Конструирование диагностических препаратов для экспрессных методов лабораторной диагностики бруцеллеза и детекции его возбудителей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Касторная, Маргарита Николаевна

• Касторная, Маргарита Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Касторная, Маргарита Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА"

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика используемых штаммов микроорганизмов.

2.2. Методы выделения антигенов.

2.3. Разрушение микробных клеток.

2.4. Определение оптической плотности.

2.5. Метод количественного определения белка.

2.6. Метод иммунизации животных.

2.7. Методика выделения иммуноглобулинов ПЭГом.

2.8. Постановка реакции радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони.

2.9. Метод постановки реакции Райта.

2.10. Метод получения иммунопероксидазных коньюгатов и определение их активности в ИФА.

2.11. Получение флюоресцирующих иммуноглобулинов.

2.12. Иммунофлюоресцентный анализ.

2.12.1. Прямой метод окрашивания.

2.12.2. Реакция непрямой иммунофлюоресценции.

2.12.3. Количественный иммунофлюоресцентный анализ

КИФА)

2.13. Метод проведения генетической идентификации возбудителя бруцеллеза с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.14. Методика проведения хемилюминесцентного иммунного анализа (ХЛИА).

2.15. Лиофилизация иммуноглобулинов, антигенов, сывороток и коньюгатов.

2.16. Характеристика лабораторных животных, использованных в опытах.

2.17. Методы математической и статистической обработки.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА АНТИГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ

СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА

3.1. Разработка эритроцитарного бруцеллезного антигенного диагностикума.

3.2. Стабилизация антигенного эритроцитарного бруцеллезного диагностикума.

3.3. Изучение диагностической ценности антигенного эритроцитарного диагностикума.

3.4. Разработка бруцеллезного антигенного диагностикума для реакции агглютинации латекса.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ С МАГНИТНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА В ЭКСПРЕССНЫХ МЕТОДАХ ИММУНОАНАЛИЗОВ (ИФА и КИФА).

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА СОЧЕТАННЫХ МЕТОДОВ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРУЦЕЛЛЕЗА: МАГНОИММУ-НОСОРБЦИЯ - ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ И МАГНОИММУНОСОРБЦИЯ - ХЕМИЛЮМИНЕС-ЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ.

5.1. Сочетанный метод детекции возбудителей бруцеллеза: селективное концентрирование на магноиммуносорбенте - ПЦР-анализ.

5.2. Сочетанный метод детекции возбудителей бруцеллеза: селективное концентрирование на магноиммуносорбенте - хеми-люминесцентный иммунный анализ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование диагностических препаратов для экспрессных методов лабораторной диагностики бруцеллеза и детекции его возбудителей»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В последние годы во всем мире отмечается рост заболеваемости бруцеллезом, особенно в районах развитого овцеводства (Губина, Маликов, 1989; Воробьев, Черкасский, Степанов, 1997; Онищенко, 2001; Покровский, Филатов, Шаханина, 2001; Gavazzi, Prigeut, Baudet et al. , 1997; Sun, Zhang, Sun, 1998; Handa, Singh, Sing et al., 1998;Cerri, Ebani, Pedrini et al., 1999 и др.). Зависимость поражения этой инфекцией сельскохозяйственных животных прямо пропорциональна частоте случаев заболеваемости бруцеллезом людей (Вершилова, 1973; Ковалев, Петров, Богданов и др., 1997; Баташев, Уралева, Кучин и др., 1998; Schopf, Khaschabi, 1997; Miller, Adams, Ficht et al., 1999; Sanchez Chaparro, Merida de la Torre, Gonzalez Alegre et al., 1999; Milionis, Christou, Elisaf, 2000 и др.).

В России проблема бруцеллеза стоит достаточно остро, так как заболевания людей и животных регистрируются ежегодно практически на всех её административных территориях. Почти 90% заболевших людей бруцеллезом приходится на территории Северо-Кавказкого (Карачаево-Черкесская Республика и Дагестан), Поволжского (Волгоградская и Саратовская области), Западного и Восточно-Сибирского (прежде всего Челябинская область) регионов. Наиболее пораженным бруцеллезом регионом является Ставропольский край, где показатели заболеваемости населения края превышают среднероссийские в 9-15 раз (Гнутов, Богданов, Постовой и др., 1995; Лямкин, Таран, Бутаев, 2001).

Использование специфической вакцинации привело к изменению иммунологического фона в сторону гиперсенсибилизации населения к бруцеллезному антигену, клинической картины болезни и эпидемиологического процесса в целом (Вершилова, Голубева, 1972; Ельников, Ангелов, Юндин и др., 1987; Панова, Мансурова, 1998; Kumar, Singh, Barbuddne, 1997). Появились сведения по клинике бруцеллеза у лиц различного профессионального состава, не всегда укладывающиеся в общепринятую патогенетическую схему (Панова, Мансурова, 1998; Баташев, Уралева, Кучин и др., 1998; Цирельсон, Салов, Сыздыков, 1999; Palanduz, Palanduz, Guler et al., 2000).

Особенности клинического течения бруцеллеза, тенденции к хронизации процесса, его полиморганотропность и сменяемость поражений, обуславливающих полиморфизм клинических проявлений, осложняют своевременную диагностику и дифференциацию его форм. В связи с чем, важная роль отводится лабораторным методам подтверждения диагноза (Абусуева, Арбулиева, Хаиров, 1999; Закарян, Цирельсон, Бекетов и др., 1999; Дентовская, Шарова, Самойлова и др., 2000; Baldi, Wanke, Loza et al., 1994; Baldi, Miguel, Fossati et al.,1996; Nunez-Torres., Diaz-Aparicio, Tenorio et al.,1998).

До 1995 года в практическом здравоохранении России использовались диагностические препараты, производимые в странах ближнего зарубежья (Украине, Республике Казахстан, Грузии, Молдове). В связи с возникшими значительными трудностями в поставках МИБП из указанных государств, а также отсутствием аналогичного производства в Российской Федерации, Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации дал указание (от 28.04.1995 г. № 28) разработать и организовать выпуск МИБП для диагностики особо опасных инфекций и индикации их возбудителей в Российских научно-исследовательских противочумных институтах. На рабочем совещании представителей противочумных институтов, состоявшемся 16-18 мая, 1995 года, было принято решение о распределении номенклатуры МИБП между институтами. В частности, СтавНИПЧИ, в ряду прочих, было вменено в обязанность совершенствование, разработка бруцеллезных МИБП и организация их производства.

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель диссертационной работы заключалась в совершенствовании методов и разработке новых медицинских иммунобиологических препаратов для диагностики бруцеллеза и индикации его возбудителей.

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Разработать высокочувствительные и специфичные бруцеллезные антигенные эритроцитарные и суспензионный диагностикумы для выявления специфических антител.

2. Разработать композиционные сорбенты с магнитными свойствами для селективной иммуносорбции специфических антител и антигенов при диагностике бруцеллеза и индикации его возбудителей в экспрессных методах иммуноанализов (ИФА и КИФА).

3. Разработать условия сочетанных методов детекции возбудителя бруцеллеза: магноиммуносорбция - ПЦР - анализ; магноиммуносорбция -хемилюминесцентный иммунный анализ (ХЛИА).

4. Провести лабораторные и клинические испытания диагностикумов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Разработаны высокочувствительные и специфичные антигенные эритроцитарные и латексный диагностикумы для серологической диагностики бруцеллеза.

Показана эффективность и ценность применения антигенных магноиммуносорбентов в экспресс-методах диагностики бруцеллеза.

Разработаны условия сочетанных методов: предварительное селективное концентрирование инфекционного агента на магноиммуносорбенте с последующей его детекцией в ПЦР - анализе и индикация возбудителя бруцеллеза в хемшпоминесцентном иммунном анализе с предварительным избирательным концентрированием на магноиммуносорбенте, что впервые дало возможность применения ХЛИА для исследования объектов внешней среды.

Приоритетность вышеизложенного подтверждена:

- Патентом № 21 65081 РФ, С 2 7 G 01 № 33/ 53, заяв. 05.01.99., опубл. 10.04.2001, Бюл. № 10. "Способ индикации микроорганизмов";

- Решением о выдаче патента от 20.11.2002 г. Заявка № 2001121392/14 на патент: "Способ лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции у людей";

-Положительным решением от 05.03.2002г. Заявка № 2001135978 на патент: "Способ обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды".

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Предварительное селективное концентрирование патогена на аффинном магносорбенте дает возможность с большей эффективностью исследовать объекты внешней среды, в том числе и сильно загрязненные, а последующая индикация возбудителей в таких методах как полимеразная цепная реакция и хемилюминесцентной иммунный анализ позволяет повысить эффективность и достоверность исследования при увеличении специфической чувствительности на 2-3 порядка по сравнению с общепринятыми экспрессными методами. Разработанные бруцеллезные антигенные магноиммуносорбентные тест-системы для избирательного концентрирования специфических антител и последующего проведения ИФА и КИФА обладают более высокой разрешающей способностью, что выражается в увеличении числа серопозитивных результатов исследований на бруцеллез по сравнению с традиционными лабораторными методами иммуноанализов. Проведенные лабораторные и клинические испытания разработанных бруцеллезных антигенных эритроцитарных и латексных диагностикумов свидетельствуют об их высокой чувствительности, специфичности и перспективе использования в лабораториях практического здравоохранения РФ.

Составлена нормативная документация на диагностикум эритроцитарный бруцеллезный антигенный сухой и жидкий (регламент производства, фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению), одобренная Ученым Советом СтавНИПЧИ и утвержденная директором института (протокол № 11 от 28.10. 1998 г.).

