Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Илюшин, Денис Григорьевич

• Илюшин, Денис Григорьевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Илюшин, Денис Григорьевич

Оглавление

Введение

Список сокращений

Обзор литературы

Терапия и профилактика отравлений ФОТ

Биологический антидоты как средство профилактики и терапии 14 отравлений ФОТ

Бутирилхолинэстераза человека

Биотехнологическое получение рекомбинантной бутирилхолинэстеразы 31 человека

Материалы и методы

Реактивы и материалы

Бактериальные штаммы

Клеточные линии

Растворы и бактериальные среды

Антибиотики

Методы работы с нуклеиновыми кислотами

Методы работы с бактериями Escherichia coli

Методы работы с эукариотическими клетками линии СНО

Методы работы с белками

Методы работы с животными

Результаты и обсуждение

Создание эукариотической системы экспрессии человеческой 58 бутирилхолинэстразы

Разработка системы детекции и оценки продукции рекомбинантного белка

Характеристики рекомбинантной БуХЭ

Оптимизация фармакокинетических параметров рчБуХЭ химическим 77 полисиалированием in vitro

Исследование защитной эффективности модифицированной рчБуХЭ in vivo

Выводы

Список литературы

Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo»

Введение

Цель работы состояла в создании эффективной системы экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы (БуХЭ) человека и исследовании функциональной активности полученного фермента в экспериментах in vitro и in vivo. Для ее достижения были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. создание эффективной эукариотической системы экспрессии функционально активной БуХЭ человека;

2. изучение физико-химических свойств рекомбинантной БуХЭ человека;

3. оптимизация фармакокинетических характеристик рекомбинантного фермента;

4. определение эффективности полученного препарата рекомбинантной БуХЭ для профилактики отравлений ФОТ.

Клетки линии СНО были выбраны в качестве наиболее сбалансированным решения проблемы экспрессии рекомбинантной БуХЭ. Ген БуХЭ был клонирован под контроль промотора фактора элонгации полипептидной цепи (EF-al). После проведения стабильной трансфекции и оптимизации условий продукции на специализированных безбелковых ростовых средах удалось получить клон A3 продуцирующий до 30 мг рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (рчБуХЭ) на литр ростовой среды, что как минимум на порядок выше, чем в ранее разработанных системах. Для изменение олигомерного состава рекомбинантного фермента клон A3 был трансфицирован фрагментом ДНК, несущим ген обогащенного остатками пролина пептида PRAD под контролем промотора EF-al. В результате отбора был получен стабильный клеточный клон АЗН9, продуцирующий БуХЭ в основном форме димера и тетрамера. Опыты на мышах линии BALB/c рчБуХЭ показали, что фармакокинетические параметры смеси олигомеров рчБуХЭ не позволяет эффективно использовать рекомбинантный фермент для профилактики отравлений ФОТ.

Для радикального увеличения времени полувыведение препарата рчБуХЭ из крови была предложена химическая модификация гомополимеры N-ацетилнейраминовой кислоты - сиалирование. В отличие по полимеров

3

этиленгликоля, широко применяемых для модификаций рекомбинантных белков, гетеро- и гомополимеры сиаловой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не являются токсичными и не накапливаются в тканях и внутренних органах. Таким образом, модификация полисиаловыми кислотами позволяет снизить риск возможных побочных действий рчБуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота. Применение комбинаторного подхода позволило определить оптимальные условия реакции химического полисилирования рчБуХЭ, при которых удалось добиться не менее 80% выхода реакции при относительно не высокой (не более 10%) потере удельной активности рекомбинантного фермента.

Полученные конъюгат рчБуХЭ с гомополимерами сиаловой кислоты (рчБуХЭ-СА027) был подвергнут всестороннему анализу in vitro и in vivo. Установлено, что химическая модификация полисиалированием не влияет на олигомеризацию рчБуХЭ. Масс-пекрометрическое исследование конъюгата рчБуХЭ-СА027 позволило выявить по меньшей мере 6 потенциальных сайтов модификации рекомбинантного фермента. Сравнение кинетических констант гидролиза (Хм, ксat, Kss и Ъ) бутирилтиохолин иодида модифицированной и не модифицированной рекомбинантной рчБуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что полученные значения отличались от известных из литературы в пределах ошибки, что свидетельствует об интактности активного центра фермента и его окружения. Фармакокинетические испытания in vivo на мышах линии BALB/c свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения конъюгата рчБуХЭ-СА027 возросло в 6 раз по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ и стало сопоставимо со временем полувыведения препарата нативной БуХЭ плазмы крови человека. Таким образом впервые химическое полисиалирование было успешно применено для модификации сложного глобулярного фермента.

