Индукция остеогенеза рекомбинантным эритропоэтином с использованием органоидов кости (экспериментальное исследование in vitro) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Надеждина Наталья Анатольевна

• Надеждина Наталья Анатольевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Надеждина Наталья Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Эритропоэтин: свойства и плейотропные эффекты

1.2 Роль мезенхимных стволовых клеток и эритропоэтина в процессе формирования костной ткани

1.3 Органоиды как новый инструмент для моделирования заболеваний и оценки эффективности лекарственных средств

1.4 Ремоделирование костной ткани и модели in vitro

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы исследования

2.1.1 Соответствие работы правилам и рекомендациям по проведению экспериментальных исследований

2.1.2 Лекарственные препараты, используемые в экспериментальном исследовании

2.1.3 Клеточная линия, использованная в экспериментах in vitro

2.1.4 Модель трабекулярного костного органоида

2.2 Методы исследования

2.2.1 Оценка влияния рекомбинантного эритропоэтина на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток человека

2.2.2 Оценка влияния золедроновой кислоты и бевацизумаба на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток человека

2.2.3 Оценка влияния рекомбинантного эритропоэтина на дифференцировку мезенхимных стволовых клеток человека в остеогенном направлении

2.2.4 Оценка влияния лекарственных препаратов на пролиферацию остеобластов и эндотелиальных клеток в трабекулярном костном органоиде

2.2.5 Оценка влияния лекарственных препаратов на формирование остеогенной соединительной ткани в трабекулярном костном органоиде

2.2.6 Оценка влияния лекарственных препаратов на объем образованных соединительнотканных структур в трабекулярном костном органоиде

2.2.7 Оценка влияния лекарственных препаратов на функциональную активность митохондрий в клетках, формирующих фиброваскулярную остеогенную ткань в трабекулярном костном органоиде

2.2.8 Статистическая обработка данных

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Оценка влияния рекомбинантного эритропоэтина на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток человека

3.2 Оценка влияния золедроновой кислоты и бевацизумаба на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток человека

3.3 Оценка влияния рекомбинантного эритропоэтина на дифференцировку мезенхимных стволовых клеток человека в остеогенном направлении

3.4 Модель трабекулярного костного органоида

3.5 Оценка влияния лекарственных препаратов на пролиферацию остеобластов и эндотелиальных клеток в трабекулярном костном органоиде

3.6 Оценка влияния лекарственных препаратов на формирование остеогенной соединительной ткани в трабекулярном костном органоиде

3.7 Оценка влияния лекарственных препаратов на объем образованных соединительнотканных структур в трабекулярном костном органоиде

3.8 Оценка влияния лекарственных препаратов на функциональную активность митохондрий в клетках, формирующих фиброваскулярную остеогенную ткань в

трабекулярном костном органоиде

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение А. Патент на изобретение «Способ формирования трабекулярного костного органоида»

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Индукция остеогенеза рекомбинантным эритропоэтином с использованием органоидов кости (экспериментальное исследование in vitro)»

Актуальность темы исследования

В настоящее время дефекты костной ткани, которые обычно возникают в результате травмы, костной инфекции или удаления костных опухолей составляют значительную часть переломов конечностей и вызывают снижение качества жизни пациентов. Поэтому эффективное лечение и терапия заболеваний костей имеет большое клиническое значение. Важно подчеркнуть, что согласно прогнозам, отмечается рост на 115% в период с 2020 по 2050 год заболеваний опорно-двигательного аппарата, что свидетельствует о низкой эффективности терапии существующими лекарственными средствами и методов реабилитации

[71].

Прежде чем выйти на рынок, большинство препаратов для лечения заболеваний костей требуют тщательного тестирования in vitro и in vivo. Например, это препараты препятствующие резорбции костей, стимулирующие рост костей, ангиогенные и противовоспалительные лекарственные средства. Основными недостатками традиционных методов испытаний являются органная токсичность, длительный цикл и высокая стоимость [134]. Создание костных органоидов значительно сократит цикл испытаний и уменьшит их стоимость. С другой стороны, органоидные методы могут более точно имитировать физиологические и патологические состояния на клеточном уровне по сравнению с 2D-культурой. Органоиды, полученные от пациента, сохраняют гистологические характеристики и гетерогенность заболеваний и представляют собой идеальную модель для поиска новых терапевтических эффектов существующих на рынке лекарственных средств или являться инструментом скрининга новых перспективных субстанций.

На сегодняшний день костные органоиды предоставляют достаточный ресурс для тестирования лекарств, претендующих на остеоиндуктивность, особенно, из-за отсутствия необходимости крупномасштабных доклинических исследований in vivo. Таким образом, костные органоиды являются отличной

моделью для прогнозирования результата регенерации костной ткани, определения эффективной терапевтической дозы и выявления механизмов терапевтического действия.

Сегодня для терапии заболеваний различного генеза применяют лекарственные препараты, полученные с использованием методов генной инженерии, среди которых особый интерес представляет рекомбинантный эритропоэтин человека (рчЭПО), который обладает плейотропным эффектом [145]. Было показано, что кроме регуляции гемопоэза эритропоэтин (ЭПО) опосредует формирование костной ткани, так как воздействует на гемопоэтические и стромальные стволовые клетки, но эффекты и механизмы остеогенеза при регенерации костной ткани с участием эритропоэтина до конца не изучены.

В связи с вышеизложенным, поиск новых способов терапевтических воздействий и более эффективных стратегий лечения остается актуальной задачей современной регенеративной фармакологии.

Степень разработанности темы исследования

Известно, что рецепторы эритропоэтина (EPOR) присутствуют в негематопоэтических тканях, именно это обстоятельство позволяет предположить, что ЭПО имеет специфические функции в других тканях организма за пределами гематопоэтических тканей [108]. Следует отметить, что высокие дозы ЭПО необходимы, чтобы обеспечивать его тканезащитные эффекты по сравнению с гематопоэтическими эффектами, где нужны низкие концентрации [25].

Обоснованием того, что ЭПО может влиять на остеогенные клетки является природа взаимодействия прогениторных остеогенных клеток с гемопоэтическими клетками [155]. Было показано, что остеогенная активность in vivo усиливается после прямой абляции или травмы костного мозга [122]. Исследования в опытах in vivo при моделировании травмы кости у мышей показали эффективность высоких концентраций ЭПО от 500 ME/кг/день до 5000 ME/кг/день, однако эффект от лечения нивелировался при продолжительном лечении ЭПО [52, 101].

Эти результаты позволили предположить, что ЭПО оказывает остеоиндуктивное действие только на начальных фазах остеогенеза.

В связи с этим, на первый план выступает фиброваскулярная фаза остеогенеза, где основным клеточным компонентом выступают фибробласты, остеопрогениторные клетки и мезенхимные стволовые клетки (МСК). Остеопрогениторные клетки и МСК стимулируются цитокинами и гипоксической средой для пролиферации, концентрации и дифференцировки в остеобласты формируя матрикс [23].

Для подтверждения данной гипотезы была разработана модель трабекулярного костного органоида, которая соответствует фиброваскулярной фазе внутримембранозного остеогенеза. Анализ открытых источников показал, что ЭПО взаимодействует с гетеродимерным рецептором EPOR/^cR(CD131) с последующей активацией неканонического сигнального пути JAK/STAT. JAK2, за которым следует фосфорилирование и активация STAT, а также активация других путей PI3K/AKT и ERK1/2. Было отмечено, что фосфорилированные субъединицы STAT5 STAT5A и STAT5B димеризуются и транслоцируются в ядро, чтобы активировать экспрессию генов Bcl-xL, NF-kB, TGF-в и Runx-2 [89, 119, 141].

