Функциональная вариабельность генов подверженности инфекционным заболеваниям тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат медицинских наук Ожегова, Диана Сергеевна

  • Ожегова, Диана Сергеевна
  • кандидат медицинских науккандидат медицинских наук
  • 2009, Томск
  • Специальность ВАК РФ03.00.15
  • Количество страниц 185
Ожегова, Диана Сергеевна. Функциональная вариабельность генов подверженности инфекционным заболеваниям: дис. кандидат медицинских наук: 03.00.15 - Генетика. Томск. 2009. 185 с.

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Ожегова, Диана Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Функциональная геномика инфекционных заболеваний.

1.2. Биоинформатика, как инструмент формирования выборки генов из генома человека для изучения патологии.

1.3. Генетическая подверженность туберкулезу и сальмонеллезу.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристикаг-выборки здоровых доноров.

2.2. Биоинформационные подходы для поиска и оценки фенотипической значимости выбранных SNPs.

2.2.1. Поиск функционально значимых SNPs с помощью on-line программ и баз данных.

2.2.2. Выбор потенциально функционально значимых SNPs с помощью программы Matlnspector.

2.3. Молекулярно-генетические методы исследования.

2.3.1. Выделение ДНК из мононуклеаров венозной крови.

2.3.2. Определение полиморфизма генов IFNG, IFNGR2, МСР1, STAT1, TLR2.

2.3.3.Условия культивирования мононуклеарных клеток венозной крови.

2.3.4. Выделение РНК из мононуклеаров венозной крови и получение кДНК с помощью реакции обратной транскрипции.

2.3.5. Условия постановки RT-PCR.

2.4. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Поиск функционально значимых SNPs с помощью биоинформационных ресурсов.

3.2. Оценка уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции PHA, TDM, LPS, IFN-y, IL-4 и их комбинациями.

3.3. Сравнение уровней генетической экспрессии в культурах клеток носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Генетика», 03.00.15 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональная вариабельность генов подверженности инфекционным заболеваниям»

Одной из проблем современной медицины является изучение механизмов возникновения и персистирования внутриклеточных бактериальных инфекций, вызванных различного рода грамположительными и грамотрицательными бактериями [Воробьев, 2001; Ottenhoff, van Crevel, 2002; Schnappinger, Ehrt, 2006; Коненков, 2008]. Этапы инфицирования человеческого организма Mycobacterium tuberculosis и Salmonella enteritidis, запуск и поддержание иммунопатологических процессов напрямую зависят от работы генов, обеспечивающих формирование иммунного ответа. Несмотря на многочисленные исследования в области генетики инфекционных заболеваний, многие аспекты функционирования генов, определяющих развитие защитных реакций при внедрении патогенна, остаются до конца не установленными [Raupach, Stefan, 2001; Гельцер, 2002; López-Maderuelo, Arnalich, 2003; Aleáis, 2005]. К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о том, что такие инфекционные заболевания, как туберкулез и сальмонеллез, являются полигенными [Altare, 1998; Brightbill, 1999; Hunter, 2000; Kaufmann, 2001; Qiao, 2003; Коненков, 2008]. Вклад каждого из локусов гена в развитие заболевания является небольшим и может проявляться только в контексте специфических аллелей других генов [Cargill, 1999; Flores-Villanueva, 2005; Bulat-Kardum, 2006]. Выявление спектра генов и их полиморфизмов, влияющих на риск развития туберкулеза и сальмонеллеза, заболеваний со схожими начальными этапами патогенеза, представляет особый интерес.

Одной из основных задач современных исследователей является установление однонуклеотидных полиморфных вариантов генов (SNPs), функционально вовлеченных в развитие заболевания. Наше понимание функциональной значимости многих наследуемых полиморфных вариантов генов ограничено. Имеющиеся на сегодняшний день данные о фенотипическом проявлении вновь выявленных полиморфизмов носят противоречивый характер и не позволяют сделать однозначных выводов об их вкладе в развитие заболевания [Ма, 2003; Sergio, 2004; Lee, 2005; Bulat-Kardum, 2006; Cooke, 2006; Malik, 2006]. Комбинирование молекулярно-генетических, эпидемиологических и биоинформационных подходов для оценки функциональной значимости полиморфных вариантов генов, позволяет обеспечить высокую воспроизводимость и точность полученных ассоциаций между генотипами и заболеванием.