Способность рчБуХЭ и рчБуХЭ-СА027 эффективно связывать агент VR in vitro стало основанием для проведения эксперимента на животных. В результате испытания in vivo на беспородных мышах доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N-ацетилнейраминой кислоты при внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса обеспечивает профилактическую защиту от действия 4.2 ЛД50 агента

VII, не вызывая долгосрочных изменений в поведенческой активности и физической выносливости подопытных животных.

Таким образом, настоящая работа описывает метод получения конъюгата рекомбинантной бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека с гомополимерами Ы-ацетил нейраминовой кислоты, полностью удовлетворяющего современным основным требованиям к биологическому антидоту.

Список сокращений

АцХЭ - ацетилхолинэстераза БуХЭ - бутирилхолинэстераза рмБуХЭ - рекомбинантная бутирилхолинэстераза мыши рчБуХЭ - рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека чБуХЭ - бутирилхолинэстераза человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

кДа - тысяча Дальтон

п.о. - пар оснований

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

т.п.о. - тысяч пар оснований

ТАЕ - Трис-ацетатный буфер

TBE - Трис-боратный буфер

ФОС - фосфоорганические

соединения

ФОТ - фосфоорганические токсины ЭФ - электрофоретическое разделение

BSA - бычий сывороточный альбумин ВТС - бутирилтиохолин иодид CAO - окисленные полисиаловые пислоты (Colominic oxidized acids) CIAP - щелочная фосфатаза кишечника телёнка (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) CMV - цитомегаловирус DMEM - Среда Игла в модификации

Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium)

DNTB - динитротиобензойная

кислота

dNTP-

дезоксирибонуклеозидтрифосфат EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

EF - фактор элонгации пептидной цепи al

FDA - Управление по контролю

качества пищевых и лекарственных

препаратов США (Food and Drug

Administration)

Gal - галактоза

Ig - иммуноглобулин

mQ - вода особой чистоты из

установки "Milli-Q" (Millipore, США)

MRT - среднее время удержания

NeuAc - N-ацетил нейраминовая/

сиаловая кислота

PBS - фосфатно-солевой раствор

PRAD - обогащенный пролином

пептид, (proline-rich attachment domen)

PRiMA - обогащенный пролином

мембранный якоро (proline-rich

membrane anchor)

RSV - промотер вируса папилломы

человека

Tris-

трис(гидроксиметил)аминометан

Обзор литературы

В конце 1930 г. в качестве инсектицидов был синтезирован ряд фосфоорганических токсинов (ФОТ). Высокая токсичность этих веществ сразу привлекла внимание военных. Хотя такие ФОТ как табун, зарин или зоман, так и не нашли широкого применения в период Второй мировой войны, большие количества этих токсинов до сих пор хранятся на военных складах многих стран [1]. Доступность ряда ФОТ в качестве пестицидов в странах с развивающейся аграрной отраслью экономики приводит к частым случаям отравлений и летальных интоксикаций [2]. По данным Всемирной организации здравоохранения бытовое летальное отравление ФОТ получает более 300 ООО человек в год [3].

Несмотря на то, что 185 государств в 1992 присоединились к Конвенции «О запрещении химического оружия», сохраняется угроза использования нервно-паралитических агентов и других ФОТ в ходе военных действий и террористических актов. Известно несколько документированных случаев применения ФОТ в качестве боевых-отравляющих веществ: военные конфликты между Ираком и Ираном, агрессия Ирана против курдов [4], террористические акты секты Aum Shinrikyo в японских городах Матсумото и Токио [5].

За последние 60 лет исследований методы медикаментозного лечения отравлений фосфорорганическими токсинами активно развивались. Тем не менее, они все еще несовершенны, так как позволяют избежать смерти, но не потери трудоспособности и необратимых поражений головного мозга. Альтернативным подходом в терапии и профилактике отравлений ФОТ является использование биологических антидотов [6]. Ими могут быть антитела, разнообразные функциональные циклодекстрины и ферменты, которые изолируют и инактивируют высокотоксичные соединения до того как те достигнут своей биологической мишени [7]. Из всех антидотов против ФОТ только бутирилхолинэстераза плазмы крови человека получила статус «New development drug» от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) в 2006 г.

Терапия и профилактика отравлений ФОТ

История открытия и применения ФОТ

Класс фосфорорганических соединений очень многообразен. Среди множества этих соединений можно выделить подгруппу веществ, называемых фосфорорганическими токсинами (ФОТ), селективно действующих на холинэстеразы различных организмов. Общим для этих соединений является наличие ассиметричного атома фосфора. ФОТ можно разделить на такие подгруппы как инсектициды (рис. 1. А-В), нервно-паралитические агенты типа «в» (рис. 1. Г—И) и нервно-паралитические агенты типа «V» (рис. 1. К-О).

