Иммунная регуляция мезенхимных стволовых клеток и их потомков в очагах эктопического кроветворения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Карпенко Дмитрий Владимирович

• Карпенко Дмитрий Владимирович
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Карпенко Дмитрий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение

1.2. Иммунные привилегии мезенхимных стволовых клеток

1.2.1. Обзор истории изучения

1.2.2. Иммунные привилегии стволовых клеток

1.2.3. Иммунные привилегии мезенхимных стволовых клеток и мезенхимных клеток

1.2.4. Описание разработанной модели

1.3. Эпигенетические аспекты регуляции 111Ь и размера очагов эктопического кроветворения

1.3.1. Основания для изучения

1.3.2. Эпигенетика - исторический обзор

1.3.3. Эпигенетика - молекулярная биология

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Животные

2.2. Очаги эктопического кроветворения

2.3. Схемы трансплантации

2.3.1. Пилотный эксперимент

2.3.2. Основной эксперимент

2.3.3. Эксперимент с иммунизацией мышей-реципиентов

2.4. Многоцветная проточная цитометрия

2.5. Критерии включения

2.6. Статистическая обработка данных по иммунному аспекту регуляции мезенхимных стволовых клеток

2.7. Облучение

2.8. Иммунизация

2.9. Иммуноферментный анализ

2.10. Выделение ДНК

2.11. Измерение концентрации ДНК

2.12. Бисульфитная конверсия ДНК

2.13. Традиционная ПЦР

2.14. Определение нуклеотидной последовательности продуктов ПЦР

2.15. Несимметричная ПЦР

2.16. Гель-электрофорез в агарозном геле

2.17. Клонирование продуктов конверсии

2.18. Анализ нуклеотидной последовательности промоторов 111Ь мыши и 1Ь1Б человека

2.19. Определение степени деметилирования CpG в клонах

2.20. Определение степени метилирования CpG в суммарном ПЦР продукте, полученном после конверсии

2.20.1. Алгоритм вычислений

2.20.2. Оценка эффективности конверсии ДНК

2.20.3. Погрешности

2.21. Выделение РНК из тканей и обратная транскрипция

2.22. ПЦР в режиме реального времени

2.23. Обработка данных ПЦР в режиме реального времени

2.24. Праймеры и зонды

2.25. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Иммунные привилегии мезенхимных стволовых клеток

3.1.1. Разработка модели для изучения иммунных привилегий

3.1.2. Оценка иммунной привилегированности мезенхимных стволовых клеток в очагах эктопического кроветворения в неиммунизированных мышах

3.1.3. Оценка иммунной привилегированности мезенхимных стволовых клеток в очагах эктопического кроветворения в иммунизированных мышах

3.2. Сравнение размера очагов эктопического кроветворения в иммунизированных и неиммунизированных реципиентах

3.3. Эпигенетические аспекты регуляции 111Ь и размера очагов эктопического кроветворения

3.3.1. Разработка метода анализа метилирования CpG в ДНК

3.3.2. Исследование метилирования в промоторе гена, кодирующего интерлейкин-1р, у мышей с использованием разработанного метода

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммунные привилегии мезенхимных стволовых клеток и нестин в модели очагов эктопического кроветворения

Метод анализа метилирования CpG в ДНК

Стволовая система как объект изучения взаимодействия механизмов стволовых и иммунных клеток

Обобщение полученных результатов

ВЫВОДЫ

ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунная регуляция мезенхимных стволовых клеток и их потомков в очагах эктопического кроветворения»

Актуальность темы

Кроветворение обеспечивает образование клеток и компонентов крови, отвечающих за транспорт кислорода и углекислого газа, других субстратов и продуктов метаболизма, за остановку кровотечений, передачу и регуляцию сигналов по всему организму, защиту организма от вирусов и бактерий, а также от онкологических заболеваний. Для стабильного и длительного функционирования кроветворения необходим баланс между дифференцировкой гематопоэтических стволовых клеток (ГСК) в соответствии с потребностями организма и поддержанием их пула. Было показано, что поддержание ГСК в состоянии покоя и ассоциированная с ним редкость деления этих клеток важны для сохранения численности их популяции и функциональности [1]. Также было показано, что значительную роль в поддержании ГСК играют мезенхимные клетки (МК), формирующие строму костного мозга (КМ) и специализированные кроветворные ниши для ГСК [2]. В последнее время появляются новые сведения о роли иммунных клеток в поддержании и регуляции стволовых ниш и, в частности, ниш ГСК [3-6].