В связи с вышеизложенным, появились предпосылки для разработки плана исследований, где основной акцент ставился на определении экспрессии фактора транскрипции Runx-2 и активности митохондрий при одновременной оценки роста соединительнотканных структур и формированием остеогенной ткани костного органоида в сравнении с лекарственными средствами обладающими ингибирующим действием как в отношении остеобластов, так и эндотелиальных клеток [21, 110].

Цель исследования

Повышение эффективности остеогенеза при применении рекомбинантного эритропоэтина человека эпоэтина альфа в качестве остеоиндуктора на экспериментальной модели костного органоида.

Задачи исследования

1. Разработать модель костного органоида человека.

2. Определить эффективную дозу рекомбинантного эритропоэтина для активации пролиферации мезенхимных стволовых клеток в сравнении с бевацизумабом и золедроновой кислотой.

3. Установить эффективную дозу рекомбинантного эритропоэтина для индукции остеогенеза при культивировании мезенхимных стволовых клеток.

4. Выявить протективное или ингибирующее действие рекомбинантного эритропоэтина в сравнении с бевацизумабом и золедроновой кислотой на пролиферацию остеобластов и эндотелиальных клеток с использованием моделей костного органоида.

5. Исследовать влияние рекомбинантного эритропоэтина в сравнении с бевацизумабом и золедроновой кислотой на формирование остеогенной соединительной ткани и рост соединительнотканных структур с использованием моделей костного органоида.

6. Оценить влияние рекомбинантного эритропоэтина на митохондриальный биогенез в сравнении с бевацизумабом и золедроновой кислотой в клетках, формирующих фиброваскулярную остеогенную ткань в трабекулярном костном органоиде.

7. Определить возможные механизмы терапевтического действия рекомбинантного эритропоэтина.

Научная новизна исследования

В настоящем исследовании впервые использована модель трабекулярного костного органоида для определения остеоиндуктивных свойств лекарственного препарата с действующим веществом рчЭПО в сравнении с бевацизумабом и золедроновой кислотой.

Впервые продемонстрирован остеоиндуктивный эффект рчЭПО в дозе 20 МЕ/мл на моделях костного органоида. Было установлено, что применение рчЭПО приводит к повышению пролиферации и дифференцировки МСК в остеогенном направлении, увеличению пролиферации остеобластов и

эндотелиоцитов, стимулированию роста соединительнотканных структур костного органоида с формированием остеогенной ткани, усилению активности митохондрий и уменьшению внутриклеточной генерации активных форм кислорода.

Впервые продемонстрировано ингибирующее действие рчЭПО в дозе 200 МЕ/мл на пролиферацию и дифференцировку мезенхимных стволовых клеток в остеогенном направлении.

Впервые показано ингибирующее действие на остеогенез бевацизумаба в дозе 0,25 мг/мл и золедроновой кислоты в дозе 8 мкг/мл на моделях костного органоида. Установлено, что применение бевацизумаба или золедроновой кислоты приводит к уменьшению пролиферации МСКч, остеобластов и эндотелиоцитов, угнетению роста соединительнотканных структур костного органоида и формирования остеогенной ткани, снижению активности митохондрий и повышению внутриклеточной генерации активных форм кислорода.

Впервые предполагается, что фармакологическая активность рчЭПО реализуется за счет индукции факторов транскрипции остеогенеза и активации эндотелиальной синтазы оксида азота, повышающей активность митохондрий при остеогенезе в экспериментальной модели трабекулярного костного органоида.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты настоящего исследования демонстрируют перспективность дальнейшей разработки нового направления профилактики и лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата, направленного на разработку новых лекарственных средств индукторов экспрессии остеогенных факторов транскрипции и эндотелиальной синтазы оксида азота.

Установленный остеоиндуктивный эффект препарата рчЭПО свидетельствует о перспективности его применения для коррекции остеогенеза и эндотелиальной протекции. Выявленный фармакологический эффект, через индукцию факторов транскрипции остеогенеза и повышение активности митохондрий посредством активации эндотелиальной синтазы оксида азота,

формирует предпосылки для продолжения доклинических исследований данного терапевтического эффекта на других экспериментальных моделях, как в опытах in vitro, так и in vivo. Важно подчеркнуть, что выявленная доза рчЭПО может быть использована для активации остеогенеза при местном однократном применении в зоне повреждения костной ткани, на начальных этапах процесса регенерации.

Методология и методы исследования В экспериментальном исследовании in vitro использован современный подход к изучению остеоиндуктивного действия лекарственного препарата рчЭПО эпоэтина альфа при однократном добавлении в питательную среду в сравнении с лекарственными препаратами бевацизумабом и золедроновой кислотой на модели трабекулярного костного органоида. Методологические подходы, используемые в данном исследовании, были определены согласно поставленным задачам исследования. Протокол и дизайн эксперимента разработан в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств [4, 97], с применением современного специализированного сертифицированного оборудования, при помощи которого были получены достоверные и репрезентативные результаты. Расчет доз и введение изучаемых фармакологически лекарственных препаратов подобраны в ходе проведения экспериментов. Исследование выполнено на кафедре фармакологии и клинической фармакологии, в НИИ Фармакологии живых систем и на базе Биологического учебно-научного комплекса «Инновационные решения» института фармации, химии и биологии НИУ «БелГУ».

Внедрение результатов научных исследований Результаты экспериментального исследования in vitro показали высокую фармакологическую активность рчЭПО на модели костного органоида, что позволяет провести доклинические исследования в опытах in vivo по коррекции нарушений регенерации костной ткани и других патологических состояний, ассоциированных с нарушением пролиферации и дифференцировки прогениторных клеток.

Полученные результаты диссертационной работы используются в учебно-методической и научно-исследовательской деятельности кафедры фармакологии и клинической фармакологии и НИИ Фармакологии живых систем ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», что подтверждается соответствующими актами внедрения.

Положения, выносимые на защиту

1. Рекомбинантный эритропоэтина человека эпоэтин альфа в дозе 20 МЕ/мл активирует пролиферацию мезенхимных стволовых клеток, тогда как бевацизумаб в дозе 0,25 мг/мл и золедроновая кислота в дозе 8 мкг/мл оказывают ингибирующее действие.

2. Рекомбинантный эритропоэтин человека эпоэтин альфа в дозе 20 МЕ/мл оказывает остеоиндуктивное действие, направляя дифференцировку мезенхимных стволовых клеток в остеогенном направлении.

3. Рекомбинантный эритропоэтин человека эпоэтин альфа в дозе 20 МЕ/мл оказывает цитопротективное действие, стимулируя пролиферацию остеобластов и эндотелиоцитов, тогда как бевацизумаб в дозе 0,25 мг/мл и золедроновая кислота в дозе 8 мкг/мл оказывают ингибирующее действие на остеогенные клетки с использованием моделей костного органоида.

4. Рекомбинантный эритропоэтин человека эпоэтин альфа в дозе 20 МЕ/мл стимулирует формирование остеогенной соединительной ткани и рост соединительнотканных структур, тогда как бевацизумаб в дозе 0,25 мг/мл и золедроновая кислота в дозе 8 мкг/мл оказывают ингибирующее действие на остеогенез в экспериментальной модели трабекулярного костного органоида.

5. Рекомбинантный эритропоэтин человека эпоэтин альфа в дозе 20 МЕ/мл увеличивает функциональную активность митохондрий и уменьшает окислительную активность кислорода в клетках, формирующих фиброваскулярную остеогенную ткань в трабекулярном костном органоиде, тогда как бевацизумаб в дозе 0,25 мг/мл и золедроновая кислота в дозе 8 мкг/мл оказывают противоположное действие.