ск ^сн3

О і чоґ о

СІ /

НзС

Б

Н3С'

в II

о

Н3С

в

Н3С.

і т

,СН3

Н3С

чСНз

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Илюшин, Денис Григорьевич

Выводы

1. Разработана эффективная система экспрессии рекомбинантной БуХЭ человека в клетках линии СНО, позволяющая получать до 30 мг/л активного фермента в олигомерной форме.

2. Полученный рекомбинантный фермент обладает сравнимыми структурно-функциональными характеристиками с препаратом БуХЭ плазмы крови человека.

3. Впервые успешно осуществлено химическое полисиалирование гидролитического фермента. Подобраны условия реакции, позволяющие получать конъюгат рчБуХЭ-СА027 с 80%-ным выходом. Показано, что данная модификация не изменяет кинетические характеристики фермента, что свидетельствует об интактности его активного центра.

4. Применение химического полисиалирования существенно улучшило фармакокинетические параметры рекомбинантного фермента, увеличив время полувыведения модифицированной рчБуХЭ в 5,5 раз.

5. Полисиалированный препарат показал высокую эффективность в качестве профилактического биологического антидота. Защитный индекс по веществу УЫ составил 4,2 ЛД50, что сопоставимо с БуХЭ плазмы крови человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Илюшин, Денис Григорьевич, 2013 год

Список литературы

1. Greenfield R.A. et al. Microbiological, biological, and chemical weapons of

warfare and terrorism. //Am. J. Med. Sei. 2002. Том 323, № 6. С. 326-340

2. Kwong T.C. Organophosphate pesticides: biochemistry and clinical

toxicology. // Ther Drug Monit. 2002. Том 24, № 1. С. 144-149

3. Eddieston M. et al. Management of acute organophosphorus pesticide

poisoning. // Lancet. 2008. Том 371, № 9612. С. 597-607

4. Macilwain С. Study proves Iraq used nerve gas. // Nature. 1993. Том 363, №

6424. С. 3

5. TU A.T. Basic information on nerve gas and the use of sarin by Aum

Shinrikyo // Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan. J-STAGE, 1996. Том 44, № 3. C. 293-320

6. Masson P., Carletti E., Nachon F. Structure, activities and biomedical

applications of human butyrylcholinesterase. // Protein Pept. Lett. 2009. Том 16, № 10. С. 1215-1224

7. Masson P. et al. A collaborative endeavor to design cholinesterase-based

catalytic scavengers against toxic organophosphorus esters // Chem Biol Interact. 2008. Том 175, № 1-3. С. 273-280

8. Hammond J.W. Poison Gas. Greenwood Publishing Group, 1999

9. Tucker J. War of Nerves. Anchor, 2007

10. Coleman K. A history of chemical warfare. Palgrave MacMillan, 2005

11. Gupta R.C. Handbook of Toxicology of Chemical Warfare Agents. Academic

Pr, 2009

12. Purves D. et al. Neuroscience. Sinauer Associates Incorporated, 2011.

13. Shafferman A. et al. Mutagenesis of human acetylcholinesterase. Identification of residues involved in catalytic activity and in polypeptide folding. // J Biol Chem. 1992. Том 267, № 25. С. 17640-17648

14. Maxwell D.M. et al. Toxicodynamic modeling of highly toxic organophosphorus compounds. // J. Mol. Neurosci. 2006. Том 30, № 1-2. С.129-131

15. Peeples E.S. et al. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant

91

exposure, identified by mass spectrometry. // Toxicol. Sci. 2005. Том 83, № 2. С. 303-312

16. Dunn M.A., Sidell F.R. Progress in medical defense against nerve agents. //

JAMA. 1989. Tom 262, № 5. C. 649-652

17. Jokanovic M. Medical treatment of acute poisoning with organophosphorus

and carbamate pesticides. // Toxicol Lett. 2009. Том 190, № 2. С. 107-115

18. Shih T.-M., Rowland T.C., McDonough J.H. Anticonvulsants for nerve agent-induced seizures: The influence of the therapeutic dose of atropine. // J Pharmacol Exp Ther. 2007. Том 320, № 1. С. 154-161

19. Kaires P. Identification of Gulf War syndrome: methodological issues and

medical illnesses. // JAMA. 1997. Том 278, № 5. С. 385-387

20. Gots R.E. et al. Identification of Gulf War syndrome: methodological issues

and medical illnesses. // JAMA. 1997. Том 278, № 5. С. 385-371

21. Schlesinger N., Baker D.G., Schumacher H.R. Persian Gulf War myalgia

syndrome. // J. Rheumatol. 1997. Том 24, № 5. С. 1018-1019

22. Jokanovic M., Prostran M. Pyridinium oximes as cholinesterase reactivators.

Structure-activity relationship and efficacy in the treatment of poisoning with organophosphorus compounds. // Curr Med Chem. 2009. Том 16, № 17. С. 2177-2188