Стволовая клетка и её окружение взаимно регулируют друг друга, что формирует сложную систему взаимодействий [7; 8]. Показано участие Т-регуляторных клеток в процессах восстановления тканей, поддержания

состояния покоя стволовых клеток и обеспечения их дифференцировки [5; 9; 10]. Для макрофагов показана их роль в процессах восстановления различных тканей, а их дисфункция приводит к нарушению регуляции дифференцировки стволовых клеток и фиброзу [3; 6; 11; 12]. Эпигенетическая регуляция стволовых клеток также является неотъемлемым звеном, поддерживающим сохранность и функционирование стволовых клеток [13]. Нарушения в эпигенетической регуляции могут приводить к серьёзным патологическим состояниям, включая онкологические заболевания [14-16]. В клинической практике применяется несколько препаратов, направленных на эпигенетические механизмы, и ещё

больший спектр препаратов находится на разных стадиях клинических испытаний [17; 18]. Эпигенетические исследования не только предоставляют дополнительные инструменты для диагностики, но и содержат большой объём ещё не изученной и не систематизированной информации.

Понимание механизмов регуляции стволовых и иммунных клеток имеет большое значение для фундаментальной и клинической медицины. Знания об этих механизмах могут стать основой для разработки новых решений в трансляционной медицине и совершенствования протоколов в уже существующих терапевтических подходах. Примером успешного применения знаний о механизмах иммунной регуляции стромальными клетками-предшественницами КМ может служить использование мезенхимных клеток и их продуктов для подавления аутоиммунных процессов [19; 20]. В трансплантологии и гематологии для профилактики и лечения реакции «трансплантат-против-хозяина» используются мезенхимные клетки и их внеклеточные продукты [21; 22]. Другим примером является стимуляция стволовых ниш и активация их механизмов периферической защиты от аутоиммунных реакций вместо стандартной иммуносупрессивной терапии, которая может сопровождаться инфекционными осложнениями [23]. Воспалительные процессы играют ключевую роль в запуске регенерации, однако их избыточная активность замедляет восстановление [24]. Таким образом, понимание механизмов иммунной регуляции стволовых клеток и процессов регенерации может предоставить новые инструменты и решения для управления иммунной системой [24; 25]. Наличие иммунных привилегий в опухолевом микроокружении или непосредственно у опухолевых клеток может потребовать ингибирования различных сигнальных путей в качестве терапии в каждом отдельном случае для достижения большей эффективности персонализированной терапии [26-28]. Таким образом, изучение аспектов регуляции стволовых и иммунных клеток является актуальной задачей для широкого круга медицинских проблем.

Наряду с задачей понимания биологических функций фундаментальное значение имеют вопросы создания и развития методов и инструментов для изучения биологических объектов.

Степень разработанности научной темы

Работы последних лет показывают тесную связь между иммунной системой и стволовыми клетками взрослого организма млекопитающих [29; 30]. Было выдвинуто предположение, что иммунные привилегии характерны для широкого круга покоящихся стволовых клеток, в том числе и для мезенхимных стволовых клеток (МСК), располагающихся в различных соединительных тканях, в том числе в костном мозге [31; 32].

