

Term2-D 5'-AGATCTTATAATGTCGGATC-3'

Term2-R 5 '-CTG ATCCG ACATTATAAG ATCTAGTA-3 '

QX10-D 5 '-AGCAACAA(YYY)|CAACAACAGCAA(YYY)2CAAC-3 •

QX10-D+ 5'-AGCAACAA(YYY),CAACAACAGCAA(YYY)2CAACAGTCAA-3'

QX10-R 5'-CTGTTG(ZZZ):TTGCTGTrGTTG(ZZZ)2TTGTTG-3'

В олигонуклеотидах QX10-D, QX1Ü-D+ и QX10-R кодоны YYYi и YYY2 имели следующие значения: для белка polyQC - TGT, TGC; QM - ATG, ATG; QF - TTT, TTC; QP - CCT, CCA; QS - AGT, AGC; QT - ACT, ACC; QW - TGG, TGG; QV - GTT, GTC; QA - GCI", GCC; QH - CAT, CAC; QN - A AT, AAC; Q1 - ATT, АТС; QG - GGT, GGC; QL - ТТЛ, TTG; QR - CGT, CGC; QE - GAA, GAG. Триплеты ZZZ, и ZZZ2 комплементарны кодонам YYY2 и YYY|.

Bx2B-D 5'-ATTACTTTGGATCCAGTCAAATGG-3'

Bx2B-R 5'-CGCCATTTGACTGGATCCAAAGTAAT-3'

SU35D1 5 '-C ACTCGACCA A AGCTCCCA-3 '

SU35R1 5'-CCTTCTTGGTAGC ATTGC-3 ' полипептиды подходящей длины, определяли секвеиированием (праймер SU35D1). Кроме того, секвенирование показало, что в некоторых конструкциях полиглутаминовая последовательность оканчивалась как . ,Q-PQGA-(Sup35MC), вместо .QQ-SQGA-(Sup35MC). Такие конструкции также использовали, поскольку это отличие не сказывалось на способности белков к полимеризации и на свойствах полимеров, что было показано в данной работе и в работе И. Александрова с соавторами [Alexandrov et al,, 2008]. Сопоставление первичных структур белков Sup35 и polyQ(X)-Sup35MC приведено на Рис. 9.

Sup35 MSD - (Q/N-богатый домен) - SQG - М . polyQ(X)s MSG- polyQ(X) -SQG-А. ► polyQ(X)p MSG - polyQ(X) - PQG - A .

VA.J

N-домен M и С-домены

Рисунок 9. Сопоставление первичных структур Sup35 и химерных полиглутаминовых белков.

Плазмида, кодирующая 85Q-GFP была сконструирована из плазмиды 85Q-MC путем рекомбинации in vivo . Данный метод основан на высокой эффективности процесса гомологичной рекомбинации у 5. cerevisiae, что позволяет при трансформации клеток дрожжей смесью линеаризованного вектора и вставки, фланги которой гомологичны концам вектора с высокой вероятностью получать гибридный продукт. Плазмида YEplac 181-NMS35-GFP [Salnikova et al., 2005], кодирующая химерный белок Sup35, у которого С-домен был заменен на GFP, была обработана ферментами М1и\ и Mls\, и смешана с плазмидой pSBSE-Q85MC, обработанной ферментами PvuW и Kspl Данная смесь была использована для трансформации дрожжей, из которых потом была выделена плазмидная ДНК. Эту ДНК амплифицировали в клетках Е. coli, выделяли и подтверждали правильность замены секвенированием.

3. Приготовление дрожжевых лизатов

Культуры дрожжей выращивали до А = 1,5 (Х=600 нм). Далее клетки осаждали, промывали водой и лизировали с помощью стеклянных бус в приборе Bullet Blender (Next Advance). Состав буфера для разрушения клеток - 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 шМ NaCl, 1 тМ дитиотреитол. Для ингибирования протеаз в состав буфера также были включены 10 mM PMSF и коктейль ингибиторов протеаз (Complete™ protease inhibitor mixture, Roche Applied Science) в рекомендованной концентрации. Осветление лизата проводилось путем центрифугирования при 1500g в течение 4 минут. Перед, нанесением лизатов на гель пробы выравнивали по количеству общего клеточного белка с помощью модифицированного биурегового метода (описан ниже) [Herbert D, Phipps PJ, 1971] и последующего разведения.

Для измерения количества общего белка в пробах аликвоты лизатов разводили в дистиллированной воде (до объема 700 мкл), затем добавляли 350 мкл ЗМ NaOH и инкубировали при 100°С 5 мин. После этого пробы охлаждали до комнатной температуры. Далее добавляли 350 мкл водного раствора CuS04 (2.5%, безводного). Смесь инкубировали 5 минут при комнатной температуре, после чего подвергали центрифугированию при 11 000 g. Далее определяли поглощение супернатанта при X = 555 нм. В качестве контроля использовали пробу без клеточного лизата (700 мкл Н2О без добавления клеточного лизата).

4. Фракционирование лизатов с помощью ультрацентрифугирования

Для разделения мономерных и агрегатных фракций Sup35 и Sup45 500 мкл клеточных лизатов фракционировали при помощи ультрацентрифугирования при 100,000 g (48,000 оборотов в минуту в роторе TÍ75, центрифуга Beckman Optima TL) в течение 1 часа при 4°С.

5. Электрофорез и блоттинг

Олигомеры белков polyQY, -QW и -QF анализировали с помощью электрофореза в круппопористом полиакриламидном геле (5% акриламида, 0.06% бисакриламида). При этом пробы не кипятили перед нанесением на гель. SDD-AGE (semi-denaturating detergent agarose gel electrophoresis - агарозный электрофорез в полуденатурирующих условиях) проводили по стандартной процедуре [Kryndushkin et al., 2003] с модификациями [Halfmann, Lindquist, 2008]. Мы использовали горизонтальные гели 2% агарозы (Melford High-Strength), приготовленные на трис-ацетатном буфере с ЭДТА (40 мМ Трис, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА), содержавшем 0.1% SDS. Лизаты смешивали с буфером для нанесения SDD-AGE (0.5* трис-ацетаг/ЭДТА, 2% SDS, 5% глицерин, 0.05% бромфеноловый синий, 0.04% бетамеркаптоэтанол) и наносили на гель без предварительного кипячения. После электрофореза, белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью капиллярного переноса под вакуумом на установке Vacugene XL (Pharmacia) в течении 5 часов, используя в качестве буфера для переноса TBS (25 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 2 мМ KCl, pH 7.4). Блоты окрашивали по стандартной методике с помощью первичных кроличьих антител (AT) против Sup35NM, Sup35C и GFP (Santa-Cruz) и вторичных антител против кроличьих антигенов, коньюгированных с пероксидазой хрена (Thermo Scientific). Связанные антитела детектировали с помощью люминесцентного субстрата SuperSignal West Dura (Thermo Scientific). Важно отметить, что в некипяченных пробах, содержащих SDS, происходит ускоренная деградация мономерных белков, и поэтому на блотах SDD-AGE электрофорезов часто не видны пятна, соответствующие мономерному Sup35.

Дот-блот анализ проводился по стандартной методике с помощью прибора для вакуумного дот-блоггинга (Bioracl). Разведенные в 10 раз лизаты клеток, а также соответствующие дополнительные разведения (5 мкл) наносились на увлажненную нитроцеллюлозную мембрану, после чего лунки прибора 3 раза промывались буфером TBS (100 мкл). Дальнейшая обработка мембран с белком описана в предыдущем параграфе.

6. Анализ термостабильности полимеров в присутствии SDS

Клеточные лизаты смешивали с буфером для нанесения SDD-AGE (общий объем 25 мкл), помещали в пробирки для ПЦР и накрывали двумя каплями вазелинового масла. Далее образцы помещали в многоканальный ДНК амплификатор Терцик (ДНК-Технологии) и инкубировали при требуемой температуре в течение 8 минут, после чего охлаждали до 10°С. Остывшие образцы анализировали с помощью SDD-AGE и последующего иммуноблоттинга (Пример изображения представлен в Приложении 2). Получившиеся в результате изображения денситометрировали с помощью программного пакета ImageJ.

7. Определение эффективности сквозного прочтения нонсенс-кодонов

Измерение активности ß-галактозидазы в клетках дрожжей, выращенных в жидкой среде, проводили в соответствии с опубликованной методикой [Stansfield et al., 1995] с некоторыми модификациями. Для определения эффективности сквозного прочтения нонсенс-кодонов использовали плазмиды pUKC815 и pUKC817. pUKC815 несет химерный ген PGKl-lucZ, в то время как pUKC8I7 имеет встроенный в рамке в месте стыка генов PGK1 и lacZ стоп-кодон UAA. Таким образом, об интенсивности сквозного прочтения этих стоп-кодонов можно было судить по активности ß-галактозидазы, измеряемой в лизатах клеток. Уровень нонсенс-супрессии определи как отношение (%) активности р-галактозидазы в клетках трансформантов, несущих р1ЖС817, к активности Р-галактозидазы в клетках, имеющих плазмиду р1ЖС815. Клетки дрожжей выращивали до экспоненциальной фазы роста (А = 1,5 (^=600 им)) в объеме 2 мл, собирали центрифугированием, промывали в буфере Ъ (16.1 г/л №оНР04 х 71-ЬО; 5.5 г/л ШНгР04 х ЬЬО; 0.75 г/л КС1 (безводный), 0.246 г/л х 7Н20, рН = 7,0), и ресуспендировали в

100 мкл буфера Ъ. Далее клетки подвергали двум циклам замораживания/оттаивания, используя при этом жидкий азот и водяную баню на 30°С. После этого суспензию смешивали с 0,7 мл буфера Ъ с 40 мМ р-меркаптоэтанола. Затем добавляли 200 мкл (ЖРС (4 мг/мл в буфере Ъ) и выдерживали их па 30°С при постоянном помешивании до появления характерного желтого оттенка (для разных трансформантов и условий роста от 20 мин до нескольких часов). После этого реакцию останавливали добавлением 400 мкл 1 М Ыа2СОз. Суспензию осаждали центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 10 минут. Далее с помощью спектрофотометра определяли оптическую плотность (/^=420 нм) супернатанта, после чего р-галактозидазную активность рассчитывали по формуле (А = ЮОО*ОО.ш/и*У*Р)), где I (мин) - время инкубации с СЖРй, V (мл)- объем дрожжевой культуры, взятой в реакцию, а Р - количество белка в пробе (мг/мл). Для каждого измерения в работе брали три независимые дрожжевые колонии, причем измерения проводили независимо 2 раза для каждой колонии. Окончательное значение получали усреднением 3 результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Изучение механизма токсичности полиглутаминовых белков для клеток дрожжей

Известно, чю сверхпродукция белка 103Q-GFP (схематически изображен на Рис. 5) токсична для клеток дрожжей. Эта токсичность проявляется в виде существенного замедления роста клеток при индукции синтеза 103Q-GFP. Вариант этого белка с более коротким полиглутаминовым грактом (25Q-GFP) не вызывает замедления роста клеток и не агрегирует [Meriin et al., 2002]. Поскольку в работах, моделирующих болезнь Гентингтона у дрожжей, замедление роста клеток принято обозначать термином "токсичность", мы будем придерживаться этой терминологии. По опубликованным данным, в отсутствие приона [PJlf] белок 103Q-GFP не токсичен и не образует в клетках микроскопически выявляемых флуоресцирующих высокомолекулярных агрегатов.

Однако, согласно данным, полученным в нашей лаборатории, даже белки с полиглутаминовыми трактами более короткими, чем у 103Q-GFP могут образовывать в клетках дрожжей полимеры, выявляемые с помощью SDD-AGE, в отсутствие приона [PIN*] [Alexandrov et al., 2008]. Это указывало на то, что в отсутствие [PIN*] такие полимеры может образовывать и 103Q-GFP, несмотря на отсутствие агрегатов, детекшруемых с помощью флуоресцентной микроскопии.