23. Kassa J. Review of oximes in the antidotal treatment of poisoning by organophosphorus nerve agents. // J. Toxicol. Clin. Toxicol. 2002. Том 40, №6. С. 803-816

24. Cannard К. The acute treatment of nerve agent exposure. // J. Neurol. Sci.

2006. Том 249, № 1. С. 86-94

25. Kassa J., Kuca K., Cabal J. A comparison of the potency of trimedoxime and

other currently available oximes to reactivate tabun-inhibited acetylcholinesterase and eliminate acute toxic effects of tabun. // Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2005. Том 149, № 2. С. 419-^23

26. Musilek К. et al. Novel series of bispyridinium compounds bearing a (Z)-

but-2-ene linker—synthesis and evaluation of their reactivation activity

92

against tabun and paraoxon-inhibited acetylcholinesterase. // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2007. Том 17, № 11. С. 3172-3176

27. Wille Т. et al. Detoxification of nerve agents by a substituted beta-cyclodextrin: application of a modified biological assay. // Toxicology. 2009. Tom 265, № 3. C. 96-100

28. Bhattacharjee A.K. et al. Discovery of non-oxime reactivators using an in

silico pharmacophore model of oxime reactivators of OP-inhibited acetylcholinesterase. // Eur J Med Chem. 2012. Том 49. С. 229-238

29. Muller S. et al. In vitro detoxification of cyclosarin (GF) by modified cyclodextrins. // Toxicol Lett. 2011. Том 200, № 1-2. С. 53-58

30. Le Provost R. et al. Optimized strategies to synthesize P-cyclodextrin-oxime

conjugates as a new generation of organophosphate scavengers. // Org. Biomol. Chem. 2011. Том 9, № 8. С. 3026-3032

31. Wadia R.S. Treatment of organophosphate poisoning // Indian Journal of

Critical Care Medicine. 2003

32. Eyer P. et al. Are we using the right dose? - a tale of mole and gram. // Br J

Clin Pharmacol. 2008. Том 66, № 4. С. 451^52

33. Wolfe A.D. et al. Acetylcholinesterase prophylaxis against organophosphate

toxicity // Fundamental and Applied Toxicology. 1987. Том 9, № 2. С. 266-270

34. Sweeney R.E., Maxwell D.M. A theoretical expression for the protection

associated with stoichiometric and catalytic scavengers in a single compartment model of organophosphorous poisoning. // Math Biosci. 2003. Tom 181, №2. C. 133-143

35. Millard C.B. et al. Crystal structures of aged phosphonylated acetylcholinesterase: nerve agent reaction products at the atomic level. // Biochemistry. 1999. Том 38, № 22. С. 7032-7039

36. Kaplan D. et al. Does "butyrylization" of acetylcholinesterase through substitution of the six divergent aromatic amino acids in the active center gorge generate an enzyme mimic of butyrylcholinesterase? // Biochemistry. 2001. Tom 40, № 25. C. 7433-7445

93

37. Sklan E.H. et al. Acetylcholinesterase/paraoxonase genotype and expression

predict anxiety scores in Health, Risk Factors, Exercise Training, and Genetics study. // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. Том 101, № 15. С. 55125517

38. Evron Т. et al. Plant-derived human acetylcholinesterase-R provides protection from lethal organophosphate poisoning and its chronic aftermath. // FASEB J. 2007. Том 21, № 11. С. 2961-2969

39. Cohen О. et al. Effect of chemical modification of recombinant human

acetylcholinesterase by polyethylene glycol on its circulatory longevity. // Biochem J. 2001. Том 357, № Pt 3. C. 795-802

40. Saxena A. et al. Mutant acetylcholinesterases as potential detoxification agents for organophosphate poisoning. // Biochem Pharmacol. 1997. Том 54, № 2. С. 269-274

41. Sirivarasai J. et al. Paraoxonase (PON1) polymorphism and activity as the

determinants of sensitivity to organophosphates in human subjects. // Chem Biol Interact. 2007. Том 168, № 3. С. 184-192

42. Rochu D., Chabriere E., Masson P. Human paraoxonase: a promising approach for pre-treatment and therapy of organophosphorus poisoning. // Toxicology. 2007. Tom 233, № 1-3. C. 47-59

43. Khersonsky O., Tawfik D.S. Structure-reactivity studies of serum paraoxonase PON1 suggest that its native activity is lactonase. // Biochemistry. 2005. Том 44, № 16. С. 6371-6382

44. Shih D.M. et al. Decreased obesity and atherosclerosis in human paraoxonase 3 transgenic mice. // Circ. Res. 2007. Том 100, № 8. С. 12001207