Ранее было показано, что провоспалительные медиаторы, в частности, ИЛ-1Р, являются ростовыми факторами для мезенхимных клеток-предшественниц. Введение мышам интерлейкина-1р (ИЛ-1Р) внутривенно приводило к формированию увеличенных очагов эктопического кроветворения под капсулой почки после имплантации КМ от сингенных доноров [33]. Было отмечено, что сублетальное облучение приводит к аналогичному эффекту, что заставляет ещё раз обратить внимание на фактор некроза опухолей альфа (ТОТ), поскольку показано, что его уровень повышается после облучения [34], а ИЛ-1Р является одним из его генов-мишеней [35]. Было отмечено, что эффект от облучения не зависит от времени, прошедшего после экспозиции. Так, увеличенные очаги кроветворения могут быть получены через несколько месяцев после облучения, а уровень ИЛ-1Р в крови ни в одном из исследований не снижался до уровня до облучения. Всё это указывает на возможность того, что в наблюдаемом феномене задействованы эпигенетические механизмы регуляции [33].

Вместе с работами, посвящёнными эпигенетической регуляции, развиваются и методы ее изучения [36; 37]. Так, например, методы секвенирования нового поколения (NGS), нацеленные на получение большого количества информации, позволяют снизить затраты в расчёте на единичный CpG при широкомасштабном скрининге, но являются излишне дорогими для локального применения в малых

задачах. Так, компания Illumina предлагает анализ 3300000 CpG за один запуск [38]. Отдельно отстоят методы, позволяющие прямое наблюдение модифицированных оснований и выполнение длинных прочтений, как, например, методы, разработанные компаниями Nanopore [39] и PacBio [40]. В дополнение к NGS в научном сообществе представлены разнообразные методы, обладающие различной эффективностью, для изучения локального профиля эпигенетической регуляции ДНК [41-43].

Цель исследования

Установить особенности иммунной регуляции мезенхимных стволовых клеток и их потомков в костном мозге мышей на основании исследования наличия у этих клеток иммунных привилегий и определения роли метилирования промотора гена интерлейкина-ip в клетках различных тканей в формировании очагов эктопического кроветворения.

Задачи исследования

1. Разработать подход, основанный на модели очагов эктопического кроветворения, для исследования воздействия иммунной системы на иммунологически меченные стволовые клетки стромы костного мозга у мышей in vivo.

2. С помощью разработанного подхода исследовать иммунные привилегии мезенхимных стволовых клеток костного мозга в интактных и иммунизированных мышах.

3. Сравнить влияние иммунизации на размер очагов эктопического кроветворения с эффектами от сублетального облучения и введения интерлейкина-

1Р.

4. Разработать усовершенствованный протокол анализа степени метилирования индивидуальных CpG-динуклеотидов, в том числе и входящих в состав промотора гена Illb.

5. Определить профиль метилирования CpG-динуклеотидов промотора гена Illb после сублетального облучения в ряде тканей мышей. Сопоставить его с уровнем экспрессии гена Illb в этих тканях.

Научная новизна

Впервые разработан подход для изучения иммунных привилегий мезенхимных стволовых клеток костного мозга на основе модели очагов эктопического кроветворения и трансгенных мышей.

Экспериментально продемонстрированы иммунные привилегии мезенхимных стволовых клеток и произведена оценка их выраженности.

Показано увеличение размера кроветворной территории очагов, сформированных у иммунизированных мышей-реципиентов.

Разработан эффективный протокол для изучения метилирования индивидуальных CpG-динуклеотидов в локальных участках ДНК.

Показано дифференциальное метилирование в исследованных CpG-динуклеотидах в области -2438 п.н. и -2229 п.н. от старта транскрипции гена Illb мыши.

Теоретическая и практическая значимость

Разработана in vivo модель для изучения механизмов реализации иммунных привилегий различных клеточных субпопуляций костного мозга, включая но не ограничиваясь МСК, у мышей. Модель основана на применении трансгенных мышей линии Nestin-GFP в качестве источника тестируемых на наличие иммунных привилегий клеточных популяций, мышей линии C57Bl/6 в качестве реципиентов, методе формирования очагов эктопического кроветворения под капсулой почки и методе многоцветной проточной цитофлуориметрии.