1.1 Влияние прионного состояния Rnql на полимеризацию 103Q-GFP

Чтобы изучить зависимость полимеризации 103Q-GFP от приона [PIN*], конструкции, кодирующие кот и контрольный, не токсичный и не склонный к агрегации, белок 25Q-GFP были продуцированы в клетках двух вариантов штамма дрожжей 74D-694, с приопным фенотипом [PIN*] и [pin].

Полученные трансформанты были выращены на среде с глюкозой и перенесены на среду, содержащую в качестве единственного источника углерода галактозу, что индуцировало синтез белков 103Q-GFP и 25Q-GFP. Лизаты клеток, выращенных таким образом, анализировали с помощью SDD-AGE [Kryndushkin et al., 2003]. SDS-устойчивые полимеры 103Q-GFP наблюдали как в клетках [PIN*], так и в клетках [pin], хотя общее количество полимеров в клетках [pin] было в 3 раза меньше, чем в клетках [PIN*] (Рис. 10). Способность белков 103Q-GFP и 25Q-GFP к агрегации также была изучена с помощью флуоресцентной микроскопии. В соответствии с опубликованными ранее результатами [Meriin et al., 2002], белок 103Q-GFP образовывал видимые агрегаты в [PIN*] клетках и не образовывал таковых в клетках [pin]. 25Q-GFP не образовывал видимых агрегатов ни в [PIN*], ни в [pin] клетках (данные не представлены).

Р/ЛГ] \рт-) [Р/№) \pitr]

9ч 9ч

Рисунок 10 Полимеризация 103Q-GFP в клетках [PIN*] и fpin'J. (Л) Динамика возникновения полимеров I03Q-GFP. Клетки 74-D694 [psi][PIN'] или [psi][pin], содержащие мультикопийную плазмиду pi 03Q-GFP были выращены в жидкой среде (см. Материалы и методы) и проинкубированы в среде с раффинозой (Раф) и галактозой (Гал) в качестве единственных источников углерода в течение указанного времени. (Б) Сравнение количества полимеров IU3Q-GFP в клетках [pin] и [PIN*] Лизаты получали из клеток инкубированных 9 часов в среде с галактозой. Образцы разводили в указанной пропорции. Полимеры 103Q-GFP визуализировали с помощью SDD-AGE. Окраска - AT GFP.

1.2 Полимеризация белков Sup35 и Rnql в присутствии 103Q-GFP

Ранее было показано, что в клетках [PIN*] полимеры 103Q-GFP вызывают полимеризацию белка Sup35, кодируемого хромосомным геном SUP35 [Urakov et al., 2010]. Этот белок является жизненно-важным, поэтому можно было предположить, что его полимеризация и, следовательно, частичная инактивация, может приводить к ингибированию роста клеток. Поскольку в данной работе мы показали, что 103Q-GFP может образовывать полимеры и в клетках [pin], было решено проверить, могут ли его полимеры вызывать полимеризацию хромосомно-кодируемых белков Sup35 и Rnql в таких клетках. Оказалось, что оба эти белка образуют SDS-устойчивые полимеры в присутствии полимеров 103Q-GFP (Рис. 12, 13). При этом количество полимерного Sup35 в клетках [PIN*] было примерно в 3 раза больше, чем в [pin] (Рис. 12А), а количество мономерного Sup35 в штамме [PIN*] было примерно в 3 раза выше, чем в штамме [pin] (Рис. 12Б).

Полимеризация 103Q-GFP и Sup35 сопровождалось заметным увеличением сквозного прочтения кодона UAA (Рис. 14), что свидетельствует о снижении эффективности терминации трансляции, ожидаемого при снижении количества растворимого Sup35 из-за его перехода неактивную полимерную форму.

Примечательно, что в клетках [PIN*] продукция 103Q-GFP влияла на количество полимеров Rnql (Рис. 13). Причины этого неясны, однако можно предположить, что взаимодействуя с полимерами Rnql, полиглутаминовый белок мешает нормальной полимеризации Rnql. Кроме того, избыток полимеров полиглутаминовых белков может титровать на себя шапероны и тем самым влиять на размер полимеров Rnql.

1.3 Роль белков Sup35 и Sup45 в токсичности 103Q-GFP

Поскольку Sup35 является жизненно-важным белком, снижение количества его функциональной формы может ухудшать жизнеспособность клеток. Поэтому мы изучили роль этого белка в токсичности белка 103Q-GFP. Для этого сравнили ингибирование роста клеток при индукции синтеза 103Q-GFP и 25Q-GFP в штаммах дрожжей [PIIST] и [pin'], которые содержали ген SUP35 дикого типа, или же укороченный вариант SUP35C. Белковый продукт гена SUP35C (Sup35C) лишен N- и М-доменов, что не позволяет ему полимеризоваться. Продукция белка Sup35C снимала токсичность 103Q-GFP для клеток [pin] и существенно ослабляла ее для [PIht] (Рис. 15). Жизнеспособность клеток, продуцирующих неполимеризующимся 25Q-GFP, не зависела от Sup35C (Рис. 16). Эти результаты позволяют сделать вывод, что снижение количества функционального Sup35 вносит существенный вклад в токсичность полиглутаминовых полимеров. Поскольку токсичность снижается в результате замены белка Sup35 дикого типа белком Sup35C, можно было предположить, что наличие NM-области Sup35 влияет на количество полимеров 103Q-GFP или Rnql. Однако количество полимеров обоих белков и размеры этих полимеров не зависели от продукции Sup35 дикого типа и Sup35C (Рис. 17). Важно отметить, что продукция белка Sup35C не полностью восстанавливала жизнеспособность клеток, содержащих полимеры 103Q-GFP и прион [PIN*]. Это, по всей видимости, означает, что, помимо инактивации Sup35, существуют и другие факторы токсичности. этих двух аминокислот, очень сходных по своим амилоидогенным свойствам, прионные домены белков дрожжей также содержат остатки других аминокислот. Исходя из этого, можно предположить, что именно эти дополнительные аминокислоты каким-то образом определяют основные отличия прионов от ненаследуемых амилоидных полимеров полиглутаминовых белков. Поскольку в клетках дрожжей амилоидные полимеры фрагментируются шаперонами, было предположено, что прионные полимеры узнаются за счет экспонированных гидрофобных аминокислотных остатков, которые характерны для неправильно свернутых белков. В работе И. Александрова с соавторами [Alexandrov et al., 2008] было показано, что добавление остатков тирозина в полиглутаминовый домен модельного белка приводит к улучшению фрагментации его полимеров. Это отчасти подтверждало гипотезу о роли гидрофобных аминокислот во фрагментации амилоидных полимеров, поэтому было решено провести систематический анализ влияния остатков различных аминокислот на возникновение и фрагментацию полимеров; образованных белками с полиглутаминовыми доменами.

Поскольку эффективность фрагментации амилоидных полимеров зависит от варианта их укладки, а изменение аминокислотного состава, скорее всего, может изменять эту укладку, то изучать роль тех или иных аминокислотных остатков удобнее при помощи белков, которые неспособны образовывать стабильные варианты укладки. В связи с этим, полиглутаминовые белки, которые, по всей видимости, не образуют стабильных структурных вариантов, являются удобной моделью для изучения эффекта различных аминокислотных остатков на возникновение и фрагментацию амилоидных полимеров. Кроме того, в отличие от прионогенных белков дрожжей, полиглутаминовые белки с высокой частотой переходят в амилоидное состояние. Например, прион [PSF] возникает с вероятностью -5x10"7 в присутствии приона [PINпри нормальном уровне экспрессии белка Sup35 [Lancaster et al., 2010], тогда как химерный белок на основе Sup35, у которого прионный домен заменен полиглутаминовым трактом, в сходных условиях образует полимеры практически в каждой клетке (результаты данной работы и [А1ехапёгоу е1 а1., 2008]).

2.1 Генетические конструкции, кодирующие белки ро1у(ЗХ

Для решения поставленных задач с помощью оригинального метода конструирования были получены плазмиды, кодирующие белок Бир35, у которого прионный домен был заменен полиглутаминовым доменом со вставками всех других кодируемых аминокислотных остатков, кроме лизина и аспарагиновой кислоты, поскольку в анализ были включены белки со вставками аргинина и глутаминовой кислоты, обладающие сходными свойствами. Полиглутаминовые домены состояли из тандемных повторов (^СЖ^ХС), где X -любая аминокислота. Далее эти белки будут называться пС)Х, где п - длина полиглутаминового тракта. Например, 760У - это белок, который содержит полиглутаминовый тракт со вставками тирозина, состоящий из 76 аминокислотных остатков. Если же речь будет идти обо всех белках такого типа, они будут называться ро1уС)Х белками. Для обозначения вставочных аминокислотных остатков использован однобуквенный код. Во всех случаях, если не указано иное, белки ро1у(}Х состояли из соответствующего ро1уС)Х домена, и М- и С-доменов 5ир35.

2.2 Влияние вставок аминокислотных остатков на возникновение амилоидных полимеров

Полученные плазмиды были введены в клетки дрожжей 5. сеге\>тае штамма 74-Э694, содержавшие прионный детерминант который способствовал эффективной Количество химерного белка было примерно в 3 раза выше нормального количества Бир35 дикого типа, однако эта разницы, скорее всего, не должна приводить к столь значительным отличиям в вероятности возникновении амилоидного состояния.

Таким образом, можно сделать вывод, что вставка большинства аминокислотных остатков не мешает полимеризации белков с полиглутаминовыми доменами. В присутствии полимеров Rnql полимеризации мешали вставки заряженных остатков аргинина и глутаминовой кислоты, остатки пролина и лейцина, а также, в меньшей степени, глицина. Механизм ингибирования полимеризации, судя по всему, различался, поскольку белок со вставками глицина все же мог образовывать полимеры, хотя и в сниженном количестве, а белки со вставками лейцина, аргинина и глутаминовой кислоты, в отличие от белка со вставками пролина, могли полимеризовагься в присутствии полимеров белка 85Q-GFP.

В отсутствие полимеров Rnql наблюдалась задержка в образовании полимеров с гомогенным полиглутаминовым доменом, а также белков со вставками аспарагина и гистидина. Белки со вставками аланина и глицина не полимеризовались в отсутствие полимеров Rnql, что указывает на их сниженную способность к полимеризации.

2.3 Влияние вставок аминокислотных остатков на размер амилоидных полимеров

Далее мы изучили влияние вставок различных аминокислотных остатков в полиглутаминовые домены polyQX белков па эффективность фрагментации их полимеров. Эффективность фрагментации оценивалась по размеру полимеров, который определяли с помощью SDD-AGE. В соответствии с количественной моделью образования прионных полимеров, размер полимеров обратно пропорционален частоте фрагментации, и, более того, зависит исключительно от частоты их фрагментации [Alexandrov et al., 2008; Tanaka et al., 2006] (см. Приложение 1).

Поскольку использованная в данной работе стратегия получения генетических конструкций не гарантировала получение полиглутаминовых доменов одинаковой длины, мы проверили, насколько сильно частота фрагментации амилоидных полимеров зависит от длины полиглутаминового домена (Рис. 23). Оказалось, что по мере увеличения длины полиглутаминового домена размер полимеров соответствующих белков уменьшается, хотя и не значительно. Эту тенденцию наблюдали для белков со вставками разных аминокислотных остатков. В связи с этим, из-за трудоемкости получения плазмид, кодирующих полиглутаминовые домены одинаковой длины, для дальнейшего анализа были использованы белки, у которых ро1уОХ домен содержал от 76 до 101 аминокислотных остатков, поскольку в этом диапазоне влияние длины домена на размер полимеров было несущественным.