6. Механизм действия рекомбинантного эритропоэтина человека эпоэтина альфа направлен на индукцию экспрессии фактора транскрипции остеогенеза Runx2 через активацию неканонического сигнального пути JAK/STAT и увеличение митохондриального биогенеза через активацию неканонического сигнального пути JAK/PI-3K/Akt-1 и эндотелиальной синтазы оксида азота в экспериментальной модели трабекулярного костного органоида.

7. Модель трабекулярного костного органоида может использоваться для оценки эффективности лекарственных средств, обладающих цитопротективным или ингибирующим действием на остеогенез, в опытах in vitro.

Личный вклад

Автор выполнил поиск и провел анализ открытых отечественных и зарубежных источников литературы по теме исследования. Совместно с научным руководителем автор определил цель и задачи исследования, выдвинул гипотезу о возможных механизмах терапевтического действия рчЭПО эпоэтина альфа, разработал дизайн исследования и выполнил набор экспериментального материала, провел статистическую обработку данных, осуществил описание полученных результатов. Автор подготовил и опубликовал результаты исследования. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах данного исследования.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов настоящего исследования обусловлена достаточным количеством наблюдений и использования методического блока, соответствующего задачам исследования. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с оценкой достоверности различий.

Результаты диссертации представлены на V Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 23-25 ноября 2022); всероссийской научно-практической конференции с международным участием «НИИ фармакологии живых систем: семь лет пассионарного развития» (Белгород, 10 апреля 2023); IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики» (Кемерово, 24 мая 2024);

девятой междисциплинарной конференции «Молекулярные и биологические аспекты химии, фармацевтики и фармакологии» (Сыктывкар, 28 мая - 1 июня 2024); III международной научно-практической конференции «Разработка лекарственных средств: традиции и перспективы» (Томск, 18-20 сентября 2024); всероссийской научной конференции, посвященной 40-летию НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга «Фармакологические подходы в регенеративной медицине» (Томск, 7-10 октября 2024); всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Артура Викторовича Вальдмана «Трансляционный мост: экспериментальная фармакология - клинической медицине» (Санкт-Петербург, 17-18 октября 2024); международной научно-практической конференции «Генетические технологии для биологии и медицины» (Белгород (Россия), Дэчжоу (Китай), ноябрь 2024).

Публикации

Результаты исследования опубликованы в 14 работах в центральной и местной печати, в том числе 4 статьи - в изданиях, индексируемых в международной реферативной базе данных Scopus, получен 1 патент на изобретение РФ; опубликовано 9 работ в других научных изданиях и сборниках материалов конференций.

Объем и структура работы

Диссертационное исследование изложено на 117 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 38 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы, включающего 155 источников, и одного приложения.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Эритропоэтин: свойства и плейотропные эффекты

ЭПО представляет собой гликопротеиновый гормон, является членом суперсемейства цитокинов I типа, наибольшее сходство ЭПО отмечается с цитокинами, которые модулируют рост и воспаление [54]. ЭПО на 60% состоит из белка и на 40% из углеводов. Например, молекулярная масса рчЭПО эпоэтина альфа составляет 28-30,4 кДа [91, 126, 127]. Особенностью эритропоэтина является его мультифункциональность, так как в зависимости от условий данный белок может функционировать как цитокин, гормон и фактор роста. Цитокиновая активность ЭПО проявляется посредством его взаимодействия со специфическими рецепторами, локализованными на поверхности таргетных клеток, тем самым открывая путь к трансдукции сигналов из внешней во внутреннюю среду клеток-мишеней. ЭПО действует как классический гормон, так как он синтезируется в одном органе (интерстициальные клетки перитубулярного капиллярного ложа коры почек у взрослого организма или в перисинусоидальных клетках печени в ходе эмбрионального и перинатального периода), затем происходит его секреция в кровяное русло, где он влияет на удаленные структуры, органы кроветворной системы (предшественники красных клеток крови и предшественники, обнаруженные в костном мозге человека). И, наконец, как фактор роста ЭПО необходим для формирования зрелых красных клеток крови из мультипотентных клеток-предшественниц [152].

Ген человеческого ЭПО кодирует белок-предшественник, включающий 193 аминокислотных остатка [61]. Отщепление 27-аминокислотной ведущей последовательности приводит к формированию зрелого протеина, который подвергается К-гликозилированию в трех аспарагиновых остатках, О-гликозилированию в сериновом остатке, С-терминальный аргинин удаляется для того, чтобы создать финальную циркулирующую форму, включающую 165 аминокислотных остатков.

Таким образом, зрелый ЭПО тяжело гликозилирован, имеет три N связанные и одну О-связанную кислотные олигосахаридные боковые цепочки [91, 126]. Четыре антипараллельные а-спирали (аА, аВ, аС и аD в порядке от К-конца к С-концу) со смежными циклами определяют пространственную третичную структуру ЭПО [36]. Гликозилированные цепочки поддерживают биологическую активность ЭПО и обеспечивают стабильность структуры [61]. Молекула ЭПО является гидрофобной и требует наличия интактных дисульфидных мостиков для осуществления активности [126].

Продукция ЭПО зависит от скорости транскрипции гена эритропоэтина (локализованного в 7 хромосоме). В процесс вовлечены несколько транскрипционных факторов. Промотер гена ЭПО угнетается GATA-2 и ядерным фактором кВ (ОТ-кВ), которые вероятно ответственны за ослабление экспрессии ЭПО при воспалительных заболеваниях [86, 91]. Почки являются первичной областью продукции ЭПО. При гипоксии в почечных перитубулярных фибробластах повышается экспрессия гена эритропоэтина посредством индуцируемого гипоксией фактора транскрипции и происходит последующее высвобождение ЭПО в циркуляторное русло. До рождения печень является первичной областью продукции ЭПО, во взрослом организме обеспечивает синтез ЭПО на 10%. Преимущественная экспрессия ЭПО происходит в почках, печени, однако транскрипты встречаются и в других тканях, включая мозг, сердце, легкие [90, 127].

Известно, что ЭПО связывается с мембранными рецепторами, локализованными на поверхности клеток-мишеней. Рецептор EPOR принадлежит I классу суперсемейства цитокиновых рецепторов, которые характеризуются наличием внеклеточной К-терминальной последовательности. Зрелый EPOR человека представляет собой гликопротеин, включающий 484 аминокислотных остатка и 1 К-гликан [90].

В гематопоэтических клетках две молекулы EPOR образуют гомодимер (EPOR/EPOR) с высокой аффинностью к его лиганду [127]. Связывание с ЭПО индуцирует конформационные изменения и плотное соединение двух

мономерных молекул EPOR. Это приводит к сближению молекул янус-киназ 2 (JAK2) [88], которые контактируют с EPOR в околомембранной области с последующим трансфосфорилированием. Активация JAK2 приводит к фосфорилированию нескольких тирозиновых остатков EPOR, которые служат сайтами прикрепления сигнальных молекул [29, 59, 61]. Активированная JAK2 запускает сигнальный путь посредством ядерного фактора каппа B (NF-kB) [58].

Известно, что ЭПО является главным активирующим фактором сигнального пути JAK2/STAT3, запуск которого широко подтвержден при развитии заболеваний крови и сердечно-церебральных сосудистых заболеваниях [45]. Когда путь сигнальной трансдукции STAT3 активирован, активированный STAT3 непосредственно передает сигнал в ядро и регулирует ряд генов [44]. STAT 5 и NF-kB транслоцируются в ядро и действуют как транскрипционные факторы для Bcl-2, Bcl-xL и антиапоптотических генов [47, 58]. Кроме активации JAK/STAT пути, ЭПО стимулирует также другие сигнальные пути, включая путь фосфатидилинозитол-3 киназа (PI3K)/Akt), путь митоген активированной протеин киназы (МЛРК)/внеклеточная сигнал связанная киназа (ERK 1/2) и протеин киназу C, обеспечивая выживание клетки и ее пролиферацию [51, 61]. Эффект ЭПО терминируется действием гематопоэтической клеточной фосфатазы, которая катализирует JAK2 дефосфорилирование [90].

