Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Смирнов, Александр Владимирович

• Смирнов, Александр Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Смирнов, Александр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Особенности структуры 5S рРНК, её взаимодействия с макромолекулами и возможные функции.

1. Общие сведения о 5S рРНК.

2. Особенности структуры 5S рРНК.

2.1. Спираль I.

2.2. Спираль II.

2.3. Петли В и С.

2.4. Спираль III.

2.5. Спирали IV и V и петля D.

2.6. Петля Е.

Петля Е бактериального типа.

Петля Е эукариотического типа.

2.7. Конформационная подвижность и реорганизация структуры 5S рРНК.

3. Взаимодействия с биологическими макромолекулами.

3.1. Взаимодействие с транскрипционным фактором IIIA.

3.2. Взаимодействия с рибосомными белками eL5/L 18-ссмейства.

3.3. Взаимодействие с рибосомным белком L5 прокариот.

3.4. Взаимодействие с бактериальным рибосомным белком L25.

3.5. Взаимодействие с 23S рРНК.

4. Функции 5S рРНК.

5. Импорт 5S рРНК в митохондрии клеток млекопитающих.

Возможная роль 5S рРНК в митохондриях млекопитающих.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Штаммы Е. coli и линии клеток человека.

1.1. Штаммы Е. coli.

1.2. Линии клеток человека.

2. Генно-инженерные конструкции.

2.1. Генно-инженерные конструкции для клонирования и экспрессии генов версий 5S рРНК.

2.2. Генно-инженерные конструкции для экспрессии генов (npe)MRP-L18.

3. Моделирование вторичных структур версий 5S рРНК in silico.

4. Генно-инженерные методы.:.

4.1. Создание генов мутантных версий 5S рРНК.

ПЦР-мутагенез генов 5SрРНК.

Клонирование генов 5SрРНК.

4.2. Клонирование генов (npe)MRP-L18.

ПЦР-амплификация генов (npe)MRP-L18.

Клонирование генов (npe)MRP-L18.

5. Экспрессия мутантных версий 5S рРНК.

5.1. Экспрессия мутантных версий 5S рРНК in vitro.

ПЦР генов мутантных версий 5SрРНК.

Рестрикция ПЦР-продуктов.

77-транскрип ция.

5.2. Экспрессия мутантных версий 5S рРНК in vivo.

Стабильная трансфекция человеческих клеток генами мутантной

5S рРНК.

Выделение тотальной РНК из трансфицированных клеток.

Обратная транскрипция с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР).

6. Экспрессия генов белков.

6.1. Экспрессия генов (npe)MRP-L18 в клетках Е. coli.

6.2. Экспрессия генов белков в бесклеточной сопряжённой системе транскрипции-трансляции.

ПЦР генов белков.

Бесклеточная сопряжённая система транскрипции-трансляции.

7. Анализ конформации 5S рРНК.

7.1. Нативный гель-электрофорез.

7.2. Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) в геле.

Сборка и гель-электрофорез 5 S рРНК.

Количественный анализ данных FRET в геле.

8. Методы, использованные в экспериментах с роданезой.

8.1. Характеристика фермента и хранение.

8.2. Определение энзиматической активности.

8.3. Денатурация.

8.4. Термоинактивация.

8.5. Реактивация.

8.6. Агрегация.

8.7. Измерение УФ-спектров роданезных форм.

8.8. Вестерн-блот анализ.

Гель-электрофорез белков по Лэммли.

Вестерн-блоттинг.

8.9. Иммунодеплетирование роданезы из белковых экстрактов.

9. Анализ РНК-белковых взаимодействий.

9.1. Задержка в геле.

9.2. Анализ по Скэтчарду.

9.3. Норс-Вестерн блоттинг.

10. Котрансляционное взаимодействие между роданезой и 5S рРНК.

10.1. Флуоресцентное мечение 5S рРНК.

10.2. Реакция котрансляционноо связывания.

11. Импорт белков и 5S рРНК в выделенные митохондрии человека.

11.1. Выделение митохондрий из клеток человека.

11.2. Импорт белков в выделеннные митохондрии.

11.3. Импорт 5S рРНК в выделенные митохондрии человека.

Выделение и фракционирование белков, направляющих импорт 5S рРНК.

Дефосфорилирование Т7-транскриптов 5SpPHK.

Меченые транскриптое.