Продемонстрированные в данной работе иммунные привилегии МСК in vivo позволяют пересмотреть принципы их применения в сторону использования первичных некультивированных клеток в противовес предвартельно культивированным мезенхимным клеткам костного мозга, что может улучшить

клинический эффект от использования МСК при аллоТГСК, трансплантации солидных органов и в целях регенеративной медицины.

Продемонстрированные иммунные привилегии МСК расширяют представления о взаимодействии стволовых (в том числе опухолевых стволовых) клеток и иммунной системы. Это позволяет по-новому взглянуть на вопросы терапии опухолевых заболеваний и, в особенности, воздействия на опухолевые стволовые клетки, которые имеют естественную защиту, характерную для стволовых клеток, и ассоциируются с рефрактерностью, рецидивами, метастазированием.

Предложенный метод изучения метилирования CpG-динуклеотидов, основанный на анализе прочтений по Сэнгеру общего ПЦР-продукта без его предварительного клонирования в Е.свИ, предоставляет эффективный инструмент для изучения локального профиля метилирования ДНК, который может быть использован для диагностики в дополнение к мощным и дорогим инструментам (например, NGS), малоэффективным при изучении локальных областей генома.

Обнаруженная область дифференциального метилирования СрО-динуклеотидов в промоторе 111Ь в совокупности с обнаружением сайтов связывания транскрипционных факторов, содержащих в себе СрО, позволяет углубить понимание регуляции экспрессии интерлейкина-1р, одного из важнейших медиаторов воспаления, в различных тканях организма млекопитающих.

Методология и методы исследования

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с требованиями локального этического комитета ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. Эксперименты на животных включали в себя облучение животных и оперативные вмешательства. Образование очагов эктопического кроветворения инициировали имплантацией костного мозга в виде минимально манипулирванного фрагмента ткани под капсулу почки реципиента, где в течение 6 недель формировалась новая кроветворная территория очага. Мышей-реципиентов забивали дислокацией шейных позвонков, клетки очагов и костного мозга изучали на предмет ОБР+

клеток методами многоцветной проточной цитофлуориметрии. При необходимости клетки очага и иных органов и тканей изымали и из них выделяли РНК для анализа экспрессии генов и/или ДНК для определения метилирования CpG-динуклеотидов. Экспрессию измеряли с помощью ПЦР в режиме реального времени, а метилирование - с помощью метода бисульфитного секвенирования. Оригинальная модификация метода бисульфитного секвенирования на основе тотального ПЦР-продукта представлена в работе. Модель для изучения иммунных регуляций мезенхимных клеток in vivo была основана на линии мышей nes-GFP. Согласно литературе, мезенхимные стволовые клетки этих мышей экспрессируют GFP, в свою очередь, известный как иммуногенный белок. Таким образом, была разработана модель для изучения изогенных трансплантатов, где только малая часть целевых клеток несёт иммуногенный маркёр, а остальная часть клеток иммунологически не отличима от клеток иммунологически полноценного не трансгенного реципиента. Сохранение GFP+ клеток оценивали с помощью многоцветной проточной цитофлуориметрии, а функциональность стволовых клеток - по способности формировать и поддерживать очаг эктопического кроветворения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Мезенхимные стволовые клетки и другие Nes-GFP+ клетки костного мозга мыши обладают иммунными привилегиями, достаточными для их выживания в очагах эктопического кроветворения, даже в условиях направленной активации иммунной системы.

2. Промотор гена Illb мышей содержит область, в которой уровень метилирования CpG-динуклеотидов различается в зависимости от ткани организма.

3. Разработанный на основе трансгенной мышиной линии Nes-GFP и модели очагов эктопического кроветворения подход применим для исследования иммунных привилегий МСК и других клеточных популяций.