45. Masson P., Rochu D. Catalytic bioscavengers against toxic esters, an alternative approach for prophylaxis and treatments of poisonings. // Acta Naturae. 2009. Том 1, № 1. С. 68-791

46. Scharff E.I. et al. Crystal structure of diisopropylfluorophosphatase from Loligo vulgaris. // Structure. 2001. Том 9, № 6. С. 493-502

47. Jawad Z., Paoli M. Novel sequences propel familiar folds. // Structure. 2002.

Том 10, №4. С. 447^54

48. Kuo C.L., La Du B.N. Calcium binding by human and rabbit serum paraoxonases. Structural stability and enzymatic activity. // Drug Metab. Dispos. 1998. Tom 26, № 7. C. 653-660

49. Harel M. et al. Structure and evolution of the serum paraoxonase family of

detoxifying and anti-atherosclerotic enzymes. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Tom 11, № 5. C. 412-419

50. Aharoni A. et al. Directed evolution of mammalian paraoxonases PON1 and

PON3 for bacterial expression and catalytic specialization. // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. Том 101, № 2. С. 482-487

51. Gupta R.D. et al. Directed evolution of hydrolases for prevention of G-type

nerve agent intoxication. //Nat. Chem. Biol. 2011. Том 7, № 2. С. 120-125

52. Valiyaveettil M. et al. Protective efficacy of catalytic bioscavenger, paraoxonase 1 against sarin and soman exposure in guinea pigs. // Biochem Pharmacol. 2011. Том 81, № 6. С. 800-809

53. Jencks W.P. Catalysis in Chemistry and Enzymology. Dover Publications,

1987

54. Kohen F. et al. Antibody-enhanced hydrolysis of steroid esters. // Biochim

Biophys Acta. 1980. Том 629, № 2. С. 328-337

55. Pollack S.J., Jacobs J.W., Schultz P.G. Selective chemical catalysis by an

antibody. // Science. 1986. Том 234, № 4783. С. 1570-1573

56. Tramontano A., Janda K.D., Lerner R.A. Catalytic antibodies. // Science.

1986. Tom 234, № 4783. C. 1566-1570

57. Smirnov I. et al. Reactibodies generated by kinetic selection couple chemical

reactivity with favorable protein dynamics. // Proc Natl Acad Sci USA. 2011. Том 108, № 38. C. 15954-15959

58. Kolesnikov A.V. et al. Enzyme mimicry by the antiidiotypic antibody approach. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Том 97, № 25. С. 1352613531

59. Jbilo О. et al. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase expression in

adult rabbit tissues and during development. // Eur J Biochem. 1994. Том

95

225, № l.C. 115-124

60. Mesulam M. Acetylcholinesterase knockouts establish central cholinergic

pathways and can use butyrylcholinesterase to hydrolyze acetylcholine // Neuroscience. 2002. Том 110, № 4. С. 627-639

61. George S.T., Balasubramanian A.S. The aryl acylamidases and their relationship to cholinesterases in human serum, erythrocyte and liver. // Eur J Biochem. 1981. Tom 121, № l.C. 177-186

62. Saxena A. et al. Prophylaxis with human serum butyrylcholinesterase protects guinea pigs exposed to multiple lethal doses of soman or VX. // Biochem Pharmacol. 2011. Том 81, № 1. С. 164-169

63. Lockridge О. et al. Large Scale Purification of Butyrylcholinesterase From

Human Plasma Suitable for Injection Into Monkeys; a Potential New Therapeutic for Protection Against Cocaine and Nerve Agent Toxicity. // J Med Chem Biol Radiol Def. 2005. Том 3. (DOI: 10.1901/jaba.2005.3-nihms5095)

64. Raveh L. The Stoichiometry of Protection against Soman and VX Toxicity in

Monkeys Pretreated with Human Butyrylcholinesterase // Toxicol Appl Pharmacol. 1997. Том 145, № 1. С. 43-53

65. Lockridge О., Masson P. Pesticides and susceptible populations: people with

butyrylcholinesterase genetic variants may be at risk. // Neurotoxicology. 2000. Tom 21, № 1-2. C. 113-126

66. Saxena A. et al. Role of oligosaccharides in the pharmacokinetics of tissue-

derived and genetically engineered cholinesterases // Mol Pharmacol. 1998. Том 53, № 1. C. 112-122

67. Lockridge O. et al. Complete amino acid sequence of human serum cholinesterase. // J Biol Chem. 1987. Том 262, № 2. С. 549-557

68. Li H. et al. Lamellipodin proline rich peptides associated with native plasma

butyrylcholinesterase tetramers. // Biochem J. 2008. Том 411, № 2. С. 425432

69. £okugra§ A.N. Butyrylcholinesterase: structure and physiological importance // Turk J Biochem. 2003