Реакция импорта 5SрРНК в выделенные митохондрии.

Расчёт эффективности импорта версий 5S рРНК в выделенные митохондрии.л.

12. Импорт 5S рРНК in vivo.

12.1. Импорт мутантных версий 5S рРНК в митохондрии стабильно трансфицированных человеческих клеток.

12.2. Импорт мутантных версий 5 S рРНК в митохондрии человеческих клеток, трансфицированных транскриптами.

Трансфекция человеческих клеток транскриптами.

Норзерн-блот гибридизация.

Расчёт эффективности импорта версий 5SрРНК в митохондрии in vivo.

13. Ингибирование экспрессии генов роданезы и MRP-L18 с помощью РНК-интерференции.

14. Анализ экспрессии митохондриальных белков in vivo.

15. Выделение и анализ митохондриальных рибосом.

15.1. Выделение и Норзерн-блот анализ грубого препарата митохондриальных рибосом.

Выделение грубого препарата миторибосом печени крысы.

Норзерн-блот анализ РНК из грубого препарата миторибосом.

15.2. Фракционирование митохондриального лизата печени крысы на сахарозном градиенте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Детерминанты импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека.

1.1. Стратегия поиска детерминант импорта.

1.2. Роль главных доменов в импорте 5S рРНК.

1.3. Влияние делеций в домене р на эффективность импорта 5 S рРНК in vitro.

1.4. Влияние мутаций в домене у на эффективность импорта 5S рРНК in vitro.

1.5. Влияние мутаций в домене а и петле А на эффективность импорта 5S рРНК in vitro.

1.6. Анализ двойных мутантов 5S рРНК по доменам а и у.

1.7. Анализ импорта мутантных версий 5S рРНК в человеческие митохондрии in vivo.

1.8. Возможный механизм регуляции распределения 5S рРНК в эукариотической клетке.

1.9. 5S рРНК как вектор.

2. Факторы импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека.

2.1. Получение и анализ белковых фракций, направляющих импорт 5S рРНК in vitro.

2.2. Роданеза как фактор импорта.

2.3. Взаимодействие роданезы с 5S рРНК.

2.4. 5S рРНК как шаперон для роданезы.

Анализ конформации 5SрРНК человека в растворе.

Конформационно-специфичный шаперонный эффект 5S рРНК. 146 Конформация роданезы в комплексе с 5S рРНК.

2.5. MRP-L18 как 5S рРНК-связывающий фактор.

2.6. IïpeMRP-L18 как фактор импорта 5S рРНК.

2.7. Система преМЯР-ЬШроданеза как молекулярный конвейер.

Взаимодействия 5S рРНК с роданезой и (npe)MRP-L18 в минимальной системе импорта.

Математическая модель, описывающая конвейерный механизм передачи 5 S рРНК.

Взаимодействия 5S рРНК с "митохондриальными" формами роданезы и MRP-L18.

2.8. Система импорта 5S рРНК in vivo.

3. Возможная функция 5 S рРНК в митохондриях млекопитающих.

Необходимость импортированной 5S рРНК для поддержания митохондриальной трансляции.

Импортированная 5S рРНК как компонент миторибосомы млекопитающих.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Ранние этапы эволюции рибосомы.

Эволюция митохондриальной рибосомы. Вариант I: протисты.А75 Эволюция митохондриальной рибосомы. Вариант II: растения и животные.

Развитие механизма импорта 5SрРНК в митохондрии.

TIpeMRP-Ll8 как первый фактор импорта.

Роданеза как второй фактор импорта или один из «вторых факторов»?.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов»

Среди известных на сегодняшний день генетических систем одной из наиболее динамичных, вне всякого сомнения, является система митохондрий. В процессе эволюции эукариотической клетки с огромной скоростью происходили и продолжают происходить глубочайшие перестройки аппарата воспроизведения и реализации генетической информации органелл. В контексте постоянного диалога с ядерным геномом митохондрии потеряли свою автономию вследствие переноса практически всех белок-кодирующих генов в ядро. В то же время значительная часть генов РНК (несмотря на явно «пробелковый» характер эволюции митохондриальных метаболических систем) и генов, кодирующих белки электрон-транспортной цепи, сохранена в митохондриальном геноме. Сосуществование двух относительно независимых генетических систем, контролирующих метаболизм митохондрий, привело к возникновению весьма сложных механизмов взаимодействия.