В настоящее время существуют десятки биоинформационных ресурсов, которые позволяют проводить селекцию генов кандидатов и их полиморфных вариантов, влияющих на восприимчивость к инфекционным заболеваниям и их патогенез [Cartharius, 2003; Bulyk, 2004; Berezikov, 2005; Peng, 2006; Chorley, 2008]. Предполагаемый вклад однонуклеотидных полиморфных замен в изменение уровня экспрессии генов может быть оценен посредством использования специальных компьютерных программ: Matlnspector, MATRIX SEARCH, SignalScan и др. [GuhaThakurta, 2006].

Важную роль в изучении функционирования генов, несущих в своей структуре SNPs с предполагаемым фенотипическим эффектом, и их вклада в развитие инфекционных заболеваний, играет экспрессионное профилирование [Bussemaker, 2001; Lazarus, 2005]. К настоящему времени разработан ряд экспериментальных моделей, представляющих собой культуры клеток человека, которые позволяют получить информацию об экспрессии изучаемых генов и уточнить многие патофизиологические процессы in vitro, происходящие при введении в культуру клеток бактериальных агентов [Crespo, 2002; Major, 2002; Пичугина, 2003; Cliff, 2004]. Такие модели являются перспективными в плане изучения иммунных основ заболеваний.

Например, для подтверждения функциональной значимости выбранных полиморфных вариантов можно оценить уровень экспрессии генов в культурах мононуклеарных клеток крови человека, обработанных продуктами экстракции клеточных стенок М. tuberculosis и S. enteritidis.

Известно, что фенотипический эффект полиморфного варианта гена может зависеть от контекста в котором он действуют, то есть от вида стимулятора, вводимого в культуру клеток. В связи с этим огромный интерес представляет изучение влияния компонентов клеточной стенки М. tuberculosis и S. enteritidis, иммуномодуляторов IFN-y и IL-4, и их комбинаций с микробными агентами на уровень экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток человека.

Известно, что при туберкулезе и сальмонеллезе значительно меняется уровень продукции целого ряда цитокинов [Brightbill, 1999; Kaufmann, 2001; Khalifeh, 2004; Фрейдин, 2006]. Основным активатором макрофагов, клеток выполняющих главную защитную роль против внутриклеточных инфекций, является IFN-y, который регулирует экспрессию более 500 генов и играет значительную роль в координации иммунного ответа на множество сигналов от разных типов клеток [Brewington, 2001]. Дефект синтеза IFN-y, нарушения во внутриклеточной передаче сигнала вызывают иммунологические нарушения, повышающие риск развития бактериальных инфекций [Kincaid, 2003]. В настоящее время установлено, что М. tuberculosis может блокировать эффекты IFN-y путем нарушения транслокации гомодимера транскрипционного фактора STAT1 в ядро, где он стимулирует экспрессию IFN-у-индуцируемых генов провоспалительных цитокинов (TLR2, МСР1 и др.) [Ting, 1999]. Рецептор для IFN-y, состоящий из лиганд-связывающей цепочки IFN-yRl и сигнальной субъединицы рецептора IFN-yR2, является обязательным и незаменимым в развитии иммунитета к внутриклеточным патогеннам. Многочисленные исследования дают основание предполагать существенную роль гена TLR2 и его полиморфизмов в формировании чувствительности к заболеваниям, обусловленных нарушениями в макрофагально - моноцитарной защите. Носительство дефектного гена TLR2 может быть одним из факторов развития туберкулеза (Тб) и сальмонеллеза. В исследованиях О. Pedro (2005) и N. Thuong (2009) доказана причастность

МСР1 (моноцитарный хемотаксический атрактант) к развитию инфекционных заболеваний.