В отличие от гематопоэтических клеток, в негематопоэтических клетках ЭПО реализует свои функции в результате взаимодействия с гетеродимерным рецептором (EPOR/^cR(CD131). По сравнению с гомодимерным EPOR/EPOR, присутствующим в гематопоэтической системе, гетеродимерный рецептор обладает меньшей аффинностью к его лиганду. В связи с чем для реализации протекторного действия в отношении тканей и других плейотропных эффектов ЭПО требуется больше чем при стимуляции эритропоэза [127]. Уже доказано, что защита тканей осуществляется через гетерорецепторный комплекс, содержащий EPOR/pcR(CD131). Негематопоэтические внутриклеточные сигнальные пути, где работает рецептор EPOR/^cR(CD131), включают продукцию оксида азота и активацию факторов транскрипции через JAK2, STAT3/5, PI3K/Akt, а также

МАРК пути. Включение некоторых функций связано с активацией специфических путей, тогда как для полного осуществления плейотропного влияния ЭПО требуется активация всех сигнальных внутриклеточных путей [127].

ЭПО впервые был идентифицирован как гормон, основной функцией которого является стимуляция дифференцировки эритроидных клеток-предшественниц в костном мозге в функциональные эритробласты [126], что позволяет регулировать доставку кислорода к тканям [137]. ЭПО увеличивает число развивающихся эритроидных предшественников и ускоряет выход ретикулоцитов из костного мозга, но не влияет на длительность клеточного цикла или число митозов, которые происходят во время дифференцировки клетки [126]. Кроме этого ЭПО является важным гормоном, определяющим дифференцировку клеток в эритроидном направлении, взаимодействует с ранними (предшественниками эритроидных клеток) и поздними эритроидными предшественниками (колониеобразующая эритроидная единица). Также ЭПО, по-видимому, стимулирует пролиферацию проэритробластов и базофильных эритробластов, которые первыми морфологически распознаются как эритроидные элементы, при этом он не является обязательным ростовым фактором дифференцировки в эритроидном направлении [126].

Экспрессия ЭПО была обнаружена вне почечной ткани во множестве других органов: головном мозге, половых и молочных железах, плаценте, печени, селезенке, легких, где может быть синтезирован в небольших количествах [17, 18, 91]. Результаты исследований показали, что рецепторы эритропоэтина экспрессированы на различных клетках плода и взрослого организма, в том числе на клетках центральной нервной системы, пищеварительного канала, мышечной ткани (гладкой, поперечно-полосатой и сердечной), матки, сетчатки, поджелудочной железы [17, 54, 139].

Таким образом, выявлено, что ЭПО дополнительно к его основной роли — участие в регуляции эритропоэза у млекопитающих, влияет на пролиферацию и апоптоз различных негематопоэтических клеток через рецепторы ЭПО [17, 18].

Характеристика неэритропоэтических биологических эффектов ЭПО и понимание механизмов сигнальной активации эритропоэтин-эритропоэтиновый рецептор в негематопоэтических органах и типах клеток является важным для будущего развития новых способов применения ЭПО и его производных в клинической практике.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Надеждина Наталья Анатольевна, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ГОСТ Р 53434 - 2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

2. Методы культивирования клеток / Г.П. Пинаев, М.С. Богдановой // Спб: Изд-во Политехн. ун-та, 2008. - 278 с.

3. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки человека при "физиологической" гипоксии in vitro / Е. Р. Андреева, Л. Б. Буравкова, А. И. Григорьев // М: ГНЦ РФ-ИМБП РАН. - 2016. - 256 с.

4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / М-во здравоохранения и соц. развития, Науч. центр экспертизы средств мед. применения; под ред. А. Н. Миронова [и др.]. - Москва: Гриф и К, 2012. - Ч. 1. - 944 с.

5. Способ формирования трабекулярного костного органоида. Патент на изобретение № 2818357, патентообладатель НИУ "БелГУ" Дата государственной регистрации в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 02 мая 2024 год.

6. 2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size / T. Otani, M. C. Marchetto, F. H. Gage [et al.] // Cell Stem Cell. - 2016. - Vol. 18. - P. 467-480.

7. 3D bioactive composite scaffolds for bone tissue engineering / G. Turnbull, J. Clarke, F. Picard [et al.] // Bioact. Mater. - 2018. - Vol. 3. - P. 278-314.

8. A model for intramembranous ossification during fracture healing / Z. Thompson, T. Miclau, D. Hu [et al.] // J. Orthop. Res. - 2002. - Vol. 20. - P.1091-1098.

9. 3D in vitro bone organ model using human progenitor cells / A. Papadimitropoulos, A. Scherberich, S. Güven [et al.] // Eur. Cells Mater. - 2011. - Vol. 21. - P. 445-458.

10. Accelerated fracture healing in transgenic mice overexpressing an anabolic isoform of fibroblast growth factor 2 / M. M. Hurle, D. J. Adams, L. Wang [et al.] // J. Cell Biochem. - 2016. - Vol. 117. - P. 599-611.

11. Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells by Akt-dependent phosphorylation / S. Dimmeler, I. Fleming, B. Fisslthaler [et al] // Nature. - 1999. -Vol. 10, № 399. - P. 601-605.

12. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase / R. K. Jaiswal, N. Jaiswal, SP. Bruder [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. - 2000. - Vol. 275, № 13. - P. 9645-9652.

13. Analysis of alphaSMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing / B. G. Matthews, D. Grcevic, L. Wang [et al.] // J. Bone Miner. Res. - 2014. - Vol. 29. - P. 1283-1294.

14. An Organoid for Woven Bone / A. Akiva, J. Melke, S. Ansari [et al.] // Adv. Funct. Mater. - 2021. - Vol. 31. - P. 510-524.

15. An overview on different strategies for the stemness maintenance of MSCs / K. Saei Arezoumand, E. Alizadeh, Y. Pilehvar-Soltanahmadi [et al.] // Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. - 2017. - Vol. 45, № 7. - P. 1255-1271.

16. Antiangiogenic and antitumor effects of bevacizumab in patients with inflammatory and locally advanced breast cancer / S. B. Wedam, J. A. Low, S. X. Yang [et al] // J. Clin. Oncol. - 2006. - Vol. 24. - P. 769-777.

17. Arcasoy, M.O. Non-erythroid effects of erythropoietin / M.O. Arcasoy // Haematologica. -2010. - Vol. 95, № 11. - P.1803-1805.

18. Arcasoy, M.O. The non-haematopoietic biological effects of erythropoietin / M.O. Arcasoy // British Journal of Haematology. - 2008. - Vol. 141, № 1. - P. 14-31.

19. Aurora, M. hPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue / M. Aurora, J. R. Spence // Dev. Biol. - 2016. - Vol. 420. - P. 230238.

20. Bankers-Fulbright, J. L. Interleukin-1 signal transduction / K. R. Kalli, D. J. McKean // Life Sci. - 1996. - Vol. 59. - P. 61-83.

21. Bevacizumab and sunitinib mediate osteogenic and pro-inflammatory molecular changes in primary human alveolar osteoblasts in vitro / E. Hofmann, B. Eggers, N. Heim [et al] // Odontology. - 2022. - Vol. 110, № 4. - P. 634-647.