К таким механизмам в первую очередь относится импорт кодируемых ядерным геномом макромолекул в органеллы. Направленное перемещение белков из цитозоля в митохондрии, очевидно, является одним из наиболее древних приобретений эукариотической клетки. Осуществляемое благодаря работе высоко консервативного белкового аппрата, оно было тщательно исследовано и в настоящее время описано в деталях. Вместе с тем, значительно позже и, очевидно, независимо в разных систематических группах митохондрии начали терять также отдельные гены РНК, что усилило их интеграцию в эукариотическую систему клетки-хозяина. Потеря своих РНК (и, по крайней мере, в одном случае, описанном у дрожжей, развитие нового адаптивного механизма - Катепзк! а1., 2007) привела к необходимости выработать специальный механизм для их импорта из цитозоля. У протистов, растений, грибов и животных самые разнообразные белковые системы были использованы для осуществления этой задачи (см. для обзора ТагаББОУ е/ а1., 2007). Отличающиеся в первую очередь поразительной непохожестью друг на друга, системы импорта РНК в разных таксонах оказались весьма сложными для исследования. Не является исключением и человеческая клетка, в которой был показан митохондриальный импорт нескольких РНК, важнейшей из которых явлется 5Б рРНК (ЕЩеИв е1 а!., 2001).

Впервые обнаруженная в митохондриях быка, цитозольная 5Б рРНК оказалась едва ли не самым высоко представленным в органеллах видом рибонуклеиновой кислоты (Ма§аШае8 ега1., 1998). Присутствие её в матриксе выглядело несколько неожиданным, т.к. было принято считать, что гены 5Б рРНК бесследно исчезли из митохондриальных геномов животных и грибов, а её функцию взяли на себя новые белки, столь характерные для миторибосом (БЬагша е? а/., 2003). Вместе с тем, недавний цикл работ, направленных на выявление функции этой маленькой, но, как оказалось, весьма важной молекулы, показал, что 58 рРНК, являясь одной из наиболее консервативных макромолекул в рибосоме, выполняет роль «администратора», ответственного за координацию работы функциональных сайтов рибосомной машины (ЮрапБОУ еХ а1., 2005). С уверенностью можно сказать, что без этого высшего регуляторного центра последовательное, чёткое и закономерное осуществление реакций элонгации является невозможным.

Каким же образом эукариотические клетки решали проблему исчезновения 58 рРНК из митохондриального генома? Один из способов, как это уже отмечалось выше, состоит в замещении 58 рРНК новыми рибосомными белками, формирующими центральный протуберанец большой субчастицы (трипаносоматиды, дрожжи - 8Ьагта е1 а1, 2009). Однако очевидное существование пути импорта цитозольной 58 рРНК в митохондрии позвоночных, как и ряд других косвенных данных, заставляет нас предположить, что в последнем случае может иметь место прямая замена утраченной 58 рРНК на её эукариотический ортолог.

Исследованию механизма импорта 5 S рРНК в митохондрии клеток человека, его регуляции и функциональной роли транспортируемой молекулы в органеллах посвящена настоящая работа.

Целью настоящей работы было исследование механизма импорта и возможной функции 5 S рРНК в митохондриях клеток человека и создание рекомбинантных форм 5 S рРНК, способных служить митохондриальными векторами.

Основные задачи исследования:

1. Выявить структурные элементы 5S рРНК, служащие сигналами её митохондриальной локализации (детерминанты импорта).

2. Идентифицировать белковые факторы, необходимые для проникновения

5S рРНК в митохондрии (факторы импорта).

3. Исследовать роль каждого фактора импорта в процессе транспорта 5 S рРНК в митохондрии.

4. Проверить гипотезу об участии импортируемой 5S рРНК в митохондриальной трансляции.