4. Разработанный протокол на основе секвенирования суммарного ПЦР-продукта конверсированной ДНК с использованием одного флуорофора эффективен для изучения метилирования СрО-динуклеотидов в локальных участках ДНК.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность полученных выводов обеспечена детальным представлением выполненных экспериментов и произведённого анализа. Используя методы, описанные в литературе и применяемые в мировом научном сообществе, в работе были предложены и проверены новые подходы. Этапы исследования подробно изложены в работе. Все данные, использованные для анализа, приведены в главе «Результаты». Указанные аспекты делают работу воспроизводимой и проверяемой. Работа выполнена на достаточном количестве экспериментальных животных, проведен значительный объем исследований, позволяющий выполнить статистическую обработку полученных данных.

Полученные результаты были представлены в виде стендовых и устных докладов, тезисов на конференциях, конгрессах, съездах: объединенные VI конгресс гематологов России и III конгресс трансфузиологов России (Москва 2022), съезд международного сообщества по эксперементальной гематологии 18ЕИ 2020 (онлайн, 2020), съезд международного сообщества по эксперементальной гематологии 18ЕИ 2021 (онлайн, 2021), всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург 2022), конференция «Прикладная математика иммунологии и вирусологии» (Сириус, 2022), V Национальный конгресс по регенеративной медицине (Москва, 2022), IV международная конференция по клеточной и экспериментальной биологии СЕВ-2023 (Онлайн, 2023), ежегодный съезд междунородного сообщества по изучению стволовых клеток 188СЯ-2023 (Онлайн, 2023). По результатам диссертации опубликовано 14 научных трудов, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства науки и высшего образования РФ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Представленная диссертация соответствует п.3 «Исследования по изучению этиопатогенетических механизмов становления и развития наследственных и приобретенных болезней системы крови, основанных на достижениях естественных и фундаментальных наук (морфологии, молекулярной и клеточной биологии, генетики, иммунологии, биохимии и других), в том числе экспериментальных» и п.10 «Исследования гемопоэтических стволовых, мезенхимных стромальных и отдельных видов соматических клеток человека и разработки в области клеточных технологий в гематологии с целью внедрения в клиническую практику новых методов терапии и профилактики» паспорта специальности 3.1.28. Гематология и переливание крови, а также п.4 «Транскрипция, регуляция транскрипции, в том числе эпигенетическая, регуляторные элементы генома, регуляторные сети» паспорта специальности 1.5.3. Молекулярная биология (отрасль науки - биологические, медицинские).

Личный вклад автора

Автор лично участвовал в формировании цели и задач исследования, в составлении дизайна исследования, проведении экспериментов и исследований, получении и обработке полученных результатов. Основной массив экспериментальной работы по анализу метилирования CpG-динуклеотидов, посадке очагов эктопического кроветворения, интерпретации полученных данных, а также в подготовке научных статей к публикации, выполнены лично диссертантом.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа, с учётом приложений, представлена на 177 страницах и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», заключения, выводов, списка основных сокращений и перечня литературы (331 источник). Работа содержит 7 таблиц и 40 рисунков.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение

Кроветворение обеспечивает широкое разнообразие клеток и компонентов крови, отвечающих за транспорт кислорода и углекислого газа, других субстратов и продуктов метаболизма, за остановку кровотечений, передачу и регуляцию сигналов по всему организму, за защиту организма от вирусов и бактерий, а также за подаление раковых клеток. Основным источником клеток крови взрослого человека является костный мозг, где находятся гематопоэтические стволовые клетки (ГСК). Для стабильного и длительного функционирования кроветворения необходим баланс между корректной дифференцировкой ГСК, в соответствии с потребностями организма, и поддержанием их пула. Было показано, что удержание ГСК в покоящемся состоянии важно для сохранения их функциональности и сохранения их субпопуляции [1]. ГСК располагаются и функционируют в так называемых кроветворных «нишах», а значительную роль в их формировании играют мезенхимные клетки (МК), составляющие строму костного мозга (КМ) [2]. Вместе с тем появляются новые сведения о роли иммунных клеток в поддержании и регуляции стволовых ниш и в частности ниш ГСК [3-6]. Работа посвящена изучению ниши кроветворных клеток в лице мезенхимных клеток, в том числе мезенхимных стволовых клеток, под действием иммунной системы.