22. Bigham-Sadegh, A. Selection of animal models for pre-clinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering / A. Bigham-Sadegh, A. Oryan // Connect Tissue Res. - 2015. - Vol. 56. -P.175-194.

23. Bone remodeling during fracture repair: the cellular picture / A. Schindeler, M. M. McDonald, P. Bokko, D. G. Little // Semin. Cell Dev. Biol. - 2008. - Vol. 19, №5. - P. 459-466.

24. Brassard, J. A. Engineering Stem Cell Self-organization to Build Better Organoids / J. A. Brassard, M. P. Lutolf // Cell Stem Cell. - 2019. - Vol. 24. - P. 860876.

25. Brines, M. Emerging biological roles for erythropoietin in the nervous system / M. Brines, A. Cerami // Nature reviews. Neuroscience. - 2005. - Vol. 6. - P. 484-494.

26. Broxmeyer, H. E. Erythropoietin: multiple targets, actions, and modifying influences for biological and clinical consideration / H. E. Broxmeyer // J Exp Med. -2013. - Vol. 210, № 2. - P. 205-208.

27. Calcein-AM is a detector of intracellular oxidative activity / J. Uggeri, R. Gatti, S. Belletti [et al.] // Histochem. Cell Biol. - 2000. - Vol. 122. - P. 499-505.

28. Carbamylated Erythropoietin Outperforms Erythropoietin in the Treatment of AKI-on-CKD and Other AKI Models / F. E. Togel, J. D. Ahlstrom, Y. Yang [et al.] // Journal of the American Society of Nephrology. - 2016. - Vol. 27, № 11. - P. 33943404.

29. Carter-Su, C. Growth hormone signaling pathways. Growth hormone & IGF research / C. Carter-Su, J. Schwartz, L.S. Argetsinger // Official journal of th Growth Hormone Research Society and the International IGF Research Society. - 2016. - Vol. 28. - P. 11-15.

30. Cartilage and bone tissue engineering using adipose stromal/stem cells spheroids as building blocks / G. S. Kronemberger, R. A. M. Matsui, G. d. A. S. d. C. E. Miranda [et al.] // World J. Stem Cells. - 2020. - Vol. 12. - P. 110-122.

31. Cellular biology of fracture healing / C. S. Bahney, R. L. Zondervan, P. Allison [et al.] // J. Orthop. Res. - 2019. - Vol. 37, № 1. - P. 35-50.

32. Characterization of an Alginate Encapsulated LS180 Spheroid Model for Anti-colorectal Cancer Compound Screening / T. Smit, C. Calitz, C. Willers, [et al.] // ACS Med. Chem. Lett. - 2020. - Vol. 11, № 5. - P. 1014-1021.

33. Claes, L. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions / L. Claes, S. Recknagel, A. Ignatius // Nat. Rev. Rheumatol. - 2012. - Vol. 8. - P.133-143.

34. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids / H. Clevers // Cell. - 2016. - Vol. 165. - P. 1586-1597.

35. Coaxial 3D bioprinting of self-assembled multicellular heterogeneous tumor fibers / X. Dai, L. Liu, J. Ouyang [et al.] // Sci. Rep. - 2017. - Vol. 1, №11. - P. 14 -57.

36. Desai, S. Signal Transduction Effects Induced by Erythropoietin in a HNSCC Model System / S. Desai // Richmond, Virginia: School of Medicine Virginia Commonwealth University. - 2012. - P. 113.

37. Differences in Mitochondrial Membrane Potential Identify Distinct Populations of Human Cardiac Mesenchymal Progenitor Cells / E. Gambini, I. Martinelli, I. Stadiotti [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2020. - Vol.21, №20. - P. 74-67.

38. Differential inhibition of fracture healing by non selective and cyclooxygenase-2 selective non-steroidal anti-inflammatory drugs /L. C. Gerstenfeld, M. Thiede, K. Seibert [et al.] // J. Orthop. Res. - 2003. - Vol. 21. - P. 670-675.

39. Differentiation of Osteoblasts and in Vitro Bone Formation from Murine Embryonic Stem Cells / L. D. K. Buttery, S. Bourne, J. D. Xynos [et al.] // Tissue Eng. - 2001. - Vol. 7. - P. 89-99.

40. Dominance of SOX9 function over RUNX2 during skeletogenesis / G. Zhou, Q. Zheng, F. Engin [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2006. - Vol. 103. -P.19004-19009.

41. Early invasion of the bladder wall by solitary bacteria protects UPEC from antibiotics and neutrophil swarms in an organoid model / K. Sharma, V. V Thacker, N. Dhar [et al.] // Cell Rep. - 2021. - Vol. 36. - P. 109-351.

42. Effects of erythropoietin on the bone microenvironment / S. J. McGee, A. M. Havens, Y. Shiozawa [et al.] // Growth Factors. - 2012. - Vol. 30, № 1. - P. 22-28.

43. Effects of matrine on HepG2 cell proliferation and expression of tumor relevant proteins in vitro / Q. Xue-Gong, H. Zhang, S. Wang [et al.] // Pharmaceutical Biology. - 2010. - Vol. 48, № 3. - P. 275-281.

44. Effect of recombinant human erythropoietin on the sternness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro / L. Ye, L. Chen, Q. Yu [et al.] // International Journal of Stem Cells. - 2010. - Vol. 3, № 2. - P. 175-182.

45. Effects of recombinant human erythropoietin (rhEPO) on JAK2/STAT3 pathway and endothelial apoptosis in the rabbit basilar artery after subarachnoid haemorrhage / G. Chen, S. Zhang, J. Shi [et al.] // Cytokine. - 2009. - Vol. 45. - P. 162-168.

46. Efficacy and safety of adjuvant recombinant human erythropoietin and ferrous sulfate as treatment for iron deficiency anemia during the third trimester of pregnancy / L. R. Sanchez-Gonzalez, S. E. Castro-Melendez, A. C. Angeles-Torres [et al.] // European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. - 2016. -Vol. 295. - P. 32-36.

47. Emerging understanding of Bcl-2 biology: Implications for neoplastic progression and treatment / C. Correia, S. H. Lee, X. W. Meng [et al.] // Biochimica et biophysica acta. - 2015. - Vol. 1853, № 7. - P. 1658-1671.

48. Endochondral ossification: How cartilage is converted into bone in the developing skeleton / E. J. Mackie, Y. A. Ahmed, L. Tatarczuch [et al.] // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2008. - Vol. 40. -P. 46-62.

49. Enhanced osteodifferentiation of MSC spheroids on patterned electrospun fiber mats—An advanced 3D double strategy for bone tissue regeneration. Mater / S. Sankar, C. S. Sharma, S. N. Rath // Sci. Eng. C. - 2019. - Vol. 94. - P. 703-712.

50. Erythropoietin, a hypoxia-regulated factor, elicits a pro-angiogenic program in human mesenchymal stem cells / K. J. Zwezdaryk, S. B. Coffelt, Y. G. Figueroa [et al.] // Experimental Hematology. - 2007. -Vol. 35, № 4. - P. 640-652.

51. Erythropoietin directly stimulates osteoclast precursors and induces bone loss / S. Hiram-Bab, T. Liron, N. Deshet-Unger [et al.] // FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. - 2015. -Vol. 29, № 5. - P. 1890-1900.

52. Erythropoietin (EPO): EPO-receptor signaling improves early endochondral ossification and mechanical strength in fracture healing / J. H. Holstein, M. D Menger, C. Scheuer [et al] // Life sciences. - 2007. - Vol. 10. - P. 893-900.

53. Erythropoietin facilitates the recruitment of bone marrow mesenchymal stem cells to sites of spinal cord injury / J. Li, W. Guo, M. Xiong [et al.] // Experimental and Therapeutic Medicine. - 2017. - Vol. 13, № 5. - P. 1806-1812.