5. Сконструировать на основе 5 S рРНК векторные молекулы, способные переносить гетерологичные последовательности РЕЙС в матрикс человеческих митохондрий in vivo. В результате выполнения данной работы детально охарактеризован механизм импорта 5 S рРНК в митохондрии человеческих клеток. Систематическое исследование эффективности импорта мутантных версий 5 S рРНК позволило выявить существование двух сигналов митохондриальной локализации, один из которых расположен в проксимальной части спирали I, а другой - в спирали IV и петле D. Эти структурные элементы соответствуют сайтам связывания с двумя факторами импорта: митохондриальным рибосомным белком L18 (MRP-L18) и митохондриальным ферментом роданезой. Оба белка работают в молекулярном конвейере, обеспечивая эффективный «захват» молекул 5S рРНК и направление их в митохондрии. Создана минимальная in vitro система импорта 5 S рРНК в человеческие митохондрии, составленная из очищенных компонентов. Детально охарактеризовано взаимодействие факторов импорта с молекулой РНК. Впервые продемонстрированы РНК-связывающие свойства роданезы, а также необычный шаперонный эффект, который 5 S рРНК способна оказывать на денатурированный или синтезируемый на рибосоме фермент.

Показано, что MRP-L18, ранее фактически не охарактеризованный представитель семейства самых консервативных 5 S рРНК-связывающих белков, способен взаимодействовать с 5 S рРНК прокариотического типа, но, очевидно, приобрёл в процессе эволюции способность формировать также неклассический комплекс с эукариотической 5 S рРНК. Этот результат позволил нам предположить, что комплекс 5S pPHK/MRP-L18 является основной формой существования 5S рРНК в митохондриях. Выделение и изучение митохондриальных рибосом из печени крысы впервые подтвердило присутствие в их составе цитозольной 5 S рРНК. Исследования in vivo, в которых подавлялась экспрессия роданезы или MRP-L18, показали, что при уменьшении импорта 5 S рРНК в митохондрии наблюдается пропорциональное снижение уровня митохондриальной трансляции. Таким образом, участие импортируемой 5 S рРНК как компонента миторибосомы в реакциях митохондриальной трансляции более не вызывает сомнений.

Раскрытие механизма импорта 5 S рРНК позволило нам сконструировать высокоэффективную векторную систему, обеспечивающую доставку гетерологичных РНК-последовательностей в органеллы in vivo. Использование этой системы открывает широчайшие возможности как для генетических манипуляций над митохондриями, так и для терапии многочисленных заболеваний, связанных с мутациями в митохондриальном геноме.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Особенности структуры 58 рРНК, её взаимодействия с макромолекулами и возможные функции

Малые некодирующие РНК привлекают внимание исследователей как сохранившиеся до нашего времени представители гипотетического «мира РНК», который, по-видимому, предшествовал современному этапу эволюции жизни на Земле. Среди малых РНК особый интерес представляет 5Б рРНК. Она является компонентом рибосом всех живых организмов, за исключением рибосом митохондрий грибов и животных, и взаимодействует с разнообразными белковыми факторами, а также с 23 Б (288) рРНК. Предполагают, что 5Б рРНК должна играть важную роль в процессе синтеза белка на рибосоме. Вместе с тем, несмотря на обилие данных о структуре и взаимодействиях 5 Б рРНК с другими биологическими макромолекулами, её функция остаётся невыясненной.

За более чем тридцатилетнюю историю изучения 5 Б рРНК стала классическим модельным объектом в исследованиях структуры и динамики РНК в растворе и в составе комплексов с белками, процесса РНК-белкового распознавания и связывания. Весьма интригующим стало открытие импорта 5Б рРНК эукариотического типа в митохондрии позвоночных, хотя механизм этого переноса до сих пор не ясен. Загадочна и роль эукариотической 58 рРНК в прокариотической системе митохондрий. Настоящий обзор посвящён рассмотрению особенностей структуры 58 рРНК в контексте её взаимодействий с разнообразными факторами и выполняемых ею функций.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Смирнов, Александр Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены структурные элементы, обусловливающие митохондриальную локализацию 5S рРНК человека (детерминанты импорта), — область спирали IV-петли D и проксимальная часть спирали I.

2. Идентифицированы и охарактеризованы белковые факторы импорта 5S рРНК - митохондриальный фермент роданеза и предшественник митохондриального рибосомного белка L18 (npeMRP-L18).

3. Детально исследовано взаимодействие между факторами импорта и 5S рРНК и механизм, обеспечивающий митохондриальную локализацию 5S рРНК.

4. Впервые показано присутствие импортированной 5S рРНК в миторибосомах млекопитающих, получены данные об её участии в митохондриальной трансляции.