Существует ряд основных подходов, с помощью которых изучают характеристики МК. Длительные культуры костного мозга (ДККМ) декстеровского типа являются одной из моделей для изучения МК костного мозга [44]. Культура представляет собой композицию различных прикреплённых к пластику клеток кроветворного и стромального происхождения, а также суспензионную фракцию, состоящую, в основном, из кроветворных клеток. С помощью модели была продемонстрирована необходимость стромальных клеток для поддержания ГСК и формирования ниши для их функционирования [45]. Культивирование мезенхимных прикреплённых клеток на пластике можно

выделить как отдельный подход в их изучении [46]. Он позволяет изучать кумулятивную продукцию белков и экспрессию генов, а также воздействие различных факторов, как на саму гетерогенную культуру мезенхимных клеток, так и их влияние на другие клетки при контактной или бесконтактной кокультивации [21; 47]. Изучение потенциалов дифференцировки и пролиферации у индивидуальных стромальных клеток-предшественниц изучается посредством метода колониеобразующих единиц фибробластных (КОЕф) - ближайших из известных потомков МСК [48; 49]. Метод изучает формирование колоний прикреплённых к пластику клеток, высеянных в пластиковую культуральную посуду в концентрации, позволяющей различение индивидуальных колоний. Метод позволяет оценивать состояние стромы КМ - о нем можно судить по количеству КОЕф и их скорости роста. КОЕф исследуются на маркёры остеогенной дифференцировки в виде увеличения экспрессии щелочной фосфатазы и отложения кальция, адипогенной дифференцировки с помощью окрашивания нейтральных жировых вакуолей красителем oil red O, и хондрогенной дифференцировки, определяемой с помощью окрашивания антителами к коллагену второго типа и по морфологическим признакам. Изучаться может как индуцированная факторами дифференцировка, так и спонтанная дифференцировка. Метод формирования очагов эктопического кроветворения (ОЭК) в экстрамедуллярных областях, в частности, под капсулой почки мыши является одним из основных методов изучения стромы костного мозга in vivo [50].

Метод ОЭК является экспериментальной основой выполненной работы и будет рассмотрен подробнее. В работе ОЭК используется в качестве основного метода изучения МСК in vivo. Экспериментальная суть модели заключается в том, что костный мозг бедра мыши-донора в виде цельного фрагмента ткани помещается под капсулу почки мыши-реципиента. В месте имплантации костного мозга запускается процесс формирования кроветворной территории de novo. Кроветворные клетки почти полностью покидают имплантат, и имплантированный костный мозг оказывает сильное стимулирующее действие на ангиогенез и пролиферацию эндотелия сосудов, которые врастают в имплантат и

восстанавливают в нём циркуляцию уже через 24 ч [51]. Из сети ретикулярных клеток возникает регенераторная бластема, видимая уже через 2 суток после имплантации. Активно пролиферируют примитивные мезенхимные и ретикулярные клетки и дифференцирующиеся из них остеобласты [52; 53]. Остеобласты, образующие прочный матрикс, быстро строят губчатую кость. Через 8 суток появляются первые синусоидные сосуды, которые в течение двух суток заполняют всю костномозговую полость. В это же время выявляются и кроветворные клетки всех типов дифференцировки, в том числе и остеокласты. Последние лизируют кость, остаётся только её ламинарный остов в виде тонкой раковины. Кроветворение восстанавливается, и новообразованная кроветворная территория соответствует обычному костному мозгу, расположенному в губчатых костях скелета, как по клеточному составу, так и по относительному содержанию ГСК. Очаг стабилен и существует неопределенно долго [54]. Новообразованная кроветворная территория участвует в кроветворении как обычные костномозговые плацдармы. В таком очаге нормально протекают процессы регуляции кроветворения [55; 56]. Таким образом, под капсулой почки образуется полноценный очаг эктопического кроветворения. Основная часть стромы очага имеет донорское происхождение, а кроветворные клетки, в основном, принадлежат реципиенту [57]. Тем не менее в таких очагах могут сохраняться и кроветворные клетки донора: по разным оценкам их может быть от 15% до 40% от всех делящихся в очаге кроветворных клеток [56-60]. Весь процесс построения очага занимает 42 дня. Для формирования кроветворной территории и её поддержания необходимы донорские МСК [61]. Преимущество данной экспериментальной модели над введением МСК внутрикостно заключается в том, что она позволяет наблюдать не только покоящиеся стволовые клетки, но и их потомков, формирующих очаг, и, вместе с тем, оценивать воздействие иммунной системы на клетки донора в случае аллогенного или изогенного реципиента.

