Изучение формирования сывороточных антител к нейраминидазе пандемического, потенциально пандемического и сезонных вирусов гриппа А в эксперименте и клинических наблюдениях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Смолоногина, Татьяна Анатольевна

  • Смолоногина, Татьяна Анатольевна
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2011, Санкт-ПетербургСанкт-Петербург
  • Специальность ВАК РФ03.02.02
  • Количество страниц 190
Смолоногина, Татьяна Анатольевна. Изучение формирования сывороточных антител к нейраминидазе пандемического, потенциально пандемического и сезонных вирусов гриппа А в эксперименте и клинических наблюдениях: дис. кандидат биологических наук: 03.02.02 - Вирусология. Санкт-Петербург. 2011. 190 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Смолоногина, Татьяна Анатольевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные представления о строении и функции нейраминидазы вируса гриппа.

1.1.1. Структурная организация и антигенные сайты нейраминидазы вируса гриппа.

1.1.2. Ферментативная активность нейраминидазы вируса гриппа и ее роль в репликативном цикле вируса.

1.1.3. Патогенез гриппозной инфекции, сопряженный с вирусной нейраминидазой, и факторы его упреждающие.

1.2. Методы определения антинейраминидазных антител.

1.2.1. Реакция ингибирования нейраминидазной активности.

1.2.2. Реакция ингибирования элюирования вируса с эритроцитов и лектин-тест.

1.2.3. Реакция постадсорбционной нейтрализации.

1.2.4. Радиальная диффузия.

1.2.5. Одномерный радиальный гемолиз в агарозном геле.

1.2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ.

1.3. Защитные свойства антител к NA вируса гриппа при экспериментальной инфекции лабораторных животных и птиц.

1.4. Роль антинейраминидазных антител в восприимчивости и развитии гриппозной инфекции у людей.

1.5. Гетеросубтипический иммунитет, опосредованный антителами к NA.

1.6. Формирование иммунного ответа к нейраминидазе вируса гриппа после противогриппозной вакцинации.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Вирусологические методы.

2.2. Методы работы с мышами.

2.3. Исследуемые образцы сывороток крови волонтеров.

2.4. Серологические методики.

2.5. Оценка эволюционных изменений аминокислотных последовательностей и молекулярная филогения.

2.6. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Отработка методик выявления сывороточных антинейраминидазных антител к дрейфовым и шифтовым вирусам гриппа А.

3.1.1. Подготовка диагностических реассортантных штаммов на основе вируса А/лошадь/Прага/1/56(Н7Ю), содержащих ЫА эпидемического, пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа.

3.1.2. Изучение биологических свойств диагностическихреассортантов на основе вируса гриппа А/лошадь/Прага/1/56(Н7Ю).

3.1.3. Модификация методик, предназначенных для выявления антител кИА в сыворотке крови, с учетом биологических свойств диагностических реассортантов.

3.1.4. Апробирование модифицированных методик количественной оценки содержания антинейраминидазных антител на сыворотках крови лабораторных животных '. ^

3.2. Применение модифицированных методик выявления антинейраминидазных антител при изучении иммуногенности живой гриппозной вакцины и уровня коллективного иммунитета.

3.2.1. Оценка антинейраминидазных антител у волонтеров, привитых сезонной трехвалентной ЖГВ осенью 2005 г.

3.2.2. Оценка антинейраминидазных антител в клинических испытаниях моновалентной ЖГВ против пандемического гриппа А(НШ1).

3.2.3. Оценка антинейраминидазных антител в клинических испытаниях ЖГВ «Орвакс» подтипа А (Н5И2).

3.2.4. Оценка антинейраминидазных антител к пандемическому штамму А (НШ1) у волонтеров, привитых сезонной трехвалентной ЖГВ осенью 2010 г.

3.2.5. Уровень коллективного иммунитета к нейраминидазе эпидемического и пандемического вирусов гриппа А(НШ1) осенью 2010 г.

3.3. Защитная эффективность сывороточных антинейраминидазных антител при моделировании гриппозной инфекции на мышах.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Вирусология», 03.02.02 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение формирования сывороточных антител к нейраминидазе пандемического, потенциально пандемического и сезонных вирусов гриппа А в эксперименте и клинических наблюдениях»

Актуальность работы. Антитела к поверхностным антигенам вируса гриппа -гемагглютинину (НА) и нейраминидазе (NA) - являются одними из основных факторов, определяющих восприимчивость человека к гриппозной инфекции. Защитное действие антител к NA заключается в снижении частоты инфицирования и доли клинически выраженных форм при естественной инфекции дрейфовыми и шифтовым вариантами вируса гриппа А [10, 131, 137]. Однако неразрешенным остается вопрос о возможном вкладе антинейраминидазных антител наряду с Т-клетками памяти в гетеросубтипическую защиту в условиях смены подтипа НА, к примеру, при прогнозируемой адаптации и внедрении в циркуляцию высокопатогенных штаммов A(H5N1). Исследования в области перекрестной защиты и представленности в человеческой популяции антинейраминидазных антител, перекрестно реагирующих с NA пандемических и потенциально пандемических штаммов вируса гриппа, на настоящий момент немногочисленны [122, 144, 157].

Традиционно иммуногенность гриппозных вакцин оценивается исключительно по формированию сывороточных антигемагглютинирующих антител. Оценка < \ 1 Ч поствакцинальных титров антинейраминидазных антител в сыворотке -крови ' Li " проводится редко. Работы датируются в основном 70-80 годами 20, века и были

А. iг п, * выполнены с привлечением имевшихся на тот момент методик, не предоставлявших возможности инструментального учета результатов или предполагавших использование токсичных реагентов в сложном каскаде химических реакций [4, 7, 10, 81, 137]. На совещаниях Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2004, 2007 и 2008 гг. была отмечена немаловажность разработки новых либо усовершенствования и стандартизации уже существующих методов выявления гуморального иммунного ответа к NA вируса гриппа. Указанный класс методик может быть перспективен в качестве дополнительного критерия оценки иммуногенности вакцинных штаммов, что особенно актуально в случае апробации вакцинных препаратов против потенциально пандемических вирусов гриппа.

Цель исследования: изучить продукцию антинейраминидазных антител при иммунизации волонтеров живыми вакцинами против сезонного, пандемического и потенциально пандемического гриппа А.

Задачи исследования:

1. Подготовить и охарактеризовать диагностические реассортантные штаммы, содержащие ИА пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа А, для использования в тестах, направленных на выявление антинейраминидазных антител.

2. Отработать методики определения сывороточных антител к нейраминидазе дрейфовых и шифтовых вирусов гриппа А с применением диагностических реассортантов.

3. С помощью адаптированной твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности (РИНА), модификации теста постадсорбционной микронейтрализации и иммуноферментного анализа оценить выработку гомологичных антинейраминидазных антител у волонтеров, привитых различными живыми гриппозными вакцинами (ЖГВ).

4. Охарактеризовать фон и поствакцинальную продукцию перекрестно-реагирующих антинейраминидазных антител к пандемическому штамму вируса гриппа А(НШ1) и вирусу гриппа птиц А(Н5Ш) у лиц различного возраста.

5. На модели экспериментальной гриппозной инфекции »определить * « V р протективные свойства сывороточных антинейраминидазных антител., ,.> г" < <■

Научная новизна. % -I

1. Впервые проведена оценка иммуногенности пандемической ЖГВ подтипа А(НШ1) и ЖГВ потенциально пандемического подтипа Н5 по интенсивности выработки антинейраминидазных антител. Выдвинуто положение о целесообразности использования предложенных тестов для дополнительной характеристики иммуногенности вакцинных препаратов.

2. Впервые изучено формирование сывороточных антител, специфичных к ЫА пандемического штамма А(НШ1) и потенциально пандемического вируса птичьего гриппа А(Н5Ш), в клинических испытаниях сезонной трехвалентной ЖГВ. Показано, что выраженная стимуляция продукции иммуноглобулинов, перекрестно реагирующих с ЫА шифтовых вариантов вируса гриппа, у молодых людей 18-20 лет при однократном введении препарата отсутствует.

3. Впервые выявлен фон сывороточных перекрестно-реагирующих антител к ЫА вируса А(Н5Ш), а также к ИА пандемического штамма А(НШ1) до его внедрения и на момент начала циркуляции в человеческой популяции по результатам обследования волонтеров различного возраста, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

Практическая значимость работы. В результате выполнения работы автором подготовлен ряд оригинальных диагностических реассортантных штаммов, предназначенных для выявления сывороточных антител к ЫА дрейфовых и шифтовых вариантов вирусов гриппа, включая вирусы гриппа птиц А(Н5Ш) и пандемические штаммы А(НШ1) 2009 г. С учетом биологических свойств диагностических реассортантов модифицированы реакция постадсорбционной микронейтрализации (РПН) и твердофазная РИНА. Эти методы могут быть использованы для количественной характеристики индукции сывороточных антинейраминидазных антител у людей, привитых различными гриппозными вакцинами, а также для определения уровня предсуществующего в человеческой популяции иммунитета к предполагаемым пандемическим штаммам вируса гриппа А;

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Подготовленные и охарактеризованные диагностические реассортантные штаммы на основе вируса гриппа лошади А(Н7Ш), обладающие КА вирусов гриппа, человека, птиц и пандемического штамма 2009 г., позволяют'специфично оценивать і

1 > „ * < « " - ' - ' " »і* С <> Г'' , сывороточные антинеираминидазные антитела в разработанных модификациях, твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности и реакции постадсорбционной микронейтрализации, а также в иммуноферментном анализе.

2. Иммунизация сезонной, пандемической и прототипом пандемической ЖГВ в 1,2-2,4 раза увеличивает продукцию антител к нейраминидазе вакцинного вируса у волонтеров 18-60 лет.

3. Часть волонтеров отвечает на иммунизацию ЖГВ достоверным приростом гомологичных сывороточных антинейраминидазных антител в отсутствие сероконверсий антител к гемагглютинину вакцинного штамма. Определение антинейраминидазных антител в сыворотке крови предоставляет дополнительную информацию об эффективности стимуляции гуморального иммунного ответа гриппозными вакцинами против сезонного, пандемического и потенциально пандемического гриппа А.

4. Перекрестно-реагирующие антинейраминидазные антитела к штамму А/Калифорния/07/09(НШ1) обнаруживаются в сыворотках крови волонтеров 18-20 лет, обследованных еще до вступления пандемического вируса A(H1N1) в активную циркуляцию. Антинейраминидазные антитела к вирусу гриппа птиц А/Вьетнам/1203/04(H5N1) выявляются у обследованных лиц 18-20 лет, не имевших контакта с указанным штаммом.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Вклад соавторов заключается в проведении вакцинации и сборе материалов в клинических испытаниях с участием волонтеров. Автор выражает благодарность Гореву Н.Е. за подготовку диагностического реассортанта RN1/99-human A(H7N1) и Дониной С.А. за постановку реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с сыворотками крови клинически здоровых в отношении респираторных заболеваний волонтеров в возрасте 1-82 лет, собранными в августе-сентябре 2010 г. Научно-исследовательской лабораторией «Диагностика».

Внедрение результатов работы. Авторские диагностические реассортантные штаммы депонированы в Государственной коллекции вирусов ФГБУ /«НИИ Л'"t ' ' t- , , "i > , вирусологии «им. :Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития .-России с(номера , *'>' ' Ч', , '••и*''"' ' ^ ' ' депонентов: ГКВ № 2473, ,2474, 2475); По теме работы получен <1. ¡ патент на i \ изобретение. Подана 1 заявка на патент.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на Международной конференции «New Cells for New Vaccines IV - Changing the Vaccine Landscape: Recombinant Systems» (Уилмингтон, штат Делавэр, США, 11-14 октября 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 25-26 февраля 2010 г.), Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г), Международной конференции «Options for the control of influenza VII» (Гонконг, Китай, 3-7 сентября 2010), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010 года), Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодёжь — медицине будущего» (Одесса, Украина, 28 - 29 апреля 2011 года).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах и сборниках научных статей (из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК), 1 патент РФ и 5 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 190 страницах текста, включая 22 таблицы и 22 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 197 источников. Из них 20 отечественных и 177 иностранных.