Рисунок 23. Увеличение длины полиглутаминового домена приводит к уменьшению размера полимеров. Лизаты клеток 74-Об94/А535 [РШ ], продуцирующих белки ро1у(^)Х различной длины анализировали с помощью ЯОИ-АСЕ. Окраска - АТк Sup35NM.

Белки, имеющие в своем составе полиглутаминовые домены со вставками остатков тирозина, триптофана и фенилаланина образовывали самые мелкие полимеры (Рис. 20). Полимеры среднего размеры образовывали белки со вставками аланина, метионина, цистеина, серина, треонина и гистидина, а самые крупные полимеры, близкие по размеру к полимерам чистого полиглутамина, были образованы белками со вставками аспарагина, валина, изолейцина и глицина.

Таким образом, самые мелкие полимеры образовывали белки со вставками остатков ароматических гидрофобных аминокислот. Отсутствие заметного влияния аспарагина на размер полимеров было ожидаемо, поскольку этот остаток очень похож по своим свойствам на глутамин. Глицин, который не имеет бокового радикала, также, вероятно, не может служить сигналом для распознавания шаперонами. Однако оказалось неожиданным, что сильно гидрофобные остатки валина и изолейцина не влияли на фрагментацию. Таким образом, все изученные аминокислоты можно разделить на 4 класса по их влиянию на образование полимеров и их фрагментацию. Первые три класса включают в себя остатки, которые не препятствуют образованию полимеров в присутствии полимеров Rnql, при этом остатки первого класса оказывают наиболее стимулирующий эффект на фрагментацию, остатки второго класса стимулируют фрагментацию несколько слабее, а остатки третьего класса не усиливают фрагментацию. Остатки четвертого класса препятствуют полимеризации и поэтому их эффект на фрагментацию нельзя корректно сравнить с эффектами других остатков (Таблица 5).

Таблица 5. Влияние различных аминокислотных остатков в составе ро!уС>Х доменов на образование амилоидных полимеров и их фрагментацию.

Класс I II III IV

Ос га гок У \У Р Н А Б Т С м 0 N I V в я В Ь Р

Ш] + + + + + + + + + + + + + +/- я А гпу! э + + + +/- - + + + + +* +* + + - я 85<3 [РПУ] + + +

Размер полимеров Малые Средние Большие Большие обозначает эффективную полимеризацию, (+/-) сниженное количество полимеров, (+*) полимеры возникали только после дополнительного культивирования клеток. Штимм - варианты штамма 74-0694/А335, содержагцие либо прионные полимеры Кпд! ([Р1Ы*]), либо полимеры 85Q-GFP и Япс]1 (850 [Р11\г ]). либо не содержащие этих полимеров (/\rnql).

2.4 Эффективная фрагментация полимеров 76QY, 96QW и 81QF приводит к образованию SDS-устойчивых олигомеров вплоть до днмеров.

Как правило, большой размер амилоидов, образующихся в клетках дрожжей, не позволяет им входить в иолиакриламидный гель и для их анализа в нашей лаборатории был специально разработан метод анализа в агарозном геле (SDD-AGE). Однако этот метод не позволяет получить дискретного разрешения полос полимерных форм. Эффективная фрагментация полимеров polyQY, -QW и -QF позволила нам проанализировать их электрофоретическую подвижность в полиакриламидном геле.

Анализу размера олигомеров препятствовало то, что в лизатах клеток дикого типа в присутствии SDS амилоидные полимеры подвержены протеолитической деградации (Рис. 24Б). Вероятно, это происходит вследствие того, что SDS растворяет мембраны вакуолей, содержащие протеазы, а используемые ингибиторы протеаз недостаточно эффективны для предотвращения этого эффекта. Присутствие частично деградировавших белков мешает различению олигомерных форм амилоидов в крупнопористом полиакриламидном геле, который позволяет разделять белки с молекулярной массой до 4 мДа [Eilertsen, Keller, 1992]. Мы обнаружили, что делеция гена PRBI существенно снижает деградацию белков в лизатах, обработанных SDS (Рис. 24А), и размазывание полос олигомерного 76QY в частности (Рис. 24Б). Полимеры 76QY, 96QW и 81QF разделяли в соответствии с числом мономеров, и самый малый видимый олигомер по своей подвижности соответствовал димеру (Рис. 25). Поскольку известно, что олигомерные формы амилоидогенных белков могут образовываться независимо от фибриллярных форм и не обязательно являются их предшественниками, то было важно понять, являются ли наблюдаемые олигомеры продуктами фрагментации фибрилл, или же они возникают de novo. Если наличие олигомеров связано с эффективной фрагментаций, то блокирование активности Hsp 104 должно приводить к их удлинению и исчезновению. Если же олигомеры возникают de novo - то их размер не должен изменяться. Мы фрагментации. Поскольку для прионных полимеров прочность коррелирует с протяженностью области прионного домена, упакованной в амилоидне ядро, можно ожидать, что белки с более протяженными полиглутаминовыми доменами должны образовывать полимеры с более крупными и прочными амилоидными ядрами, которые должны фрагментироваться менее эффективно. Чтобы подтвердить или опровергнуть эту гипотезу, мы изучили корреляцию между размером полимеров и их физической стабильностью. Стабильность полимеров оценивали по их устойчивости к нагреванию в присутствии SDS. Это распространенный метод оценки стабильности белковых комплексов и для простоты изложения далее устойчивость полимеров к нагреванию в присутствии SDS мы будем называть термостабильностью. Для полимеров Sup35 показано, что термостабильность полимеров коррелирует с их физической прочностью [Tanaka et al., 2004, 2006]. Для изучения прочности амилоидов часто используется более прямой метод, основанный на определении механической прочности полимеров по их устойчивости к быстрому перемешиванию или ультразвуку. Однако этот метод, хорошо применимый к длинным полимерам, получаемым in vitro, неприменим к изучаемым нами полимерам ex vivo, поскольку они примерно 10-100 раз короче.

Результаты, представленные на Рис. 23 противоречат предсказанию, что удлинение полиглутаминовых доменов должно снижать эффективность фрагментации, поскольку размер полимеров снижался по мере увеличения длины полиглутаминового домена. Это уменьшение размера было небольшим, но воспроизводимым. При этом термостабильность полимеров двух polyQA белков, 71QA и 110QA, была сходной (Рис. 26А), несмотря на то, что полимеры 110QA были меньше (Рис. 23). Таким образом, размер полимеров в данном случае коррелировал с их физической прочностью. В друг ом случае, несмотря на то, что термостабильность полимеров 120QY была несколько выше стабильности 76QY (Рис. 26Б), размеры их полимеров были одинаковы (Рис. 23).

8ир35Ш-5 и 8ир35Я1-3 приводила к существенному увеличению термостабильности полимеров (Рис. 28Б), в то время как увеличение размера полимеров наблюдали только при передаче клеткам, продуцирующим белок 8ир35Ш-3 (Рис. 28А).

ЭирЗб

М-6.5 Р1-5 Ш-З

Полноразмерный белок

Д 102-112

Д94-112

Д75-112

Рисунок 27. Схематическое изображение прионного домена Бир35 и его делеционных вариантов. Обозначения белков приведены слева, удаленные остатки прионного домена указаны справа (схема составлена по [РагЬаш, 11е8епс1е, Тике, 2001р.

Кроме того, полимеры сильного варианта [РХ/4"] (8ир35 дикого типа) лишь незначительно отличались по размеру от полимеров слабого варианта [Р^/], состоявших из того же белка. При этом термостабильность этих полимеров различалась существенно. Поскольку полимеры 8ир35 слабого варианта [Р51/], состоящие из 8ир35 111-6.5, не отличались по термостабильности от полимеров полноразмерного белка того же варианта и при этом по размеру совпадали с полимерами сильного [Р5/"] (8ир35 дикого типа), можно заключить, что в данном случае термостабильность также не коррелирует с размером полимеров (Рис. 28В).

Таким образом, нам удалось показать, что во многих случаях термостабильность амилоидных полимеров не коррелирует с эффективностью их фрагментации. Это указывает на то, что прочность амилоидных фибрилл не определяет эффективность их фрагментации.

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности структуры полимеров polyQX белков

Одна из основных целей работы заключалась в установлении зависимости эффективности фрагментации амилоидных полимеров от аминокислотного состава амилоидогенных доменов образующих их белков. В качестве модели мы использовали белки с протяженными полиглутаминовыми трактами, поскольку в клетках дрожжей такие белки образуют амилоиды, которые фрагментируются неэффективно. Вставка остатков различных аминокислот в полиглутаминовый тракт позволяла наблюдать их влияние на возникновение и фрагментацию амилоидов. Домены polyQX состояли из повторов QQQXQ, где X - это любая аминокислота. Подход базировался на гипотезе о том, что фрагментация амилоидов осуществляется шаперонами, которые распознают их, как агрегаты аномально свернутых белков. Мы также предположили, что шапероны выявляют такие агрегаты rio экспонированию остатков гидрофобных аминокислот, которые при нормальной укладке обычно находятся внутри белка. Стратегия, основанная на добавлении различных аминокислотных остатков в полиглутаминовый домен, была использована в нашей лаборатории ранее [Alexandrov et al., 2008]. Данная экспериментальная модель имеет ряд преимуществ, главное из которых заключается в том, что использование полиглутаминовых белков позволяет, в отличие от прионных белков дрожжей, исключить влияние структурной вариации полимера на эффективность фрагментации. Действительно, известно, что прионные полимеры, например, полимеры белка Sup35, могут существовать в виде разнообразных структурных вариантов, заметно различающихся по эффективности их фрагментации in vivo [Kryndushkin et al., 2003], что проявляется в вариации прионных фенотипов. Однако мы не обнаружили вариации в размере полимеров и, следовательно, в эффективности фрагментации для какого-либо из polyQX белков. Неспособность белков polyQX образовывать различные варианты амилоидов можно объяснить следующим образом. Существование вариантов прионных полимеров обеспечивается тем, что пространственное взаиморасположение и укладка мономеров воспроизводятся с высокой точностью при присоединении каждого следующего мономера к фибрилле. Это связано, в частности, с тем, что полипептидные цепи мономеров в амилоидной структуре расположены в регистре - одноименные аминокислотные остатки соседних полипептидов расположены напротив друг друга. Белки с полиглутаминовым доменами, находясь в составе полимера, могут взаимодействовать друг с другом со смещением, то есть вне регистра, поскольку их последовательность гомогенна е1 а1., 2012]. С этим предположением согласуются различия профилей термостабильности полимеров белков ро1уС>А и -<ЗУ и прионных полимеров (Рис. 26, 28). Для полимеров белков ро1уС>А и характерен более плавный распад до мономерного состояния, чем для полимеров прионного белка Бир35. Мы предполагаем, что разница в динамике распада этих двух типов полимеров вызвана тем, что все прионные полимеры в препарате имеют одинаковую укладку, соответствующую тому или иному варианту [.РХ/4], в то время как амилоидные полимеры ро1у(^А и гетерогенны по структуре. Основываясь на этих соображениях, мы предлагаем модель строения полимеров полиглутаминовых белков, согласно которой амилоиды белков ро!у(3 и ро1у<ЗХ имеют ступенчатую структуру: полипептидные цепи в составе полимера сдвинуты друг относительно друга, и длина межмолекулярного контакта между мономерами является непостоянной (Рис. 30). В такой структуре при полимеризации укладка полиглутаминовых доменов может копироваться неточно, что должно препятствовать стабильному поддержанию различных структурных вариантов.

Структура с регистром Ступенчатая структура (полимер Бир35) (полиглутаминовыи амилоид)

111|1Н1111111||||11111111Н111111||

МПНННШШММШИШМНММ

ЗирЗбЫ БирЗбМС

Или ро1уОХ

Рисунок 30. Схематическое изображение структуры прионных полимеров и амилоидных полимеров белков ро1у()Х. В прионных полимерах прионный домен каждого мономера взаимодействует в регистре с предыдущим и поэтому точно копирует его конфирмацию. В полимерах полиглутаминовых амилоидов регистра нет из-за гомогенности амилоидогенной последовательности, поэтому пептидные цепи могут быть смещены относительно друг друга, в результате чего укладка копируется неточно.