Материалы исследований легли в основу: методических рекомендаций "Детекция бруцелл в материале, зараженном или подозрительном на зараженность возбудителем бруцеллеза, с помощью полимеразно-цепной реакции с предварительным селективным концентрированием на МИС", одобренных Ученым Советом СтавНИПЧИ и утвержденных директором института (протокол № 1 от 27.01.2000 г.); "Методических рекомендаций по применению антигенных бруцеллезных магноиммуносорбентов в методах иммуноанализа (непрямого ИФА и КИФА)", одобренных Ученым Советом СтавНИПЧИ и утвержденных директором института (протокол № 5 от 31.05.2001 г.); "Методических рекомендаций по использованию тест-системы бруцеллезной иммуноглобулиновой магноиммуносорбентной в хемилюминесцентном иммунном анализе (ХЛИА)", одобренных Ученым Советом СтавНИПЧИ и утвержденных директором института (протокол № 1 от 30.01. 2002 г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Разработка антигенных бруцеллезных эритроцитарных (на основе белкового и липосахаридного сенситинов) и латексного диагностикумов для выявления специфических антител.

2. Получение МИБП на основе магноиммуносорбентов и использование их в экспресс-методах диагностики и индикации возбудителя бруцеллеза.

3. Результаты изучения диагностической ценности бруцеллезной антигенной магноиммуносорбентной тест-системы в методах непрямого иммуноанализа ИФА и КИФА, бруцеллезных антигенных эритроцитарных и суспензионных диагностикумов в лабораторных и клинических испытаниях при исследовании сывороток крови с целью обнаружения специфических антител.

4. Разработанные условия сочетанных методов: предварительное селективное концентрирование инфекционного агента на магноиммуносорбенте с последующей его детекцией в ПЦР - анализе и индикация возбудителя бруцеллеза в ХЛИА с предварительным избирательным концентрированием на магноиммуносорбенте.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Основные результаты диссертационной работы были представлены и доложены на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МОРФ (Киров, 30 ноября-1 декабря, 1998 г.); научной конференции общества молодых ученых и специалистов СтавНИПЧИ (Ставрополь, 18 марта, 1999 г.); I Всесоюзного научно- практической конференции (Саратов, 21-22 ноября, 2000 г.); международной научно-практической конференции "Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы", посвященной 10-летию Суверенитета Республики Казахстан и 50 -летию Талдыкарганской ПЧС (Талдыкарг, 1-2 августа, 2001 г.); межлабораторной научной конференции СтавНИПЧИ (3 октября, 2002 г.).

Основные результаты диссертации отражены в 13 научных публикациях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающий 202 отечественных и 160 зарубежных источников. Она изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 14 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Касторная, Маргарита Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Разработан высокочувствительный бруцеллезный эритроцитар-ный антигенный диагностикум для выявления специфических антител, при этом показана возможность использования в качестве сенситина с равным успехом как комплексного водорастворимого белкового антигена, так и ли-пополисахарида.

2. Разработан эффективный суспензионный антигенный диагностикум для реакции агглютинации на основе окрашенной полиакролеиновой матрицы и бруцеллезного комплексного белкового водорастворимого антигена.

3. Впервые сконструирована магноиммуносорбентная антигенная тест-система для диагностики бруцеллеза в экспрессных методах иммуноа-нализов: иммуноферментном и количественной иммунофлюоресценции.

4. Показана возможность и подобраны условия сочетанного применения избирательного концентрирования возбудителей бруцеллеза на магноиммуносорбенте с последующей детекцией патогена в ПЦР-анализе, что позволило повысить чувствительность метода в несколько раз и сократить время проведения анализа до 3-х часов.

5. Отработаны условия сочетанного применения предварительного селективного концентрирования возбудителей бруцеллеза на магноиммуносорбенте с последующим проведением хемилюминесцентного анализа, что впервые позволило привлекать ХЛИА для исследования объектов внешней среды, при этом разрешающая способность метода составляет от 10 до 100 и выше мк.кл. в пробе.

6. Лабораторные и клинические испытания полученных бруцеллезных диагностикумов подтвердили их высокую чувствительность, специфичность, информативность, что расширяет возможности и арсенал лабораторных средств диагностики бруцеллеза и индикации его возбудителей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бруцеллез- это медико-ветеринарная проблема, связанная с тем, что во всем мире до сих пор отмечается рост заболеваемости бруцеллезом. В России проблема бруцеллеза стоит достаточно остро, так как заболевания людей и животных регистрируются ежегодно практически на всех её административных территориях (Воробьев, Черкасский, Степанов, 1997; Голубин-ский, Марамович, 1998; Онищенко, 2001; Handa, Singh, Sing et al., 1998; Cerri, Ebani, Pedrini et al., 1999 и др.)

В связи с этим, возникает необходимость повышения качества выполнения и усиления всех этапов комплекса противобруцеллезных мероприятий, где лабораторная диагностика занимает одну из ключевых позиций. Поэтому совершенствование имеющихся МИБП, разработка новых бруцеллезных диагностикумов и методов, повышающих их чувствительность и специфичность, несомненно актуальны.

До сих пор традиционно используются простые, достаточно чувствительные, не требующие применения специальной аппаратуры и поэтому общедоступные серологические тесты и, в частности, РНГА. Причем, подходы к их изготовлению отличаются большим разнообразием. При отработке условий и параметров изготовления эритроцитарного антигенного бруцеллезного диагностикума необходимо было решить ряд задач: выбрать специфичный лиганд и подобрать эффективную методику его извлечения из микробной клетки; отработать условия формалинизации эритроцитов барана; подобрать условия сенсибилизации эритроцитов специфичным бруцеллезным антигеном; отработать условия его стабилизации. Комплексный водорастворимый белковый антиген изолировали водно-солевой экстракцией в сочетании с ультразвуковой дезинтеграцией, используя биомассы вакцинных штаммов В.abortus 19, B.suis 61, B.melitensis Rev-1. Кроме водорастворимых комплексов бруцелл, в качестве сенситина использовали специфический ЛПС, извлеченный из микробных клеток S-форм бруцелл воднофенольной экстракцией по модифицированному методу E.Moreno et al. (1974). Антигены иммобилизовали на поверхности эритроцитов барана, формалинизированных по методу Чизмена в модификации М.И.Леви с со-авт. (1962), при этом активацию их поверхности проводили 2% раствором вторичного алкилсульфата натрия. Оптимальная нагрузка белкового лиганда равнялась 200 мкг/мл, а ЛПС - 100 мкг/мл при следующих условиях конъюгации: концентрация эритроцитов 20%; температура их связывания с сенси-тином 45° С; рН раствора - 6,0 в течение 18 часов.

Для длительного сохранения исходных свойств и увеличения срока годности отработаны режимы лиофильного высушивания бруцеллезных эритроцитарных антигенных диагностикумов. При контроле полученных серий диагностикумов титры специфических антител в РИГА достигали 1: 10 240-1: 20 480 при нагрузке водорастворимым белковым лигандом, а при сенсибилизации ЛПС - не менее 1: 20 480. При изучении специфичности на коммерческих гетерологичных агглютинирующих сыворотках перекрестных реакций не наблюдалось. Таким образом, антигенные эритроци-тарные препараты с обоими сенситинами пригодны для лабораторной диагностики бруцеллеза. На диагностикумы составлена нормативная документация (регламент производства, фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению), утвержденная директором и одобренная Ученым Советом СтавНИПЧИ (протокол № 11 от 28.10.1998 г.). ОБТК проведены лабораторные испытания экспериментальных серий препаратов, которые подтвердили соответствие их требованиям нормативной документации и общим медико-биологическим требованиям к эритроцитарным диагностикумам. Диагностическая ценность диагностикумов подтверждена клиническими испытаниями при исследовании сывороток крови женщин из роддома г. Ставрополя (акт испытаний от 20.12.2000 г.).

Латексные микроносители обеспечивают более воспроизводимые результаты по сравнению с эритроцитарными и могут с успехом их заменять в реакции гемагглютинации в связи с тем, что химические свойства полимерных микросфер относительно постоянны и поддаются более легкой и точной характеристике по сравнению с поверхностными свойствами наружной мембраны эритроцитов (Лукин, 1986; Воробьева, Фокина, 1992; Matsumoto, Ishikawa et al., 1993; Young, Moyesctal, 1998).

Для изготовления суспензионного бруцеллезного антигенного диагностикума нами разработана биотехнологическая схема, включающая выделение комплексного белкового водорастворимого антигена, получение окрашенной полиакролеиновой матрицы, иммобилизацию антигена на поверхности латекса, лиофилизацию диагностикума.

Изучение чувствительности и специфичности 15 экспериментально-производственных серий диагностикума при постановке РАЛ на стекле (качественный тест) и титровании 1326 сывороток крови от людей в микропланшетах (количественный тест) свидетельствовало о равноценности эрит-роцитарному антигенному бруцеллезному диагностикуму и возможности применения в практическом здравоохранении, особенно при проведении массовых обследований на бруцеллез.

Новые возможности в диагностике инфекционных заболеваний вносят иммуносорбционные методы, особое место среди которых занимают аффинные сорбенты с магнитными свойствами. Используя принцип получения биотехнологических композиционных МИС на основе алюмосиликата, мы изготовили бруцеллезные антигенные композиционные магноиммуносор-бенты на основе кремнезема-алюмосиликата (КМИС).