Современные методы предлагают богатое разнообразие подходов для изучения тканей и клеток, среди которых флуоресцентная микроскопия, в том числе и прижизненная [62], использование системы Сге-рекомбиназы для

наследуемого маркирования целевых субпопуляций клеток [63], а также методы анализа экспрессии с использованием высокопроизводительного секвенирования [64] и анализ индивидуальных клеток с использованием многоцветного окрашивания на специфические маркёры [65].

Комбинация классических и современных методов позволяет получить новые данные о функциях МК. Несмотря на богатство инструментов иследования, многие аспекты остаются недостаточно изученными. Определение МСК вызывает значительные разногласия и приводит в ряде случаев к различным выводам [6669]. Разногласия возникают не только из названия МСК, но и из их описания: так, например, мезенхимные стволовые клетки рассматриваются с разных сторон и характеризуются различным фенотипом [61; 70-75]. Значительные затруднения связаны с тем, что популяция стволовых клеток - это крайне малая доля 10-4-10-6 клеток костного мозга [68; 76; 77], а попытки их селекции и обогащения приводят к их дифференцировке, поскольку стволовые клетки нуждаются в соответствующих межклеточных сигналах, поддерживающих их стволовой статус [32, 78-81].

Первая часть работы посвящена демонстрации факта наличия иммунных привилегий у мезенхимных стволовых клеток [68]. При изучении очагов эктопического кроветворения в иммунизированных реципиентах было отмечено увеличение их размеров как и в работах с облучёнными реципиентами. Было выдвинуто предположение о том, что в формировании увеличенных очагов кроветворения играют роль провоспалительные факторы, поскольку их содержание в крови повышается как при иммунизации, так и при облучении. Известно, что уровень экспрессии провоспалительных факторов, в частности, ИЛ -1Р регулируется в том числе и на эпигенетическом уровне. Вторая часть данной диссертационной работы посвящена изучению эпигенетической регуляции метилирования CpG в составе промотора провоспалительного цитокина ИЛ-1Р и его связи с формированием очагов увеличенного размера [82].

1.2. Иммунные привилегии мезенхимных стволовых клеток

В клинике зачастую встречаются случаи терапии аллогенными мезенхимными стволовыми клетками (МСК), что поднимает вопрос об их иммунной привилегированности [21; 83]. Однако результаты клинической трансплантации и терапии от аллогенного донора показывают формирование иммунного ответа и неприживление МСК [84]. Таким образом, исследователи склонны отказываться от идеи иммунной привилегированности МСК [84].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Карпенко Дмитрий Владимирович, 2025 год

г - Л

• •

•

•

• •

• • •

Рисунок Б.3 - Профиль метилирования выбранных СрО в промоторе гена 111Ь в костях до и на разные сроки после облучения. (А) Данные по клонам

продукта ПЦР. (Б) Данные по суммарному продукту ПЦР. Контекст экспериментальных данных представлен и используется в дальнейшем в разделе Исследование метилирования в промоторе гена, кодирующего интерлейкин-1р, у