2. Влияние различных аминокислотных остатков в составе полиглутаминовой последовательности на образование амилоидных полимеров и их фрагментацию

По влиянию на образование и размер полимеров полиглутаминовых белков, и *ученные аминокислоты были разделены на 4 класса (Таблица 5). Большинство остатков (классы 1-111) не препятствовали образованию амилоидных полимеров в клетках [Р1Ы~] (содержащих прионные полимеры белка 1^1). В то же время белок 91С2А в отсутствие полимеров И.пц1 не полимеризовался, а белок 91 ОН полимеризовался неэффективно.

Остатки аргинина, глутаминовой кисло¡ы, пролина и лейцина (класс IV) препятствовали полимеризации полиглутаминовых белков даже в клетках [Р/ЛЛ]. Остатки глицина также ингибировали полимеризацию, однако их эффект был менее выражен. Следует, однако, отметить, что белки 910Я, 81 РЕ и 1210Ь все же могли полимеризоваться, но только в присутствии полимеров 850-СРР. Для 91011 и 810Е можно предполагать что их сниженная склонность к полимеризации связана с отталкиванием одноименно заряженных остатков находящихся в соседних молекулах, а в присутствии 85Q-GFP они образовывали с этим белком чередующийся кополимер, что снимало эффект отталкивания заряженных остатков. В отличие от заряженных аминокислотных остатков, природа ингибирующего эффекта лейцина остается неясной, особенно учитывая то, что вставки сходных с лейцином по свойствам остатков изолейцина и валина не препятствовали полимеризации. 81QP не образовывал SDS-устойчивых полимеров даже в присутствии полимеров Q85-GFP, что можно объяснить тем, чго остатки пролина создают в пептидной цепи характерные изгибы, несовместимые с Р-структурой.

Вставки остатков ароматических аминокислот, тирозина, триптофана и фенилаланина (класс I), приводили к наиболее эффективной фрагментации. При этом полимерная фракция таких белков состояла из олигомеров, среди которых наиболее представленными были тетра- и пентамеры, а самыми мелкими олигомерами были димеры (Рис. 25). Для сравнения, прионные частицы Sup35 обычно содержат от 10 до 50 молекул [Kryndushkin et al„ 2003]. Существование димеров, устойчивых к обработке SDS, указывает на то, что даже димеры могут поддерживать амилоидную структуру.

Остатки аланина, цистеина, метионина, серина, треонина и гистидина были отнесены к классу И, поскольку эти остатки стимулировали фрагментацию полимеров, но слабее, чем остатки ароматических аминокислот. Алании, цистеин и метионин являются умеренными гидрофобами; серии и треонин - полярные аминокислоты, а гистидин обладает слабым зарядом. Таким образом, остатки II класса различаются по своим свойствам и неясно, почему они имеют сходный эффект на частоту фрагментации.

Аминокислотные остатки, отнесенные к классу 111, не стимулировали фрагментацию. В эту группу вошли аспарагин, глицин, а также, что удивительно, изолейцин и валин, являющиеся гидрофобными аминокислотами. Таким образом, исходная гипотеза, в соответствии с которой основным свойством аминокислотных остатков, стимулирующих распознавание амилоида шаперонами, является их гидрофобность, не подтвердилась.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что наиболее эффективно фрагментацию стимулируют остатки ароматических аминокислот, в то время как остатки наиболее гидрофобных аминокислот либо не способствуют фрагментации амилоидных полимеров (валин и изолейцин), либо даже ингибируют полимеризацию (лейцин). Возможно, валин и изолейцин способствуют связыванию шаперонов, не участвующих во фрагментации полимеров, и поэтому они не оказывают стимулирующего эффекта на фрагментацию. Остальные аминокислотные остатки, умеренно стимулирующие фрагментацию полимеров, имели разнообразную природу и только половину из них можно отнести к гидрофобным.

3. Факторы, влияющие на фрагментацию амилоидных полимеров

Процесс фрагментации амилоидов состоит из двух этапов. На первом этапе Hspl04 с помощью других шаперонов узнает молекулу белка в составе полимера и связывается с ней (Рис, 31 А). На втором этапе молекула протягивается сквозь центральную пору гексамера Hsp 104, что приводит к фрагментации полимера (Рис. 31 Б).

Зависимость частоты фрагментации полимеров от эффективности распознавания Hsp 104 и/или его шапсронами-партнерами была продемонстрирована несколькими группами. Удаление участка связывания с Hspl04, расположенного в М-домене Sup35 (а.к. 129-148) заметно снижало частоту фрагментации полимеров Sup35 и ослабляло фенотип [А^Г] [Helsen, Glover, 2012]. Ослабление фрагментации, которое приводило к потере [AS/*], наблюдали при снижении активности шаперонов Sis 1 и Ssal, которые способствуют связыванию Hsp 104 с мишенью [Aron et al., 2007; Higurashi et al., 2008; Tipton, Verges, Weissman, 2008; Winkler et al., 2012]. Возможно, это означает, что ключевую роль в распознавании полимеров играют шапероны Sisl и Ssa, в то время как распознавание полимеров шапероном Нзр104 является вспомогательным. Если это предположение верно, то эффективная фрагментация, которую мы наблюдали для некоторых ро1у(^Х полимеров, скорее всего, связана с распознаванием ро1у()Х трактов шаперонами 81з1/88а.

Рисунок 31. Схематическое изображение процесса фрагментации прионных полимеров Sup35. (Л) Шапероны Sisl, Ssa (Hsp70) и Hspl04 последовательно связываются с полимером, распознавая экспонированные области полипептидной цепи (Б) Шаперон Hspl04 протягивает полипептидную цепь одного из мономеров Sup35 сквозь свою центральную пору, тем самым разделяя длинный полимер на два более коротких.

Важно отметить, что распознавание амилоидов шаперонами не требует каких-либо специфических последовательностей аминокислот. Это было показано на примере полимеров мутантного Sup35, прионные домены которого были получены путем генерации случайной последовательности из аминокислот, входящих в состав прионного домена белка дикого типа. Такие полимеры были способны к наследованию и фрагментировались [Ross et al., 2005]. Это наблюдение также подтверждает вывод о том, что распознавание прионных полимеров шаперонами может происходить в результате их взаимодействия с определенными аминокислотными остатками в составе прионогенных доменов, которые были выявлены в ходе нашей работы. Важно отметить, что А

Hsp104 Б ароматические аминокислоты, оказавшиеся наиболее эффективными стимуляторами фрагментации, были ранее выявлены в качестве сигналов для распознавания пептидных субстратов как шапероном Hsp 104, так и DnaJ - бактериальным аналогом шаперона Sis 1 -[ Rüdiger, Schneider-Mergener, Bukau, 2001; Lum, Niggemann, Glover, 2008; Helsen, Glover, 2012]. Таким образом, данные о роли ароматических аминокислот во фрагментации амилоидных полимеров хорошо объясняются ролью таких аминокислот в распознавании полимеров шаперонами.

Для осуществления фрагментации амилоида Hsp 104 после связывания с полимером должен вытянуть из него мономер (Рис. 31 Б). Эффективность этого процесса может зависеть от прочности полимера. Это связано со специфическим свойством Hsp 104, которое отсутствует у сходных с ним белков, например ClpC: Hsp 104 может перестать разворачивать молекулу белка и отделиться от своей мишени при встрече с правильно свернутым глобулярным доменом [Haslberger et al., 2008]. Амилоидное ядро полимера также является стабильной и прочной структурой, что также может увеличивать вероятность отделения Hsp 104 от субстрата. Однако, полученные в нашей работе данные указывают на то, что прочность амилоидных полимеров не определяет эффективность их фрагментации.

Еще один фактор, который может влиять на эффективность фрагментации - это способность Hsp 104 прочно связываться с полипепгидной цепью и прикладывать к ней достаточное усилие для разворачивания структуры. Известно, что Hsp 104 протягивает субстрат при участии двух остатков тирозина в каждом мономере, которые обращены во внутреннюю полость шаперонного гексамера. Замена этих остатков на аланин вызывает проскальзывание цепи субстрата, в то время как замены на ароматические остатки фенилаланина или триптофана только слегка снижали эффективность разворачивания субстрата [Lum et al., 2004; Schlieker et al., 2004]. Показано также, что [AS/] мог наследоваться, хотя и со сниженной эффективностью, в клетках, мутантных по Hsp 104, у которого один из остатков тирозина, участвующих в протягивании субстрата был заменен на другие ароматические аминокислоты (Y662F и Y662W), [Hung, Masison, 2006]. Можно предположить, что взаимодействие ароматических остатков субстрата и активного центра Hsp 104 может способствовать эффективному прохождению пептидной цепи через пору шаперонного комплекса. Показано, что ароматические остатки важны для взаимодействия Hsp 104 с субстратом: афинность модельного пептида р370 (KLFSDDVFEREYA) к Hsp 104 в большой степени зависит от наличия ароматических остатков [Lum, Niggemann, Glover, 2008; Helsen, Glover, 2012]. Таким образом, стимулирующий эффект ароматических остатков на фрагментацию амилоидных полимеров может частично объясняться более эффективным протягиванием полипептидной цепи сквозь пору Hsp 104.

Различия в эффективности фрагментации полимеров "сильных" и "слабых" [-PS7+] легко объясняется как различиями прочности соответствующих фибрилл, так и вариациями в эффективности узнавания полимеров шаперонами. У полимеров "сильных" [PS/4-] в амилоидное ядро вовлечена более короткая область прионного домена и поэтому полимер оказывается менее прочным. В то же время, у этих полимеров оказывается неупакованной более длинная область прионного домена. Можно предположить, что более длинная неупакованная область должна лучше распознаваться шаперонами и вызывать более эффективную фрагментацию, особенно если в этой области будут присутствовать аминокислотные остатки, которые способствуют распознаванию (Рис. 32). Полученные в нашей работе данные согласуются с этим предположением. Так, мы наблюдали, что удлинение трактов polyQX улучшает фрагментацию соответствующих полимеров. В предполагаемой без-регистровой ступенчатой структуре polyQX полимеров увеличение длины polyQX должно увеличивать как средний размер области упакованной в амилоидное ядро, так и размер неуложенной области. Таким образом, должны возрастать как прочность полимеров, так и эффективность их узнавания шаперонами. Поскольку мы наблюдали улучшение эффективности фрагментации, можно сделать вывод, что для эффективной фрагментации полимеров более существенна их способность распознаваться шаперонами, чем прочность. Действительно, отсутствие корреляции между физической прочностью полимеров БирЗб и их размером указывает на то, что прочность амилоидных полимеров не является основным фактором, определяющим эффективность их фрагментации.

Эффективность фрагментации

Высокая

Низкая Ядро ^^Экспонирования» облГ^ А Спрятанные сигналы Д Экспонированные сигналы

Рисунок 32. Схематическое изображение прионного домена Бир35 в составе полимеров сильных и слабых [РБГ1. Полимеры отличаются протяженностью области, участвующей в образовании амилоидного ядра, и протяженностью экспонированной области. В случае сильного варианта [РБГ], для полимеров которого характерна более эффективная фрагментация, остатки аминокислот, которые способствуют распознаванию амилоидов шаперонами, находятся в экспонированной области. Поэтому они могут стимулировать фрагментацию. Если же эти остатки спрятаны внутри амилоидного ядра фибриллы, как в случае слабого варианта, то они не будут оказывать стимулирующего эффекта на фрагментацию амилоидов.

4. Роль фрагментации в патогенезе амилоидных болезней млекопитающих

В последние годы накапливаются данные о том, что амилоидные полимеры способны распространятся между клетками и тканями [см. обзор СиьЬтап е1 а1., 2010].