Технология получения магноиммуносорбента на основе алюмосиликата включает 8 стадий. На I стадии получали гидрогель из алюмосиликата А120з х 3SiO 2 х nH20 и компонентов синтеза (Fe 2O3, полиглюкин); на II стадии происходило созревание композиционного гидрогеля; на III стадии путем термообработки из гидрогеля получали ксерогель; на IV стадии производили размельчение ксерогеля механическим путем; на V стадии получали методом рассева высокодисперсные фракции сорбента; на VI - проводили химическое модифицирование сорбента активными группами (метод окисления с помощью вторичного алкилсульфата натрия); на VII стадии -ковалентное присоединение лиганда (бруцеллезный комплексный водорастворимый антиген); VIII стадия- лиофилизация.

В итоге был получен магноиммуносорбент, представляющий собой высоко дисперсные микрогранулы размером от 70 до 150 мкм, неправильной формы, обладающие магнитными свойствами, хорошей смачиваемостью, отсутствием склонности к конгломерации, с повышенной специфической емкостью, характеризующейся механической, химической и микробиологической устойчивостью, а также способностью к лиофилизации с сохранением при этом специфической биологической активности.

Изготовлено 18 экспериментальных серий алюмосиликатных бруцеллезных антигенных магноиммуносорбентов, которые были проверены на активность и специфичность в методах иммуноанализов: непрямом иммуно-ферментном и количественном иммунофлюоресцентном.

Диагностическая ценность разработанного антигенного композиционного МИС была подтверждена при исследовании 1326 сывороток беременных женщин, поступивших в палату патологии, на роды, у здоровых беременных и с отягощенным акушерским анамнезом (самопроизвольными выкидышами на ранних и поздних сроках, с замершей беременностью, уродством плода, преждевременными родами, многоводием, преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты, хронической внутриутробной гипоксией плода) на базе клинической лаборатории Ставропольского родильного дома.

Параллельно эти же сыворотки исследовались в непрямом ИФА и НРИФ без применения КМИС.

При исследовании сывороток крови показано преимущество использования композиционных антигенных КМИС в ИФА, которое выразилось в увеличении положительных результатов на 0,22 % от общего количества исследованных сывороток и на 21,5 % от общего количества положительно реагирующих сывороток (при разведении сывороток 1:200) при сравнении с результатами исследования этих же сывороток в непрямом ИФА без использования КМИС.

При исследовании эффективности и чувствительности разработанных КМИС в КИФА показано преимущество данного теста на 0,23% от общего количества исследованных сывороток и на 14, 3% от общего количества положительно реагирующих сывороток (в разведении 1:200) по сравнению с РНИФ.

Таким образом, при использовании антигенных бруцеллезных магно-иммуносорбентных тест-систем дополнительно были выявлены 14 женщин с положительными реакциями на бруцеллез. В последующем у них была определена положительная аллергическая реакция и при детальном клиническом обследовании поставлен диагноз: "бруцеллез".

Были проведены повторные исследования положительно реагирующих сывороток крови, взятых спустя 2 недели после первого исследования в этих же методах. При этом отмечено подтверждение ранее полученных результатов без нарастания титров антител, что свидетельствовало об отсутствии динамики процесса.

В результате проведенных исследований отмечено, что при помощи методов иммуноанализов - непрямого ИФА и количественного иммуноф-люоресцентного анализа (КИФА) с использованием бруцеллезного антигенного КМИС выявлены положительные сыворотки крови с более высокими титрами специфических антител, чем в традиционных методах иммуноа-нализа (непрямого ИФА и РНИФ).

Это свидетельствует о более высокой разрешающей способности методов иммуноанализов с применением КМИС, что выражается в повышении их чувствительности и информативности, а также перспективности использования в диагностике бруцеллезной инфекции. На основе полученных результатов оформлены методические рекомендации: "Использование бруцеллезных антигенных МИС тест-систем в методах иммуноанализа непрямом ИФА и КИФА", утвержденные директором и одобренные Ученым Советом СтавНИПЧИ (протокол № 5 от 21.05.2001 г.).

Способность магноиммуносорбентов прочно (на уровне реакций антиген-антитело) фиксировать на своей поверхности искомый антиген дает возможность исследовать широкий диапазон проб, в том числе и сильно загрязненных, и их объемов (от нескольких сот микролитров до многих кубических метров жидкостей), осуществлять тщательную отмывку пробы от загрязнений, мешающих проведению индикационных реакций, тем самым, повышая достоверность как положительных, так и отрицательных результатов.

Для дальнейшего совершенствования экспрессных методов индикации возбудителей бруцеллеза мы объединили метод предварительного концентрирования искомого патогена на КМИС с последующей детекцией его в полимеразной цепной реакции и хемилюминесцентном иммунном анализе.

В основе ПЦР лежит амплификация участка генома путем многократного копирования специфической для данного микроорганизма нуклеотид-ной последовательности с последующей визуализацией фрагментов ДНК в электрофорезе.

Хемилюминесцентная реакция является разновидностью люминесценции. Хемилюминесцентными называют химические реакции, при которых вещества переходят в возбужденное состояние, а затем высвобождают накопленную энергию в виде эмиссии света. Применительно к микробиологическим исследованиям один из компонентов специфической реакции "антиген-антитело" коньюгируют (метят) маркером, участвующем в последующем в реакции хемилюминесценции, которую регистрируют любыми приборами, чувствительными к эмиссии видимого света, используя для этого сцинтилляционные счетчики или люминометры.

При отработке условий сочетанного метода: КМИС + ПЦР эксперименты проводили с чистыми культурами бруцеллезного микроба В.abortus 19 и в модельных опытах на почве и фураже, контаминированных вирулентным штаммом Br.abortus 544. Из культуры Br. abortus 19, выращенной при температуре 37° С, готовили по 500 мл суспензий с концентрациями lx 101; 1х 102; 2х 102; 5х 102; 8х 102; 1х 103мк. кл. в этом объеме пробы, в которые вносили по 1 мл взвеси клеток гетерологичных штаммов (Fr.tularensis, Y.enterocolitica, E.coli) в концентрации lx 109 мк.кл./мл. Пробы пропускали самотеком через специальную проточную магнитную ловушку с фиксированным бруцеллезным КМИС. После контакта с пробой и тщательной отмывки физиологическим раствором для лизиса клеток и их стерилизации иммуносорбент прогревали на водяной бане при температуре 100° С в течение 30 мин. Аликвоту в 5 мкл исследовали в ПЦР, используя тест- систему "Ниармедик" (Россия), включающую праймеры 1 и 2. Амплификацию осуществляли с использованием амплификаторов Gene Amp PSR System 2400 фирмы "Perkin Elmer" и PCT Minicycler "M.J. Research" (США).

В качестве положительных контролей были использованы образцы ДНК возбудителя бруцеллеза.

Параллельно исследуемые пробы подвергали ПЦР - анализу без пред-варительнрго концентрирования на МИС с использованием вышеназванной тест-системы.

Положительные результаты получены при обоих вариантах постановки, однако, в ПЦР без КМИС этот показатель составил - 2х 10 мк.кл. в 1 мл, у а при постановке ПЦР с КМИС - 1х 10 м.к. в объёме пробы, что повысило чувствительность анализа на несколько порядков.

В модельных опытах на почве и фураже, контаминированных ви

1 2 2 рулентным штаммом В.abortus 544 концентрациях 1х 10 ; 1 х 10 ; 2х 10 ;

5х 102; 8х 102; lx 103 mk.kji. в объёме пробы, после концентрирования на КМИС и проведения ПЦР-анализа получены идентичные результаты.

При подборе условий сочетанного метода: КМИС+ХЛИА были использованы бруцеллезные магноиммуносорбенты, выявляющие возбудитель бруцеллеза в S-форме, соответствующие бруцеллезные иммуноперок-сидазные коньюгаты в разведении 1:200, бруцеллезные корпускулярные антигены Br.abortus 544, Br.melitensis 16-М, Br.suis 1330 в разведениях I х 109 - 1 х 101 мк. кл. в объёме пробы, водорастворимые антигены Br.abortus 544, Br.melitensis 16-М, Br.suis 1330 в разведениях 0,05 - 20 нг/мл, а так же корпускулярные антигены гетерологичных штаммов Fr.tularensis Schu, Y.enterocolitica 383, E.coli 010 в разведениях 1 х 109мк/мл. Опыты проводили как на чистых культурах, так и в модельных опытах, как описано выше. Пробы также пропускали через проточную магнитную ловушку. Чувствительность бруцеллезных КМИС, выявляющих возбудитель бруцеллеза в ХЛИА, составила 1 х 102 - 1 хЮ1 мк.кл. в пробе для корпускулярных антигенов и 0,1 нг/мл - для водорастворимых, при этом воспроизводимость опытов составила 100%.

Таким образом, проведенные эксперименты по сочетанному применению предварительного концентрирования возбудителей бруцеллеза на аффинных сорбентах с магнитными свойствами и последующей детекцией патогена в ПЦР-анализе и ХЛИА убедительно показали возможность обнаружения от 100 до 10 мк.кл. в исследуемом объеме пробы, в том числе и сильно загрязненной, что свидетельствует о значительном (на несколько порядков) повышении чувствительности названных методов. При этом нами впервые ХЛИА был успешно привлечен для исследования объектов внешней среды в условиях эксперимента.