Похожие диссертационные работы по специальности «Вирусология», 03.02.02 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Смолоногина, Татьяна Анатольевна

169 ВЫВОДЫ

1. Специфичность оценки антинейраминидазных антител с применением диагностических реассортантов на основе вируса гриппа лошади А(Н7И7), содержащих ИА штаммов человека, птиц и свиного происхождения, основывается на антигенной удаленности Н7 от гемагглютинина эпидемических, пандемических и потенциально пандемических вирусов гриппа А и подтверждается хорошей корреляцией данных, полученных с использованием цельного вируса и препаратов ИА.

2. Разработанные на основе авторских реассортантных штаммов модификации твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности и реакции постадсорбционной микронейтрализации способствуют увеличению чувствительности и стандартизации указанных методик выявления сывороточных антител к ЫА.

3. Иммунизация трехвалентной сезонной, моновалентной пандемической и прототипом пандемической ЖГВ стимулирует выработку гомологичных антинейраминидазных антител у 20-47% вакцинированных волонтеров 18-60 лет. >

Сочетанное применение РТГА или реакции микронейтрализации с модифицированными методиками количественной оценки антител к ЫА более полно" характеризует иммуногенность вакцинных препаратов.

4. В сыворотках крови 7-15% лиц в возрасте от 1 года до 82 лет и 16-20% невакцинированных волонтеров 18-20 лет, обследованных в период с 2005 г. по 2010 г., присутствуют перекрестно-реагирующие антитела к ЫА пандемического штамма А/Калифорния/07/09(НШ1) и вируса гриппа птиц А/Вьетнам/1203/04(Н5Ш) соответственно.

5. При моделировании на мышах гриппозной инфекции штаммом А/Калифорния/07/09(НШ1) подтверждена защитная эффективность антинейраминидазных антител, проявляющаяся в снижении репродукции заражающего вируса в легких.

Заключение

На настоящий момент имеются обширные данные, свидетельствующие о защитной эффективности антител к нейраминидазе вируса гриппа, проявляющейся по крайней мере в снижении тяжести переносимого заболевания при инфекции гомологичным или дрейфовым вариантом штамма, а также описывающие формирование иммунного ответа к минорному поверхностному гликопротеину вируса после прививки сезонными гриппозными вакцинами. Однако сложившаяся эпидемиологическая ситуация, характеризующаяся широким распространением штаммов свиного происхождения A(H1N1) в человеческой популяции и не исключающая внедрение вирусов гриппа птиц A(H5N1), имеющих низкий процент гомологии в аминокислотной последовательности НА и более выраженное антигенное сходство с NA современных эпидемических штаммов, открывает новые аспекты в проблематике. Актуальность приобретает изучение уровня предсуществующих в человеческой популяции антинейраминидазных антител, перекрестно реагирующих с соответствующим поверхностным антигеном предположительно пандемических штаммов вируса гриппа; их формирования в ответ т * « * ■ , 1 на иммунизацию сезонной гриппозной вакциной и потенциала в качестве защитного фактора в условиях смены подтипа НА. Исследования в данном русле немногочисленны, что объясняется недоработкой методологической базы: в первую очередь отсутствием актуальных тестовых антигенов (диагностических штаммов вируса гриппа с нерелевантным гемагглютинином или доступных препаратов NA), способных обеспечить специфичность оценки антинейраминидазных антител; отсутствием единого стандартного протокола методики, которая бы отвечала современному уровню технического прогресса, исключала фактор субъективности при учете результатов, в то же время являлась бы приемлемой с точки зрения личной безопасности исследователя, временных затрат и трудоемкости, принципиальных для проведения масштабной серологической диагностики. Совершенствование методологической базы имеет также важное прикладное значение для более полной оценки иммуногенности нового поколения гриппозных вакцин - вакцин против пандемического гриппа.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Вирусологические методы

Вирусы. Для выявления антинейраминидазных антител использовали диагностические реассортантные штаммы, подготовленные на основе вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/56(H7N7): RN2/57-human A(H7N2), RNl/04-avian A(H7N1) и RNl/09-swine A(H7N1), содержащие NA от холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), высокопатогенного вируса гриппа А/Вьетнам/1203/2004(H5N1) и пандемического штамма А/Калифорния/07/09(НШ1) [A(HlNl)pdm2009], соответственно. Для их подготовки использовали вирус гриппа А/лошадь/Прага/1 /5 6(H7N7) и полученный методами обратной генетики вакцинный штамм А/Вьетнам/1203/2004xPR8 IBCDC-RG(H5N1) [PR8/H5N1-RG], содержащий НА и NA от вируса птичьего гриппа А/Вьетнам/1203/2004(H5N1) и 6 генов внутренних и неструктурных белков от высокопродуктивного донора А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1) [PR8], предоставленные Центром по контролю и предупреждению заболеваний (Атланта, Джорджия, США), а также реассортантные вакцинные г» штаммы для ЖГВ на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(НШ2): 7:1 реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш) [Lenl7/H5N2] и штамм А/17/Калифорния/2009/38(НШ1) из коллекции отдела вирусологии им. A.A. Смородинцева НИИЭМ СЗО РАМН. Еще один реассортантный штамм подтипа A(H7N1) - RNl/99-human A(H7N1), содержащий NA от эпидемического вируса А/Новая Каледония/20/99(НШ1) [A(H1N1)1999], был подготовлен и передан из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ ведущим научным сотрудником лаборатории гриппозных вакцин, Н.Е. Горевым.

Помимо этого в работе были использованы реассортантные вакцинные штаммы для ЖГВ на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2): А/17/Калифорния/04/06(НЗЫ2); H/32/5(HlNl), обладающий поверхностными антигенами вируса гриппа А/Хабаровск/1/77(НШ1); A/17/Новая Каледония/99/145(НШ1); A/17/Соломоновы острова/06/9(НШ1) и А/17/Брисбен/07/28(НШ1). Перечисленные атгенуированные штаммы, а также вирус

А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1) были получены из коллекции отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева НИИЭМ СЗО РАМН.

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Культивирование использовавшихся в работе вирусов производилось в аллантоисной полости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) (ООО «Племрепродуктор Назия», пос. Приладожский, Кировский район, Ленинградская обл.). РКЭ заражали в аллантоисную полость 200 мкл вируссодержащей жидкости и инкубировали при оптимальной температуре (34°С) в течение 24-48 часов.

Для определения 50%-ой эмбриональной инфекционной активности предварительно делали ряд 10-кратных падающих разведений исследуемого вирусного материала, которыми впоследствии производилось заражение из расчета 100 мкл на один РКЭ. После инкубации в течение 48 часов при температуре 32°С 50%-ую эмбриональную инфекционную дозу, выражаемую в lg ЭИД50/мл, рассчитывали по методу Reed-Muench [149].

Концентрирование и очистка вируса в ступенчатом градиенте сахарозы. Для ряда серологических тестов требовался концентрированный и очищенный препарат вируса. В связи с чем вируссодержащая жидкость из аллантоисной .полости ' ' \ инфицированных куриных эмбрионов сначала «осветляли» центрифугированием при ' , * г < і

7! с

3000 об/мин в течение 20 мин (центрифуга Rotina 38R, Hettich-zentrifugen). Затем

N J надосадки переносили во флаконы для ультрацентрифугирования и центрифугировали при 17000 об/мин в течение 3-х часов (ультрацентрифуга Beckman coulter Optima™ L-100 XP Ultracentrifuge, ротор Type 19). Надосадок удаляли, осадок ресуспендировали в 2,0 мл ледяного кальциево-боратного буфера (рН = 7,2). Ресуспендированный вирус наносили на ступенчатый 30/60% градиент сахарозы, приготовленный на кальциево-боратном буфере, с последующим центрифугированием при 20000 об/мин в течение 2,5 часов (ротор SW 40 Ті). Вируссодержащий слой на границе фаз сахарозы с различной плотностью отбирали и очищали от сахарозы в кальциево-боратном буфере ультрацентрифугированием при 20000 об/мин в течение 2,5 часов (ротор SW 40 Ті). Осадок ресуспендировали в 1,0 мл кальциево-боратного буфера.

Культивирование вирусов в культуре клеток MDCK. Для работы использовали перевиваемую клеточную линию MDCK NBL-2, полученную из Центра по контролю и предупреждению заболеваний (Атланта, Джорджия, США). Культивирование вируса производилось в присутствии 2 мкг/мл трипсина ТРСК (трипсин бычьей поджелудочной железы, обработанный L-l-Tosylamide-2-Phenylethyl Chloromethyl Ketone, Sigma-Aldrich) на двухдневном монолое клеток, выращенном в полистироловых флаконах для адгезивных клеточных культур Т-25 фирмы «Sarstedt» (кат № 83.1810) в питательной среде DMEM (ООО «Биолот») с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки до концентрации 10% (ООО «Биолот») при посевной дозе 2*105 клеток/мл. Доза вируса, вносимая во флакон для адсорбции на клеточном монослое в течение 1 часа (1,0-5,0 lg КИД50/0,1мл), а также время последующей инкубации при температуре 34°С (3-4 суток) в термостате с подачей СОг зависели от степени его адаптации к репродукции в указанной системе.

Для определения 50%-ой культуральной инфекционной дозы клетки инкубировали в плоскодонных 96-луночных полистироловых планшетах для адгезивных культур фирмы «Sarstedt» (кат № 83.1835) в течение 2 суток при 37°С и 5% содержании СО2. Посевная доза составляла 2*105 клеток/мл. После удаления поддерживающей среды и двукратной отмывки монослоя фосфатно-солевым буфером (0,01 M раствор с pH = 7,3-7,5, ООО «Биолот») в лунки планшета вносили по 100 мкл образцов, представляющих собой падающие 3- или 10-кратные разведения исследуемых штаммов вируса гриппа в питательной среде DMEM с добавлением трипсина ТРСК (концентрация 2 мкг/мл). Планшеты инкубировали в термостате с подачей С02 при температуре 34°С, 72 часа. Учет результатов проводился по следующим показателям:

1) наличие вируса в культуральной среде согласно реакции гемагглютинации (РГА) с 1% взвесью куриных эритроцитов;

2) наличие цитопатического действия вируса гриппа, оцениваемого по окрашиванию 100 мкл 0,5% раствора кристаллического фиолетового (Sigma) в 50% этаноле на фосфатно-солевом буфере (ФБ) с добавлением глутарового альдегида (Рапгеас) в конечной концентрации 0,25% при экспозиции в течение 30 минут с последующей спектрофотометрией монослоя, отмытого от несвязавшегося красителя, при длине волны 630 нм (Universal microplate reader ELX800, BIO-ТЕК INSTRUMENTS, INC.);

3) связывание моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа А [154]. Для постановки ИФА монослой клеток предварительно фиксировали холодным 80% раствором ацетона (10 мин при комнатной температуре). После удаления фиксатора и 3-хкратной отмывки 0,05% раствором твин-20 (ООО «Биолот») в ФБ (ФБ-Т) в лунки планшета вносили по 100 мкл мышиных моноклональных антител (А-3) к NP-белку вируса гриппа A (CDC # VS2370, Центр по контролю и предупреждению заболеваний, Атланта, Джорджия, США), разведенных 1/4000 в блокирующем буфере (4% раствор эмбриональной бычьей сыворотки в ФБ-Т). После часовой инкубации при комнатной температуре и 4-хкратной отмывки ФБ-Т добавляли по 100 мкл пероксидазного конъюгата козьих антител к IgG мыши (кат. номер A3673, Sigma), разведенных 1/2000 в блокирующем буфере. Затем следовали инкубация при комнатной температуре в течение 1,5 часов, 6-тикратная отмывка ФБ-Т и добавление 100 мкл субстрата для пероксидазы хрена - 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (кат. № 555214, ТМВ Substrate Reagent Set, BD Biosciences,). Спустя 5 минут ферментативную реакцию останавливали 100 мкл 1Н серной кислоты (ЗАО «Вектон»), результаты считывали на спектрофотометре при длине волны 450 нм.

В случае окрашивания кристаллическим фиолетовым положительной по * « - / - 'i < репродукции вируса считалась проба, дающая оптическую плотность при указанной t , > •« V „ длине волны ниже порогового значения, рассчитанного как среднее (М) минус три среднеквадратичных отклонения (СКО) ОП для лунок с монослоем клеток, не подвергавшимся воздействию вируса. При учете результатов по связыванию моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа А - проба, ОП которой превышала порог, равный М+3*СКО значений ОП для лунок клеточного контроля. 50% культуральную инфекционную дозу рассчитывали по методу Reed-Muench [149].