Так, для болезни Паркинсона, связанной с образованием амилоидных агрегатов альфа-синуклеина, продемонстрировано постепенное распространение патологии между близлежащими областями мозга [Braak, Tredici Del, 2008], что указывает на возможность перемещения полимеров альфа-синуклсина между клетками мозга. Эффективная фрагментация амилоидных полимеров должна способствовать прогрессии амилоидных заболеваний, поскольку она увеличивает количество полимеров, а меньший размер облегчает их перемещение между клетками. Это, в частности, означает, что ослабление фрагментации полимеров могло бы стать стратегией эффективной терапии для многих амилоидозов. К настоящему времени о фрагментации амилоидных полимеров в клетках млекопитающих практически ничего не известно. Клетки млекопитающих не содержат гомологов Hsp 104 и неясно, существуют ли у млекопитающих какие-либо шапероны, способные фрагментировать амилоиды, или какие-то другие механизмы активной фрагментации. Модельные белки и их полимеры, которые в данной работе были подробно изучены в дрожжевой системе, могут быть использованы в качестве инструмента для изучения аппарата фрагментации амилоидных полимеров в клетках млекопитающих.

5. Образование макроагрегатов и SDS-устойчивых полимеров гентингтина

Изучение полимеризации полиглутаминовых белков в клетках дрожжей не только важно для выяснения механизмов возникновения и распространения амилоидов, но также позволяет моделировать заболевания, вызываемые таким амилоидами. Обычно в этих работах используют гибридные белки, состоящие из полиглутаминового домена и флуоресцентного белка, например GFP. При использовании дрожжей для моделирования молекулярных основ болезни Гентингтона часто используют гибридный белок, содержащей последовательность, кодируемую первым экзоном гена /775 и GFP. В этих работах было показано, что агрегация патологической формы гентингтина с протяженным полиглутаминовым трактом (белок 103Q-GFP) токсична для клеток дрожжей. Важно отметить, что как агрегация такого белка, так и его токсичность проявлялись только в присутствии дрожжевых прионов, таких как [PIN1] или [PSt] [Meriin et al., 2002; Gong et al., 2012; Zhao et al., 2012]. В полном соответствии с этими данными, мы также наблюдали, что 103Q-GFP очень редко образует флуоресцентно-различимые агрегаты в [pin] клетках, в то время как в [PIN*'] клетках его агрегаты присутствуют в большей части клеток. Однако следует заметить, что ранее в нашей лаборатории при использовании электрофоретического метода SDD-AGE было обнаружено, что полиглутаминовые белки способны образовывать детергент-устойчивые агрегаты и в клетках [pin] [Alexandrov et al., 2008]. В связи с этим мы использовали метод SDD-AGE, чтобы выяснить, способен ли белок 103Q-GFP полимеризоваться в отсутствие прионных полимеров Rnql и Sup35, а также всегда ли полимеризация полиглутаминовых белков сопровождается образованием микроскопически различимых агрегатов. В нашей работе мы исследовали зависимость возникновения полимеров 103Q-GFP от приона [PIN*]. Электрофоретический анализ показал, что сверхпродукция 103Q-GFP приводила к образованию SDS-устойчивых полимеров как в клетках [P/Af*], так и [pin]. Сходные результаты были ранее получены для белка, состоящего из GFP и присоединенного к нему с С-конца полиаспарагинового тракта [Peters, Huang, 2007]. В отсутствие прионных полимеров Rnql этот белок образовывал SDS-устойчивые полимеры, но не образовывал крупных, микроскопически различимых флуоресцентных агрегатов. Таким образом, широко используемый метод флуоресцентной детекции агрегатов амилоидных белков не позволяет делать выводы об отсутсвии амилоидных полимеров в клетках, поскольку эти полимеры могут не образовывать микроскопически видимых агрегатов.

6. Токсичность агрегированных форм гентингтина

Ингибирование роста клеток [pin], синтезирующих 103Q-GFP, но не содержащих микроскопически наблюдаемые агрегаты 103Q-GFP, позволяет заключить, что токсичность этого белка связана с его способность образовывать SDS-устойчивые полимеры. Возможно, такие полимеры могут соответствовать токсическим олигомерам в клетках млекопитающих, поскольку для этих клеток показано, что токсический эффект агрегации гентингтина связан в основном с растворимыми олигомерными формами гентингтина, в то время как образование крупных агрегатов снижает токсичность [Takahashi et al., 2008]. В то же время, в клетках дрожжей токсический эффект сверхпродукции 103Q-GFP проявлялся сильнее в клетках [А/ЛГ], в которых как раз наблюдалось существенное количество микроскопически выявляемых флуоресцентных агрегатов этого белка. Следует заметить, однако, что клетки [PIN*] содержат большее количество SDS-устойчивых полимеров. Таким образом, полученные данные не позволяют делать окончательные выводы о роли микроскопически видимых агрегатов в токсичности гентингтина в клетках дрожжей.

7. Механизм токсического эффекта гентингтина в клетках дрожжей

Мы показали, что токсический эффект 103Q-GFP в существенной степени связан с уменьшением количества растворимой формы белка Sup35 в результате его полимеризации. Об этом, в частности, свидетельствует то, что продукция белка Sup35, лишенного прионного домена, приводила к исчезновению токсичности 103Q-GFP для клеток [pin] и существенно снижала ее для клеток [PIN^]. Белок Sup35, скорее всего, вовлекался в полимеры 103Q-GFP за счет взаимодействия между polyQ трактом гентингтина и Q/N-богатым прионным доменом Sup35. Токсичность 103Q-GFP также зависела от белка Sup45, который вовлекался в агрегаты белка Sup35. Коагрегация Sup35 и Sup45, вероятно, обусловлена способностью этих белков взаимодействовать друг с другом [Stansfield et al., 1995].

Существенная роль белка Sup35 в токсичности 103Q-GFP может показаться неожиданной, поскольку клетки дрожжей содержат более 100 Q/N-богатых белков, многие из которых являются жизненно-важными. Однако следует заметить, что среди этих белков Sup35 имеет один из наиболее высоких уровней продукции, что увеличивает степень его полимеризации. Помимо этого, вместе с Sup35 агрегирует и инактивируется другой жизненно важный белок - Sup45. Роль Sup45 в токсичности 103Q-GFP не столь неожиданна, поскольку известно, что вовлечение Sup45 в прионные полимеры Sup35 токсично для клеток [PS/1] с повышенным уровнем продукции Sup35 [Dagkesamanskaya, Ter-Avanesyan, 1991; Paushkin et al., 1997]. В то же время, вовлечение других жизненно-важных партнеров Sup35 в эти комплексы не приводило к токсичности [Vishveshwara, Bradley, Liebman, 2009].

Мы показали, что инактивация Sup35 и Sup45, вызванная агрегацией 103Q-GFP, приводила к дефекту герминации трансляции. Однако инактивация этих белков может влиять не только на терминацию трансляции, но и на многие другие процессы, поскольку данные факторы играют существенную роль в организации цитоскелета, цитокинезе и регуляции клеточного цикла [Valouev et al., 2004; Valouev, Kushnirov, Ter-Avanesyan, 2002], а также и в других процессах [Hoshino et al., 1999; Cosson et al., 2002; Hosoda et al., 2003; Urakov et al., 2006; Merritt et al., 2010].

Важно, что инактивация факторов терминации трансляции не полностью объясняет причину токсичности 103Q-GFP, поскольку продукция белка Sup35C, который не способен к агрегации, восстанавливала рост [PIN*] клеток не в полной мере. Это указывает на то, что существуют иные, независимые причины токсичности гентингтина. Например, известно, что агрегаты гентингтина в клетках дрожжей инактивируют жизненно-важные белки, участвующие в белковой деградации [Duennwald, Lindquist, 2008] и эндоцитозе [Meriin et al., 2007].

Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что в дрожжевой модели амилоидные полимеры белка с протяженным трактом polyQ вызывают полимеризацию клеточных Q/N-богатых белков и связанную с ней инактивацию белков, которые способны взаимодействовать с этими Q/N-богатыми белками. Если такие белки оказываются жизненно важными, то снижение количества их растворимой функциональной формы может быть вредным для клеток. Мы считаем, что данный механизм, скорее всего, является универсальным как для дрожжей, так и для млекопитающих.

8. Происхождение приопов дрожжей

Высокое содержание остатков глутамина и аспарагина в прионных доменах белков дрожжей делает их похожими на белки с удлиненными полиглутамииовыми трактами. Сходство белков с такими доменами проявляется и в их склонности к агрегации. Белки с полиглутамииовыми доменами довольно часто встречаются у всех эукариот, в том числе и у дрожжей. Эти домены могут выполнять разнообразные функции [Clabough, Zeitlin, 2006; Lindqvist, Laakkonen, Albert, 2007; Schaefer, Wanker, Andrade-Navarro, 2012]. Так, в транскрипционных факторах эти домены могут участвовать во взаимодействиях с белками-партнерами, которые также могут содержать полиглутаминовые тракты [Atanesyan et al., 2011]. Длина полиглутаминовых трактов зачастую непостоянна - она может изменяться благодаря удлинению или укорочению повторяющихся участков полиглутамин-кодирующих последовательностей генов при репликации ДНК [Mirkin, 2007]. Поскольку чрезмерное удлинение полиглутаминового домена может приводить к агрегации и токсичности таких белков, то они могут быть объектами эволюционной противоселекции. Вместе с тем, действие такого негативного отбора может уравновешиваться функциональной необходимостью удлинить полиглутаминовую последовательность.

Анализ встречаемости различных аминокислотных остатков в прионных доменах белков дрожжей позволил прийти к выводу, что домены дрожжевых прионных белков зачастую обогащены одним из аминокислотных остатков, который, по нашим данным, способствует фрагментации полимеров (Таблица б). Например, в прионном домене Бир35 содержится ~16% тирозиновых остатков, в домене Сус8 ~20% аланиновых остатков, в то время как прионные домены игеЗ и обогащены остатками серина. Это наблюдение, а также наличие полиглутаминовых трактов и высокое содержание остатков глутамина и аспарагина в большинстве известных прионных доменов дрожжей позволило нам предположить, что прионогенные белки дрожжей могут происходить от белков с полиглутаминовыми доменами. Таблица 6. Аминокислотный состав прионных доменов белков дрожжей

I п ш

IV-.

Представлено процентное содержание соответствующих аминокислотных остатков в прионных доменах некоторых дрожжевых белков. Границы прионных доменов были взяты из статьи [А1ЬеШ е1 а1., 2009]. Наиболее представленные аминокислотные остатки, способствующие фрагментации, отмечены жирным шрифтом. Римские цифры слева обозначает класс, к которому была отнесена та или иная аминокислота в зависимости от ее эффекта на фрагментацию и образование амилоидных полимеров. Последняя колонка обозначает встречаемость аминокислотных остатков во всех белках дрожжей Saccharomyc.es сеге\> 'тае.

Белок А.К.\ 3ир35 игеЗ Сус8 2/р1 Мо13 Среднее вЗ.С.