5. Создана высоко эффективная векторная система на основе 5S рРНК, обеспечивающая доставку гетерологичных РНК-последовательностей в человеческие митохондрии in vivo.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Смирнов, Александр Владимирович, 2009 год

1. Andersen, J. and Delihas, N. (1986) J. Biol. Chem. 261, 2912-2917. Aoyama, K., Tanaka, T., Hidaka, S. and Ishikawa, K. (1984) J. Biochem. 95, 11791186.

2. Ban, N;, Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B. and Steitz, T.A. (2000) Science 289, 905920.

3. Ehresmann, С. (1991) У. Mol. Biol. 218, 69-81. Baumstark, T., Schröder, A.R.W. and Riesner, D. (1997) EMBO J. 16, 599-610. Bear, D.G., Schleich, T., Noller, H.F. and Garrett, R.A. (1977) Nucl. Acids Res. 4, 2511-2526.

4. Bhattacharyya, A.M. and Horowitz, P.M. (2001) J Biol Chem 276, 28739-28743. Blobel, G. (1971) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 68, 1881-1885.

5. Bogdanov, A.A., Dontsova, O.A., Dokudovskaya, S.S., Lavrik, I.N. (1995) Biochem.

6. Cell. Biol. 73, 869-876. Bokov, K. and Steinberg, S.V. (2009) Nature 457, 977-980.

7. Branch, A.D., Benenfeld, B.J., and Robertson, H.D. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 6590-6594.

8. Brubacher-Kauffmann, S., Maréchal -Drouard, L., Cosset, A., Dietrich, A. and Duchêne, A.-M. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 2037-2042.

9. Chen, H.-C., Viry-Moussaid, M., Dietrich, A. and Wintz, H. (1997) Biochem. and

10. Biophys. Research Comm. 237, 432-437. Chow, C.S., Hartmann, K.M., Rawling, S.L., Huber, P.W., and Barton, J.K. (1992)

11. Biochemistry 31, 3534-3542. Ciesiolka, J., and Krzyzosiak, W.J. (1996) Biochem. Mol. Biol. Int. 39, 319-328. Clegg, R.M., Murchie, A.I.H., Zechel, A., Carlberg, C., Diekmann, S. and Lilley,

12. D.M.J. (1992) Biochemistry 31, 4846-4856. Correll, C.C., Beneken, J., Plantinga, M.J., Lubbers, M. and Chan, Y.-L. (2003) Nucl.

13. R. (1996) RNA 2, 146-152. Dontsova, O., Tishkov, V., Dokudovskaya, S., Bogdanov, A., Döring, T., RinkeAppel, J., Thamm, S., Greuer, B., and Brimacombe, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 4125-4129.

14. Dörner, M., Altmann, M., Pääbo, S. and Morl, M. (2001) Mol. Biol. Cell 12, 26882698.

15. Douthwaite, S., Garrett, R.A., Wagner, R. and Feunteun, J. (1979) Nucl. Acids Res. 6, 2453-2470.

16. Dulbecco, R. and Freeman, G. (1959) Virology. 8, 396-397. Eilers, M., and Schatz, G. (1986) Nature 322, 228-232.

17. Enriquez, J.A., Cabezas-Herrera, J., Bayona-Bafaluy, M.P., and Attardi, G. (2000) J

18. Biol Chem 275, 11207-11215. Entelis, N., Brandina, I., Kamenski, P., Krasheninnikov, I.A., Martin, R.P., and

19. Tarassov, I. (2006) Genes Dev 20(12), 1609-1620. Entelis, N.S., Kolesnikova, O.A., Dogan, S., Martin, R.P., and Tarassov, I.A. (2001) J.

20. Biol. Chem. 276, 45642-45653. Erdmann, V.A., Fahnestock, S., Higo, K., and Nomura, M. (1971) Proc. Natl. Acad.

21. Sei. USA 68, 2932-2936. Fahnestock, S.R. and Nomura, M. (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 363-365. Fernandez-Silva, P., Martinez-Azorin, F., Micol, V., and Attardi, G. (1997). Embo J 16, 1066-1079.

22. Forget, B. G.; Weissman, S. M. (1967) Science 158, 1695-1699. Förster, Th. (1948) Phys. 2, 55-75.

23. Funari, S.S., Rapp, G., Perbandt, M., Dierks, K., Vallazza, M., Betzel, C., Erdmann,

24. V.A., Svergun, D.I. (2000) JBiol Chem 275(40), 31283-31288. Giegerich, R., Haase, D., Rehmsmeier, M. (1999) Pacific Symposium on

25. Biocomputing 126-137. Glick, B., and Schatz, G. (1991) Annu Rev Genet 25, 21-44. Glover, K.E., Spencer, D.F., and Gray, M.W. (2001) J. Biol. Chem. 276, 639-648.