Для определения 50%-ой культуральной инфекционной дозы также использовалась модификация изложенного выше протокола, согласно которой планшеты с подготовленным клеточным монослоем инкубировали с 3- или 10-кратными падающими разведениями исследуемых штаммов вируса гриппа в питательной среде DMEM (в объеме 100 мкл) в течение 1 часа при 34°С. После адсорбции вирусных частиц на клеточных рецепторах образцы удаляли, планшеты подвергали однократной отмывке ФБ, а в лунки вносили среду DMEM с трипсином

ТРСК (концентрация 2 мкг/мл). В дальнейшем планшеты также помещались на 72 часа в СОг-инкубатор, поддерживающий температуру 34°С.

Получение диагностических реассортантных штаммов на основе вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/56(H7N7). Диагностические штаммы для тестов, направленных на выявление антинейраминидазных антител в образцах сывороток крови, содержащие НА вируса гриппа А/лошадь/Прага/1/5 6(H7N7) и унаследовавшие нейраминидазу от вирусов гриппа птиц, человека и штамма свиного происхождения, были получены методом классической генетической реассортации по описанным ранее методикам [1]. Для этих целей было произведено скрещивание вируса гриппа лошади подтипа A(H7N7) и штаммов А/Вьетнам/1203/2004xPR8 IBCDC-RG(H5N1), А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5К2), А/17/Калифорния/2009/38(НШ1) в РКЭ. В качестве селективных факторов для отбора клонов с нужными свойствами из множества полученных для каждой пары родительских штаммов реассортантов использовали соответственно моноклональные антитела, взаимодействующие с НА штамма А/Вьетнам/1203/2004(Н5Ш) (CDC # VS2722), моноклональные антитела СР62 и 364/1 к НА вирусов гриппа птиц А/курица/Пенсильвания/1370/83(H5N2) и А/курица/Пенсильвания/8125/83(Н5№) (CDC # VS2347), моноклональные антитела, специфичные к НА штамма А/Новая Каледония/20/99(НШ1), (СБС # VS2454) из * * г * ' ' ' * диагностического набора Центра по контролю и предупреждению заболеваний (Атланта, Джорджия, США). В случае, когда один из родительских вирусов был представлен холодоадаптированным вакцинным штаммом на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш), дополнительным селективным фактором служила пониженная температура инкубации (25°С).

Подтип гемагглютинина отобранных клонов был определен в реакции торможения гемагглютинации, полный анализ состава генома проводился с помощью методов молекулярной генетики.

Анализ состава генома реассортантных штаммов. Анализ состава генома реассортантых штаммов осуществлялся с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с применением специфичных праймеров и обработкой полученных ДНК-копий фрагментов РНК эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами). Выделение вирусной РНК производилось из 140 мкл вируссодержащей жидкости (культуральной среды или жидкости аллантоисной полости РКЭ) с использованием набора реактивов QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN) согласно указаниям производителя. ДНК-копии участков генов были получены с помощью обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони (кат.№ ЕЗ18, M-MulV RT, НПО «СибЭнзим»), а затем амплифицированы Taq-полимеразой (кат. № E332L, НПО «СибЭнзим») в ПЦР. Для анализа амплифицированных ДНК-копий фрагментов РНК проводился электрофорез в 1,7% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (ООО «Лаборатория Медиген») из расчета 5 мкл 1% раствора на 100 мл геля, в IX ТБЭ буфере, в состав которого входили трис(оксиметил)аминометан, борная кислота и этилендиамин тетрауксусная кислота (ЗАО «Вектон»).

Для определения происхождения генов поверхностных гликозилированных белков у полученных реассортантов использовались следующие прямые (F) и обратные (R) праймеры, специфичные к участкам нуклеотидных последовательностей НА-гена штаммов А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5Ш) [3], А/Калифорния/07/09(НШ1) и NA-гена ряда штаммов, обладающих подтипом N2, в том числе А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш) [94], а также праймеры для амплификации участка гена Н5 с 915 по 1278 н.к. по нумерации последовательности для штамма v /

А/Вьетнам/1203/2004(Н5Ш) [182]: H5Dk-F6 (5' GAA ААТ AGT GCT ТСТ ТСТ TG 3'), H5Dk-R353 (5' TTC AGT ТСТ ТСА TAG TCG TT 3'), Hlsw-F315 (5' AAC GTG TTA CCC AGG AGA TTT CA 3'), Hlsw-R871 (5' CGT GGA CTG GTG TAT CTG AAA TGA 3'), N2-F14 (5' GTG AAG ATG AAT CCA AAT CAA 3'), N2-R677 (5' GAG ACC ATG AAC CAA TAC TGT С 3'), H5-F (5' GCC ATT CCA CAA CAT АСА CCC 3'), H5-R (5' TAA ATT CTC TAT CCT CCT TTC AA 3').

Помимо приведенных выше олигонуклеотидов для тех же целей применялись праймеры, разработанные нами с помощью программы FastPCR по нуклеотидным последовательностям генов, кодирующих поверхностные гликозилированные белки штаммов А/лошадь/Прага/1 / 5 6(H7N7), А/Вьетнам/1203/2004(Н5Ш) и А/Калифорния/07/09(НШ1), взятых из базы данных вирусов гриппа Национального центра биотехнологической информации (The Influenza Virus Resource at the National Center for Biotechnology Information) [28]: H7eq-F21 (5' ATT AGC CAC TTC GGC ATT CTT СТА 3'), H7eq-R338 (5' TCA TTG TCA AAT TTG CCT GG 3'), N7eq-F25 (5' TGA АТС СТА АТС AGA AAC ТС 3'), N7eq-R396 (5' AAC TTA GAG GAT CAC ATG

AG 3'), Nlav-F592 (5' AGT TGG AGG AAC AAC ATA CT 3'), Nlav-R943 (5' AAC TAC CTG TTC CAT CAT TG 3'), Nlsw-F673 (5' AGA АСА CAA GAG TCT GAA TG 3'), Nlsw-R963 (5' AAT CCC ACT GCA TAT GTA ТС 3'), синтезированные компанией «Бигль».

Молекулярно-генетический анализ генов внутренних и неструктурных белков реассортантов, предположительно унаследовавших соответствующие сегменты РНК от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш), проводился с использованием праймеров и рестриктаз, разработанных А.И. Климовым [94]. Для определения принадлежности генов внутренних и неструктурных белков диагностического штамма на основе вируса гриппа А/Вьетнам/1203/2004хРК8 IBCDC-RG(H5N1) был дополнительно разработан и синтезирован набор специфичных праймеров: PB2PR8-F653-672 (5' GAG AAC TGG ТСС GCA AAA CG 3'); PB2PR8-R877-897 (5' ACC AAT CTG TGT GCT GTG GCA 3'); PBlPR8-F356-377(5' TGG AGG TTG TTC AGC AAA CAC G 3'); PB1PR8-R591-612 (5' AGT CAT ATT GTC TCT CAC CCG T 3'); PAPR8-F308-327 (5' GCA АСА СТА CAG GGG CTG AG 3'); PAPR8- R565-584 (5' AGG CCT CTG CTG GCC ATT TC 3'); NPPR8-F 1042-1061 (5' TGC CAT TCT GCC GCA TTT GA 3'); NPPR8-R1196-1215 (5' GGT CCT TAT GGC CCA GTA CC 3'); MlPR8-F347-366 (5' ACAJTC CAT GGG GCC AAA GA 3'); MlPR8-R568-589 A

5' AGC CTT AGC TGT AGT GCT GGC T 3'); NSPR8-F38-57 (5' CAC TGT GTC AAG CTT TCA GG 3'); NSPR8-R266-285 (5' ACG CAG GTA CAG AGG CCA TG 3') («Бигль»). Специфичность амплификации с указанными праймерами подтверждалась рестрикцией ДНК-копий участков генов РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS эндонуклеазами BstMB I, BstF5 I, Tru9 I, Hind III, BstC8 I и Tru91 (НПО «СибЭнзим»), соответственно.

Секвенировнание. Для стадий выделения вирусной РНК, получения ДНК-копий участков РНК, очистки проб от легкоплавкой агарозы после разделения амплифицированных фрагментов ДНК при помощи электрофореза, терминирующей ПЦР в процессе секвенирования отдельных сегментов РНК диагностического реассортнантного штамма RNl/04-avian A(H7N1) до и после прохождения им адаптационных пассажей в культуре клеток MDCK использовались диагностические наборы QIAamp Viral RNA Kit (кат. № 52904, QIAGEN), One-step RT-PCR Kit (кат. № 210210, QIAGEN), QIAquick Gel Extraction Kit (кат. № 28706, QIAGEN) и BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (кат. № 4337455, Applied Biosystems) согласно указаниям производителей. Очистка образцов от не включившихся меченных дидезоксинуклеотидов осуществлялась гельфильтрацией через приготовленные самостоятельно колонки с сорбентом Sephadex G-100 Fine DNA grade (GE Healthcare) по протоколу, предложенному Межинститутским центром секвенирования ДНК (г. Новосибирск) [16], после чего 25 мкл пробы смешивали с 15 мкл формамида (ЗАО «Вектон»), смесь прогревали в течение 5 мин при температуре 95°С, затем охлаждали до 4°С и проводили капиллярный электрофорез со считыванием флюоресценции на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Model: 628-0040, Applied Biosystems, Hitachi).

Использовались следующие праймеры в концентрации 20мкМ: универсальные праймеры для НА, NA и NS генов вируса гриппа [75] A FluAHA-UniF (5' GAT CGC ТСТ ТСА GGG AGC AAA AGC AGG GG 3'), FluAHA-UniR (5' ACT GGC TCT TCT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT 3'), FluANA-UniF (5' GAT CGC TCT TCA GGG AGC AAA AGC AGG AGT 3'), FluANA-UniR (5' ACT GGC TCT TCT ATT AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT 3'), FluANS-UniF (5' GAT CGC TCT TCA GGG AGC AAA AGC AGG GTG 3'), FluANS-UniR (5' ACT GGC TCT TCT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TTT 3'); праймеры, разработанные нами по последовательностям НА-гена штамма А/лошадь/Прага/1/5 6(H7N7) и NS-гена штамма А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1), H7-F393 (5' TGG GAT TCA CAT ATA CCG GAG TG 3'), H7-F723 (5' TTC ACT GGC TGA TGC TAG АТС С 3'), H7-F1067'(5' GCA GGA TTC ATT GAA AAT GGG TGG 3'), H7-F1334 (5' GCA GAA TTC CTC GTA GCA GTG GA 3'), H7-R575 (5' GGA TTC CCC AGA TTA TCA GAG CTG 3'), H7-R961 (5'CTG CTT CAC GTA TCT GGG GCA 3'), H7-R1340 (5' GAT TCT CCA CTG СТА CGA GGA A 3'), PR8NS-F284 (5' GTC GCG TTA CCT AAC CGA CAT GAC 3'), PR8NS-R266 (5' GGT CAT TTT AAG TGC CTC АТС GGA 3'), PR8NS-R671 (5' AGT GAG TGG AGG TCT CCC ATT CTC 3'), a также праймеры, специфичные к NA штаммов подтипа A(H5N1), H5N1NA-F293 (5' GGG GGA TGT GTT TGT TAT 3'), H5N1NA-F615 (5' TGG AGG AAC AAC ATA CTG А 3'), H5N1NA-F1033 (5' GGA TCG GGA GAA CCA AAA G 3'), H5N1NA-R401 (5' CCC ATT GGA GTG CTT GTC 3'), H5N1NA-R936 (5' GAT TGT CTC CGA AAA CTC CA 3'), H5N1NA-R1195 (5' AGT TCT GGA TGC TGG АСА 3').

2.2. Методы работы с мышами

Для воспроизведения экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации использовали линейных мышей СВАЛ (самцов) в возрасте 10-12 недель, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» РАМН (Ленинградская область).