96

70. 0stergaard D., Mogensen J.V. Half-life of plasma cholinesterase // Acta

Anesthesiologica Scandinavica. 1988. Том 32. № 3. С. 266-269

71. Perrier A.L., Massoulie J., Krejci E. PRiMA: the membrane anchor of acetylcholinesterase in the brain. // Neuron. 2002. Том 33, № 2. С. 275285

72. Noureddine H. et al. Acetylcholinesterase associates differently with its

anchoring proteins ColQ and PRiMA. // J Biol Chem. 2008. Том 283, № 30. С.20722-20732

73. Bon S., Coussen F., Massoulie J. Quaternary associations of acetylcholinesterase. II. The polyproline attachment domain of the collagen tail. // J Biol Chem. 1997. Том 272, № 5. С. 3016-3021

74. Altamirano C.V., Lockridge O. Conserved aromatic residues of the C-terminus of human butyrylcholinesterase mediate the association of tetramers. // Biochemistry. 1999. Том 38, № 40. С. 13414-13422

75. Biberoglu К. et al. The Proline Rich Tetramerization Peptides in Equine

Serum Butyrylcholinesterase. // FEBS J. 2012. Том 279. № 20. 3844-3858

76. Dvir H. et al. The synaptic acetylcholinesterase tetramer assembles around a

polyproline II helix. // EMBO J. 2004. Том 23, № 22. С. 4394-4405

77. Masson P., Lockridge O. Butyrylcholinesterase for protection from organophosphorus poisons: catalytic complexities and hysteretic behavior. //Arch. Biochem. Biophys. 2010. Том 494, № 2. С. 107-120

78. Nachon F. et al. Role of water in aging of human butyrylcholinesterase

inhibited by echothiophate: the crystal structure suggests two alternative mechanisms of aging. // Biochemistry. 2005. Том 44, № 4. С. 1154-1162

79. Nicolet Y. et al. Crystal structure of human butyrylcholinesterase and of its

complexes with substrate and products. // J Biol Chem. 2003. Том 278, № 42. С. 41141^11147

80. Carletti E. et al. Structure-activity analysis of aging and reactivation of human butyrylcholinesterase inhibited by analogues of tabun. // Biochem J. 2009. Tom 421, № 1. C. 97-106

81. Allderdice P.W. et al. The cloned butyrylcholinesterase (BCHE) gene maps

97

to a single chromosome site, 3q26. // Genomics. 1991. Том 11, № 2. С. 452-454

82. Lockridge О. et al. Hydrolysis of diacetylmorphine (heroin) by human serum

Cholinesterase. // J Pharmacol Exp Ther. 1980. Том 215, № 1. С. 1-88

83. Gätke M.R. et al. Response to mivacurium in a patient compound heterozygous for a novel and a known silent mutation in the butyrylcholinesterase gene: genotyping by sequencing. // Anesthesiology. 2001. Том 95, № 3. C. 600-606

84. Manoharan I. et al. Naturally occurring mutation Leu307Pro of human butyrylcholinesterase in the Vysya community of India // Pharmacogenetics and Genomics. 2006. Том 16, № 7. P. 461

85. Saxena A. et al. Pretreatment with human serum butyrylcholinesterase alone

prevents cardiac abnormalities, seizures, and death in Göttingen minipigs exposed to sarin vapor. // Biochem Pharmacol. 2011. Том 82, № 12. С. 1984-1993

86. Myers T.M. et al. Characterization of human serum butyrylcholinesterase in

rhesus monkeys: behavioral and physiological effects. // Neurotoxicol Teratol. 2012. Том 34, № 3. С. 323-330

87. Masson P. et al. Multidisciplinary approaches to Cholinesterase functions /

ed. Shafferman A., Velan B. New York: Plenum Press, 1992

88. Bershtein S., Tawfik D.S. Advances in laboratory evolution of enzymes. //

Curr Opin Chem Biol. 2008. Том 12, № 2. С. 151-158

89. Патрушев JI.И. Искусственные генетические системы. Издательство Наука, 2004

90. Nachon F. et al. Engineering of a monomeric and low-glycosylated form of

human butyrylcholinesterase: expression, purification, characterization and crystallization // Eur J Biochem. 2002. Том 269, № 2. С. 630-637

91. Kris M. et al. Endogenous butyrylcholinesterase in SV40 transformed cell

lines: COS-1, COS-7, MRC-5 SV40, and WI-38 VA13 // In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1994. ТомЗОА. № 10. 680-689

92. Huang Y.-J. et al. Recombinant human butyrylcholinesterase from milk of

98

transgenic animals to protect against organophosphate poisoning. // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. Tom 104, № 34. C. 13603-13608