Новизна проведенных разработок и полученных положительных результатов подтверждены патентами: "Способ индикации микроорганизмов". Патент № 21 65081 РФ, С27 G01 № 33/53, заяв. 05.01.99., опубл. 10.04.2001,

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Касторная, Маргарита Николаевна, 2003 год

1. Абусуева А.С., Арбулиева Е.У., Хаиров С.Г. Сравнительная оценка различных диагностикумов в РПГА при бруцеллезе //ЖМЭИ. 1999. -N4.-C. 98-100.

2. Аграновская Е.Н., Карпенкова Н.И. Вопросы прикладной иммунологии. -Л. 1967,- С.144-146.

3. Айманова О.Я. Усовершенствование методов производства эритроцитарных препаратов для диагностики особо опасных инфекций: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов. -1986.

4. Алтухов А.А., Бекетов Б.И., Шамардин В.А., Руль Н.В., Тугам-баев Т.Н. Ускоренный метод обнаружения бруцелл //Там же. С. 103.

5. Афанасьев Е.Н. Сравнительная характеристика антигенной структуры бактерий рода Brucella: Дис.канд. мед. наук. Ставрополь, 1983.- 173 С.

6. Афанасьев Е.Н., Таран И.Ф., Тюменцева И.С. Антигенная структура бруцелл. Сообщение III. Иммуноферментный анализ водорастворимых антигенов бруцелл. Деп. в ВИНИТИ 12.09.86 г. - N 6637,- В. - 1986 б.

7. Афанасьев Е.Н., Таран И.Ф., Тюменцева И.С. Антигенная структура бруцелл. Сообщение V. Изучение антигенных взаимосвязей бруцелл методом непрямой реакции иммунофлюоресценции. Деп. в ВИНИТИ 12.09.86 г. - N 6635. -В. - 1986 г.

8. Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Касторная М.Н. К вопросу диагностики возбудителя бруцеллеза //Эрдэм шинжилгээний бутээл. -Улаанбаатор, 1999. № 7. - С. 229-231.

9. Афанасьев Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. . докт. мед. наук. Ростов, 2000. -45 с.

10. Ахмедов А.Н., Рыбкин B.C., Тихонов В.Г., Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. Информативность ИФА при поисках антигенов бруцелл //ООИ на Кавказе: Тезисы докл. VI краевой науч. конфер., посвящ. 70- летию ВОСР. -Ставрополь, 1987,- С.2 4- 26.

11. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

12. Базиков И.А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов диагностики сифилиса: Дис. .докт. мед. наук. Ставрополь, 2000. - 200 с.

13. Балахонов С.В., Шестопалов М.Ю., Калиновский А.И., Голу-бинский Е.П. Опыт использования ПЦР в диагностике бруцеллеза и холеры //Эрдэм шинжилгээний бутээл. Улаанбаатор, 1999. - № 7. - С. 175-183.

14. Белозеров B.C. Бруцеллез. Ленинград. - 1985. - 183 с.

15. Бельская Н.А., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификации белков бактерий //Материалы СевероКавказской биохим. конф. Махачкала, 1970. - С.270-271.

16. Бельская Н.А., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификация белков //Лаб. дело. 1972. - № 10. - С.514-616.

17. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии М,- 1961.- С.57-87.

18. Богомаз В. И. Синтез, свойства и применение новых видов модифицированных кремнеземов: Автореф. дисс. . канд. хим. наук. Киев, 1982 .-С. 21.

19. Брыкалов А.В. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине //Матер, конф. химиков Сев. Кавказа Нальчик, 1991,- С. 185-186.

20. Брыкалов А.В. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной сорбции и иммобилизации: Дисс. . докт. химич. наук. Санкт-Петербург, 1993,- 330 с.

21. Быкова О.И., Алексеев В.В. Количественная иммунофлюорес-ценция. Аспекты практического применения //ЖМЭИ,- 1986. № 5. - С. 9499.

22. Вейблант В.И., Павлова Ю.П. Применение реакции агломерации ализариновых суспензионных антител для количественного определения фракции I //Проблемы ООИ. Саратов, 1969. - № 4. - С. 51-53.

23. Вейнблат В.И., Вельская Н.А., Митина B.C. Белковый и антигенный состав фракций, выделенных осаждением сульфатом аммония из экстрактов чумного микроба штамма ЕВ //Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1971. - Вып. 5 (22). - С. 120-123.

24. Вейнблат В.И., Бельская Н.А., Митина B.C. Белковый и антигенный состав фракций, выделенных осаждением сульфатом аммония из экстрактов чумного микроба штамма ЕВ //Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1971. - Вып. 5 (22). - С. 120-123.

25. Вершилова П.А. Бруцеллез //Общая и частная эпидемиология. Т. 1. Общая эпидемиология и эпидемиология кишечных инфекций. М.: Медицина, 1973. - С.378-402.

26. Вершилова П.А., Голубева А.А., Кайтмазова Е.И., Островская Н.Н., Ходжаев Ш.Х., Чернышева М.И. Лабораторная диагностика бруцеллеза //Бруцеллез М.: Медицина. - С.225.

27. Вершилова П.А., Голубева А.А. Эпидемиология бруцеллеза //Бруцеллез. -М.: Медицина, 1972. -С.319-347.

28. Воробьев А.А., Черкасский Б.Л., Степанов А.В. и др. Актуальные проблемы борьбы с особо опасными инфекциями //Междунар. симп. "00 инфекц. заболевания: эпидемиол., экспресс-диагност, и профилакт.": Докл., 16-20 июня 1997. Киров, 1997. - С.243-257.

29. Воробьева З.Г., Фокина Е.Н. Экспериментальные основы реакции латекс-агглютинации (обзор литературы) //Клинич. и лаборатор. диагност. 1999,- № 5. - С.54-56.

30. Выглежанина Е.С., Кузьмина В.Б., Астахова Т.С., Богаутдинов З.Ф., Ниязов У.Э., Шумилов К.В. Изучение возможности применения ИФА для дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсинеоза //Клинич. лаборатор. диагност. 1999. - № 12. - С.13-14.

31. Гавенский С.Д., Ефременко В.И., Климова И.М., Пушкарь В.Г., Перов В.Ю. Бактериологический метод определения концентрирующей способности магнитных иммуносорбентов //Сборн. научн. работ. Волгоград, 1989. - Вып. 4 - С.23-27.

32. Гавенский С.Д., Пушкарь В.Г. Жизнеспособность микроорганизмов в магнитных иммуносорбентах //Актуал. вопр. профилакт. 00 и др. инфекц. заболеваний Ставрополь, 1995,- С. 115.

33. Гайда А.В., Староверов С.М. Модифицированные кремнеземные носители в биотехнологии //Журн. Всесоюзн. химич. общества им. Д.И. Менделеева, 1989. Т.34,- № 3,- С. 350-361.

34. Гайдамович С.Я., Клисенко Г.А., Шаноян Н.К. Реакция агглютинации сенсибилизированных антителами эритроцитов вирусом колорадской клещевой лихорадки //Вопросы вирусол.- 1974. № 2. - С.169.

35. Гайдара Б. Г., Желудков М. М.,Чернышева М. М. Оценка эффективности методов лабораторной диагностики бруцеллеза //ЖМЭИ,-1984.-№4.- С. 54 58.

36. Голубев Л.Г., Сажин Б.Е., Валашек Е.Р. Сушка в химико-фармацевтической промышленности М.- 1978.- С. 18-50.

37. Горелов В.Н., Селютина Д.Ф., Кулаков Ю.К., Скавронская А.Г. Разработка методов генетического анализа бруцелл //Там же. С. 80-81.

38. Греков Л.И., Владимерцева И.В., Ефременко В.И. Способ получения сорбента: А. С. N 1643073 от 22.12.90.

39. Григорьева Г.И. Мембраны и мембранные белки в сравнительной характеристике стафилококков. Автореф. дисс. . канд. биолог, наук. -Пущино, 1980,- 19 с.

40. Губина Е. А., Желудков М. М., Дьяков С. И., Лебедева И.К., Толмачева Т.А. Иммунофлюоресцентный экспресс-метод определения ан-тибиотикочувствительности бруцелл //Антибиотики и химиотерапия.-1989. № 2 . - С.107.

41. Губина Е.А., Маликов В.Е. Некоторые проблемы эпидемиологии и профилактики бруцеллеза в СССР //Актуал. вопр. профилакт. бруцеллеза и организ. мед. помощи больным: Тез. докл. Всесоюзн. конфер. Новосибирск (24-25 октября 1989 г.) Москва, 1989 . - С. 5.

42. Дентовская С.В., Гаранина С.Б., Щербакова С.А., Миронова Н.И., Куличенко А.Н. Применение ПЦР и ИФА для диагностики хронического у людей //Карантин, и зооноз. инфекц. в Казахстане.- Алматы,1999. -Вып. 1.-С. 193-195.

43. Дентовская С.В., Куличенко А.Н. Использование молекулярно-генетических подходов для лабораторной диагностики бруцеллеза //Проблемы ООИ,- Саратов, 1999. С. 3- 11.

44. Ермаченко В.А., Григорьева Г.И., Джемухадзе Г.К., Харатьян Е.Ф., Дегтярева Г.К., Лукоянова М.А., Рудзит Э.А. Получение мембран стафилококков и их ферментативная и белковая характеристика.- Москва, 1978,- С.74.

45. Ерохин Е.П. Метод пассивной агглютинации полимерных дисперсий для диагностики легионеллеза //ЖМЭИ. 1991.- № 11.- С. 41-43.

46. Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., Перов В.Ю. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов//ЖМЭИ,- 1989. -№ 12. С. 100-105.

47. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Хорошенький А.Г., Бинатова В.В., Климова И.М., Пушкарь В.Г. Способ получения МИС: Патент N 5040754 РФ, А в/к 39/385 с.12. N 11/00//01, заявл. 29.04.92. опубл. 7.06.95.

48. Ефременко В. И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. Ставрополь, 1996. - 130 с.

49. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней //ЖМЭИ. № 2. - 1997. - С. 102 - 106.

50. Жарникова И.В. Разработка технологии композиционных магноиммуносорбентов и конструирование их на основе диагностических тест-систем для иммуноанализа возбудителей чумы и туляремии: Дис. . канд. биолог, наук. Ставрополь, 1995. - 149 с.

51. Желудков М.М. Перспективы совершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза //Актуал. вопр. профилакт. бруцеллеза и орга-низ. мед. помощи больным: Тез. докл. Всесоюзн. конфер.- Новосибирск (24-25 октября 1989 г.) Москва, 1989. - С. 91.

52. Желудков М.М., Павлова И.П., Курманова К.Б., Полыцикова Н.Н., Перекопский И.С. Определение специфических циркулирующих в крови иммунных комплексов при бруцеллезной инфекции //Там же,- С. 105.

53. Желудков М.М., Павлова И.П., Умнова Н.С., Курманова К.Б., Сулейманов А.К., Перекопский И.С. Использование иммуноферментного анализа для выявления бруцеллезных антител разных классов //Там же С. 107-109.

54. Желудков М.М., Маликов В.Е., Драновская Е.А. Совершенствование ИФА для диагностики бруцеллезной инфекции //Актуал. вопр. профилакт. 00 и др. инфекц. заболев. Ставрополь, 1995. - С. 149.

55. Желудков М.М., Кулаков Ю.К. Использование в иммунофер-ментном анализе белковых антигенов бруцелл, синтезированных в клетках Escherichia coli //ЖМЭИ. 1998. - № 5. - С. 74 -77.

56. Казахстан и 50-летию Талдыкорганской ПЧС (г. Талдыкарган, 1-2 августа, 2001 г.). Вып.З. - Алматы, 2001. - С. 25- 29.

57. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Обнаружение антигенов бруцелл с помощью частиц коллоидных металлов в качестве маркеров специфических антител //ЖМЭИ. 2001. - № 3. -С.65-69.

58. Зайцев А.А. Сравнительные аспекты применения иммуноглобу-линовых тест-систем на основе моноклональных антител для серодиагностики возбудителя чумы в природных очагах Кавказа: дисс. . канд. мед. наук. Ставрополь, 1990. - 199 с.

59. Закарян С.Б., Цирельсон JI.E., Бекетов Б.И., Салов В.Д. Эффективность клинико-лабораторных методов диагностики хронического бруцеллеза //Карантин, и зооноз. инфекции в Казахстане. Алматы,1999. -Вып. 1,-С. 71-74.

60. Закревский В.И. Иммуносорбенты и их применение в иммунологии микроорганизмов //ЖМЭИ. 1980. - № 4. - С. 9-15.

61. Закревский В.И., Ефременко В.И., Фабер С.М. Приготовление и применение иммуносорбентов для изучения антигенного состава микроорганизмов I и II группы: Методич. рекоменд. Волгоград, 1982,- Ч. 2. - С. 9.

62. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций. Саратов, 1993. - 109 с.

63. Зыкин Л.Ф. Иммуноферментный анализ при экспертизе некоторых зоонозов //Матер. VII съезда Всеросс. общества эпидемиол., микро-биол., паразитол. Москва, 1997. - Т. 1. - С. 442.

64. Иванов Ю.В., Коровкин С.А. Флюоресценция с временным разрешением и ее применение для диагностики ООИ //Матер. VII съезда Все-росс. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. Москва, 1997. - Т. 1. -С. 442.

65. Иванова М.Р., Дзамихова А.А., Хамукаева 3.3. Некоторые кли-нико-лабораторные особенности течения бруцеллеза //Актуал. вопросы ООИ: Матер, регионал. научно-практич. конфер. Нальчик, 2000. - С. 5659.

66. Кальной С.М., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Швецова Н.М., Таран В.И. Повышение эффективности улавливания микроорганизмов из воздуха //Там же. С. 365.

67. Каральник Б.В. Теоретическое обоснование принципов стандартизации эритроцитарных диагностикумов. В кн.: Матер, межинстит. Науч. конфер. Памяти Л.А. Тарасевича. - М., 1967 в. - С. 225.

68. Каральник Б.В. О выявлении инфицированности по реакциям с эритроцитарными диагностиками //Эритроцитарные диагностикумы. Москва, "Медицина", 1976. - С. 127.

69. Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А. Эритроцитарные белковые диагностикумы. Изд-во "Наука", 1982. - Алма-Ата, 1982. -148 с.

70. Касторная М.Н., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С. Бруцеллез. Лабораторная диагностика. (Обзор литературы).- Деп. в ВИНИТИ 21.08.00. N 2887-ВОО.

71. Касторная М.Н., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Ефременко

72. Коваленко А. А. Разработка хемилюминесцентного анализа для иммунодиагностики сибирской язвы: Автореф. . дис. канд. биол. наук. -Саратов, 1992. 16 с.

73. Кулаков Ю.К., Желудков М.М. Молекулярные основы вирулентности бруцелл //Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол. 2001,- № 4.-С. 8-12.

74. Леви М.И., Басова Н.Н., Сучков Ю.Г. и др. Реакция пассивной гемагглютинации в реакции нейтрализации антител при некоторых инфекциях //ЖМЭИ,- 1962,- № 10,- С. 40- 45.

75. Левкин С.В. Диагностика и оценка эффективности лечения системной красной волчанки с помощью иммобилизованных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами: Дис. . канд. мед. наук. Волгоград. - 1991. - 246 с.

76. Лефковитс И., Пернис Б. В кн.: Иммунологические методы исследований. Москва, изд. "Мир", 1988. - 528 С.

77. Лопотко Д.О., Жаров В.П., Романовская Т.Р., Кугинский Г.С. Исследование влияния фотодинамического эффекта на микроорганизмы методом лазерной термооптической цитометрии //Квантовая электроника. -Москва, 1999. 29, № 3. - С. 221-226.

78. Луканина Л.М., Лямкин Г.И. Особенности технологии изготовления бруцеллезного антигенного эритроцитарного диагностикумажидкого) //Актуал. вопр. профил. чумы и др. инфекц. заболев. -Ставрополь, 1994. -С. 194.

79. Луканина Л.М., Лямкин Г.И. Сравнительная характеристика чувствительности бруцеллезных антигенных эритроцитарных диагностикумов //Там же. С. 195.

80. Лукин Ю.В., Бахарев В.Н., Заиченко и др., Полиакролеиновые латексы: синтез, введение наполнителей и механизмы формированиф. -доклад АН СССР.- 1985.-Т. 285.-№ 1 .-С. 159-161.

81. Лукин Ю.В., Трифонов В.Д., Туркин С.И., Зубов В.П. Полиакролеиновые латесы в качестве иммунореагентов // Тр. МХТИ. 1985. -Вып. 185.-С. 88-92.

82. Мананков В.В., Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т., Напалкова И.М. Усовершенствование ТИФА на основе авидин-биотиновой системы для лабораторной диагностики бактериальных ООИ //Генетика и биохимия виру-лент. возбуд. ООИ. Волгоград, 1992. - С. 161.

83. Меньшов П.И., Шмутер М.Ф. Формалинизация эритроцитов с помощью мешалки //Проблемы ООИ.- Саратов, 1969,- № 5,- С.202-203.

84. Меньшов П.И., Шмутер М.Ф. Подбор оптимальных методов формалинизации эритроцитов для приготовления стойких эритроцитарных диагностикумов для чумы и бруцеллеза //Проблемы ООИ. Саратов, 1969.-№ 6 - С.231.

85. Мешкова Л.Ю., Рыбкин B.C., Яковлева А.Т., Лобанов А.Н., Шедерикина А.Я. Хемилюминесцентный иммуноанализ в ранней диагностике сапа и мелиоидоза //Там же. С. 165.

86. Михайлов Л.М., Титенко A.M. К вопросу получения и использования моноклональных антител антигенов бруцелл //Матер, научно -практич. конфер., посвящ. 100-летию образов. Противочумн. службы России (16 -18 сентября 1997 г.) Т. 2. - С. 196.

87. Михайлов Л.М., Титенко A.M., Захлебная О.Д. Получение гибридом к поверхностным антигенам бруцелл и их специфичность //Актуал. пробл. профилакт. 00 и природно-очаговых инфекц. болезней. Иркутск, 1994,- С. 111-112.

88. Нго Т.Т., Ленхофф Г.М. В кн.: Иммуноферментный анализ. -Москва, 1988. 626 С.

89. Нифантьев В.М., Шуанова Р.Ж. Пути усовершенствования диагностики бруцеллеза //Актуал. вопр. проф-ки бруцеллеза и организ. мед. помощи больным: Тез. докл. Всесоюзн. конфер. Новосибирск (24 25 октября 1989 г.) - Москва, 1989. - С. 93.

90. Оловников А.М. Агрегат гемагглютинационная проба на анти-эритроцитарные антитела //Бюл. экспер. медиц. - 1975. № 9,- С.61.

91. Онищенко Г.Г. Об эпидемиологической ситуации и заболеваемости природно-очаговыми инфекциями в Российской Федерации и мерах по их профилактике //ЖМЭИ. 2001,- № 3,- С. 22-28.