Репродукция вирусов в дыхательных путях мышей. Мышам под легкой эфирной анестезией интраназально (и/н) вводили 50 мкл аллантоисной жидкости с

1 7 содержанием вируса 10-10 ЭИД50. Эвтаназию проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» [17]. Титры вирусов определяли в легких подопытных животных на 3-й сутки по результатам титрования в РКЭ суспензии органов, приготовленной в 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера, начиная с разведения 1:1. 50% мышиную инфекционную дозу определяли по методу Кееё-МиепсЬ [149].

Иммунизация мышей. Иммунные сыворотки для апробации модифицированных методик по выявлению антинейраминидазных антител получали на 21-й день после однократного интраназального введения лабораторным животным 50 мкл аллантоисной жидкости, содержащей 1) 6,5 ^ ЭИД50/5О мкл реассортантного штамма для ЖГВ А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш); 2) 4,0 ЭИД50/50 мкл реассортантного штамма для ИГВ А/Вьегнам/1203/2004хРЯ8 1ВСОС-1Ю(Н5Ш). Для тех же целей; использовали сыворотки крови мышей, однократно привитых 7,0 ЭИД50/5О мкл реассортантного штамма для ЖГВ А/17/Калифорния/2009/38(НШ1), предоставленные старшим научным сотрудником отдела вирусологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, А.Р. Рекстиным.

Для моделирования иммунного ответа к минорному поверхностному антигену вируса гриппа группам мышей под легкой эфирной анестезией двукратно внутримышечно (в/м) вводили 5,0 мкг очищенной ИА штамма А/Калифорния/07/09(НШ1)2; 10 мкг очищенной ЫА штамма А/Вьетнам/1203/2004 хРЯ8 1ВСОС-11С(Н5Ш)2 или 1 мкг рекомбинантной мультимерной ИА штамма А/Калифорния/07/09(НШ1)3 в смеси с неполным

2 Препарат подготовлен A.A. Шалджяном и М.П. Грудининым, ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» МЗ РФ, лаборатория молекулярной вирусологии и генной инженерии, г. Санкт-Петербург, Россия.

3 Препарат предоставлен B.J. Bosch, Университет г. Утрехта, факультет ветеринарной медицины, отдел инфекционных заболеваний и иммунологии, г. Утрехт, Нидерланды. адъювантом Фрейнда (Sigma, кат. номер F5506-6X10ML) в пропорции 2:1 в объеме 100 мкл. Дополнительно по описанной выше схеме группа мышей была иммунизирована инактивированной субъединичной гриппозной вакциной, подготовленной на основе реассортантного вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5М2) с добавлением адъюванта (2% суспензия гидроокиси алюминия), с концентрацией НА 3 мкг/100 мкл (ФГУП "НПО "Микроген"). Для сопоставления характеристик гуморального иммунного ответа на субъединичные вакцины с таковыми, полученными при вакцинации штаммом для ЖГВ или развитии гриппозной инфекции, в рамках одного опыта отдельным группам мышей и/н двукратно вводили 1,5 МИД50/0,05мл А/17/Калифорния/09/38 (H1N1), 300 МИД50/0,05мл реассортантных штаммов RNl/09-swine A(H7N1), RNl/04-avian A(H7N1) или однократно инфицировали 25 МИД5о/0,05мл штамма для ИГВ PR8/H5N1-RG. В качестве препарата плацебо использовали стерильный фосфатно-солевой буфер. В случае двукратной иммунизации интервал между прививками составлял 21 день. Забор крови у подвергнутых наркозу и обездвиженных подопытных животных производился на 21 сутки после повторной иммунизации посредством вскрытия подключичного сосудистого пучка. Образцы , крови отстаивались 1 час при комнатной температуре. Затем следовали центрифугирование » ^ j f ( проб на 3 тыс. оборотов 15 минут (микроцентрифуга MiniSpin PLUS,' Eppendorf), отбор сыворотки и ее прогрев при 56°С в течение 30 минут.

Реинфекцш иммунизированных лабораторных животных. Реинфекция иммунизированных мышей производилась на 21-е сутки после последней прививки одним из указанных вирусов: 1) 30 МИД50/0,05мл штамма А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1); 2) 50 МИД5О/0,05мл штамма PR8/H5N1-RG; 3) 103'5 МИД50/0,05мл штамма А/Калифорния/07/09(НШ1) в зависимости от использовавшегося для праймирования антигена. Концентрацию заражающего вируса в легких определяли на 3-й сутки после инфицирования по результатам титрования суспензии органов в РКЭ, начиная с разведения 1:10.

2.3. Исследуемые образцы сывороток крови волонтеров

Формирование сывороточных антинейраминидазных антител в ответ на иммунизацию оценивалось у 56 молодых людей в возрасте 18-20 лет, привитых в 2005 г. сезонной коммерческой трехвалентной ЖГВ, включавшей рекомендованные ВОЗ реассортантные вакцинные штаммы A/17/Новая Каледония/99/145(НШ1), А/17/Калифорния/04/06(НЗК2), В/60/Джилин/01/1 (серия 501); у 66 добровольцев в возрасте 18-60 лет, участвовавших в 2006-2007 гг. в клинических испытаниях экспериментальной серии ЖГВ «Орвакс» на основе аттенуированного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5К2); у 23 волонтеров в возрасте 18-20 лет, получивших прививку моновалентной пандемической ЖГВ (экспериментальная серия) на основе штамма А/17/Калифорния/09/38(НШ1) осенью 2009 г.; у 47 волонтеров школьного возраста, вакцинированных осенью 2010 года различными сериями коммерческой сезонной трехвалентной ЖГВ, включавшей рекомендованные на тот период вакцинные штаммы А/17/Калифорния/2009/38(НШ1), А/17/Перт/09/87(НЗШ) и В/60/Брисбен/08/83.

Во всех клинических испытаниях участвовали клинически здоровые; волонтеры с неизвестным анамнезом в отношении заболевания гриппом и противогриппозной' i г ¿ч* ^ ST * * С Ц! ' Т вакцинации, не имевшие противопоказаний к прививке ЖГВ, предоставившие письменное добровольное информированное согласие. Вакцина и плацебо в виде шифрованных препаратов вводились интраназально с помощью индивидуального распылителя по 0,25 мл в каждый носовой ход по следующим схемам: однократно (сезонная ЖГВ) или двукратно с интервалом 10 и 21 день при клинических испытаниях пандемической и прототипа пандемической ЖГВ подтипов A(H1N1) и A(H5N2), соответственно. Моно- и трехвалентная гриппозная аллантоисная живая интраназальная вакцины были выпущены Иркутским предприятием по производству иммунобиологических препаратов (ФГУП «Микроген»). В качестве препарата плацебо использовали стерильный физиологический раствор. Образцы капиллярной крови волонтеров были получены до вакцинации, перед ревакцинацией (в случае двукратного введения препарата) и на 21 день после последней прививки.

Проведение вакцинации и сбор материалов в клинических испытаниях с участием волонтеров является вкладом соавторов (с.н.с. С.А. Дониной, с.н.с. Е.П.

Григорьевой, н.с. Д.А. Коренькова, н.с. Г.Д. Петуховой, н.с. Е.М. Дорошенко -сотрудников отдела вирусологии НИИ Экспериментальной медицины СЗО РАМН) в настоящую диссертационную работу.

Для оценки уровня коллективного иммунитета к нейраминидазе вируса гриппа осенью 2009 г. и 2010 г. в исследование были взяты дополнительно собранные образцы капиллярной крови 37 (возраст: 18-20 лет) и 21 (возраст: 18-76 лет) клинически здорового добровольца с неизвестным анамнезом в отношении заболевания гриппом и противогриппозной вакцинации. 95 образцов сывороток крови обследованных в августе-сентябре 2010 г. лиц в возрасте от 1 года до 82 лет были предоставлены директором Научно-исследовательской лаборатории «Диагностика» (г. Санкт-Петербург), Суворовой М.А.

В исследовании были использованы также сыворотки крови лиц (п = 5), перенесших естественную инфекцию пандемическим вирусом A(H1N1), предоставленные старшим научным сотрудником Лаборатории биотехнологии и диагностических препаратов ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ Е.М. Войцеховской.

Все образцы до проведения серологических тестов хранили при температуре ', 20°С. " - . С 1

• ■ * " * , ' V' Ч ' * " " s , v ' , t * * » - 4 4 +

- 2.4. Серологические методики r 1 '

Обработка сывороток крови. Для разрушения термолабильных ингибиторов гемагглютинации сыворотки прогревали при 56°С в течение 30 мин. Для удаления NA-чувствительных ингибиторов гемагглютинации один объем цельной сыворотки инкубировали 18-20 часов при 37°С в присутствии 3 объемов экстракта нейраминидазы холерных вибрионов (RDE-receptor destroying enzyme, Denka Seiken CO) с последующей инактивацией фермента прогреванием проб на водяной бане при 56°С в течение 1 часа. Второй этап обработки сывороток крови не проводился, если образцы предполагалось использовать для постановки реакции микронейтрализации или твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности.

Реакция торможения гемагглютинации. РТГА выполнялась по описанной ранее методике [99] с 0,75 % взвесью куриных или человеческих эритроцитов 0-группы в 96-луночных полимерных планшетах для иммунологических реакции с «и»-дном

ОАО «Фирма Медполимер»). Достоверной сероконверсией считался прирост титра антигемагглютиниррующих антител в 4 и более раз.

Реакция микронейтрализации (РН). Для постановки РН в плоскодонных 96-луночных полистироловых планшетах для адгезивных культур выращивали монослой клеток MDCK, следуя протоколу, приведенному в разделе 2.1. После удаления поддерживающей среды и двукратной отмывки планшетов фосфатно-солевым буфером вносили 50 мкл падающих двукратных разведений (начиная с разведения 1:10) образцов сывороток крови в среде DMEM с содержанием трипсина ТРСК в концентрации 2 мкг/мл. Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл стандартной дозы вируса 200 КИД50/0,05мл (= 100 КИД50/0,1мл), разведенного до указанной концентрации той же средой. Планшеты инкубировали в термостате с подачей СО2 при температуре 34°С в течение 72 часов. Степень деструкции клеточного монослоя оценивали по окрашиванию 0,5% раствором кристаллического фиолетового согласно приведенному в разделе 2.1. протоколу. Титр сыворотки определяли как величину, обратную наивысшему разведению образца, дающему при длине воины 630 нм оптическую плотность, превышающую пороговое значение X, рассчитанное по следующей формуле: \ сс -vc U

1)Х= +ГС , w 2 » I где СС (cell control) - среднее значение оптической плотности для лунок клеточного контроля (монослоя клеток, не подвергавшегося воздействию вируса); VC (virus control) - среднее значение оптической плотности для лунок вирусного контроля (монослоя клеток, подвергшегося воздействию вируса в отсутствие иммунной сыворотки).

За достоверную сероконверсию был принят 4-х и более кратный прирост титра нейтрализующих антител.

Реакция постадсорбционной микронейтрализации. Реакция представляет собой воплощение идеи метода постадсорбционной нейтрализации, предложенного еще в 70-х годах 20 века [55, 56], на базе современной методики микронейтрализации в культуре эпителиальных клеток почки собаки. Подготовка монослоя клеток MDCK осуществлялась согласно приведенному в разделе 2.1. протоколу. После удаления поддерживающей среды и двукратной отмывки 96-луночных планшетов для адгезивных культур фосфатно-солевым буфером в каждую лунку вносили по 100 мкл вируса, разведенного в среде DMEM до концентрации 10 КИД50/0,1мл, причем последняя определялась по результатам титрования исходного вируссодержащего раствора по протоколу с отмывкой не связавшихся на клеточных рецепторах вирусных частиц (см. раздел 2.1.). Сорбция вируса на клеточном монослое протекала в течение 1 часа при температуре 34°С, затем образцы удаляли, планшеты подвергали однократной отмывке ФБ, а в лунки вносили 100 мкл предварительно раститрованных (начиная с разведения 1:20) в среде DMEM с содержанием трипсина ТРСК в концентрации 2 мкг/мл сывороток крови. Планшеты помещались в СО2-инкубатор, поддерживающий температуру 34°С, на 72 часа. Учет результатов проводился с помощью реакции гемагглютинации с культуральными надосадками и 1% взвесью куриных эритроцитов, а также в иммуноферментном анализе с моноклональными антителами к NP-белку вируса гриппа А на фиксированном монослое (см. раздел 2.1.). В последнем случае титр сыворотки определялся как величина, обратная наивысшему разведению образца, дающему при длине волны 450 нм оптическую плотность, ниже порогового значения X, рассчитанного по следующей формуле: VC-CC « 1 ' %

2)Х = +СС , 2 ч где CC/VC - среднее значение оптической плотности для лунок клеточного/вирусного контролей соответственно.