93. Yang X., Carter M.G. Transgenic animal bioreactors: a new line of defense

against chemical weapons? // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. Том 104, № 35. С. 13859-13860

94. Geyer B.C. et al. Plant-derived human butyrylcholinesterase, but not an organophosphorous-compound hydrolyzing variant thereof, protects rodents against nerve agents. // Proc Natl Acad Sci USA. 2010. Том 107, № 47. С. 20251-20256

95. Geyer B.C. et al. Transgenic plants as a source for the bioscavenging enzyme, human butyrylcholinesterase. // Plant Biotechnol. J. 2010. Том 8, № 8. С. 873-886

96. Duysen E.G., В artels C.F., Lockridge O. Wild-type and A328W mutant human butyrylcholinesterase tetramers expressed in Chinese hamster ovary cells have a 16-hour half-life in the circulation and protect mice from cocaine toxicity // J Pharmacol Exp Ther. 2002. Том 302, № 2. С. 751-758

97. Chilukuri N. et al. Polyethylene glycosylation prolongs the circulatory stability of recombinant human butyrylcholinesterase // Chem Biol Interact. 2005. Tom 157-158. C. 115-121

98. Saxena A. et al. Structure of glycan moieties responsible for the extended

circulatory life time of fetal bovine serum acetylcholinesterase and equine serum butyrylcholinesterase. // Biochemistry. 1997. Том 36, № 24. С. 7481-7489

99. Raveh L. et al. Human butyrylcholinesterase as a general prophylactic antidote for nerve agent toxicity. In vitro and in vivo quantitative characterization. // Biochem Pharmacol. 1993. Том 45, № 12. С. 24652474

100. Chitlaru Т. et al. Overloading and removal of N-glycosylation targets on human acetylcholinesterase: effects on glycan composition and circulatory residence time. // Biochem J. 2002. Том 363, № Pt 3. C. 619-631

101. Rosenberg Y.J. et al. Demonstration of in vivo stability and lack of

99

immunogenicity of a polyethyleneglycol-conjugated recombinant CHO-derived butyrylcholinesterase bioscavenger using a homologous macaque model. // Chem Biol Interact. 2010. Том 187, № 1-3. С. 279-286

102. Chilukuri N. et al. Effect of polyethylene glycol modification on the circulatory stability and immunogenicity of recombinant human butyrylcholinesterase // Chem Biol Interact. 2008. Том 175, № 1-3. С. 255-260

103. Freshney R.I. Culture of animal cells. Wiley-Blackwell, 2005

104. ELLMAN G.L. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem Pharmacol. 1961. Том 7. С. 88-95

105. Karnovsky M.J., Roots L. A "Direct-Coloring" Thiocholine Method for Cholinesterases // J Histochem Cytochem. 1964. Том 12. С. 219-221

106. Harlow E., Harlow E., Lane D. Antibodies. CSHL Press, 1988

107. Ausubel F.M. Short protocols in molecular biology. Current Protocols, 2002

108. Jain S. et al. Polysialylated insulin: synthesis, characterization and biological activity in vivo. // Biochim Biophys Acta. 2003. Том 1622, № 1. С. 42^19

109. Finney D. Probit Analysis. Cambridge Univ Pr, 2009

110. Nair A.J. Principles of Biotechnology. Firewall Media, 2008

111. Mulsant P. et al. Phleomycin resistance as a dominant selectable marker in CHO cells. // Somat. Cell Mol. Genet. 1988. Том 14, № 3. С. 243-252

112. Izumi M. et al. Blasticidin S-resistance gene (bsr): a novel selectable marker for mammalian cells. // Exp. Cell Res. 1991. Том 197, № 2. С. 229-233

113. Fontes E.B. et al. Characterization of an immunoglobulin binding protein homolog in the maize floury-2 endosperm mutant. // Plant Cell. 1991. Том 3, № 5. С. 483^96

114. Kishnani P.S. et al. Recombinant human acid [alpha]-glucosidase: major clinical benefits in infantile-onset Pompe disease // Neurology. 2007. Том 68, № 2. С. 99-109

115. Schwartz R.S. et al. Human recombinant DNA-derived antihemophilic factor (factor VIII) in the treatment of hemophilia A. recombinant Factor VIII Study Group // N Engl J Med. 1990. Том 323, № 26. С. 1800-1805

116. White G.C., Beebe A., Nielsen B. Recombinant factor IX // Thromb Haemost. 1997. Том 78, № 1. С. 261-265

117. Jacobs L.D. et al. Intramuscular interferon beta-la for disease progression in relapsing multiple sclerosis. The Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG) //Ann Neurol. 1996. Том 39, № 3. С. 285-294