мышей. Черные столбцы обозначают необлученный контроль, столбцы серого градиента обозначают данные полученные на +1, +7, +60, +270 и +600 дней после

облучения мышей. (В) Данные, согласно двум методам, представленные графиком Бленда-Альтмана. По горизонтали - среднее между методами значение метилирования для каждого СрО образца, по вертикали - разница между значениями с рисунка А и Б. Красная линия отображает среднее смещение оценки, а зелёные доверительный интервал

Мы можем отметить, что в области большего деметилирования разработанный подход даёт завышенные значения (рисунок Б.3В). Это объясняется потенциальной возможностью для метода возвращать значение больше 1 вследствие вариаций сигнала флуоресценции, в то время как анализ, основанный на клонах, зажат строго в значениях < 1. Это различие можно компенсировать дополнительной нормировкой. Большее отличие в диапазоне Ср07-10 в данном случае ассоциируется с тем, что получить качественное прочтение с используемых праймеров было сложнее, что отразилось в искажении результата (рисунок Б.3В). Это отражается в большем доверительном интервале для этих значений, полученных согласно предложенному подходу. Однако построение графика Бленда-Альтмана не позволяет учесть данные о погрешности значений, таким образом, данные дополнены представлением с указанием погрешностей (рисунок Б.3А,Б). Основываясь на проверке нового подхода в контролируемых условиях (рисунок 26) и с учетом сравнения разработанного метода с «золотым стандартом», а также с учётом предлагаемого уменьшения ресурсозатрат, было заключено, что подход, разработанный в рамках данной диссертации может быть использован для последующего анализа степени метилирования индивидуальных СрО в ДНК.

Несмотря на то, что разработанный метод позволяет успешно анализировать уровень метилирования по суммарному ПЦР-продукту, он имеет ряд недостатков,

часть из которых может быть устранена, а часть является существенным недостатком. Значительные сложности происходят из ошибок полимеразы, когда создаются минорные пики ассоциированные со сдвигом в несколько нуклеотидов. Происходит это на polyT/polyA участках. Такие ошибки характерны для любых методов, включающих синтез новых цепей ДНК, в том числе и при использовании платформ NGS, таких как Illumina, особенно, когда матрицей для синтеза служит конверсированная ДНК. Эта проблема может быть уменьшена при возможности работы с более точными полимеразами. Сдвиг минорных пиков следует учитывать при расчёте доли метилированных CpG в выбранной позиции образца. Сдвинутые минорные пики, как правило, не вносили искажения в «отношение доли неметилированных CpG в образцах к их доле в контроле». Проблему минорных пиков, возникающую в прочтении после участков с повторяющимся основанием, в ряде случаев удаётся обойти, анализируя обратные прочтения, полученные с комплементарной цепи. В таком обратном прочтении участок с непостоянным количеством повторяющегося основания находится после CpG, который был им искажён. В случае множественных областей длинных повторов необходимо учитывать вклад минорных пиков.

Сигнал канала А даёт гашение сигнала канала Т при одновременной регистрации, и при выборе референсных позиций Т. и Т+ нужно обращать внимание на соседние с Т нуклеотиды, чтобы избегать такого влияния. Иначе необходимо также нормировать канал А и учитывать связь АТ. Связь каналов флуоресценции капиллярного секвенатора не всегда может быть точно оценена аналитически с помощью программного обеспечения, что вносит ошибку. Ошибка, связанная с неправильными связями каналов, может быть устранена более точным подбором параметров обработки сиквенса. Прямое и обратное прочтение могут отличаться в результате на 0,2, как было представлено выше. При большом количестве циклов ПЦР (35 и более циклов) возможна наработка продукта с единичных молекул ДНК или их малого количества. Метод изучает общий пул молекул ДНК и принципиально не позволяет выделить соотношение между статусами метилирования различных CpG в каждой молекуле, дающей сигнал. Это также

естественным образом ограничивает изучение малых субпопуляций в исследуемых образцах.