Достоверной сероконверсией считался прирост титра антител в 4 и более раз.

Твердофазный иммуноферментный анализ. Лунки 96-луночных планшетов для иммунологических реакций («Sarstedt», кат. номер 82.1581.001) покрывали 100 мкл препарата HA/NA в концентрации 0,5 мкг/мл или 100 АЕ очищенного вируса в том же объеме фосфатно-солевого буфера. Для выявления антинейраминидазный антител в качестве антигена, помимо диагностических реассортантных штаммов и описанных в разделе 2.2. препаратов NA, была использована также рекомбинантная NA штамма A/Bervig Mission/l/18(HlNl) производства R&D systems (кат. номер 4858-NM, лот номер RJJ0108101). Адсорбция антигена протекала при температуре 4°С в течение ночи. Затем следовали 3-хкратная промывка планшетов ФБ-Т и контакт с 200 мкл блокирующего буфера (4% раствор эмбриональной бычьей сыворотки в ФБ-Т) в течение 1 часа при комнатной температуре для предотвращения неспецифической сорбции добавляемых на следующей стадии антител на не занятых антигеном участках поверхности твердофазного носителя. После двукратной промывки планшетов в лунки вносили серии 2-х или 4-хкратных падающих разведений сывороток крови в ФБ-Т буфере, содержащем 1% эмбриональной бычьей сыворотки, в объеме 100 мкл (начальное разведение 1:10). Инкубация происходила при температуре 37°С в течение 1,5 часов. По окончании процедуры трехкратной промывки в каждую лунку добавляли по 100 мкл одного из перечисленных конъюгатов - меченных пероксидазой хрена козьих антител к мышиным IgG (кат. номер А3673, Sigma), к мышиным IgA (кат. номер А4789, Sigma), к IgG человека (кат. номер А6029, Sigma), разведенных с помощью ФБ-Т буфера с 1%-ым содержанием эмбриональной бычьей сыворотки в 2000, 1000 и 4000 раз соответственно, и оставляли для контакта при комнатной температуре на 1 час. Затем планшеты 6 раз отмывали и вносили по 100 мкл ТМВ субстрата для пероксидазы хрена. Спустя 5 минут ферментативную реакцию останавливали 100 мкл 1Н серной кислоты, результаты считывали на спектрофотометре при длине волны 450 нм.

Титр иммунной сыворотки крови определяли как разведение образца, дающее ,при указанной длине волны оптическую плотность, равную пороговому; значению. В ; > * i > * / * 7 I качестве такового выбиралось либо среднее плюс три стандартных отклонения, высчитанные по ОП для лунок контроля, в которые вносили нормальную сыворотку крови, в случае исследования образцов, полученных от лабораторных животных, либо значение ОП = 0,4 при выявлении вирусспецифических иммуноглобулинов в сыворотках крови волонтеров, среди которых затруднительно найти полностью серонегативных лиц, способных послужить отрицательным контролем. Сероконверсией считался прирост титра антител в 2 и более раз. Обоснование такого допущения приведено в подразделе 3.1.3.

Твердофазная реакция ингибирования нейраминидазной активности. Проводилась по протоколу, основанному на опубликованной ранее методике C.R. Lambre et al. [100], включавшему стадии десиализации натурального субстрата (фетуина), сорбированного на полимерном носителе, в присутствии активной NA диагностических штаммов; специфического связывания лектина арахиса, конъюгированного с пероксидазой хрена, на демаскированных сахаридах; определения количества связавшегося конъюгата по выходу продукта пероксидазной реакции и оценки степени ингибирования сиалидазной активности в присутствии антител к NA.

Для постановки реакции 96-луночные плоскодонные планшеты для ИФА, обладающие высоким связыванием (кат. номер FEP100096, «Jet Biofil»), покрывали 150 мкл раствора фетуина эмбриональной сыворотки теленка (кат. номер F3004, «Sigma») в концентрации 50 мкг/мл в 0,1 M карбонатном/бикарбонатном буфере (рН = 9,6, кат. номер 2.1.5., ООО «БиолоТ»). Адсорбция субстрата протекала при температуре +4°С в течение ночи. Перед использованием планшеты подвергались двукратной отмывке ФБ.

65 мкл двукратных падающих разведений сывороток крови (начиная с разведения 1:10) в ФБ-БСА, т.е. ФБ с 1% содержанием бычьего сывороточного альбумина (кат. номер А7030, «Sigma»), инкубировали в лунках 96-луночных планшетов для иммунологических реакций (ОАО «Фирма Медполимер») в течение 30 мин при 37°С с эквивалентным объемом стандартной дозы вируса, разведенного до нужной концентрации в том же буфере. В качестве контролей использовали вирус в отсутствие сыворотки (вирусный контроль), RDE в разведении 1:10, а также ФБ-БСА * - ¿>v ' дг ;, отрицательный контроль). По 100 мкл смеси переносили на покрытые фетуином^

• * ' < t , и" , , *>\ -, > -;(>' I планшеты. Сиалидазная реакция протекала при 37°С в течение 1-2 часов. После чего ч • » планшеты 4 раза отмывали ФБ с добавлением твин-20 до концентрации 0,5%, в лунки вносили по 100 мкл меченного пероксидазой лектина арахиса Arachis hypogaea (кат. номер L7759, «Sigma») в концентрации 2,5 мкг/мл в ФБ-БСА. По истечении срока инкубации (1 час при комнатной температуре) планшеты 4 раза отмывали ФБ с 0,5% твин-20. Проявление пероксидазной реакции проводилось с ТМВ субстратом согласно приведенному выше протоколу.

Для разведения сывороток и вируса использовался подготовленный из стоковых растворов Na2HP04, КН2РО4 и NaCl 0,05М фосфатно-солевой буфер с ионной силой 0Д5М, оптимальный уровень рН которого для активности NA каждого из диагностических штаммов был определен в предварительных экспериментах. Для всех прочих стадий твердофазной РИНА использовался стандартный ФБ (0,01 M раствор с рН = 7,3-7,5, ООО «Биолот»). Доза вируса и время инкубации фермента с субстратом были подобраны в предварительных экспериментах таким образом, чтобы

ОП для вирусного контроля лежала в диапазоне 0,4-0,6 или составляла 25-40% от характеризуемого указанным параметром выхода продукта сиалидазной реакции, осуществляемой RDE в стандартных условиях (ФС с рН = 7,4, время инкубации при 37°С-1 час).

Полученный для серии разведений каждой сыворотки крови набор ОП служил для построения графика зависимости остаточной ферментативной активности NA в присутствии антинейраминидазных антител, рассчитываемой по формуле (3), от разведения образца иммунной сыворотки.

3) активность = ~°ПфБ-БСАУпп пп s х 100%, \U11 ВК UU ФВ-БСА ) где ОПвк И ОПфБ-бса ■ среднее значение оптической плотности для лунок вирусного и отрицательного контролей соответственно.

Титр сывороточных антинейраминидазных антител определяли как величину, обратную разведению образца, дающего 50%-ое ингибирование активности NA. Сероконверсией считалось увеличение титра антител в 2 и более раз. Такое определение достоверного прироста титра сывороточных антител проистекало из хорошей воспроизводимости и разрешающей способности метода [100] и уже было обосновано другими исследователями [39]. , . »,

- * » г ч f Т < ' s

2.5. Оценка эволюционных изменений аминокислотных последовательностей и молекулярная филогения

Выравнивание аминокислотных последовательностей, взятых из базы данных вирусов гриппа Национального центра биотехнологической информации (The Influenza Virus Resource at the National Center for Biotechnology Information) [28], производилось при помощи программы GeneDoc (версия 2.6.002); для построения филогенетических деревьев использовалось программное обеспечение MEGA (версия

4).

Для реконструкции филогенетических деревьев применялся дистанционный метод ближайшего соседства (neighbor joining) на основе матрицы эволюционных дистанций с поправкой Пуассона, учитывающих многократные замены в одних и тех же аминокислотных сайтах, и попарным исключением гэпов. Стабильность топологии дерева оценивалась с помощью бутстреп теста (bootstrap analisys) по итогам построения и сопоставления филогенетических деревьев для 1000 новых наборов аминокислотных последовательностей, сгенерированных на основе исходного выравнивания.

2.6. Статистическая обработка данных

Обработка результатов исследования проводилась с помощью статистического пакета «Statistica» (версия 6,0). Для представления полученных данных использовали следующие показатели описательной статистики: среднее арифметическое, среднегеометрические титры, среднеквадратичное отклонение; для данных, не подчиняющихся нормальному распределению, - медиана (Me) и квартили (Ql; Q3).

Для сравнения двух независимых выборок, которые подчинялись закону нормального распределения, применялся t-критерий Стьюдента для непарных выборок с предварительной проверкой условия равенства дисперсий. В случае связанных выборок сравнение проводили с помощью парного критерия Стьюдента.

При невыполнении предпосылок о нормальности распределения переменной, внутри 4 '> к 4 I К* ^ ' ^ < * <, каждой группы использовались непараметрические аналоги: критерии Манна-Уитни,

Колмогорова-Смирнова или критерий знаковых рангов Уилкоксона. Для тех же целей f f в случае номинальных данных применяли критерии хи-квадрат Пирсона, двусторонний вариант точного критерия Фишера или критерий Мак-Нимара. При проведении множественных попарных сравнений на одном массиве данных учитывали поправку Бонферрони для критического уровня значимости.

Кроме того, сопоставление нескольких независимых выборок осуществлялось с помощью однофакторного дисперсионного анализа при выполнении предпосылок о нормальности распределения зависимой переменной внутри каждой группы и однородности дисперсии или рангового дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса с последующим множественным попарным сравнением с использованием критерия Тьюки или множественными сравнениями, основанными на суммах рангов Краскела-Уоллиса (критерий Данна), соответственно. Для анализа более сложных планов применяли однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями после проверки выполнения необходимых предпосылок. Сопоставление нескольких зависимых выборок, не подчинявшихся закону нормального распределения, выполнялось с помощью рангового дисперсионного анализа Фридмана с последующими множественными сравнениями, основанными на одноименных ранговых суммах. В случае номинальных данных для тех же целей использовали критерии хи-квадрат Пирсона или (^-критерий Кокрена.

О наличии статистической взаимосвязи между переменными судили по результатам корреляционного анализа с расчетом коэффициента корреляции Спирмена/Кендалла. Мерой силы статистической взаимосвязи при анализе номинальных данных служил критерий V Крамера.

Проверяемые критериями нулевые гипотезы отвергались при уровне значимости р < 0,05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Отработка методик выявления сывороточных антинейраминидазных антител к дрейфовым и шифтовым вирусам гриппа Л

Методики по выявлению в иммунных сыворотках антител к ЫА предполагают использование очищенного антигена или особых штаммов вируса гриппа, имеющих низкий процент гомологии в аминокислотной последовательности НА с современными эпидемическими, пандемическими и предположительно пандемическими штаммами, во избежание искажения результатов из-за присутствия в исследуемых образцах антител к главному поверхностному антигену. Поэтому первым этапом нашей работы стала подготовка диагностических реассортантов на основе вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/1956(Н7Ш), отличающегося по первичной последовательности НА от штаммов А/Перт/16/2009(НЗШ) А/Брисбен/59/2007(НШ1), А/Калифорния/7/2009(НШ1) и А/Вьегнам/1203/2004 (Н5Ш) на 53-60%.

3.1.1. Подготовка диагностическихреассортантных штаммов на основе вируса А/лошадъ/Прага/1/56(Н7Ю), содержащих N.А эпидемического, пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа

Методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах были подготовлены штаммы вируса гриппа 1Ш2/57-Ьишап А(Н7Ы2), КК1/04-аУ1ап А(Н7Ш) и КШ/09-з\уте А(Н7Ш), унаследовавшие ген НА от родительского вируса А/лошадь/Прага/1 /5 6(Н7Ы7), а гены ЫА - от вирусов гриппа человека, птиц и пандемического штамма подтипа А(НШ1) 2009 г., о чем свидетельствовали данные РТГА (табл. 1) и ОТ-ПЦР-анализа с парами праймеров, специфичными к последовательностям НА/ЫА-гена только одного из родительских вирусов.