Таким образом, особый интерес вызывает исследование экспрессии генов, несущих полиморфные варианты, различных регуляторных молекул, обеспечивающих начальные этапы развития иммунного ответа: распознавание патогенна, проведение внутриклеточного активационного сигнала, а также синтез цитокинов в условиях воздействия бактериальных компонентов на клетки иммунной системы человека. Цель исследования:

Изучить функциональную вариабельность генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2, вовлеченных в формирование подверженности инфекционным заболеваниям. Задачи исследования:

1. Сформировать на основе биоинформационных данных панель потенциально функциональных однонуклеотидных полиморфизмов в промоторной и интронной областях генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2.

2. Оценить частоту однонуклеотидных полиморфизмов исследуемых генов у здоровых жителей г. Томска.

3. Оценить базальный и стимулированный различными индукторами (неспецифическим индуктором РНА, микробными продуктами TDM и LPS, иммуномодуляторами IFN-y и IL-4) уровень экспрессии генов в краткосрочных культурах мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей.

4. Провести анализ связи уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 с их полиморфными вариантами.

Научная новизна:

Предложен алгоритм поиска функционально значимых полиморфизмов генов с помощью биоинформационных методов и последующего экспрессионного профилирования. Впервые изучена функциональная значимость полиморфизмов С-2508Т гена МСР1, Т-1488С гена IFNG, T/G гена TLR2, А-1831С гена STAT1, G-1704del гена IFNGR2, влияющих на развитие и течение инфекционных заболеваний (туберкулеза и сальмонеллеза). Впервые получены данные о распределении частот аллелей полиморфного варианта rs56000463: T>G в интронной области гена TLR2 в популяции европеоидов. Впервые установлено, что изученные варианты промоторных областей генов МСР1, IFNG и IFNGR2, являются функционально значимыми и влияют на уровень экспрессии генов. Научно-практическая значимость:

Полученные данные об уровне экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей при стимуляции их индукторами микробного и не микробного происхождения дополняют фундаментальные сведения о генетической компоненте запуска и реализации защитных механизмов клеток иммунной системы при инфицировании их М. tuberculosis и S. enteritidis. Данные о функциональной значимости полиморфных вариантов промоторной области генов МСР1, IFNG и IFNGR2, могут служить основой для дальнейшего изучения их ассоциации с риском развития внутриклеточных инфекционных заболеваний. Основываясь на программе Matlnspector, представлен алгоритм поиска полиморфизмов генов, влияющих на генную экспрессию, который может быть использован в дизайне исследований, направленных на установление функционально- и патогенетически значимых вариантов генов. Положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные варианты С-2508Т гена МСР1, Т-1488С гена IFNG, G-1704del гена IFNGR2, выбранные с помощью биоинформационной программы Matlnspector, являются функционально значимыми: уровень экспрессии генов по этим полиморфным вариантам существенно меняется в зависимости от генотипа.

2. У носителей одних и тех же генотипов по исследуемым полиморфизмам разные виды стимуляторов с неизменной концентрацией вызывали разные экспрессионные ответы в культурах клеток.

3. Гомозиготные генотипы -2508СС и -2508ТТ гена МСР1 обладают протективной ролью в развитие туберкулеза и сальмонеллеза, так как ассоциированы с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Аллель -1488С гена IFNG играет протективную роль в развитии иммунита против М. tuberculosis, а аллель -1488Т развитии иммунного ответа при инфицировании S. enteritidis.

Апробация работы:

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), VIII научный конгресс молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), XII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), на Ежегодной Европейской конференции по генетике человека (Барселона, 2008), семинаре по биоинформатике на базе Сибирского государственного медицинского универиситета (Томск, 2008), межлабораторных научных семинарах ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2007, 2009), межлабораторном научном семинаре на базе ЦНИЛ (Томск, 2008), на лекциях по биоинформатике для факультета усовершенствования специалистов (Томск, 2008, 2009). Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале списка ВАК, 1 статья в сборнике, 2 тезисов в материалах отечественных конференций, 1 - в зарубежных.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.