У Туг 16,13 1.2 3.4

ИТгр с и 0.1? 0

РРЬе -< л - ^ М *>/ V 4 л- 1,2? 4.':

АА1а 4,84 5,14 !.1Е 20,45 ' 8,8'3 . 0.11 0 5,6

Н N¡5 ■ 0 1,55 2,27 7,52 0,76 0 2,1

ЭЗег 3,2- 15.42 11,76 2.34 13,6 10.69 3,5

ТТЬг ш тт лез 0 5,2

С Су® г 0 0 0 0 0.18 1/ 1,3

0,31 1.9& 1.14 : 7 * ■11.11 2.1

1 Не 1 С :.ы 101 'из 53

УУа1 г с 4,7 ? ■} 0 "1 С; л 1,2:. "

ЫАБП 16,1: 16,21 'Я Я 0.57 24 1 ^ ■> ? * ^ I оап -'¿.ОС . 1 1 ч --.г оау ! ( \ 1

К Ьуз* 1 «1 и I к ,"! Г У 2 24 г; / " йАгд 1,31 1.15 4,71 037 1.27 2,45 4.54 4,4

ЕШ с М& 3,53 0.э7 0 2.23 1,23 0,5

ОАзр' ; Р, | 0 2.3Е 0 1 *7 2.57 1,22 5.8

РРго 4,£4 0,76 С» 6.25 ■ 1,27 • 4,2 2,47 4,4

Леи 1,31 2,7? 3,63 ■ 5.11 3,8 6Л1 1 9,5

Можно предполагать, что аминокислотные остатки, способствующие фрагментации полимеров возникали в полиглутаминовых трактах в результате точечных мутаций. Затем участки с этими заменами могли амплифицироваться при помощи тех же механизмов, которые отвечают за изменение длины ро1у<3 трактов. Блоки остатков аспарагина, которые также присутствуют в прионных доменах белков дрожжей, могли появляться в полиглутаминовой последовательности путем мутаций, приводящих к сдвигу рамки считывания (см. Таблицу 7). В результате этих процессов гомогенная нолиглутаминовая последовательность могла превращаться в гетерогенную, обогащенную глутаминами и аспарагинами, и содержащую другие аминокислотные остатки. Поскольку мы показали, что вставки в полиглутаминовые последовательности 9 из возможных 20 аминокислотных остатков приводило к улучшению фрагментации соответствующих полимеров, то вероятность возникновения белка, который будет образовывать фрагментируемые полимеры, достаточно высока. Следует также отметить, что вставки в полиглутаминовую последовательность других аминокислотных остатков приводят к превращению гомогенной последовательности в гетерогенную. Гетерогенные же последовательности должны взаимодействовать в составе полимера в регистре, что в свою очередь должно снижать частоту возникновения полимеров, поскольку наличие регистра существенно ограничивает число вариантов взаимодействия между концом полимера и присоединяющимся мономером. Помимо этого, белки с гетерогенными по составу амилоидогенными доменами могут быть менее токсичными, чем белки с гомогенными полиглутаминовыми трактами, поскольку, как было показано ранее, полимеры белков ро1уС)У менее эффективно индуцируют полимеризацию некоторых клеточных (З/И-богагых белков, чем полимеры ро1у<3 [игакоу е1 а1., 2010].

В заключение следует отметить, что данная гипотеза не подразумевает существование отбора, направленного на возникновение белков с прионными свойствами. Напротив, согласно этой гипотезе, возникновение белков с прионными свойствами не зависит от их адаптивных свойств, а лишь является следствием отрицательного отбора против токсичности протяженных полиглутаминовых трактов белков дрожжей.

Таблица 7. Аминокислотные замены, возникающие в результате одиночных мутаций в polyQ и polyN последовательностях.

Единичные замены

Кодон(кодфуемая а.к.) luAA(L) GAA(E) AAA (К) CUA(L) CGA(R) CCA(P) CAU(H) CAC(H) CAG(Q)

UAG (stop) GAG (E) AAG(K) CUG(L) CGG(R) CCG(P) CAU(H) CAC(H) CAA(Q)

AAU(N) GAU (D) CAU(H) UAU(Y) AGU(S) ACU(T) AUU(I) AAG(K) AAA(K) AAC(N)

AAC(N) GAC CAC(H) UAC(Y) AGC(S) ACC(T) AUC(I) AAG(K) AAA(K) AAU(N)

Сдвиг рамки считывания Кодон(кодируемая а.к.)

1 +1

АСА(Т) AAC(N)

GCA(A) AGC(S)

UAA

AUA(I) (stop)

АСА(Т) CAA(Q)

Представлены кодоны и кодируемые ими аминокислотные замены, которые могут образовываться в последовательности, кодирующей ро1у() или ро1уЫ тракты, и соответствующих полипептидах, в результате одиночных замен нуклеотидов и сдвигов рамки считывания. Ярким и бледным зеленым соответственно отмечены "исходные" кодоны глутамина и аспарагина, серым - результаты мутаций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа посвящена изучению биологической роли и свойств амилоидных полимеров, образованных белками с полиглутаминовыми трактами. При использовании дрожжевой модели болезни Геншнгтона, была выявлена одна из наиболее существенных причин токсичности амилоидных полимеров гентингтина для клеток дрожжей. Показано, что амилоидные полимеры гентингтина индуцируют амилоидную полимеризацию жизненно-важного фактора терминации трансляции ЭирЗЗ, а полимеры Бир35, в свою очередь, адсорбируют на себя белок Бир45, являющийся функциональным партнером 8ир35. Полученные данные позволяют предполагать, что полимеризация белков с глутамин-богатыми доменами также играет существенную роль в патогенезе болезни Гентингтона у человека.

В перспективе представляется важным выявление клеточных белков человека, способных образовывать амилоидные полимеры в присутствии полимеров гентингтина, и исследование влияния их полимеризации на токсичность. Возможно, дальнейшие работы в этой области позволят обнаружить и белки, препятствующие взаимодействию жизненно-важных белков с полимерами гентингтина.

Нами был также проведен систематический анализ влияния вставок различных аминокислотных остатков в полиглутаминовые домены на образование и фрагментацию амилоидных полимеров белков с такими доменами. Введение остатков пролина, 1лутаминовой кислоты, аргинина и лейцина препятствовало полимеризации полиглутаминовых доменов со вставками этих аминокислот. Остальные аминокислоты не препятствовали полимеризации, но оказывали разное влияние на эффективность фрагментации образуемых полимеров. Эффективной фрагментации в наибольшей степени способствовали ароматические гидрофобные остатки тирозина, триптофана и фенилаланина. Остатки этих аминокислот обеспечивали, по всей видимости, максимально эффективную фрагментацию амилоидных полимеров, приводя к образованию амилоидных частиц содержащих от 2 до 10 мономеров, т.е. самых малых из когда-либо наблюдаемых амилоидных олигомеров. В то же время, вставки сильно гидрофобных остатков валина и изолейцина не стимулировали фрагментацию полимеров. Таким образом, исходное предположение о том, что детерминантами распознавания полимеров фрагментирующими шаперонами являются гидрофобные аминокислоты, подтвердилось не в полной мере.

Во многих работах считается, что частота фрагментации амилоидов может зависеть от их физической прочности, однако мы показали, что эффективность фрагментации во многих случаях не коррелирует с физической прочностью полимеров. Таким образом, полученные результаты согласуются с гипотезой о том, что основным фактором, определяющим частоту фрагментации амилоидных полимеров, является их распознавание шаперонами и что это распознавание определяется аминокислотным составом амилоидогенных доменов.

Можно предполагать, что фрагментация амилоидных полимеров играет важную роль в патогенезе амилоидных заболеваний человека. Фрагментация увеличивает количество амилоидных частиц и уменьшает их размер. Первое обстоятельство должно ускорять полимеризацию амилоидогенного белка, поскольку скорость полимеризации белка должна зависеть от количества свободных концов предсуществующих полимеров, второе же - способствовать распространению амилоидов между клетками. Действительно, в многочисленных работах [см. обзор СивЬтап е1 а1., 2010] было показано, что амилоидные полимеры могут попадать в клетки млекопитающих из межклеточного пространства, покидать клетки через мембрану или в результате гибели клеток и, по всей видимости, благодаря этим процессам перемещаться между различными отделами мозга. В связи с этим, воздействия, направленные на ослабление фрагментации амилоидных полимеров могли бы препятствовать их межклеточной передаче и существенно замедлять патогенез амилоидозов.

В заключение хочется отметить, что успешное использование белков ро1у<ЗХ для анализа эффективности фрагментации полимеров в клетках дрожжей показало, что данная простая модель может быть в дальнейшем использована и для изучения процесса фрагментации амилоидных полимеров в клетках млекопитающих. Можно надеяться, что такие работы позволят обнаружить в клетках млекопитающих белки, отвечающие за фрагментацию амилоидных полимеров, что в свою очередь будет способствовать исследованию роли фрагментации амилоидов в патогенезе амилоидозов и, возможно, создать терапевтические препараты, ингибирующие этот процесс.

ВЫВОДЫ

1. Аминокислотные остатки Leu, Pro, Glu и Arg в составе полиглутаминовых последовательностей белков препятствуют амилоидной полимеризации этих белков.

2. Остатки, не препятствующие полимеризации, можно разделить на 3 класса по способности стимулировать фрагментацию амилоидных полимеров. Ароматические остатки Туг, Phe и Тгр наиболее эффективно стимулируют фрагментацию и приводят к образованию коротких олигомеров, вплоть до димеров.

3. Устойчивость амилоидных полимеров к нагреванию в присутствии SDS часто не коррелирует с эффективностью их фрагментации. Это указывает на то, что прочность амилоидов не является основным фактором, определяющим частоту их фрагментации.

4. Токсичность амилоидных полимеров гентингтина человека для клеток дрожжей связана с инактивацией жизненно-важных факторов терминации трансляции Sup35 и Sup45 в результате их вовлечения в амилоидные агрегаты.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу поблагодарить моего научного руководителя В.В. Кушнирова, а также заведующего лабораторией М.Д. Тер-Аванесяна за неоценимую и всестороннюю помощь в работе. Также хотелось бы поблагодарить Н.В. Кочневу-Первухову, с которой мы вместе выполняли часть экспериментов по изучению токсичности гентингтина. Благодарю также всех действующих и бывших сотрудников лаборатории молекулярной генетики за поддержку и обучение азам и тонкостям работы, в особенносш М.О. Агафонова, И.М. Александрова и А.Б. Вишневскую. Также я горячо благодарю мою жену Марию Александрову за терпение и заботу.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Математическое обоснование корреляции между размером полимеров и эффективностью фрагментации

Часто встречается мнение, что размер полимеров может определяться не только частотой фрагментации, но и, например, эффективностью полимеризации на конце каждой фибриллы. Однако моделирование процесса прионной полимеризации, проведенное в работе [Tanaka et al., 2006] указывает на отсутствие такой зависимости. Эгот вывод не был напрямую сформулирован в упомянутой работе, однако он следует из тех математических зависимое гей, которые в ней приведены. Согласно этой работе, число полимеров равно аУ R а п? т п п у = — — - , в то время как число молекул в полимере равно z = — R /ру, где а,р,у и К

R р R

- это константы скорости для синтеза белка Sup35, роста полимеров, частоты фрагментации полимеров и скорости деления клеток. Средний размер полимеров (число молекул Sup35 в полимере) является частным этих двух выражений (л/у), которое равно 2

- = R/y . Это значит, что размер полимеров определяется только скоростью деления клеток и часююй фрагментации и не зависит от константы роста полимеров. Данный вывод был впервые опубликован в работе [Alexandrov et al., 2008].

Приложение 2. Анализ термостабильности полимеров 71QA с помощью SDD-AGE с 25 ео то ее «о

Лизаты клеток 74-D694/AS35 [PIN*J, продуцирующих белок 76QY, инкубировали при разных температурах в присутствии буфера для нанесения, содержащего 2% SDS, после чего образцы анализировали с помощью SDD-AGE. Полученный иммуноблот денситометрировали с помощью программного пакета Image J. Для вычитания фона в качестве референсной области использовалась область, соответствующая дорожке без нанесенного образца. Для расчета относительного количества полимеров при той или иной температуре за 100% принималось количество полимеров при 25UC.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей // Генетика. 1970. Т. 6. С. 106-115.

2. Ahn I., Son H.S. Comparative bioinformatics analysis of prion proteins isolated from reptile, rodent, ruminant, and human species. // Experimental & molecular medicine. 2007. T. 39. № 6. C. 769-77.