Так, на рисунке 1 представлен ОТ-ПЦР-анализ гена нейраминидазы реассортантного штамма 1Ш1/09-з\уте А(Н7Ш). Амплификация с праймерами, специфичными к последовательности ЫА-гена вируса А/Калифорния/07/09(НШ1), и отсутствие таковой при использовании олигонуклеотидов, гомологичных исключительно N7 штамма лошади, свидетельствует о наследии реассортантом минорного поверхностного гликопротеина от пандемического штамма 2009 г.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Смолоногина, Татьяна Анатольевна, 2011 год

1. Александрова, Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа / Г.И. Александрова // Вопросы вирусологии.- 1977,- № 4.- С. 387-395.

2. Бурцева, Е.И. Антинейраминидазная активность инактивированных гриппозных вакцин у лиц пожилого возраста / Е.И. Бурцева и др. // Вопросы вирусологии.- 2002.-Т. 47.- № 5.- С. 21-25.

3. Дешева, Ю.А. Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии : дис. . докт. мед. наук : защищена 31.03.2009 / Ю.А. Дешева,- СПб, 2009.- 328 с.

4. Иванова, В.Т. Использование лектин-теста для выявления антинейраминидазных антител в сыворотках вакцинированных / В.Т. Иванова и др. // Вопросы вирусологии.-1991,- № 6.- С. 469-471.

5. Исаева, Е.С. Каталитическая активность нейраминидазы / Е.С. Исаева, З.К. Чувакова, В.Э. Березин // Гликопротеиды ортомиксовирусов- Алма-Ата : Наука, 1988.-Гл. 2.- С. 21-33.

6. Карпович, Л.Г. Исследование клеточного и гуморального иммунитета послеv /противогриппозной вакцинации / Л.Г. Карпович и др. // Вопросы вирусологии.-1982.- Т. 27.- № 2.- С. 34-37.

7. Кустикова, Ю.Г. Изучение иммуногенной активности вирусного гемагглютинина и нейраминидазы живых и инактивированных гриппозных вакцин / Ю.Г. Кустикова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1983.- № 4.- С. 79-84.

8. Молибог, Е.В. Штаммовая специфичность антинейраминидазных антител серотипа N2 штаммов вируса гриппа у переболевших / Е.В. Молибог и др. // Вопросы вирусологи.- 1979.- № 6.- С. 631-634.

9. Найхин, А.Н. Антинейраминидазные сывороточные антитела при естественном инфицировании гриппом А и иммунизации гриппозными вакцинами / А.Н. Найхин и др. // Вопросы вирусологии.- 1983.- № 2.- С. 154-159.

10. Найхин, А.Н. Закономерности формирования коллективного иммунитета к гриппу и принципы сероэпидемиологического надзора за этой инфекцией : дис. . докт. мед. наук / А.Н. Найхин.- Л., 1986.- 368 с.

11. Найхин, А.Н. Комплексное изучение популяционного иммунитета к трем антигенам вируса гриппа А / А.Н. Найхин и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1981.- № 2,- С. 77-81.

12. Найхин, А.Н. Роль антинейраминидазных антител в иммунологическом ответе людей на введение живых гриппозных вакцин типа А / А.Н. Найхин, Н.В. Топурия, Г.М. Денисов // Микробиологический журнал.- 1980.- Т. 42.- № 5.- С. 642645.

13. Найхин, А.Н. Стимуляция гриппозными вакцинами антител к различным вариантам вируса гриппа А / А.Н. Найхин и др. // Вопросы вирусологии.- 1985.- Т. 30.-№3.- С. 290-296.

14. Найхин, А.Н. Формирование и защитные функции антител к нейраминидазе вируса гриппа А / А.Н. Найхин и др. // Вопросы вирусологии.- 1985.- № 1.- С.35-39.

15. Неклюдова, Л.И. О корреляции антинейраминидазных антител и антигемагглютининов при гриппозной инфекции и после введения живой гриппозной вакцины / Л.И. Неклюдова, Ю.Б. Фёдорова, Н.Г. Орлова // Вопросы вирусологии.-; 1974.-№2.-С. 173-176.

16. Очистка реакций секвенирования ДНК от невключившихся BigDye-ddNTP Электронный ресурс. : Рекомендации сотрудников Центра / Межинститутский центр секвенирования ДНК.- Режим доступа: http://sequest.niboch.nsc.ru/reaction clean up.html, свободный.

17. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных // Приказ Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12.08.1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных»

18. Руденко, Л.Г. Основные характеристики живой гриппозной вакцины для детей из штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) при раздельном и совместном применении / Л.Г. Руденко и др. // Вопросы вирусологии 1989.- Т. 34.- № 1.- С. 2934.

19. Штыря, Ю.А. Изучение олигоеахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа : автореф. дис. . канд. биол. наук : защищена 25.03.2009 / Ю.А. Штыря.- Москва: ООО «Цифровичок», 2009.- 24 с.

20. Штыря, Ю.А. Нейраминидаза вируса гриппа: структура и функция / Ю.А. Штыря, Л .В. Мочалова, Н.В. Бовин // Acta Naturae.- 2009,- № 2.- С. 28-34.

21. Air, G.M. Individual antibody and T cell responses to vaccination and infection with the 2009 pandemic swine-origin H1N1 influenza virus / G.M. Air et al. // Journal of clinical immunology.- 2011.- DOI 10.1007/s 10875-011-9563-1.

22. Air, G.M. Location of antigenic sites on the three-dimensional structure of the influenza N2 virus neuraminidase / G.M. Air et al. // Virology.- 1985.- Vol. 145.- № 2.- P. 237-248.

23. Aminoff, D. Methods for the quantitative estimation of N-acetyl neuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids / D. Aminoff // The Biochemical journal.- 1961.- Vol. 81.- P. 384-392.

24. Baker, N.J. Effect of Ca ++ on the stability of influenza virus neuraminidase / N. J. Baker, S.S. Gandhi // Archives of Virology.- 1976.- Vol. 52.- P. 7-18.

25. Bandaranayake, D. Risk factors and immunity in a nationally representative population following the 2009 influenza A(H1N1) pandemic / D. Bandaranayake et al. // PLoS One.- 2010,- Vol. 5.- № 10.- el3211.

26. Bao, Y. The influenza virus resource at the national center for biotechnology information / Y. Bao et al. // J. Virol.- 2008.- Vol. 82.- № 2.- P. 596-601.

27. Beigel, J. Current and future antiviral therapy of severe seasonal and avian influenza / J. Beigel, M. Bray // Antiviral research.- 2008.- Vol. 78.- № 1.- P. 91-102.

28. Beutner, K.R. Evaluation of a neuraminidase-specific influenza A virus vaccine in children: antibody responses and effects on two successive outbreaks of natural infection

29. K.R. Beutner et al. // The Journal of infectious diseases.- 1979.- Vol. 140.- № 6.- P. 844850.

30. Broberg, E. Seroprevalence to influenza A(H1N1) 2009 virus Where are we? / E. Broberg, A. Nicoll, A. Amato-Gauci // Clinical and Vaccine Immunology.- 2011,- Vol. 18.-№8.-P. 1205-1212.

31. Bui, H.H. Ab and T cell epitopes of influenza A virus, knowledge and opportunities / H.H. Bui et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2007.- Vol. 104.- № 1.- P. 246-251.

32. Burmeister, W.P. Calcium is needed for the thermostability of influenza B virus neuraminidase / W.P. Burmeister, S. Cusack, R.W. Ruigrok // Journal of General Virology.-1994.-Vol. 75.- P. 381-388.

33. Buxton, R.C. Development of a sensitive chemiluminescent neuraminidase assay for the determination of influenza virus susceptibility to zanamivir / R.C. Buxton et al. // Analytical biochemistry.- 2000.- Vol. 280.- № 2.- P. 291-300. . , ^.

34. Callow, K.A. A re-examination of the single radial haemolysis technique for the assay of influenza anti-neuraminidase antibodies in human sera / K.A. Callow, A.S. Beare // Archives of Virology.- 1980.- Vol. 65,- № 1,- P. 25-35.

35. Callow, K.A. Measurement of antibodies to influenza virus neuraminidase by an enzyme-linked immunosorbent assay / K.A. Callow // Infection and immunity.- 1983,- Vol. 41.-№2.- P. 650-656.

36. Callow, K.A. Measurement of antibody to influenza virus neuraminidase by single radial hemolysis in agarose gels / K.A. Callow, A.S. Beare // Infection and immunity.- 1976.- Vol. 13.- № 1.- P. 1-8.

37. Cate, T. R. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects / T. R. Cate et al. // Vaccine.- 2010.- Vol. 28.- № 9. p. 2076-2079.

38. Chen, Z. Cross-protection against a lethal influenza virus infection by DNA vaccine to neuraminidase / Z. Chen et al. // Vaccine.- 2000.- Vol. 18.- № 28.- P. 32143222.

39. Chen, Z. Enhanced protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with both hemagglutinin- and neuraminidase-expressing DNAs / Z. Chen et al. //Vaccine.- 1999.- Vol. 17.- P. 653-659.

40. Chi, C.Y. Pre-existing antibody response against 2009 pandemic influenza H1N1 viruses in Taiwanese population / C.Y. Chi et al. // Clinical and vaccine immunology 2010.- Vol. 17.- № 12.- P. 1958-1962.

41. Clements, M.L. Serum and nasal wash antibodies associated with resistance to experimental challenge with influenza A wild-type virus / M.L. Clements et al. // Journal of Clinical Microbiology.- 1986.- Vol. 24.- № 1.- P. 157-160.

42. Colman, P.M. Influenza virus neuraminidase: Structure, antibodies, <■ andinhibitors / P.M. Colman // Protein Science.- 1994.- Vol. 3.- № 10.- P. 1687-1696.- Y i,t \ ' , * ; < ' '

43. Colman, P.M. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virusneuraminidase / P.M. Colman, J.N. Varghese, W.G. Laver // Nature.- 1983.- Vol. 303.- № 5912.- P. 41-44.

44. Colman, P.M. Three-dimensional structure of a complex of antibody with influenza virus neuraminidase / P.M. Colman et al. // Nature.- 1987,- Vol. 326.- №6111.-P. 358-363.

45. Couch, R.B. Correlated studies of a recombinant influenza-virus vaccine. 3. Protection against experimental influenza in man / R.B. Couch RB et al. // The Journal of infectious diseases.-1971.- Vol. 124.- № 5.- P. 473-480.

46. Couch, R.B. Induction of partial immunity to influenza by a neuraminidase-specific vaccine / R.B. Couch et al. // The Journal of Infectious Diseases.- 1974.- Vol. 129.-№4.- P. 411-420.

47. Deroo, T. Recombinant neuraminidase vaccine protects against lethal influenza / T. Deroo, W.M. Jou, W. Fiers // Vaccine.- 1996.- Vol. 14.- № 6.- P. 561-569.

48. Deshairs, C. Catalytic properties of the A/H3N2 influenza neuraminidases: influence of antigenic variations / C. Deshairs et al. // The Journal of General Virology.-1986.- Vol. 67.- № 3.- P. 409-418.

49. Dowdle, W.R. Antigenic relationships among influenza virus A neuraminidase

50. N2) antigens by immunodiffusion and postinfection neutralization tests / W.R. Dowdle et»al. // Journal of clinical microbiology.- 1976.- Vol. 3.- № 3.- P. 233-238.

51. Dowdle, W.R. Inhibition of virus release by antibodies to surface antigens of influenza viruses / W.R. Dowdle, J.C. Downie, W.G. Laver // Journal of Virology.- 1974.-Vol.l3.-№2.- P. 269-275.

52. England, R.J. Nasal pH measurement: a reliable and repeatable parameter / R.J. England et al. // Clinical otolaryngology and allied sciences.- 1999.- Vol. 24.- № 1.- P. 67-68.

53. Feltquate, D.M. Different T helper cell types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization / D.M. Feltquate et al. // Journal of Immunology.-1997.- Vol. 158.- № 5.- P. 2278-2284.