54. Erythropoietin is a multifunctional tissue-protective cytokine / S. Erbayraktar, O. Yilmaz, N. Gökmen [et al.] // Current Hematology Reports. - 2003. -Vol. 2, № 6. - P. 465-470.

55. Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization / C. Heeschen, A. Aicher, R. Lehmann [et al.] // Blood. - 2003. - Vol. 102, № 4. - P. 1340-1346.

56. Erythropoietin mediated bone formation is regulated by mTOR signalling Journal of Cellular Biochemistry / J. Kim, Y. Jung, H. Sun [et al.] // Journal of Cellular Biochemistry. - 2011. - Vol. 113, № 1. - P. 220-228.

57. Erythropoietin modulates the structure of bone morphogenetic protein 2-engineered cranial bone / H. Sun, Y. Jung, Y. Shiozawa [et al.] // Tissue Engineering. Part A. - 2012. - Vol. 18, № 19-20. - P. 2095-2105.

58. Erythropoietin Pathway: A Potential Target for the Treatment of Depression / C. Ma, F. Cheng, X. Wang [et al.] // International journal of molecular sciences. - 2016. - Vol. 17, №5. - P. 677.

59. Erythropoietin promotes bone formation through EphrinB2/EphB4 signaling / C. Li, C. Shi, J. Kim [et al.] // Journal of Dental Research. - 2015. - Vol. 94, № 3.

60. Erythropoietin promotes endothelial progenitor cell proliferative and adhesive properties in a PI 3-kinase-dependent manner / J. George, E. Goldstein, A. Abashidze [et al.] // Cardiovascular Research. - 2005. - Vol. 68, № 2. - P. 299-306.

61. Erythropoietin, Stem Cell Factor, and Cancer Cell Migration / M. J. Vazquez-Mellado, V. Monjaras-Embriz, L. Rocha-Zavaleta [et al.] // Vitamins and Hormones. - 2017. - Vol. 105. - P. 273-296.

62. Erythropoietin stimulates proliferation and interferes with differentiation of myoblasts / M. Ogilvie, X. Yu, V. Nicolas-Metral [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. - 2000. - Vol. 275, № 50. - P. 39754-39761.

63. Faculty Opinions recommendation of Cerebral organoids model human brain development and microcephaly / M. A. Lancaster, M. Renner, C. A. Martin [et al.] // Nature. - 2013. - Vol. 501. - P. 373-379.

64. Faculty Opinions recommendation of Regeneration of thyroid function by transplantation of differentiated pluripotent stem cells / A. A. Kurmann, M. Serra, F. Hawkins [et al.] // Cell Stem Cell. - 2015. - Vol. 17. - P. 527-542.

65. Fate decision of mesenchymal stem cells: adipocytes or osteoblasts? / Q. Chen, P. Shou, C. Zheng [et al.] // Cell Death Differ. -2016. - Vol. 23. - P. 1128-1139.

66. Fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor play a critical role in endotheliogenesis from human adipose-derived stem cells / S. Khan, M. A. Villalobos, R. L. Choron [et al.] // J. Vasc. Surg. - 2017. - Vol. 65, № 5. - P. 14831492.

67. Forrestal, D. P. Challenges in engineering large customized bone constructs / D. P. Forrestal, T. J. Klein, M. A. Woodruff // Biotechnol. Bioeng. - 2017. - Vol. 114. - P. 1129-1139.

68. Frizzled proteins are colonic epithelial receptors for C. difficile toxin B / L. Tao, J. Zhang, P. Meraner [et al.] // Nature. - 2016. -Vol. 538. - P. 350-355.

69. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells / R. A. Wimmer, A. Leopoldi, M. Aichinger [et al.] // Nat. Protoc. - 2019. -Vol. 14. - P. 3082-3100.

70. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Bone Marrow Organoids / S. Frenz, I. Goek, M. Buser [et al.] // Blood. - 2022. - Vol. 140. -P. 1682-1683.

71. Global, regional, and national burden of other musculoskeletal disorders, 1990-2020, and projections to 2050: a systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2021 / K. G. Tiffany, M. M. Manasi, M. M. Lyn [et al] // The Lancet Rheumatology. - 2023. - Vol. 5, № 11. - P. 670-682.

72. Greco, S. J. Functional similarities among genes regulated by OCT4 in human mesenchymal and embryonic stem cells / S. J. Greco, K. Liu, P. Rameshwar // Stem Cells. - 2007. - Vol. 25, № 12. - P. 3143-3154.

73. Growth factor regulation of fracture repair / G. L. Barnes, P. J. Kostenuik, L. C. Gerstenfeld [et al.] // J. Bone Miner. Res. - 1999. - Vol. 14. - P. 1805-1815.

74. Harnessing macrophage-mediated degradation of gelatin microspheres for spatiotemporal control of BMP2 release / R. T. Annamalai, P. A. Turner, W. F. Carson [et al.] // Biomaterials. - 2018. - Vol. 161. - P. 216-227.

75. Hierarchy revealed in the specification of three skeletal fates by Sox9 and Runx2 / B. F. Eames, P. T. Sharpe, J. A. Helms // Developmental biology. - 2004. -Vol. 274. - P. 188-200.

76. High-content screening in hPSC-neural progenitors identifies drug candidates that inhibit zika virus infection in fetal-like organoids and adult brain / T. Zhou, L. Tan, G. Y. Cederquist [et al.] // Cell Stem Cell. - 2017. - Vol. 21. - P. 274283.

77. Highly efficient osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by eradication of STAT3 signaling / O. Levy, E. Ruvinov, T. Reem [et al.] // The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. - 2010. - Vol. 42, № 11. - P. 1823-1830.

78. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression / T. Seino, S. Kawasaki, M. Shimokawa [et al.] // Cell Stem Cell. - 2018. - Vol. 22. - P. 454-467.

79. Human pluripotent stem cell-derived cartilaginous organoids promote scaffold-free healing of critical size long bone defects / W. L. Tam, L. F. Mendes, X. Chen [et al.] // Stem Cell Res. Ther. - 2021. - Vol. 12. - P. 513.

80. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening / L. Broutier, G. Mastrogiovanni, M. A. Verstegen [et al.] // Nat. Med. - 2017. - Vol. 2. - P. 342- 435.

81. Human recombinant erythropoietin and the incidence of retinopathy of prematurity: a multiple regression model / K. K. Suk, J. A. Dunbar, A. Liu [et al.] // Journal AAPOS: the Official Publication of the American Association for Pediatric Ophthalmology and Strabismus. -2008. -Vol. 12, № 3. - P. 233-238.

82. Hydrogel delivery of lysostaphin eliminates orthopedic implant infection by Staphylococcus aureus and supports fracture healing / C. T. Johnson, J. A. Wroe, R. Agarwal [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2018. - Vol. 115. - P. 4960-4969.

83. Hypoxia inhibits osteogenesis in human mesenchymal stem cells through direct regulation of RUNX2 by TWIST / D.C. Yang, M.H. Yang, C.C. Tsai [et al.] // PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6. - P. 923-965.

84. Hypoxia inhibits the differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts by activation of Notch signaling / N. Xu, H. Liu, F. Qu [et al.] // Exp. Mol. Pathol. - 2013. - Vol. 94. - P. 33-39.

85. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // K. Takahashi, K. Tanabe, M. Honk [et al.] // Cell. - 2007. -Vol. 131. - P. 861-872.

86. Inhibition of erythropoietin gene expression signaling involves the transcription factors GATA-2 and NF-kB / K. La Ferla, C. Reimann, W. Junkman [et al.] // FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. - 2002. - Vol. 16, № 13. - P. 1811-1813.

87. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection / S. Bartfeld, T. Bayram, M. van de Wetering [et al.] // Gastroenterology. - 2015. - Vol. 148. - P. 126-136.

88. Involvement of the Jak-3 Janus kinase in signalling by interleukins 2 and 4 in lymphoid and myeloid cells / B. A. Witthuhn, O. Silvennoinen, O. Miura [et al.] / Nature. // - 1994. - Vol. 370, № 6485. - P. 153-157.

89. Insulin enhances the expression of the endothelial nitric oxide synthase in native endothelial cells: a dual role for Akt and AP-1 / B. Fisslthaler, T. Benzing, R. Busse, I. Fleming // Nitric Oxide. - 2003. - Vol. 8, № 4. - P. 253-261.

90. Jelkmann, W. Erythropoietin after a century of research: younger than ever / W. Jelkmann // European Journal of Haematology. - 2007. - Vol. 78, № 3. - P. 183205.

91. Jelkmann, W. Physiology and pharmacology of erythropoietin / W. Jelkmann // Transfusion Medicine and Hemotherapy: offizielles Organ der Deutschen Gesellschaft fur Transfusionsmedizin und Immunhamatologie. - 2013. - Vol. 40, № 5.

- P. 302-309.

92. Journey into Bone Models: A Review / J. Scheinpflug, M. Pfeiffenberger, A. Damerau [et al.] // Genes. - 2018. - Vol. 9. - P. 247.

93. Kim, J. Human organoids: Model systems for human biology and medicine / J. Kim, B. K. Koo, J. A. Knoblich // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2020. - Vol. 21. - P. 571-584.

94. Kishor Sivaraj, K. Blood vessel formation and function in bone /K. Kishor Sivaraj, H. Ralf Adams // Development. - 2016. - Vol. 143. - P. 2706-2715.

95. Koons, G. L. Materials design for bone-tissue engineering / G. L. Koons, M. Diba, A. G. Mikos // Nat. Rev. Mater. - 2020. - Vol. 5. - P. 584-603.

96. Koury, M. J. The molecular mechanism of erythropoietin action / M. J. Koury, M. C. Bondurant // European Journal of Biochemistry. - 1992. - Vol. 210, № 3.

- P. 649-663.

97. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning / S. A. Langhans // Frontiers in pharmacology. - 2018. - Vol. 9. - P. 334-617.

98. Laschke, M.W. Life is 3D: Boosting Spheroid Function for Tissue Engineering / M.W. Laschke, M.D. Menger // Trends Biotechnol. - 2017. - Vol. 35. -P.133-144.

99. Lee, D. Design and manufacture of 3D cell culture plate for mass production of cell-spheroids / D. Lee, S. Pathak, J.-H. Jeong // Sci. Rep. - 2019. - Vol. 9. - P. 139-176.

100. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver / M. Huch, H. Gehart, R. van Boxtel [et al.] // Cell. - 2015. - Vol. 160. - P. 299312.

101. Low dose erythropoietin stimulates bone healing in mice / P. Garcia, V. Speidel, C. Scheuer [et al] // Journal of orthopaedic research: official publication of the Orthopaedic Research Society. - 2011. - Vol. 2. - P. 165-172.

102. Marsell, R. The biology of fracture healing / T. A. Einhorn // Injury. -2011. - Vol. 42. - P. 551-555.

103. Mesenchymal stem cells. Human cell culture. Primary Mesenchymal Cells / M. F. Pittenger, G. Mbalaviele, M. Black [et al.] // Kluwer Academic Publishers. -2001. - Vol. 5. - P. 189-207.

104. MicroRNA-21 promotes osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells by the PI3K/ß-catenin pathway / Y. B. Meng, X. Li, Z. Y. Li [et al.] // Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. -2015. - Vol. 33, № 7. - P. 957-964.

105. Mitochondria as targets for nitric oxide-induced protection during simulated ischemia and reoxygenation in isolated neonatal cardiomyocytes / R. D. Rakhit, M. H. Mojet, M. S. Marber, M. R. Duchen // Circulation. - 2001. -Vol. 103, № 21. - P. 2617-2623.

106. Modelling Human Development and Disease in Pluripotent Stem-Cell-Derived Gastric Organoids / K. W. McCracken, E. M. Cata, C. M. Crawford [et al.] // Nature. - 2014. - Vol. 516. - P. 400-404.

107. Molecular aspects of healing in stabilized and non-stabilized fractures / A. X. Le, T. Miclau, D. Hu [et al.] // J. Orthop. Res. - Vol. 19. - P. 78-84.

108. Nonhematopoietic erythropoietin derivatives prevent motoneuron degeneration in vitro and in vivo / T. Mennini, M. De Paola, P. Bigini [et al] // Molecular medicine. - 2006. - Vol. 7, № 8. - P. 153-160.

109. Novel processing of iron-manganese alloy-based biomaterials by inkjet 3D printing / D. T. Chou, D. Wells, D. Hong [et al.] // Acta Biomater. - 2013. -Vol. 9. -P. 8593-8603.

110. Oral fibroblasts rescue osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells after exposure to Zoledronic acid in a paracrine effect / T. Berg, O. Doppelt-Flikshtain, B. R. Coyac, H. Zigdon-Giladi [et al] // Front. Pharmacol. - 2023. - Vol. 14.

- P.672-705.

111. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer / S. F. Boj, C. I. Hwang, L. A. Baker [et al.] // Cell. - 2015. - Vol. 160. - P. 324-338.

112. Organoid profiling identifies com mon responders to chemotherapy in pancreatic cancer / H. Tiriac, P. Belleau, D. D. Engle [et al.] // Cancer Discov. - 2018.

- Vol. 8. - P. 111-129.

113. Osteochondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors / H. Akiyama, J. E. Kim, K. Nakashima [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2005.

- Vol. 102. - P. 14665-14670.

114. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers / G. Vlachogiannis, S. Hedayat, A. Vatsiou [et al.] // Science. -2018. - Vol. 35. - P.920-926.

115. Percival, C. J. Angiogenesis and intramembranous osteogenesis / C. J. Percival, J. T. Richtsmeier // Dev. Dynam. - 2013. - Vol. 242, № 8. - P. 909-922.

116. Pharmacokinetics and erythropoietic response to human recombinant erythropoietin in healthy men / K. K. Flaharty, J. Caro, A. Erslev [et al.] // Clinical Pharmacology and Therapeutics. - 1990. - Vol. 47, № 5. - P. 557-564.

117. Ponomarev, I. V. Effect of 3D chondrocyte culturing conditions on the formation of extracellular matrix in cartilage tissue-engineering constructs / I. V. Ponomarev, L. M. Kochneva, D. Barnewitz // Bull. Exp. Biol. Med. - 2014. - Vol. 156.

- P. 548-555.

118. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling / Kuksal, Nidhi, Chalker [et al.] // Biological Chemistry. -2017. - Vol. 398, № 11. - P. 1209-1227.

119. Promotion of osteoblast differentiation in mesenchymal cells through Cbl-mediated control of STAT5 activity / F. X. Dieudonne, N. Sévère, M. Biosse-Duplan [et al] // Stem Cells. - 2013. - Vol. 31, № 7. - P. 1340-1349.

120. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients / M. Van de Wetering, H. E. Francies, J. M. Francis [et al.] // Cell. - 2015. -Vol. 161. - P. 933-945.

121. Pusztaszeri, M. P. Immunohistochemical Expression of Endothelial Markers CD31, CD34, von Willebrand Factor, and Fli-1 in Normal Human Tissues / M. P. Pusztaszeri, W. Seelentag, F. T. Bosman // Journal of Histochemistry & Cytochemistry. - 2006. - Vol. 54, № 4. - P. 385-395.