26. Grohmann, L., Graack, H.R., Kruft, V., Choli, T., Goldschmidt-Reisin, S., Kitakawa,

27. M. (1991) FEBS Lett 284, 51-56. Hanas, J.S., Bogenhagen, D.F. and Wu, C.W. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 2745-2758. Hancock, K., LeBlanc, A.J., Donze, D., and Hajduk, S.L. (1992) J. Biol Chem. 267, 23963-23971.

28. Haslbeck, M. (2006) Int J Biol Macromol 38(2), 107-14.

29. Helm, M. (2006) Nucl. Acids Res. 34, 721-733.

30. Henis, Y.I. and Levitzki, A. (1976) Eur JBiochem 71, 529-532.

31. Hofacker, I.L. (2003) Nucl Acids Res. 31, 3429-3431.

32. Home, J.R. and Erdmann, V.A. (1972) Mol Gen Genet 119(4), 337-344.

33. Home, J.R. and Erdmann, V.A. (1973) Proc. Natl Acad. Sci. USA 70, 2870-2873.

34. Horowitz, P.M., and Criscimagna, N.L. (1990) J Biol Chem 265, 2576-2583.

35. Huber, P. W., Rife, J. P., Moore, P. B. (2001) J. Mol Biol V. 312, 823.

36. Huber, P. W. and Wool, I.G. (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA 81, 322-326.

37. Huber, P.W. and Wool, I.G. (1986) Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 1593-1597.1.oda, N., Tanaka, T. and Ishikawa, K. (1981) J. Biochem. 90, 551-554.

38. Kamenski, P., Kolesnikova, O., Jubenot, V.,Entelis, N., Krasheninnikov, I.A., Martin,

39. Kiparisov, S., Petrov, A., Meskauskas, A., Sergiev, P.V., Dontsova, O.A., Dinman, J.D. (2005) Mol. Gen. Genomics 274, 235-247.

40. Kiprekar, F., Douthwaite, S., and Roepstorff, P. (2000) RNA 6, 296-306.

41. Koc, E.C., Burkhart, W., Blackburn, K., Moyer, M.B., Schlatzer, D.M., Moseley, A., and Spremulli, L.L. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43958-43969.

42. Kolesnikova, O.A., Entelis, N.S., Jacquin-Becker, C., Goltzene, F., Chrzanowska-Lightowlers, Z.M., Lightowlers, R.N., Martin, R.P., and Tarassov, I. (2004) Hum Mol Genet 13, 2519-2534.

43. Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., and Garber, M.B. (2004) Biochemistry 69, 607611.

44. Koulintchenko, M., Konstantinov, Y., and Dietrich, A. (2003) EMBOJ22(6), 12451254.

45. Koulintchenko, M., Temperley, R.J., Mason, P.A., Dietrich, A., and Lightowlers, R.N. (2006) Human Mol Genet 15(1), 143-154.

46. Kouvela, E.C., Gerbanas, G.V., Xaplanteri, M.A., Petropoulos, A.D., Dinos, G.P. and Kalpaxis, D.L. (2007) Nucl. Acids Res. 1-12.

47. Magalhäes, P.J., Andreu, A.L., and Schon, E.A. (1998) Mol. Biol. Cell 9, 2375-2382.

48. Mager-Heckel, A.-M., Brandina, I., Kamenski, P., Entelis, N., Martin, R.P., Tarassov,1. (2007) Methods Mol. Biol. 373, 235-253.

49. Marechal-Drouard, L., Weil, J.-H. and Guillemaut, P. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 4777-4788.

50. Martin, R.P., Schneller, J.M., Stahl, A.J. and Dirheimer, G. (1979) Biochemistry 18, 4600-4605.

51. Maruyama, S. and Sugai, S. (1980) J. Biochemistry 88, 151-158.

52. Maslov, D.A., Sharma, M.R., Butler, E., Falick, A.M., Gingery, M., Agrawal, R.K., Spremulli, L.L., Simpson, L. (2006) Molecular and Biochemical Parasitology 148, 69-78.