54. Fischer, H. Mechanisms of acid and base secretion by the airway epithelium / H. Fischer, J.H. Widdicombe // The Journal of membrane biology.- 2006.- Vol. 211.- № 3.- P. 139-150.

55. Frobert, E. Anti N1 cross-protecting antibodies against H5N1 detected in H1N1 infected people / E. Frobert et al. // Current microbiology.- 2010.- Vol. 61.- № 1.- P. 2528.

56. Gilbert, G.L. Influenza A (H1N1) 2009 antibodies in residents of New South Wales, Australia, after the first pandemic wave in the 2009 southern hemisphere winter / G.L. Gilbert et al. // PLoS One.- 2010.- Vol. 5.- № 9.- el2562.

57. Gioia, C. Cross-subtype immunity against avian influenza in persons recently vaccinated for influenza / C. Gioia et al. // Emerging infectious diseases.- 2008.- Vol. 14.-№1.-P. 121-128.

58. Goto, H. A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus / H. Goto, Y. Kawaoka // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.- Vol. 95.- № 17.-P. 10224-10228.

59. Goto, H. Plasminogen-binding activity of neuraminidase determines the pathogenicity of influenza A virus / H. Goto et al. // Journal of Virology.- 2001.- Vol. 75.-№19.- P. 9297-9301.

60. Greenbaum, J.A. Pre-existing immunity against swine-origin H1N1 influenza viruses in the general human population / J.A. Greenbaum et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009.- Vol. 106.- № 48.- P. 20365-20370.

61. Gubareva, L.V. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-Guanidino-Neu5Ac2en / L.V. Gubareva et al. // Journal of Virology.- 1997.- Vol. 71.- № 5.- P. 3385-3390

62. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98) / U. Gulati et al. // Journal of Virology.- 2002.- Vol. 76.- № 23.-P. 12274-12280.

63. Hancock, K. Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus / K. Hancock et al. // The New England journal of medicine.- 2009.- Vol. 361.- №20.- P. 1945-1952.

64. Hardelid, P. Assessment of baseline age-specific antibody prevalence and incidence of infection to novel influenza A/H1N1 2009 / P. Hardelid et al. // Health technology assessment (Winchester, England).- 2010.- Vol. 14.- № 55.- P.l 15-192.

65. Hennessy, A.V. Reproducibility of a neuraminidase inhibition test employed to measure anti-influenza neuraminidase antibody / A.V. Hennessy, F.M. Davenport // Applied Microbiology.- 1972.- Vol. 23.- № 4,- P. 827-828.

66. Henrissat, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities / B. Henrissat // The Biochemical journal.- 1991.- Vol. 280.- P. 309316.

67. Hervio, L.S. Negative selectivity and the evolution of protease cascades: the specificity of plasmin for peptide and protein substrates / L.S. Hervio et al. // Chemistry &

68. Biology.-2000.-Vol. 7.-№ 6.-P. 443-453. r, ' > *> ~

69. Hoffmann, E. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses / E. Hoffmann et al. // Archives of virology.- 2001,- Vol. 146.- № 12.-P.2275-2289.

70. Hughes, M.T. Influenza A viruses lacking sialidase activity can undergo multiple cycles of replication in cell culture, eggs, or mice / M. T. Hughes et al. // Journal of Virology.- 2000.- Vol. 74.- № 11.- P. 5206-5212.

71. Ito, T. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection / T. Ito et al. // Journal of Virology.- 1997.- Vol. 71.- № 4,- P. 3357-3362.

72. Jameson, J. Human CD8+ and CD4+ T lymphocyte memory to influenza A viruses of swine and avian species / J. Jameson et al. // Journal of immunology.- 1999.-Vol. 162.- № 12.- P. 7578-7583.

73. Jennings, R. Responses of volunteers to inactivated influenza virus vaccines / R. Jennings et al. // The Journal of hygiene.-1981.- Vol. 86.- № 1.- P. 1-16.

74. Johansson, B.E. Infection-permissive immunization with influenza virus-vneuraminidase prevents weight loss in infected mice / B.E. Johansson, B. Grajower, E.D. Kilbourne // Vaccine.- 1993.- Vol. 11.- № 10.- P. 1037-1039. • » "

75. Kaiser, L. Impact of oseltamivir treatment on influenza-related lower respiratory tract complications and hospitalizations / L. Kaiser et al. // Archives of internal medicine.2003.-Vol. 163.-№ 14.-P. 1667-1672.

76. Katinger, D. Specificity of neuraminidase activity from influenza viruses isolated in different hosts tested with novel substrates / D. Katinger et al. // Archives of Virology.2004.-Vol. 149.-№ n. p. 2131-2140.

77. Kendirgi, F. Novel linear DNA vaccines induce protective immune responses against lethal infection with influenza virus type A/H5N1 / F. Kendirgi et al. // Human Vaccines.- 2008.- Vol. 4.- № 6,- P. 410-419.

78. Khan, M.W. Detection of influenza virus neuraminidase-speciflc antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay / M.W. Khan et al. // Journal of Clinical Microbiology.- 1982.-Vol. 16.-№ 1.- P. 115-122.

79. Kilbourne, E.D. Comparative efficacy of neuraminidase-specific and conventional influenza virus vaccines in induction of antibody to neuraminidase in humans / E.D. Kilbourne // The Journal of Infectious Diseases.- 1976.- Vol.134.- № 4.- P. 384-394.

80. Kilbourne, E.D. Influenza Pandemics of the 20th Century / E.D. Kilbourne // Emerging Infectious Diseases.- 2006.- Vol. 12,- № 1.- P. 9-14.

81. Kilbourne, E.D. Protection of mice with recombinant influenza virus neuraminidase / E.D. Kilbourne et al. // The Journal of Infectious Diseases.- 2004.- Vol. 189.-№3.- P. 459-461.

82. Klimov, A.I. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines / A.I. Klimov, N.J. Cox // Journal of , virological methods.- 1995.-Vol. 52.-P.41-49. 1 '< < /

83. Kobasa, D. Amino acid resides contributing to the substrate specificity of the influenza A virus neuraminidase / D. Kobasa et al. // Journal of Virology.- 1999.- Vol. 73.-№8.- P. 6743-6751.

84. Kreijtz, J.H. Cross-recognition of avian H5N1 influenza virus by human cytotoxic T-lymphocyte populations directed to human influenza A virus / J.H. Kreijtz et al. //Journal of Virology.- 2008.- Vol. 82.- № 11.- P. 5161-5166.

85. Kwon, M. S100A10, annexin A2, and annexin a2 heterotetramer as candidate plasminogen receptors / M. Kwon et al. // Frontiers in bioscience: a journal and virtual library.- 2005.- Vol. 10.- P. 300-325.

86. Lambre, C.R. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates / C.R. Lambre et al. // Journal of immunological methods.- 1990.- Vol. 135.- P. 49-57.

87. Lazarowitz, S.G. Proteolytic cleavage by plasmin of the HA polypeptide of influenza virus: Host cell activation of serum plasminogen / S.G. Lazarowitz, A.R. Goldberg, P.W. Choppin // Virology.- 1973.- Vol. 56.- № 1.- P. 172-180.

88. LeBouder, F. Plasminogen promotes influenza A virus replication through an annexin II-dependent pathway in absence of neuraminidase / F. LeBouder et al. // Journal of General Virology.- 2010.- Vol.91.- P. 2753-2761.

89. Lee, L.Y. Memory T cells established by seasonal human influenza A infection crossreact with avian influenza A (H5N1) in healthy individuals / L.Y. Lee et al. // The Journal of clinical investigation.- 2008.- Vol. 118.- № 10.- P. 3478-3490.

90. Lee, V.J. Inactivated trivalent seasonal influenza vaccine induces limited cross-reactive neutralizing antibody responses against 2009 pandemic and 1934 PR8 H1N1 strains / V.J. Lee et al. // Vaccine.- 2010.- Vol. 28.- № 42.- P. 6852-6857.

91. Lentz, M.R. Sequence of the neuraminidase gene of influenza virus A/Tokyo/3/67 and previously uncharacterized monoclonal variants / M.R. Lentz et al. // Virology.- 1984.- Vol. 135.- № 1.- P. 257-265.

92. Lentz, M.R. Site-directed mutation of the active site of influenza neuraminidase and implications for the catalytic mechanism / M.R. Lentz, R.G. Webster, G.M. Air // Biochemistry.- 1987.- Vol. 26.- № 17.- P. 5351-5358.

93. Li, C. Compatibility among polymerase subunit proteins is a restricting factor in reassortment between equine H7N7 and human H3N2 influenza viruses/ C. Li et al. // Journal of Virology.- 2008.- Vol. 82.- № 23.- P. 11880-11888.

94. Li, S. Glycosylation of neuraminidase determines the neurovirulence of influenza A/WSN/33 virus / S. Li et al. // Journal of Virology.- 1993.- Vol. 67.- № 11.- P. 66676673.

95. Lin, Y.P. Adaptation of egg-grown and transfectant influenza viruses for growth in mammalian cells: selection of hemagglutinin mutants with elevated pH of membrane fusion / Y.P. Lin et al. // Virology.- 1997.- Vol. 233,- № 2.- P. 402-410.

96. Liu, C. Influenza type A virus neuraminidase does not play a role in viral entry, replication, assembly, or budding / C. Liu et al. // Journal of Virology.- 1995,- Vol. 69.- № 2.-P. 1099-1106.i

97. Liu, C. Selection and characterization of a neuraminidase-minus mutant of influenza virus and its rescue by cloned neuraminidase genes / C. Liu, G.M. Air // Virology.- 1993.- Vol. 194.- № 1,- P. 403-7

98. Liu, S. CL-385319 inhibits H5N1 avian influenza A virus infection by blocking viral entry / S. Liu et al. // European Journal of Pharmacology.- 2011.- Vol. 660.- P. 460467.

99. Luo, G. Characterization of a hemagglutinin-speciflc inhibitor of influenza A virus / G. Luo, R. Colonno, M. Krystal // Virology.- 1996.- Vol. 226.- № 1.- P. 66-76.

100. Luo, G. Molecular mechanism underlying the action of a novel fusion inhibitor of influenza A virus / G. Luo et al. // Journal of Virology.- 1997.- Vol. 71.- № 5.- P. 40624070.

101. Luther, P. The lectin neuraminidase inhibition test: a new method for the detection of antibodies to neuraminidase / P. Luther et al. // Journal of biological standardization.- 1983.- Vol. 11.-№2.- P. 115-121.

102. Lynch G.W. Cross-reactive anti-avian H5N1 influenza neutralizing antibodies in a normal 'exposure-naive' Australian blood donor population / G.W. Lynch et al. // The Open Immunology Journal.- 2008,- Vol. 1.- P. 13-19.

103. Matrosovich, M.N. Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium / M.N. Matrosovich et al. // Journal of Virology.- 2004.- Vol. 78.- № 22.- P. 12665-12667.

104. McShane, D. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis / D. McShane et al. // The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory.- 2003.- Vol. 21.- № 1.- P. 37-42.

105. McVernon, J. Seroprevalence of 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus in Australian blood donors, October December 2009 / J. McVernon et al. // Euro surveillance: European communicable disease bulletin.- 2010.- Vol. 15.- № 40.- pii=19678.

106. Miller, E. Incidence of 2009 pandemic influenza A H1N1 infection in England: a cross-sectional serological study / E. Miller et al. // Lancet.- 2010.- Vol. 375.- № 9720.- P. 1100- 1108.

107. Miyazono, K. Role for carbohydrate structures in TGF-bl latency / K. Miyazono, C.H. Heldin // Nature.- 1989.- Vol. 338.- № 6211.- P. 158-160.

108. Mochalova, L. Oligosaccharide specificity of influenza H1N1 virus neuraminidases / L. Mochalova et al. // Archives of Virology.- Vol. 152.- № 11.- P. 20472057.

109. Monto, A.S. Effect of neuraminidase antibody on Hong Kong influenza / A.S. Monto, A.P. Kendal // Lancet.- 1973.- Vol. 1.- № 7804,- P. 623-625.

110. Morley, P.S. The effect of changing single radial hemolysis assay method when quantifying influenza A antibodies in serum / P.S. Morley et al. // Veterinary microbiology.- 1995.- Vol. 44.- № 1.- P. 101-110.