118. Barngrover D. Fabrazyme—recombinant protein treatment for Fabry's disease // J Biotechnol. 2002. Том 95, № 3. С. 280-282

119. Robinson D.K., Memmert K.W. Kinetics of recombinant immunoglobulin production by mammalian cells in continuous culture. // Biotechnol Bioeng. 1991. Tom 38, № 9. C. 972-976

120. Xie W. et al. An improved cocaine hydrolase: the A328Y mutant of human butyrylcholinesterase is 4-fold more efficient // Mol Pharmacol. 1999. Том 55, № 1. С. 83-91

121. Masson P. et al. Effects of mutations of active site residues and amino acids interacting with the Q loop on substrate activation of butyrylcholinesterase // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 2001. Том 1544, № 1-2. С. 166-176

122. Bartels С.F. et al. DNA mutation associated with the human butyrylcholinesterase K-variant and its linkage to the atypical variant mutation and other polymorphic sites // Am J Hum Genet. 1992. Том 50, № 5. С. 1086-1103

123. Wang Y. et al. Resistance to organophosphorus agent toxicity in transgenic mice expressing the G117H mutant of human butyrylcholinesterase // Toxicol Appl Pharmacol. 2004. Том 196, № 3. С. 356-366

124. Preininger A. et al. Strategies for recombinant Furin employment in a biotechnological process: complete target protein precursor cleavage. // Cytotechnology. 1999. Том 30, № 1-3. С. 1-16

125. Wajih N. et al. Increased production of functional recombinant human

101

clotting factor IX by baby hamster kidney cells engineered to overexpress VKORC1, the vitamin К 2,3-epoxide-reducing enzyme of the vitamin К cycle. // J Biol Chem. 2005. Том 280, № 36. С. 31603-31607

126. Josse L., Smales C.M., Tuite M.F. Transient expression of human TorsinA enhances secretion of two functionally distinct proteins in cultured Chinese hamster ovary (CHO) cells. // Biotechnol Bioeng. 2010. Том 105, № 3. С. 556-566

127. Meleady P. et al. Sustained productivity in recombinant Chinese hamster ovary (CHO) cell lines: proteome analysis of the molecular basis for a process-related phenotype. // BMC Biotechnol. 2011. Том 11. С. 781

128. Gregoriadis G. et al. Polysialic acids: potential in drug delivery. // FEBS Lett. 1993. Tom 315, № 3. C. 271-276

129. Fernandes A.I., Gregoriadis G. Synthesis, characterization and properties of sialylated catalase. // Biochim Biophys Acta. 1996. Том 1293, № 1. С. 9096

о со

5.0

4.5

4.0

jA.

3.5

3.0 к ;

■ і ■

г.5

2.0 I

1.0

Current Data Parameter NAME R

EXP NO PROCNO

F2 - Acquii

Date_

Time

INSTRUK

PROBHD 5

PULPROG

TD

SOLVENT

NS

DS

SWK

FIDRES AO Kti DK

lition Param 2011061 14.4 spec ЮТ ВВІ 1H-B z

3276 CDC1

2394.63 0.07307 6.842008

208.80

DE 6.0

ТЕ 300.

Dl 5.0000000

----- ---- CHANNEL fl —

NUCI 1

PI 4.0

PLI 3.0

SFOl 300.'31200

F2 - Processing parame

SI 3276

SF 300.130007

NEW E

SSB

La 0.1

GB

PC 1.0

X ia

о

s =

з

w

s

о аз

CS

Ж

а о

3 <

га

О Cl

О

■S"

с ь о

то а: с

«і

¡ь.

Я

43 s

о

g

fD X

s

sa

і О Ті СП ГО

NV4E

ЗХРГ.'О

'ROCHO

RVX 31 1

- Acquisition Parameter*

2011061b

Ine 15 24

INSTRUM spect

PROBHD 5 nm ВВІ 1H-BB

PJLPROG =«

TD зг/ьъ

SOLVENT CDC 13

NS 1С

DS 0

3WH 1824В 176 Hz

?I0RES С.55689С Hz

AQ С 8978932 see

ЧС 100С

0Л 27 40С U3Í

DE 6 00 USí

TE 300 С к

Dl 2 ОООООООС

NJC1 ?1

SFOl

Г2 ■

51

SF

WDW

SSB

LB

G3

=C

HANNE.. fl ======

31F 12 20 US! b ОС dB 171 «З^вУЗІ MH

Processing parameters 32768 121.2948360 MH.

1 00 Hz 0

1 40

►d ta

о S

s

H m w S T3 о № P Я

я о "І

о <

а О

Cl

O

£ с ь о

H

то a: с съ

Сл

—т™

90

"г" 30 20 10

Л л л

80

60

ЬО

д

-10 -20 -30 -40 рріг