92. Опалейчук И. С., Умнова Н. С., Желудков М. М., Павлова И. П. Использование реакции агглютинации латекса для диагностики бруцеллезной инфекции //ЖМЭИ. -1991. № 7. - С. 61.

93. Панова Л.Д., Мансурова Р.Ф. Современные аспекты бруцеллеза беременных и новорожденных детей //Здравоохранение Башкорстана. -1998.-№ 3-4.-С. 111-115.

94. Пантелеев О.А., Ванеева Л.И. Непрямой твердофазный метод иммуноферментного анализа, его точность и источники погрешности //ЖМЭИ. 1986,- № 3. - С. 95.

95. Подзолкова Г.Г., Климова ИМ., Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Быкова О.И., Ярулин Р.Г. Применение количественной иммунофлюорес-ценции для определения адсорбционной способности магнитных иммуно-сорбентов //ЖМЭИ. 1988. -№ 5. - С. 56-58.

96. Покровский В.И., Голубинский И.П. В кн.: Иммуноферментный анализ и его применение при инфекционной патологии. - Москва, 1986. - 549 С.

97. Покровский В.И., Филатов Н.Н., Шаханина И.Л., Брико Н.И. Методология эпидемиологического надзора и социально-гигиенического мониторинга //Эпидемиол. и инфекц. болезни. 2001. - № 2,- С.4-7.

98. Практическая химия белка: М: Мир, 1989. - С.300-301.

99. Пшеничная Л.П., Тукачинский С.Е. влияние частичной модификации сывороточного альбумина на его конформацию и комплексообра-зующую активность //ЖМЭИ,- 1977. № 3. - С. 115.

100. Ртищева Л.В., Гнутов И.Н. Состояние сосудисто-тканевой проницаемости у больных бруцеллезом //Современ. аспекты природн. очаговости, эпидемиол. и проф-ки ОО инфекц. заболев. Ставрополь, 1993. -С.350-351.

101. Рыбкина Р.А., Яковлев А.Т. Возможности использования хеми-люминесцентного анализа в диагностике КУ риккетсиоза // Эпидемиолог, и клинико-иммунолог. аспекты профилакт. важнейших инфекц. заболеваний: Матер, конференции. - Астрахань, 1996. - С. 127.

102. Рыбкин B.C., Тихонов Н.Г., Жуков А.Н. Совершенствование эпиднадзора по бруцеллезу //Эрдэм шинжилгээний бутээл. Улаанбаатор, 1999. -№ 7.-С. 65-68.

103. Сафарян Э.С. Средство для дифференциальной диагностики бруцеллеза и способ его получения: Патент 2104547 Россия, МПК6 G 01 N 33/531 N 96109903/14; Заявл. 28.05.96; Опубл. 10.02.98. Бюл. № 4.

104. Соколова И.А., Лямкин Г.И., Касторная М.Н., Ляпустина Л.В. Способ индикации бруцелл основанный на применении ПЦР //Генная диагностика ООИ: Мат. I Всесоюзного научно- практической конф. (21-22 ноября, 2000 г., Саратов). Саратов, 2000. - С. 40-41.

105. Студенцова В.К., Грушина Т.А. Экспресс-метод серологической диагностики бруцеллеза //Актуал. вопр. профилакт. бруцеллеза и организ. мед. помощи больным: Тез. докл. Всесоюзн. конфер. Новосибирск (24-25 октября 1989 г.) Москва, 1989. - С. 112.

106. Стоев К.Г., Чибисова В.А., Шаханина К.А., Походзей И.В. Новый количественный иммуноферментный метод определения Ig Е с помощью специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа //Журн. иммунолог. 1981. - № 1 - С.85-88.

107. Студенцова В. К., Саттаров А. И., Ременцова М. М., Джубанга-лиев М. У. К использованию макрометодов постановки серологических реакций в диагностике бруцеллеза //Там же. С. 115.

108. Сучков Ю.Г., Конатов Ю.В. Сенсибилизация формалинизиро-ванных эритроцитов иммунными гамма-глобулинами //Журн. микробиол. -1965,-№8.- С. 63.

109. Сызранцев П.И. Простые способы вычисления основных статистических величин //Соц. зерновое хозяйство. 1978. - №3. - С.185-203.

110. Таран И.Ф., Лямкин Г.И. Бруцеллез (микробиология, иммунология, эпидемиология, профилактика). Ставрополь, 1996. - 173 с.

111. Тарусов Б.Н., Поливода А.И., Журавлев А.И. Изучение сверхслабой спонтанной хемилюминесценции животных клеток //Биофизика. -1961. Вып.4. - С. 490-492.

112. Тинкер А.И. Влияние сублимационного (лиофильного) высушивания на штамм ЕВ чумного микроба. Дисс. . доктора мед. наук. -Ставрополь, 1971. С.351.

113. Титенко A.M., Михайлов Л.М., Рудник М.П., Гриднева Г.Л. Суспензионная тест-система на основе моноклональных антител для определения антигенов бруцелл //Актуал. пробл. профилакт. 00 и природно-очаговых инфекц. болезней. Иркутск, 1994,- С. 153.

114. Тупикин Д.В.Телемикрометрический и проточный фотоэлектрический способы регистрации реакций агглютинации: Автореф. дисс. . канд. биолог, наук,- Саратов, 1990,- 19 с.

115. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей 00 и других инфекций: Автореф. дис. . доктор, мед. наук. -Саратов, 1996. -57 с.

116. Урбах В.Ю. Статистические методы в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975. - 296 с.

117. Фикс Л.И. Разработка и апробация реакции латексной агглютинации для экспрес-диагностики стафилококковой инфекции //ЖМЭИ.1995.- №6. -С. 73-74.

118. Филипов В.И., Владимирский М.А., Андросова М. В., Добринский Э.К. Матрица иммуносорбента: Патент 2140084 Россия, МПК6 G 01 № 33/551, G 01 № 33/552 № 98101146//12; Заявл. 12.01.98; Опубл. 20.10.99. Бюл.№ 20.

119. Хазиев Г.З. Профилактика зооантропонозов в Республике Баш-корстан //Сев. Вост. Регион Башкорстана: Актуал. пробл. и пути их решения: Тез. докл. научно-практич. конфер., Уфа - Болыпеустинск, 6-7 июня,1996. Уфа, 1996. - С.308- 310.

120. Цирельсон Л.Е., Салов В.Д., Сыздыков М.С. К проблеме патогенеза современного бруцеллеза //Карантин, и зоонозн. инфекции в Казахстане. Алматы, 1999. - Вып. 1. - С. 140-142.

121. Цыбин Б.П., Таран И.Ф. Оценка диагностических свойств бруцеллезного антигенного эритроцитарного диагностикума //Пробл. ООИ.- Саратов, 1976,- Вып. 6 (52).- С.26-30.

122. Цыбин Б.П. Эритроцитарные диагностикумы и перспективы их использования в диагностике бруцеллеза, холеры и туляремии. Дисс. . канд. мед. наук. Ставрополь, 1974.- С. 180.

123. Шамардин В.А., Каральник Б.В. Способ получения эритроцитарного диагностикума: АС СССР, N 634749 от 11.07.77, Б.И. N44, 1978 б.

124. Шамардин В.А., Каральник Б.В. Способ сенсибилизации эритроцитов: АС СССР, N 614377 от 22.03.76, Б.И. N 25,1978 а.

125. Шамардин В.А., Каральник Б.В. Способ приготовления диагностикума направленного действия: АС № 889 004 А 61 К 39/44. 1981.

126. Шарова И.Н., Плотникова И.А., Самойлова Л.В. Применение ПЦР для обследования групп риска по бруцеллезу //Матер, научно прак-тич. конфер., посвящ. 100-летию образов, противочумн. службы России (16-18 сентября 1997 г.)- т. 2. - Саратов, 1997,- С.237.

127. Шарова И.Н., Куличенко А.Н., Плотникова Е.А., Казакова Е.С., Гусева И.В. Сравнительная оценка ПЦР и бактериологического анализа при экспериментальном бруцеллезе //Пробл. ООИ: Сборн. научн. трудов. Вып. 79. - Саратов: "Слово", 1999. - С. 121-124.

128. Шварцман Я.С., Синицын В.А. Реакция непрямой гемагглюти-нации (обзор литературы) //ЖМЭИ. 1961,- № 9,- С.97-102.

129. Шуб Г.М., Тупикин Д.В., Хотющенко Т.Н., Коломиец В.В. Использование метода телевизионного микроскопического анализа для серодиагностики сальмонеллеза и бруцеллеза //ЖМЭИ. 1996. - № 1,- С. 46.

130. Шуб Г.М. Применение метода телевизионного микрометрического анализа для совершенствования лабораторной диагностики инфекционных заболеваний //Матер съезда Всероссийск. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. -Москва, 1997.- Т. 1.- С. 509.

131. Юдицкая М.Н. Возможность применения латекс-агглютинации для экспресс-диагностики дизентерии //Иммунология. 1991,- № 1. - С.63-64.

132. Яковлев А.Т., Коваленко А.А., Липницкий А.В., Зыкин Л.Ф. и др. Применение хемилюминесцентного иммуноанализа для ускоренной диагностики ООИ //Сборн. научн. работ. Вып. 4,- Волгоград, 1989. - С. 262.

133. Яковлев А.Т., Коваленко А.А. Хемилюминесцентный иммуноа-нализ и его применение в микробиологии //Биотехнол., иммунол. и биохимия ООИ,- Саратов, 1989,- С. 3-9.