53. Matthews, D.E., Hessler, R.A., Denslow, N.D., Edwards, J.S., and O'Brien, T.W. (1982) J Biol Chem 257, 8788-8794.

54. Matthews, D.H., Sabina, J., Zuker, M. & Turner, D.H. (1999) J. Mol. Biol. 288, 911940.

55. McDougall, J. and Wittmann-Liebold, B. (1994) Eur. J. Biochem. 221, 779-785.

56. Mears, J.A., Sharma, M.R., Gutell, R.R., McCook, A.S., Richardson, P.E., Caulfield, T.R., Agrawal, R.K., and Harvey, S.C. (2006) J Mol Biol 358, 193-212.

57. Meskauskas, A. and Dinman, J.D. (2001) RNA 7, 1084-1096.

58. Miller, D.M., Delgado, R., Chirgwin, J.M., Hardies, S.C., and Horowitz, P.M. (1991) J Biol Chem 266, 4686-4691.

59. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K„ Hartl, F.U. (1996) J Biol Chem 271(32), 19617-19624.

60. Miyazaki, M. (1974) J. Biochem. 75, 1407-1410.

61. Momen, H. (2001) Int JParasitol 31, 640-642.

62. Moreira, D., Kervestin, S., Jean-Jean, O. and Philippe, H. (2002) Mol Biol and Evolution 19, 189-200.

63. Mottram, J.C., Bell, S.D., Nelson, R.G., and Barry, J.D. (1991) J. Biol. Chem. 266, 18313-18317.

64. Nakashima, T., Yao, M., Kawamura, S., Iwasaki, K., Kimura, M., and Tanaka, I. (2001)m4 7, 692-701.

65. Nazar, R.N., Willick, G.E., and Matheson, A.T. (1979) J. Biol. Chem. 254,1506-1512.

66. Nierlich, D.P. (1982) Mol. Cell. Biol 2, 207-209.

67. Nishikawa, K., and Takemura, S. (1974) FEBS Lett. 40, 106-109.

68. Nishikawa, K. and Takemura, S. (1977) J.Biochem. 81, 995-1003.

69. Nishikawa, K. and Takemura, S. (1978) J. Biochem. 84, 259-266.

70. Nishikori, S., Yamanaka, K., Sakurai, T., Esaki, M., Ogura, T. (2008) Genes Cells 13(8), 827-838.

71. Nissen, P., Ippolito, J.A., Ban, N., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2001) Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 4899-4903.

72. O'Brien, T. W., Liu, J., Sylvester, J.E., Mougey, E.B., Fischel-Ghodsian, N., Thiede, B., Wittmann-Liebold, B., and Graack, H.-R. (2000) J. Biol Chem. 275: 18153 -18159.

73. Ogata, K., Terao, K. and Uchiumi, T. (1980) J. Biochem. 87, 517-524.

74. Ogata, K., Kurashashi, A., Nishiyama, C., and Terao, K. (1993) Eur J Biochem 213(3), 1277-82.

75. Oshima, T. (1994) Tanpakushitsu Kakusan Koso 39(15), 2406-2047.

76. Pace, B., Matthews, E.A., Johnson, K.D., Cantor, C.R., and Pace, N.R. (1982) Proc.

77. Sei. USA 102, 3913-3920. Raue, H.A., Lorenz, S., Erdmann, V.A. and Planta, R.J. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 1263-1269.

78. Salinas, T., Duchene, A.-M., Delage, L., Nilsson, S., Glaser, E., Zaepfel, M., and

79. Scripture, J.B. and Huber, P.W. (1995) J. Biol. Chem. 270, 27358-27365. Semrad, K., Green, R., and Schroeder, R. (2004) RNA 10, 1855-1860. Sharma, M., Booth, T.M., Simpson, L., Maslov, D.A., Agrawal, R.K. (2009) PNAS 106(24), 9637-9642.

80. Sharma, M.R., Koc, E.C., Datta, P.P., Booth, T.M., Spremulli, L.L., and Agrawal,

81. R.K. (2003) Cell 115, 97-108. Shpanchenko, O. V., Dontsova, O. A., Bogdanov, A. A. and Nierhaus, K. H. (1998) RNA 4, 1154-1164.