3. Alberti S. et al. A Systematic Survey Identifies Prions and Illuminates Sequence Features ofPrionogenic Proteins//Cell. 2009. T. 137. № l.C. 146-158.

4. Alexandrov I.M. et al. Appearance and propagation of polyglutamine-based amyloids in yeast: tyrosine residues enable polymer fragmentation. // The Journal of biological chemistry. 2008. T. 283. № 22. С. 15185-92.

5. Alper T. et al. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? // Nature. 1967. T. 214. № 5090. C. 764-6.

6. Aron R. et al. J-protein co-chaperone Sisl required for generation of [RNQ^] seeds nccessary for prion propagation. // The EMBO journal. 2007. T. 26. № 16. C. 3794803.

7. Atanesyan L. et al. Polyglutamine Tracts as Modulators of Transcriptional Activation from Yeast to Mammals. // Biological chemistry. 2011. T. 393. C. 63-70.

8. Baxa U. et al. Architecture of Ure2p prion filaments: the N-terminal domains form a central core fiber. //The Journal of biological chemistry. 2003. 'Г. 278. № 44. C. 43717-27.

9. Baxa U. et al. In Sup35p filaments (the [Р5Г] prion), the globular C-terminal domains are widely offset from the amyloid fibril backbone. // Molecular microbiology. 201I. T. 79. № 2. C. 523-32.

10. Bhattacharyya A. et al. Oligoproline effects on polyglutamine conformation and aggregation. // Journal of molecular biology. 2006. T. 355. JST° 3. C. 524-35.

11. Bocharova N.A. et al. Unexpected link between anaphase promoting complex and the toxicity of expanded polyglutarnines expressed in yeast. // Cell cycle. 2008. T. 7. № 24. C. 3943-6.

12. Braak H., Tredici K. Del. Invited Article: Nervous system pathology in sporadic Parkinson disease. // Neurology. 2008. T. 70. № 20. C. 1916-25.

13. Bugg C.W. et al. Structural Features and Domain Organization of Huntingtin Fibrils // Journal of Biological Chemistry. 2012.

14. Castro C.E. et al. Physical properties of polymorphic yeast prion amyloid fibers. // Biophysical journal. 2011. T. 101. № 2. C. 439-48.

15. Chandler R.L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. // Lancet. 1961. Т. 1. № 7191. C. 1378-9.

16. Chang H.-Y. et al. Strain-specific sequences required for yeast [PS/1"] prion propagation. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008. T. 105. № 36. C. 13345-50.

17. Chen B. et al. Measurement of amyloid fibril mass-per-lcngth by tilted-beam transmission electron microscopy. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009. T. 106. № 34. C. 14339-44.

18. Chernoff Y.O., Derkach I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearancc of psi-like factors in the yeast Saccharomyces ccrevisiae. // Current genetics. 1993. T. 24. № 3. C. 268-70.

19. Chernoff Y.O. et al. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor [PSt], // Scicnce. 1995. T. 268. № 5212. C. 880-4.

20. Chesebro B. et al. Identification of scrapie prion protein-specific mRNA in scrapie-infected and uninfected brain. // Nature. 1985. T. 3 15. № 6017. C. 331-3.

21. Clabough E.B.D., Zeitlin S.O. Deletion of the triplet repeat encoding polyglutamine within the mouse Huntington's disease gene results in subtle behavioral/motor phenotypes in vivo and elevated levels of ATP with cellular senescence in vitro. // Human molecular genetics. 2006. T. 15. № 4. C. 607-23.

22. Cosson B. et al. Poly(A)-binding protein acts in translation termination via eukaryotic release factor 3 interaction and does not influence [PSf] propagation. // Molecular and cellular biology. 2002. T. 22. № 10. C. 3301-15.

23. Coustou V. et al. The protein product of the het-s hcterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1997. T. 94. № 18. C. 9773-8.

24. Cox B.S. VI\ a cytoplasmic suppressor of super-suppression in yeast // Heredity. 1965. T. 20. C. 505-521.

25. Cox B.S., Tuite M.F., McLaughlin C.S. The psi factor of yeast: a problem in inheritance. // Yeast. 1988. T. 4. № 3. c. 159-78.

26. Cushman M. et al. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. //Journal of cell science. 2010. T. 123. № Pt 8. C. 1191-201.

27. Dagkesamanskaya A.R., Ter-Avanesyan M.D. Interaction of the yeast omnipotent suppressors SUP1(SUP45) and SUP2(SUP35) with non-mendelian factors. // Genetics. 1991. T. 128. №3. C. 513-20.

28. Derkatch 1,L. et al. Genesis and variability of [P5/] prion factors in Saccharomyces cerevisiae. II Genetics. 1996. T. 144. №4. C. 1375-86.

29. Derkatch l.L. et al. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the [P5P] prion in Saccharomyces ccrevisiae. // Genetics. 1997. T. 147. №2. C. 507-19.

30. Derkatch l.L. et al. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PlhT]. 11 Cell. 2001. T. 106. №2. C. 171-82.

31. Derkatch l.L. ct al. Effects of Q/N-rich, polyQ, and non-polyQ amyloids on the de novo formation of the [PS/] prion in yeast and aggregation of Sup35 in vitro. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.

2004. T. 101. №35. C. 12934-9.

32. Diaz-Avalos R. et al. Strain-specific morphologies of yeast prion amyloid fibrils. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.

2005. T. 102. №29. C. 10165-70.

33. Dong J. et al. Optical trapping with high forces reveals unexpected behaviors of prion fibrils. //Nature structural & molecular biology. 2010. T. 17. № 12. C. 1422-30.

34. Du Z. et al. Newly identified prion linked to the chromatin-remodeling factor Swil in Saccharomyces cerevisiae. // Nature genetics. 2008. T. 40. № 4. C. 460-5.

35. Duennwald M.L. et al. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006a. T. 103. № 29. C. 11051-6.

36. Duennwald M.L. et al. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006b. T. 103. № 29. C. 11045-50.

37. Duennwald M.L., Lindquist S. Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity. // Genes & development. 2008. T. 22. № 23. C. 3308-19.

38. Eilertsen K.J., Keller T.C. Identification and characterization of two huge protein components of the brush border cytoskeleton: evidence for a cellular isoform of titin. // The Journal of cell biology. 1992. T. 119. № 3. C. 549-57.

39. Gabriel J.M. et al. Molecular cloning of a candidate chicken prion protein. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992. T. 89. № 19. C. 9097-101.

40. Gafni J. et al. Inhibition of calpain cleavage of huntingtin reduces toxicity: accumulation of calpain/caspase fragments in the nucleus. // The Journal of biological chemistry. 2004. T. 279. № 19. C. 20211-20.

41. Gajdusek D.C., Gibbs C.J., Alpers M. Experimental transmission of a Kuru-like syndrome to chimpanzees. // Nature. 1966. T. 209. № 5025. C. 794-6.

42. Giorgini F. et al. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. // Nature genetics. 2005. T. 37. № 5. C. 526-31.

43. Glabe C.G. Common mechanisms of amyloid oligomer pathogenesis in degenerative disease. // Neurobiology of aging. 2006. T. 27. № 4. C. 570-5.

44. Glover J.R. et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+J, a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. // Cell. 1997. T. 89. № 5. C. 8119.

45. Gokhale K.C. et al. Modulation of prion-dependent polyglutamine aggregation and toxicity by chaperone proteins in the yeast model. // The Journal of biological chemistry. 2005. T. 280. № 24. C. 22809-18.

46. Goldsbury C. et al. Amyloid structure and assembly: insights from scanning transmission electron microscopy. //Journal of structural biology. 2011. T. 173. № 1. C. 1-13.

47. Gong H. et al. Polyglutamine Toxicity Is Controlled by Prion Composition and Gene Dosage in Yeast // PLoS Genetics. 2012. T. 8. № 4. C. el002634.

48. Griffith J.S. Self-replication and scrapie. // Nature. 1967. T. 215. № 5105. C. 1043-4.

49. Halfmann R., Lindquist S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. // Journal of visualized experiments. 2008. № 17. C. 4-7.

50. Haslbergcr T. ct al. Protein disaggregation by the AAA+ chaperone ClpB involves partial threading oflooped polypeptide segments. //Nature structural & molecular biology. 2008. T. 15. № 6. C. 641-50.

51. Haslberger T., Bukau B., Mogk A. Towards a unifying mechanism for ClpB/Hsp 104-mediated protein disaggregation and prion propagation. // Biochimie et biologic cellulaire. 2010. T. 88. № 1. C. 63-75.

52. Helsen C.W., Glover J.R. Insight into the Molecular Basis of Curing of the [PS1+] Prion by Overexpression of the 104 kDa Heat Shock Protein (Hspl04). // The Journal of biological chemistry. 2012. T. 287. № 1. C. 542-556.

53. Herbert D, Phipps PJ S.R. Chemical analysis of microbial cells // Methods in microbiology. 1971. T. 5. C. 244-249.

54. Iligurashi T. et al. Specificity of the J-protein Sisl in the propagation of 3 yeast prions. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008. T. 105. №43. C. 16596-601.

55. Hoshino S. et al. The eukaryotic polypeptide chain releasing factor (eRF3/GSPT) carrying the translation termination signal to the 3'-Poly(A) tail of mRNA. Direct association of eRF3/GSPT with polyadenylate-binding protein. // The Journal of biological chemistry. 1999. T. 274. № 24. C. 16677-80.

56. Hosoda N. et al. Translation termination factor eRF3 mediates mRNA decay through the regulation of deadenylation. // The Journal of biological chemistry. 2003. T. 278. №40. C. 38287-91.

57. Hung G.-C., Masison D.C. N-terminal domain of yeast Hspl04 chaperone is dispensable for thermotolerance and prion propagation but necessary for curing prions by Hspl04 overexpression. // Genetics. 2006. T. 173. № 2. C. 611-20.

58. Kajava A. V ct al. A model for Ure2p prion filaments and other amyloids: the parallel superpleated beta-structure. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. T. 101. № 21. C. 7885-90.

59. Kalastavadi T., True H.L. Analysis of the [RNQ+] prion reveals stability of amyloid fibers as the key determinant of yeast prion variant propagation. // The Journal of biological chemistry. 2010. T. 285. № 27. C. 20748-55.

60. Kawai-Noma S. et al. In vivo evidence for the fibrillar structures of Sup35 prions in yeast cells. //The Journal ofccll biology. 2010. T. 190. №2. C. 223-31.

61. Khurana V., Lindquist S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast? // Nature reviews. Neuroscience. 2010. T. 11. № 6. C. 436-49.

62. King C., Diaz-Avalos R. Protein-only transmission of three yeast prion strains. // Nature. 2004. T. 428. № 6980. C. 319-23.

63. King C.Y. ct al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1997. T. 94. № 13. C. 6618-22.

64. Krishnan R., Lindquist S.L. Structural insights into a yeast prion illuminate nucleation and strain diversity. // Nature. 2005. T. 435. № 7043. C. 765-72.

65

66

67

68,

69

70

71

72.

73.

74,

75,

76

77,

78,

79,

Kryndushkin D.S. et al. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04. // The Journal of biological chemistry. 2003. T. 278. №49. C. 49636-43.

Kushnirov V. V, Ter-Avanesyan M.D. Structure and replication of yeast prions. // Cell. 1998. T. 94. № 1. C. 13-6.

Lancaster A.K. et al. The spontaneous appearance rate of the yeast prion [PSI+] and its implications for the evolution of the evolvability properties of the [PSI+] system. // Genetics. 2010. T. 184. № 2. C. 393-400.

Lee D.H., Goldberg A.L. Hspl04 is essential for the selective degradation in yeast of polyglutamine expanded ataxin-1 but not most misfolded proteins generally. // Biochemical and biophysical research communications. 2010. T. 391. № 1. C. 105661.