122. Regenerating marrow induces systemic increase in osteo-and chondrogenesis. / D. Gazit, M. Karmish, L. Holzman, I. Bab // Endocrinology. - 1990.

- Vol. 5. - P. 2607-2613.

123. Regenerative Medicine: does Erythropoietin have a role? / M. Buemi, A. Lacquaniti, G. Maricchiolo [et al.] // Current Pharmaceutical Design. - 2009. - Vol. 15, № 17. - P. 2026-2036.

124. Regulation of Erythropoietin Receptor Activity in Endothelial Cells by Different Erythropoietin (EPO) Derivatives: An in Vitro Study / M. L. Trincavelli, E. Da Pozzo, O. Ciampi [et al] // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - Vol.14, № 2. - P. 825-881.

125. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process / W. Wagner, P. Horn, M. Castoldi [et al.] // PLoS One. - 2008. -Vol. 3, № 5. - P. 2213.

126. Ridley, D. M. Erythropoietin: a review / D. M. Ridley, F. Dawkins, E. Perlin // Journal of the National Medical Association. - 1994. - Vol. 86, № 2. - P. 129135.

127. Rölfing, J. H. D. The effect of erythropoietin on bone / J. H. D. Rölfing // Thesis Acta Orthopaedica supplementum. - 2014. - Vol. 353, № 85. - P. 1-29.

128. Role and regulation of RUNX2 in osteogenesis / M. Bruderer, R. G. Richards, M. Alini [et al.] // European Cells and Materials. - 2014. - Vol. 28. - P. 269286.

129. Rucci, N. Molecular biology of bone remodeling / N. Rucci // Clin. Cases Min. Bone Metab. - 2008. - Vol. 5. - P. 49-56.

130. Ryu, N. E. Spheroid Culture System Methods and Applications for Mesenchymal Stem Cells / N. E. Ryu, S. H. Lee, H. Park // Cells. - 2019. - Vol. 8. - P. 16-20.

131. Saini, A. Cystic fibrosis patients benefit from mini guts / A. Saini // Cell Stem Cell. - 2016. - Vol. 19. - P. 425-427.

132. Salmonella manipulation of host signaling pathways provokes cellular transformation associated with gallbladder carcinoma / T. Scanu, R. M. Spaapen, J. M. Bakker [et al.] // Cell Host. Microbe. - 2015. - Vol. 17. - P.763-764.

133. Scaffold Fabrication Technologies and Structure/Function Properties in Bone Tissue Engineering / M. N. Collins, G. Ren, K. Young [et al.] // Adv. Funct. Mater. - 2021. - Vol. 31. - P. 201-209.

134. Screening out irrelevant cell-based models of disease / P. Horvath, N. Aulner, M. Bickle [et al] // Nat. Rev. Drug Discov. - 2016. - Vol. 15. - P. 751-769.

135. SEAP activity measurement in reporter cell-based assays using BCIP / NBT as substrate / V. Jerome, R. Freitag, D. Schüler [et al.] // Anal. Biochem. - 2019. -Vol. 15, №585. - P.313-402.

136. Secreto, F. J. Wnt signaling during fracture repair / F. J. Secreto, L. H. Hoeppner, J. J. Westendorf // Curr. Osteoporos Rep. - 2009. - Vol. 7. - P. 64-69.

137. Semenza, G. L. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation / G. L. Semenza, G. L. Wang // Molecular and Cellular Biology. - 1992. - Vol. 12, № 12. - P. 5447-5454.

138. Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts / F. Shapiro // Eur. Cells Mater. -2008. - Vol. 15. - P. 53-76.

139. Shiozawa, Y. Erythropoietin couples hematopoiesis with bone formation / Y. Shiozawa, Y. Jung, A. M. Ziegler // PLoS One. - 2010. - Vol. 5, № 5. - P. 10853.

140. Structural characterization of human erythropoietin / P. H. Lai, R. Everett, F. F Wang [et al] // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol. 261. - P. 3116-3121.

141. The Effect of Erythropoietin and Its Derivatives on Ischemic Stroke Therapy: A Comprehensive Review / Y. Ma, Z. Zhou, G. Y. Yang [et al] // Front Pharmacol. - 2022. - Vol. 17, № 13. - P. 743-926.

142. The key regulatory roles of the PI3K/Akt signaling pathway in the functionalities of mesenchymal stem cells and applications in tissue regeneration / J. Chen, R. Crawford, C. Chen [et al.] // Tissue Engineering Part B: Reviews. - 2013. -Vol. 19, № 6. - P. 516-528.

143. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation / K. Nakashima, X. Zhou, G. Kunkel [et al.] // Cell. - 2002. - Vol. 108. - P. 17-29.

144. The osteogenic effect of erythropoietin on human mesenchymal stromal cells is dose-dependent and involves non-hematopoietic receptors and multiple intracellular signaling pathways / J. H. D. Rölfing, A. Baatrup, M. Stiehler [et al.] // Stem Cell Reviews. - 2014. - Vol. 10, № 1. - P. 69-78.

145. The pleiotropic effects of erythropoietin in infection and inflammation / M. Nairz, T. Sonnweber, A. Schroll [et al] // Microbes Infect. - 2012. - Vol. 14, № 3. - P. 238-246.

146. The primary study of CD90(+) CD34(-) and Sca-1(+) stem cells mobilized by EPO plus G-CSF in mice / F. Zheng, L. Cheng, Q. Yu [et al.] // International Journal of Stem Cells. - 2009. - Vol. 2, № 2. - P. 129-134.

147. The role of oxygen during fracture healing / C. Lu, N. Saless, X. Wang [et al.] // Bone. - 2013. - Vol. 52. - P.220-229.

148. Time series gene expression profiling and temporal regulatory pathway analysis of BMP6 induced osteoblast differentiation and mineralization / W. Luo, M. Friedman, K. Hankenson [et al.] // BMC Syst. Biol. - 2011. - Vol. 5. - P. 82.

149. TNFalpha promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by triggering the NF-kappaB signaling pathway / K. Hess, A. Ushmorov, J. Fiedler [et al.] // Bone. - 2009. - Vol. 45, № 2. - P. 367-376.

150. Tsiftsoglou, A. S. Erythropoietin (EPO) as a Key Regulator of Erythropoiesis, Bone Remodeling and Endothelial Transdifferentiation of Multipotent Mesenchymal Stem Cells (MSCs): Implications in Regenerative Medicine / A. S. Tsiftsoglou // Cells. - 2021. - Vol. 10, № 8. - P. 21-40.

151. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer / S. H. Lee, W. Hu, J. T. Matulay [et al.] // Cell. - Vol. 17, № 3. - P. 515-528.

152. Uversky, V. N. Erythropoietin and co.: intrinsic structure and functional disorder / V. N. Uversky, E. M. Redwan // Molecular BioSystems. - 2017. - Vol. 13. -P. 56-72.

153. Wubneh, A. Current state of fabrication technologies and materials for bone tissue engineering / A. Wubneh, E. K. Tsekoura, C. Ayranci // Acta Biomater. -2018. - Vol. 80. - P. 1-30.

154. Wu, C. Osteoblasts: a novel source of erythropoietin / C. Wu, A. J. Giaccia, E. B. Rankin // Current Osteoporosis Reports. - 2014. - Vol. 12, № 4. - P. 428-432.

155. Yin, T. The stem cell niches in bone / T. Yin, L. Li // The Journal of clinical investigation. - 2006. - Vol. 5. - P. 1195-1201.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А. Патент на изобретение «Способ формирования трабекулярного

костного органоида»