134. Яковлев А.Т. ИФА в лабораторной диагностике бактериальных особо опасных инфекций: Автореф. дисс. . доктора мед. наук. Саратов, 1992,- 43 с.

135. Abalos P., Daffner J., Pinochet L. Evaluation of three Brucella soluble antigens used in an indirect Elisa to discriminate S19 vaccinated from naturally infected cattle //Vet.- Microbiol.- 2000,- Vol. 71(1-2).- P.7-161.

136. Afral M.,Tengerdy R.P., Squire P.G., Elis R.P. Characterization of Brusella ovis lipopolysaccharide and its use for diagnosis of ram epididymitis by enzymelinked immunosorbent assay //J. clin. Microbiol.-1984.- v. 20, N 6,-P. 59 -60.

137. Alballa S.R. Epidemiology of human brucellosis in southern Saudi Arabia //J. Trop. Med. Hyg. 1995. -V. 98 (3). -P.185-189.

138. Albrecht В., Solbach W. Moderne methoden der infektionsdiagnostic //Focus MUL. 1999. -16, N 1. -P.31-32, 37-41.

139. Anaokar S., Garry P.J., Standefer J.C. Solid-phase enzyme immunoassay for serum ferritin. //Clin.Chem.- 1979. V.25. - P. 1426-1431.

140. Ansari A.A., Haffikudus, Goshi S.R., Medeira M.A. ELISA silid phase: stability and binding characteristics //J. Immunol. Meth.- 1985. V.84, N 1. -P.117-124.

141. Aphanasev E.N., Tyumentzeva I.S, Kastornaya M.N. Tne problems of brucellosis //ЭРДЭМ Шинжилгээний БУТЭЭЛ, 1999. № 7. - P.229.

142. Asbakk K., Gall D., Stuen S. A. Sceening ELISA for brucellosis in reindeer //Hystochem. J.- 1972,- V.20. N4. -P .321-330.

143. Avrameas S.M., Guesdon J.L. Magnetic del suitable to immunoen-zimatic determination //Patent 4241176 (USA)- 23.12.1980 Int. CI. С 1201/66, C07 G7 /00.

144. Baldi P.C., Wanke M.M., Loza M.E., Fossati C.A. Brucella abortus cytoplasmic proteins used as antigens in an ELISA potentially useful for the diagnosis of canine brucellosis //Vet. Microbiol. 1994. -V. 41(1-2). - P. 127-134.

145. Baldi P.C., Miguel S.E., Fossati C.A., Wallach J.C. Serological follow-up of human brucellosis by measuring IgG antibodies to lipopolysaccharide and cytoplasmic proteins of Brucella species //Clin. Infect. Dis.- 1996. V.22(3). -P.:446-455.

146. Baum M., Zamir O., Bergman-Rios R. et al. Comparative evaluation of microagglutination test and serum agglutination test as supplementary diagnostic methods for brucellosis // J. Clin. Microbiol. 1995. - V.33(8). -P.2166-2170.

147. Bercovich Z., Dekker Т., Eger A., Haagsma J. A comparison of the potency of several Brucella allergens used to detect brucellosis in cattle //Vet. Res. Commun. 1996. - V.20 (2). - P.141-151.

148. Berman D.Т., Wilson B.L., Moreno E. Characterization of Brucella abortus soluble antigen employed in immunoassay //J. clin. Microbiol.-1980,-v. 11,-N4.-P. 355-362.

149. Biancifiori F., Nannini D., Di Matteo A., Belfiore P. Assessment of an indirect ELISA in milk for the diagnosis of ovine Brucellosis //Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis.- 1996. V.19(l). - P. 17-24.

150. Bing D.H., Weyand J.G.M., Stavitsky A.B. Hemagglutination with aldehyde-fixed erythrocytes for assay of antigens and antibodies. Proc. Soc. exp. Biol. Med. - 1967,-V. 124.-P. 1166.

151. Blasco J.M., Garin-Bastuji В., Marin C.M., Gerbier G., Efficacy of different Rose Bengal and complement fixation antigens for the diagnosis of Bru

152. Brucella melitensis infection in sheep and goats //Vet. Rec. 1994. - V. 16;134(16). -P.415-420.

153. Boorsma D.M., Strefkert J.G. Peroxidase on glutaraldehyde for propering peroxidase conjugates //J.immunol. methods. 1979. - N 30. - P. 245255.

154. Boyden S.V. The adsorption of proteins treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera //J. Exp. Med.-1951,- N 93.-P.107-120.

155. Bricker B.J., Ewalt D.R., MacMillan A.P., Foster G., Brew S. Molecular Characterization of Brucella Strains Isolated from Marine Mammals //J. Clin Microbiol.- 2000,- Vol.38(3).- P.1258-1262.

156. Bricker B.J. Characterization of the three ribosomal RNA operons rrnA, rrnB, and rrnC, from Brucella melitensis //Gene. 2000. -Vol. 255 (1). -P.l 17-126. Related Articles, Books, LinkOut.

157. Brodzicki S. Oznaeznie nickilkicii ielosci bialka toksyng botuli-nowey nuthoda immunoenzymaticana z odezytem chemiliiminesnoyjnym //Prz. epidemiol.- 1984,- v. 38, N 1,- P. 67-72.

158. Brooks-Adler В., Splitter G. Determi nation of bovine lymphocyte responces to extracted protein of Brucella abortus by using protein immunoblot-ting //Infect. Immun.- 1988.- v.56, N10 P. 2581-2586.

159. Bundle D.R., Gidney M.A.J., Perry V.D. et al. Serological cofirma-tion of Brucella abortus and Yersinia enterocolitica 0:9 O-antigens by monoclonal antibodies //Infect.and Immun.- 1984,- v. 46, N 2.- P. 389-393.

160. Bushway R.J., Perkins L.B., Hurst H.L., Ferguson B.S. //Food chemistry.-1992. V.43. - P. 283.

161. Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E. Magnetic enzyme-linked immunosorbent assay (Melisa) for determination of specific IgG in paracoccidiodomycosis //Sabouraudia.- 1984. V.22, N 4. - P.291-299.

162. Carlsson В., Giebinr G., Scott S. Measurement of immunoglobulin G and M antibodies to type 3 pneumococcal polysaccharide by enzyme-linked immunosorbent assay //J. Clin. Microbiol.- 1982 V. 16,- P. 63-69.

163. Cerri D., Ebani V.V., Pedrini A. et al. Epididymitis by Brucella ovis: experemental infection in virgin ram lambs //New. Microbiol. 1999. - V. 22 (3). -P. 227-231.

164. Cerri D., Ebani V.V., Pedrini A., Bassi S., Bey R.F., Andreani E., Farina R. Evaluation of tests employed in serological diagnosis of brucellosis caused by Brucella ovis //New. Microbiol. 2000. - Vol. 23 (3). - P. 8-281. -Related Articles, Books.

165. Chomel B.B., DeBess E.E., Mangiamele D.M. Changing trends in the epidemiology of human brucellosis in California from 1973 to 1992: a shift toward foodborne transmission //J. Infect. Dis.- 1994. V. 170 (5). -P.1216-1223.

166. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus //J. Gen. Virol. 1977. - V.36, №3. - P.475-483.

167. Cloeckaert A., Zygmunt M.S., Dubray G., Limet J.N. Characterization of O-polysaccharide specific monoclonal antibodies derived from mice infected with the rough Brucella melitensis strain B115 //J. Gen. Microbiol. 1993. - V. 139(Pt7).-P. 1551.

168. CNBr Activated Sepharose 4 В for Affinity Chromatography of Polysaccharides and Glycoproteins. Pharmacia Fine Chemicals Upssala.-1974.-P.4.

169. Corbel M.J. Brucellosis: an overview //Emerg. Infect. Dis.- 1997.-V. 3.(2). -P.213-221.

170. Coons A.H., Greech H.G., Gones A.N., Berliner N. The demonstration of pneumococcal antigens in tissue for the use of fluorescent antibody //J.Immunol.-1942.-V. 45, N 3,- P. 157-163.

171. Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells. II. Improwevent in method for the detection antigen by means of fluorescent antibody//! Exp. Med. 1950. - V. 91, N1,- P. 1-13.

172. Cox D.L. Culture of Treponema pallidum //Methods-Enzymol.-1994,-Vol. 60-P. 390-405.

173. Csizmas L. Preparation of fermalinised erythrocytes. "Proc. soc. exp. Biol."- I960,- V.103. - P.157.

174. Dekker Robert F.H. Immobilization of a lactase onto a magnetic suppotr by covalent attachment to polyethyleneimineglutaraldehyde-activated magnetite //Appl. Biochem and Biotechnol. 1989,- V.22, N 3. - P. 289-310.

175. Delgado S., Fernandez M., Carmenes P. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of sheep infected and vaccinated with Brucella melitensis //J. Vet. Diagn. Invest. 1995. - V.7(2). - P.206-209.

176. Denes В., Glavits R. .Bacteriologically confirmed cases of ovine epi-didymo-orchitis caused by Brucella ovis in Sub-Carpathia //Acta Vet. Hung. -1994. V.42(l). - P.25-33.

177. Diaz R., Jones L.M., Wilson J.B. Antigen relationship of the gram-negative organism causing abortion to smooth and rouh Brucellae //J. Bacteriol. -1968. V.95, № 2. - P. 618-624.