Lee W.-C.M., Yoshihara M., Littleton J.T. Cytoplasmic aggregates trap polyglutamine-containing proteins and block axonal transport in a Drosophila model of Huntington's disease. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. T. 101. № 9. C. 3224-9.

Li I I. et al. Ultrastructural localization and progressive formation of neuropil aggregates in Huntington ' s disease transgenic mice // Cerebral Cortex. 1999. T. 8. № 7. C. 1227-1236.

Lindqvist C., Laakkonen L., Albert V. a. Polyglutamine variation in a flowering time protein correlates with island age in a Hawaiian plant radiation. // BMC evolutionary biology. 2007. T. 7. C. 105.

Lum R. et al. Evidence for an unfolding/threading mechanism for protein disaggregation by Saccharomyces cerevisiae Hspl04. // The Journal of biological chemistry. 2004. T. 279. № 28. C. 29139-46.

Lum R., Niggemann M., Glover J.R. Peptide and protein binding in the axial channel of l isp 104. Insights into the mechanism of protein unfolding. // The Journal of biological chemistry. 2008. T. 283. № 44. C. 30139-50.

Makarava N. et al. Recombinant prion protein induces a new transmissible prion disease in wild-type animals. // Acta neuropathologica. 2010. T. 119. 2. C. 177-87.

Manogaran A.L. et al. Prion formation and polyglutamine aggregation are controlled by two classes of genes. // PLoS genetics. 2011. T. 7. № 5. C. el001386.

Meriin A.B. et al. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnql. // The Journal of cell biology. 2002. T. 157. №6. C. 997-1004.

Meriin A.B. et al. Aggregation of expanded polyglutamine domain in yeast leads to defects in endocytosis. // Molecular and cellular biology. 2003. T. 23. № 21. C. 755465.

Meriin A.B. et al. Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains. // The FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2007. T. 21. № 8. C. 1915-25.

Merritt G.H. et al. Decoding accuracy in eRFl mutants and its correlation with pleiotropic quantitative traits in yeast. // Nucleic acids research. 2010. T. 38. № 16. C. 5479-92.

80. Mirkin S,M. Expandable DNA repeats and human disease. // Nature. 2007. T. 447. № 7147. C. 932-40.

81. Mitsui K., Doi H., Nukina N. Proteomics of polyglutamine aggregates. // Methods in enzymology. 2006. T. 412. № 06. C. 63-76.

82. Nagai Y, et al. A toxic monomeric conformer of the polyglutamine protein // Nature structural & molecular biology. 2007. T. 14. № 4. C. 332-340.

83. Nekooki-Machida Y. et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exonl show different cytotoxicity. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009. T. 106. № 24. C. 9679-84.

84. Oesch B. et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. // Cell. 1985. T. 40. №4. C. 735-46.

85. Parham S.N., Resende C.G., Tuitc M.F. Oligopeptide repeats in the yeast protein Sup35p stabilize intermolecular prion interactions. // The EMBO journal. 2001. T. 20. №9. C. 2111-9.

86. Parsell D.A. et al. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. // Nature. 1994. T. 372. № 6505. C. 475-8.

87. Patel B.K., Gavin-Smyth J., Liebman S.W. The yeast global transcriptional co-repressor protein Cyc8 can propagate as a prion. // Nature cell biology. 2009. T. 11. №

3. C. 344-9.

88. Patino M.M. et al. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. // Science. 1996. T. 273. № 5275. C. 622-6.

89. Paushkin S. V et al. Propagation of the yeast prion-like [PSr] determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor // EMBO Journal. 1996. T. 15. № 12. C. 3127-3134.

90. Paushkin S. V et al. Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation. // Molecular and cellular biology. 1997. T. 17. № 5. C. 2798-805.

91. Peters T.W., Huang M. Protein aggregation and polyasparagine-mediated cellular toxicity in Saccharomyces cerevisiae. // Prion. 2007. T. 1. № 2. C. 144-53.

92. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. // Science. 1982. T. 216. №4542. C. 136-44.

93. Prusiner S.B. et al. Transgenetic studies implicate interactions between homologous PrP isoforms in scrapie prion replication. // Cell. 1990. T. 63. № 4. C. 673-86.

94. Prusiner S.B. Prions. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998. T. 95. № 23. C. 13363-83.

95. Rivera-Milla E., Stuermer C.A.O., Málaga-Trillo E. An evolutionary basis for scrapie disease: identification of a fish prion mRNA. // Trends in genetics. 2003. T. 19. № 2. C. 72-5.

96. Rogoza T. et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfpl. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010. T. 107. № 23. C. 105737.

97. Ross E.D. et al. Primary sequence independence for prion formation. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. T. 102. № 36. C. 12825-30.

98. Riidiger S. et al. Substrate specificity of the DnaK chaperone determined by screening cellulose-bound peptide libraries. // The EMBO journal. 1997. T. 16. № 7. C. 1501-7.

99. Riidiger S., Schneider-Mergener J., Bukau B. Its substrate specificity characterizes the DnaJ co-chaperone as a scanning factor for the DnaK chaperone. // The EMBO journal. 2001. T. 20. № 5. C. 1042-50.

100. Salnikova A.B. et al. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. // The Journal of biological chemistry. 2005. T. 280. № 10. C. 8808-12.

101. Schaefer M.H., Wanker E.E., Andrade-Navarro M. a. Evolution and function of CAG/polyglutamine repeats in protein-protein interaction networks. // Nucleic acids research. 2012. T. 40. № 10. C. 4273-4287

102. Schaffar G. et al. Cellular toxicity of polyglutamine expansion proteins: mechanism of transcription factor deactivation. // Molecular cell. 2004. T. 15. № 1. C. 95-105.

103. Schlieker C. et al. Substrate recognition by the AAA+ chaperone ClpB // Nature structural & molecular biology. 2004. T. 11. № 7. C. 607-615.

104. Schmidt M. et al. Comparison of Alzheimer Abeta(l-40) and Abeta(l-42) amyloid fibrils reveals similar protofilament structures. // Proceedings of the National Academy of Scicnccs of the United States of America. 2009. T. 106. № 47. C. 198138.

105. Shewmaker F. et al. Amyloids of shuffled prion domains that form prions have a parallel in-register beta-sheet structure. // Biochemistry. 2008. T. 47. N° 13. C. 4000-7.

106. Shewmaker F., Wickner R.B., Tycko R. Amyloid of the prion domain of Sup35p has an in-register parallel beta-sheet structure. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006. T. 103. № 52. C. 19754-9.

107. Shkundina l.S. et al. The role of the N-terminal oligopeptide repeats of the yeast Sup35 prion protein in propagation and transmission of prion variants. // Genetics. 2006. T. 172. № 2. C. 827-35.

108. Shorter J., Lindquist S. Hspl04 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. // Science. 2004. T. 304. № 5678. C. 1793-7.

109. Sikorski R.S., Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. 1989. T. 122. № 1.C. 19-27.

110. Stahl N. et al. Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. // Biochemistry. 1993. T. 32. № 8. C. 1991-2002.

111. Stansficld 1. ct al. The products of the SUP45 (eRFl) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae. // The EMBO journal. 1995. T. 14. № 17. C. 4365-73.

112. Suzuki G., Shimazu N., Tanaka M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired dnig resistance and cell survival under environmental stress // Science. 2012. T. 336. № 6079. C. 355-359.

113.

114.

115.

116.

117.

118.

119,

120,

121,

122,

123,

124

125,

126

127

128

129

Takahashi T. et al. Soluble polyglutamine oligomers formed prior to inclusion body formation are cytotoxic. // Human molecular genetics. 2008. T. 17. № 3. C. 345-56.

Takahashi T., Katada S., Onodera O. Polyglutamine diseases: where does toxicity come from? What is toxicity? Where are we going? // Journal of molecular cell biology. 2010. T. 2. № 4. C. 180-91.

Tanaka M. et al. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences // Nature. 2004. T. 428. № 6980. C. 323-328.

Tanaka M. et al. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. // Nature. 2006. T. 442. № 7102. C. 585-9.

Ter-Avanesyan M.D. et al. Deletion analysis of the SUP35 gene of the yeast Saccharomyccs cerevisiae reveals two non-overlapping functional regions in the encoded protein // Molecular Microbiology. 1993. T. 7. № 5. C. 683-692.

Tipton K.A., Verges K.J., Weissman J.S. In vivo monitoring of the prion replication cycle reveals a critical role for Sisl in delivering substrates to Hspl04. // Molecular cell. 2008. T. 32. №4. C. 584-91.

Toyama B.H. et al. The structural basis of yeast prion strain variants. // Nature. 2007. T. 449. №7159. C. 233-7.

Toyama B.H., Weissman J.S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. // Annual review of biochemistry. 2011. T. 80. C. 557-85.

Urakov V.N. et al. N-terminal region of Saccharomyces cerevisiae eRF3 is essential for the functioning of the eRFl/eRF3 complex beyond translation termination. // BMC molecular biology. 2006. T. 7. C. 34.

Urakov V.N. et al. Interdependence of amyloid formation in yeast: implications for polyglutamine disorders and biological functions. // Prion. 2010. T. 4. № 1, C. 45-52.

Valouev I. a et al. Translation termination factors function outside of translation: yeast eRFl interacts with myosin light chain, Mlclp, to effect cytokinesis. // Molecular microbiology. 2004. T. 53. № 2. C. 687-96.

Valouev I. a, K.ushnirov V. V, Ter-Avanesyan M.D. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. // Cell motility and the cytoskeleton. 2002. T. 52. № 3. C. 161-73.

Vashist S., Cushman M., Shorter J. Applying Hspl04 to protein-misfolding disorders. // Biochimie et biologic cellulaire. 2010. T. 88. № 1. C. 1-13.

Vishveshwara N., Bradley M.E., Liebman S.W. Sequestration of essential proteins causes prion associated toxicity in yeast. // Molecular microbiology. 2009. T. 73. № 6. C.1101-14.

Wadsworth J.D.F., Collinge J. Molecular pathology of human prion disease. // Acta neuropathologica. 2011. T. 121. № 1. C. 69-77.

Wang Y. et al. Characterization of proteins associated with polyglutamine aggregates: a novel approach towards isolation of aggregates from protein conformation disorders. // Prion. 2007. T. 1. № 2. C. 128-35.

Wang Y. et al. Abnormal proteins can form aggresome in yeast: aggresome-targeting signals and components of the machinery. // The FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2009. T. 23. № 2. C. 451-63.

130. Wang Y.-Q. et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. // The Journal of biological chemistry. 2011. T.

286. № 14. C. 12101-7.

131. Wegrzyn R.D. et al. Mechanism of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast // Molecular and cellular biology. 2001. T. 21. № 14.

132. Wickner R.B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. // Science. 1994. T. 264. № 5158. C. 566-9.

133. Wickner R.B. et al. Protein inheritance (prions) based on parallel in-register beta-sheet amyloid structures. // BioEssays. 2008. T. 30. № 10. C. 955-64.

134. Wickner R.B., Dyda F., Tycko R. Amyloid of Rnqlp, the basis of the [PIN+] prion, has a parallel in-register beta-sheet structure. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008. T. 105. № 7. C. 2403-8.

135. Wickner R.B., Masison D.C., Edskes H.K. [PSf] and [URE3] as yeast prions. // Yeast. 1995. T. II. № 16. C. 1671-1685.

136. Winkler J. et al. Hsp70 targets Hsp 100 chaperones to substrates for protein disaggregation and prion fragmentation. // The Journal of cell biology. 2012. T. 198. № 3. C. 387-404.

137. Zhao X. et al. Sequestration of Sup35 by aggregates of huntingtin fragments causes toxicity in yeast with the [PSt]prion. // The Journal of biological chemistry. 2012. T

287. №2. C. 23346-23355

138. Zhouravleva G. et al. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3. // The EMBO journal. 1995. T. 14. № 16. C. 4065-72.