82. Silberg, J.J., Hoff, K.G., and Vickery, L.E. (1998) JBacteriol 180, 6617-6624. Simpson, A.M., Suyama, Y., Dewes, H., Campbell, D.A. and Simpson, L. (1989)

83. Nucleic Acids Res. 17, 5427-5444. Skibinska, L., Banachowicz, E., Gapinski, J., Patkowski, A., Barciszewski, J. (2004)

84. Biopolymers 73, 316-325. Sloan, I.S., Horowitz, P.M., and Chirgwin, J.M. (1994) J Biol Chem 269, 2762527630.

85. Smith, M.W., Meskauskas, A., Wang, P., Sergiev, P.V., and Dinman, J.D. (2001) Mol.

86. Cell. Biol. 21, 8264-8275. Smits, P., Smeitink, J.A.M., van den Heuvel, L.P., Huynen, M.A., Ettema, T.J.G.2007) Nucl Acids Res 35(14), 4686-4703. Spierer, P., Bogdanov, A.A., and Zimmermann, R.A. (1978) Biochemistry 17, 53945398.

87. Steitz, J.A., Berg, C., Hendrick, J.P., La Branche-Chabot, H., Metspalu, A., Rinke, J. and Yario, T. (1988)J.CellBiol. 106, 545-556.

88. Stoldt, M., Wohnert, J., Gorlach, M. and Brown, L.R. (1998) EMBOJ. 17, 6377-6384.

89. Stoldt, M., Wohnert, J., Ohlenschlager, O., Gorlach, M. And Brown, L.R. (1999) EMBOJ. 18, 6508-6521.

90. Studnicka, G.M, Eiserling, F.A. and Lake, J.A. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 1885-1904.

91. Su, A.I., Wiltshire, T., Batalov, S., et al (2004). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (16), 6062-7.

92. Suzuki, T., Terasaki, M., Takemoto-Hori, C., Hanada, T., Ueda, T., Wada, A., and Watanabe, K. (2001) J. Biol. Chem. 276, 21724-21736.

93. Szymanski, M., Barciszewska, M.Z., Erdmann, V.A. and Barciszewski, J. (2000) Mol. Biol.Evol. 17, 1194-1198.

94. Szymanski, M., Barciszewska, M.Z., Erdmann, V.A. and Barciszewski, J. (2003) Biochem. J. 371, 641-651.

95. Tarassov I, Kamenski P, Kolesnikova O, Karicheva O, Martin RP, Krasheninnikov IA, Entelis N. (2007) Cell Cycle 6(20), 2473-2477.

96. Theunissen, O., Rudt, F. and Pieler, T. (1998) Eur. J. Biochemistry 258, 758-767.

97. Tompa, P. and Csermely, P. (2004) FASEB J. 18, 1169-1175.

98. Toots, I., Metspalu, A., Villems, R. and Saarma, M. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 53315343.

99. Toots, I., Misselwitz, R., Bohm, S., Welfle, R., Villems, R. And Saarma, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10, 3381-3389.

100. Wagner, R. and Garrett, R.A. (1978) Nucl. Acids Res., 5, 4065-4075.

101. Waltner, M., Hammen, P.K., and Weiner, H. (1996) J Biol Chem 271, 21226-21230.

102. Weber, F., and Hayer-Hartl, M. (2000) Methods Mol Biol 140, 111-115.

103. Weidner, H. and Crothers, D.M. (1977) Nucl. Acids Res. 4, 3401-3414.

104. White, S. A., Nilges, M., Huang, A., Brunger, A. T., Moore, P. B. (1992)

105. Biochemistry V. 31 1610. Williamson, J.R. (2000) Nature Struct. Biol. 7, 834-837.

106. Wimberly, B., Varani, G., and Tinoco, I, Jr. (1993) Biochemistry 32, 1078-1087. Woestenenk, E.A., Gongadze, G.M., Shcherbakov, D.V., Rak, A.V., Garber, M.B.,

107. Hard, T., Berglund, H. (2002) Biochem. J. 363, 553-561. Wong, T.W. and Clayton, D.A. (1986) Cell 45, 817-825. Xiong, Y., Sundaralingam, M. {2000) RNA V. 6 1316.

108. Yeh, L.-C. C., Horowitz, P.M., and Lee, J.C. (1988) J. Biol. Chem. 263, 17412-17417. Yoshionari, S., Koike, T., Yokogawa, T., Nishikawa, K., Ueda, T., Miura, K., and Watanabe, K. (1994) FEBS Lett. 338, 137-42.

109. Zuker, M. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415.