111. Morris, S.J. Role of neuraminidase in influenza virus-induced apoptosis / S.J. Morris et al. // Journal of General Virology.- 1999.- Vol. 80.- P. 137-146. :

112. Naikhin, A.N. The importance of antineuraminidase antibodies in resistance to influenza A and immunologic memory for their synthesis / A.N. Naikhin et al. // The Journal of hygiene.- 1983.- Vol. 91.- № 1.- P. 131-138.

113. Nath, D.M. Antigenic comparison of swine influenza virus isolates / D.M. Nath, L.S. Rodkey, H.C. Minocha // Archives of Virology.- 1975.- Vol. 48.- № 3.- P. 245-252.

114. Nayak, B. Contributions of the avian influenza virus HA, NA, and M2 surface proteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity / B. Nayak et al. // Journal of Virology.- 2010.- Vol. 84,- № 5.- P. 2408-2420.

115. Ogra, P.L. Clinical and immunologic evaluation of neuraminidase-specific influenza A virus vaccine in humans / P.L. Ogra et al. // The Journal of Infectious Diseases.- 1977.- Vol. 135.- № 4.- P. 499-506.

116. Palese, P. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuralninidase / P. Palese et al. // Virology.- 1974,- Vol. 61.- № 2.- P. 397410.

117. Peters, B. The immune epitope database and analysis resource: from vision to blueprint / B. Peters et al. // PLoS biology.- 2005.- Vol. 3.- № 3.- P. e91.

118. Pichyangkul, S. Cross-reactive Antibodies against avian influenza virus A (H5N1) / S. Pichyangkul et al. // Emerging infectious diseases.- 2009.- Vol. 15.- № 9.- P.1537-1539.- < • , • '' ' '7 \Ai ' t i /*

119. Potier, M. Fluorometric assay of neuraminidase with a sodium (4-methylumbelliferyl-alpha-d-N-acetylneuraminate) substrate / M. Potier et al. // Analytical biochemistry.- 1979.- Vol. 94.- № 2.- P. 287-296.

120. Price, G.E. Differential induction of cytotoxicity and apoptosis by influenza virus strains of differing virulence / G.E. Price, H. Smith, C. Sweet // Journal of General Virology.- 1997.- Vol. 78.- P. 2821-2829.

121. Reece, P.A. Treatment options for H5N1: lessons learned from the H1N1 pandemic / P.A. Reece // Postgraduate medicine.- 2010.- Vol. 122.- № 5.- P. 134-141.

122. Reed, L.J. A simple method of estimating fifty percent endpoints / L.J. Reed, H. Muench // The American Journal of Hygiene.- 1938.- Vol. 27.- № 3.- P. 493-497.

123. Reed, M.L. Amino acid residues in the fusion peptide pocket regulate the pH of activation of the H5N1 influenza virus hemagglutinin protein / M.L. Reed et al. // Journal of Virology.- 2009.- Vol. 83.- № 8.- P. 3568-3580.

124. Rizzo, C. Cross-reactive antibody responses to the 2009 A/HlNlv influenza virus in the Italian population in the pre-pandemic period / C. Rizzo et al. // Vaccine.-2010.- Vol. 28.- № 20.- P. 3558-3562.

125. Roti, M. Healthy human subjects have CD4+ T cells directed against H5N1 influenza virus / M. Rori et al. // Journal of immunology.- 2008.- Vol. 180,- № 3.- P. 1758-1768.

126. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays / T. Rowe et al. // Journal of clinical microbiology.- 1999.- Vol. 37.- № 4.- P. 937-943.

127. Rudenko, L. Development of pandemic live attenuated influenza vaccine (LAIV)in Russia / L. Rudenko et al. // Influenza and other respiratory viruses.- 2011.-, Vol. 5.t ' f1. Suppl. 1.-P. 333-337.

128. Rudenko, L. Safety and immunogenicity of live attenuated influenza reassortant H5 vaccine (phase I—II clinical trials) / L. Rudenko et al. // Influenza and Other Respiratory Viruses.- 2008.- Vol. 2.- № 6.- P. 203-209.

129. Sandbulte, M.R. Cross-reactive neuraminidase antibodies afford partial protection against H5N1 in mice and are present in unexposed humans / M.R. Sandbulte et al. // PLoS medicine.- 2007.- Vol. 4.- № 2.- P. 265-272.

130. Schanen, B.C. Coupling sensitive in vitro and in silico techniques to assess cross-reactive CD4(+) T cells against the swine-origin H1N1 influenza virus / B.C. Schanen et al. // Vaccine.- 2011.- Vol. 29.- № 17.- P. 3299-3309.

131. Schild, G.C. Antibody against influenza A2 virus neuraminidase in human sera / G.C. Schild // The Journal of hygiene.- 1969.- Vol. 67,- № 2.- P. 353-365.

132. Schild, G.C. A quantitative, single-radial-diffusion test for immunological studies with influenza virus / G.C. Schild, M. Henry-Aymard, H.G. Pereira // Journal of General Virology.- 1972.- Vol. 16.- № 2.- P.231-236.

133. Schulman, J.L. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice / J.L. Schulman, M. Khakpour, E.D. Kilbourne // Journal of Virology.- 1968.- Vol. 2.- № 8.- P. 778-786.

134. Schulman, J.L. Virulence factors of influenza A viruses: WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells / J.L. Schulman, P. Palese // Journal of Virology.- 1977.- Vol. 24.-№ 1.- P. 170-176.

135. Schultz-Cherry, S. Influenza virus neuraminidase activates latent transforming growth factor beta / S. Schultz-Cherry, V.S. Hinshaw // Journal of Virology.- 1996.- Vol. 70.-№ 12.- P. 8624-8629.

136. Shibata, S. Characterization of a temperature-sensitive influenza B virus mutant defective in neuraminidase / S. Shibata et al. // Journal of Virology.- 1993.- Vol. 67.- № 6.- P. 3264-3273.

137. Slepushkin, A.N. Neuraminidase and resistance to vaccination with live influenza A2 Hong Kong vaccines / A.N. Slepushkin et al. // The Journal of hygiene.-1971.- Vol. 69.- № 4.- P. 571-578.

138. Smith, A.J. Natural infection with influenza A (H3N2). The development, persistence and effect of antibodies to the surface antigens / A.J. Smith, J.R. Davies // The Journal of hygiene.- 1976.-Vol. 77.- № 2.- P. 271-282.

139. Smith, B.J. Structure of a calcium-deficient form of influenza virus neuraminidase: implications for substrate binding / B.J. Smith et al. // Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography.- 2006.- Vol. 62.- P.947-952.

140. Stray, S.J. Apoptosis by influenza viruses correlates with efficiency of viral mRNA synthesis / S.J. Stray, G.M. Air // Virus Research.- 2001.- Vol. 77.- № 1.- P. 3-17.

141. Sugaya, N. Very low pandemic influenza A (H1N1) 2009 mortality associated with early neuraminidase inhibitor treatment in Japan: Analysis of 1000 hospitalized children / N. Sugaya et al. // The Journal of infection.- 2011.

142. Sugiura, A. Neurovirulence of influenza virus in mice I. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent virus strains / A. Sugiura, M. Ueda // Virology.- 1980.- Vol. 101.- № 2- P. 440-449.

143. Sun, X. Modifications to the hemagglutinin cleavage site control the virulence of a neurotropic H1N1 influenza virus / X. Sun et al. // Journal of Virology.- 2010.- Vol. 84.-№ 17.- P. 8683-8690.

144. Suzuki, T. Sialidase activity of influenza A virus in an endocytic pathway enhances viral replication / T. Suzuki et al. // Journal of Virology.- 2005.- Vol. 79.- № 18.-P. 11705-11715.

145. Suzuki, Y. Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses / Y. Suzuki et al. // Journal of Virology.- 2000.- Vol. 74,- № 24.- P. 11825-11831.

146. Sylte, M.J. Influenza neuraminidase antibodies provide partial protection for chickens against high pathogenic avian influenza infection / M.J. Sylte, B. Hubbyb, D.L.

147. Suarez // Vaccine.- 2007.- Vol. 25.- № 19.- p. 3763-3772. , > vf < x 1 i>r' ?

148. Takahashi, T. A molecular mechanism for the low-pH stability of sialidase activity of influenza A virus N2 neuraminidases / T. Takahashi et al. // FEBS Letters.-2003.-Vol. 543.- P. 71-75.

149. Takahashi, T. Duck and human pandemic influenza A viruses retain sialidase activity under low pH conditions / T. Takahashi et al. // Journal of biochemistry.- 2001.-Vol. 130.-№2.- P. 279-283.

150. Takahashi, T. The low-pH stability discovered in neuraminidase of 1918 pandemic influenza A virus enhances virus replication / T. Takahashi et al. // PLoS One.-2010.- Vol. 5,- № 12.- el5556.

151. Thoennes, S. Analysis of residues near the fusion peptide in the influenza hemagglutinin structure for roles in triggering membrane fusion / S. Thoennes et al. // Virology.- 2008.- Vol. 370.- № 2.- P. 403-414.

152. Throsby, M. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells / M. Throsby et al. // PloS One.- 2008.- Vol. 3.- № 12.- e3942.

153. Tran, T.H. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam / T.H. Tran et al. // The New England journal of medicine.- 2004.- Vol. 350,- № 12.- P. 1179-1188.

154. Tumpey, T.M. Mucosal delivery of inactivated influenza vaccine induces B-cell-dependent heterosubtypic cross-protection against lethal influenza A H5N1 virus infection / T.M. Tumpey et al. // Journal of Virology.- 2001.- Vol. 75.- № 11,- P. 5141-5150.

155. Varghese, J.N. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution / J.N. Varghese, W.G. Laver, P.M. Colman // Nature.-1983.- Vol. 303.- № 5912.- P. 35-40.

156. Viboud, C. Multinational impact of the 1968 Hong Kong influenza pandemic: evidence for a smoldering pandemic / C.Viboud et al. // The Journal of Infectious Diseases.- 2005.-Vol. 192.- № 2.- P. 233-248.

157. Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids / L. Warren // The Journal of biological chemistry .-1959.- Vol. 234.- № 8.- P. 1971-1975.

158. Washington, N. Determination of baseline human nasal pH and the effect of intranasally administered buffers / N. Washington et al. // International journal of pharmaceutics.-2000.-Vol. 198.-№2.-P. 139-146.

159. Webster, R.G. Antigenic and biological characterization of influenza virus neuraminidase (N2) with monoclonal antibodies / R.G. Webster, L.E. Brown, W.G. Laver // Virology.- 1984.- Vol. 135.- № 1.- P. 30-42.

160. Webster, R.G. Antigenic structure and variation in an influenza virus N9 neuraminidase / R. G. Webster et al. // Journal of Virology.- 1987.- Vol. 61.- № 9.- P. 2910-2916;

161. Xie, H. Immunogenicity and cross-reactivity of 2009-2010 inactivated seasonal influenza vaccine in US adults and elderly / H. Xie et al. // PLoS One.- 2011.- Vol. 6.- № l.-el6650.

162. Xu, X. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase / X. Xu et al. // Journal of Virology.- 2008.- Vol. 82.- № 21.- P. 1049310501.

163. Yamane, N. Effect of specific immunity to viral neuraminidase on subsequent influenza virus infection in man / N. Yamane et al. // Microbiology and immunology.-1979.- Vol. 23.- № 6.- P. 565-567.

164. Zimmer, S.M. Seroprevalence following the second wave of Pandemic 2009 H1N1 influenza in Pittsburgh, PA, USA / S.M. Zimmer et al. // PLoS One.- 2010.- Vol. 5.-№7.-el 1601.190

165. Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Юлии Андреевне Дешевой за бесценную помощь и поддержку, оказанную в ходе выполнения диссертационной работы.

166. Искренне признательна рецензентам Анатолию Нойевичу Найхину и Вере Зорьевне Кривицкой за бесценные советы, замечания и деятельное участие в шлифовании диссертации.

167. Выражаю глубокую благодарность руководителю отдела вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН Ларисе Георгиевне Руденко за предоставленную возможность обучения в аспирантуре, всестороннюю помощь и поддержку.А

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.