178. DiDomenico N., Line H., Knobel R., Caratsch Т., Weschler W., Loewy Z., Rosenstraus M. COB AS AMPLICOR TM: Fully automated RNA and DNA amplification and detection system for routine liagnostic PCK //Clin. Chem. 1996. - Vol.42.- N 12. - P. 1915 -1923.

179. Ewalt D R., Payeur J.B., Rhyan J.C., Geer P.L. Brucella suis biovar 1 in naturally infected cattle: a bacteriological, serological, and histological study //J.Vet. Diagn. Invest. 1997. - V.9 (4). -P.417-420.

180. Ficapal A, Alonso-Urmeneta B, Velasco J. et al. Diagnosis of Brucella ovis infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate //Vet. Rec.- 1995,- V. 5137, N6.-P. 145-147.

181. Gall D., Nielsen K. Improvements to the competitive ELISA for detection of antibodies to Brucella abortus in cattle sera. //J. Immunoassay. 1994. -V. 15. (3).-P. 277-291.

182. Fulthorpe A.M. Tetanus antitoxin titration by haemagglutination IIJ. Hyg.-1957,- V. 1.-P.46.

183. Gallien P., Dorn C., Alban G., Staak C., Protz D.Detection of Brucella species in organs of naturally infected cattle by polymerase chain reaction//Vet. Rec. 1998. -V. 9;142 (19). -P.512-514.

184. Gavazzi G., Prigeut D., Baudet J-M., Banoita S., Daoud W. JAs-pectc epidemiologiques de 42 cas de Brucellose humaine en Republique de Djibouti //Med. Trop.(Fr.). 1997. - 57, N 4. - P. 365 -368.

185. Gedikoglu S., Helvaci S., Ozakin C. et al. Detection of Brucella melitensis by BACTEC NR 730 and BACTEC 9120 systems //Eur. J. Epidemiol.-1996. -V. 12(6). P. 649-650.

186. Gidlewski Т., Cheville N.F., Rhyan J.C., Miller L.D., Gilsdorf M.J. Experimental Brucella abortus induced abortion in a llama: pathologic effects //Vet. Pathol.- 2000. Vol. 37 (1). - P.77-82.

187. Granfors K.,Toivanen A.I. Diagnjsis of human brucellosis with ELISA//Lancet.- 1982,- V.ll, N 8299,-P. 668.

188. Griffin Т., Mosbach K., Mosbach R. Magnetic diospecific affinity adsorbent for immunoglobulin and ensyme isolation//Appl.Biochem.-1981.-V.6.- P.283-292.

189. Handa R., Singh S., Singh N., Wali J.P. Brucellosis in North India: Results of a prospective study //J.Commun. Diseases. 1998. - 30, N 2. - H. 8587.

190. Harding N. Laboratory equipment digest //J.immunol. Meth. -1982. V.20,- N4,-P. 89-93.

191. Hendricks M.K., Perez E.M., Burger P.J., Mouton P.A. Brucellosis in childhood in the Western Cape. // S. Afr. Med. J. 1995. - V.85(3). - P. 176178.

192. Herman L., De Ridder H. Identification of Brucella spp. by using the polymerase chain reaction //Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58, N:6. - P. 2099-210.

193. Issa H., Jamal M. Brucellosis in children in south Jordan //East Mediterr. Health. J. 2000. - Vol. 5(5). - P. 895-902. Related Articles, Books.

194. Jandl I., Simmons R., The agglutination and sensitisation of red cell by metallic cations. Interaction beween multivalent metals and the red ctll membrane //Brit. J. Haemat.- 1957. V.3. - № 1. - P. 19.

195. Kato K., Hamguchi Y., Fukui H., Ishikayawa E. Enzyme-linked immunoassay. Novel method for synthesis of the insulin D - galactosidase conjugate and its applicability for insulin assay //J.Biochem.- 1975. - V. 78. - P. 235-237.

196. KlampB. Zoonosen//MTA. 1998. - 13, N 10. -P.711-715.

197. Klingler W., Strasburger C.Y. and Wood W.G. Chemilumines cent tags in immunoassay//Trendsin analytical chemistry -v. 2,-n. 6,- 1983.

198. Konig H.J., Vob H. Vertahren zur Herstelling von mechanisch stobi-len enzymhaltigen Immobilisation. Pat. 282923. GDR, MRU 54 0\ P.12. - N 11/04 /Tschistowkaya/. Martin - Luther-Univer- sitet Halle - Wittenbery. - N 3281731,- 1990.

199. Kubuafor D.K., Awumbila В., Akanmori B.D. Seroprevalence of brucellosis in cattle and humans in the Akwapim-South district of Ghana: public health implications //Acta.Trop. 2000. - Vol. 76(1):45. - P. 8. - Related Articles, Books, LinkOut.

200. Kumar P., Singh D.K., Barbuddne S.B. Sero-prevalense of Brucellosis among abattoir personnes of Delhi //J. Commun. Diseases. 1997. - Vol. 29.-N2. -P. 131-137.

201. Lea Т., Vartdal F., Davies C., Ugelstad J. Magnetic monosired polymer pasticles for fast and specific fractionation of human mononuclear cells //Scand. J. Immunol. 1985. - V.22 , № 2. - P.207-216.

202. Leal-Klevezas D.S., Lopez-Merino A., Martinez-Soriano J.P. Molecular detection of Brucella spp.: rapid identification of B. abortus biovar I using PCR //Arch. Med. Res. 1995. - V.6 (3). - P.263-267.

203. Leal-Klevezas D.S., Martinez-Vazquez I.O., Lopez-Merino A., Martinez-Soriano J.P. Single-step PCR for detection of Brucella spp. from blood and milk of infected animals //J. Clin. Microbiol. 1995. - V.33 (12). - P.3087-3090.

204. Leong Dian U., Hoffmann- La Roche Inc. Method and probes for identifying bacteria found in blood . Pat. 56355348,USA, MKI С 12Q 1/68 .- N 348683. Заявл. 02.12.94.; Опубл. 03.06. 97; НКИ 435/6.

205. Lifesso R.M., Harder E., Mc Corkell S.J. Spinal brucellosis //J. Bone Soint Surg. 1985. - Vol. 67 B, N 3. - P.345-351.

206. Lu Q., Zhang W., Hao Z.Study on double antigens sandwich enzyme immunoassay for detection of Brucella specific antibodies in human and animals

207. Chung. Hua. Liu. Hsing. Ping. Hsueh. Tsa. -Chih.- 1999,- Vol.20 (2). P.21-118.

208. Masson P.Z.,Cambiaso C.Z.,Collet-Cassat D., Magmisson C.G. et al. Methods in enzymology //Academic Press Ing.New-York., USA.-1981.-V. 74-P. 106-139.

209. Matar G.M., Khneisser I.A., Abdelnoor A.M. Rapid laboratory confirmation of human brucellosis by PCR analysis of a target sequence on the 31-kilodalton Brucella antigen DNA //J. Clin. Microbiol. 1996. - V.34 (2). -P.477-478.

210. McLean G., Hilbink F.Use of dried blood on filter paper in the ELISA for Brucella abortus //J. Immunol. Methods. 1989. -V.123, №:1. - P.39-43.

211. McKenna J.M., Zuscher F., Frankel J.W. An hemagglutination test for titration of antibodies to polio viruses.- "Proc. Soc. exp. Biol.". 1958,- v. 97. -P. 160.

212. Mikolon A.B., Gardner I.A., Hietala S.K.Evaluation of North American antibody detection tests for diagnosis of brucellosis in goats // J.Clin. Microbiol. 1998. - V.36.(6). - P.1716-1722.

213. Milionis H., Christou L., Elisaf M. Cutaneous manifestations in brucellosis: case report and review of the literature //Infection. 2000. - Vol. 28(2): 124,- P.6. - Related Articles, Books, LinkOut.

214. Miller W.G., Adams L.G., Ficht T.A. et al. Brucella induced abortions and infection in dittlenose dolphins //J. Zoo Wildl. Med. 1999. - V. 30 (1). -P. 100-110.

215. Molday R.S., Jen S. P.S., Rembaum A. Application of magnetic microspheres in labelind and separation of cells //Nature. 1977. - V. 268. -P.437-438.

216. Monsan P. Optimization of glutaraldehude activation of a support for enzyme immobilization//J. Mol.Catal.- 1978,- V. 3, N5. P. 371-384.

217. Moreno E., Speth S., Jones L.M., Berman D.T. Immunochemical characterisation of Brucella lipopolysaccharides and polysaccharides // Infect Immun. 1981. - V.31, № 1. - P. 214-222.

218. Наконечний I. Неспецис|ичш серологичш реакцп, зумовлеш Ier-sinia enterocolitica, при дослиженнях на бруцельоз //Вет. Мед. Украши. -1998. -№ 10.-С. 20-21.

219. Nakane Р.К., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody-a new method of conjugation //J.Histochem. Cytochem. -1974,- V. 22, N 4. P. 506-508; 10841091.

220. Neter E. Bacterial hemagglutination and hemolisis //Bact. Reviews. -1956.-v. 20,-P. 166.

221. Nickeless G.,Thorpe G.,Kricka L. et al. A rapid chamiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for cytomegalovirus immunoglobulin G //J.Virol.Meth.-1985.- Y.12, N 34,- P. 313-321.

222. Nielsen K., Gall D., Jolley M. et al. A homogeneous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus //J. Immunol. Methods. 1996. - V. 9;195(l-2). - P.161-168.

223. Nielsen K., Kelly L., Mallory M. Standartization of smooth lipopoly-saccharide preparations for use in diagnostic serological tests for bovine antibody Brucella abortus //J. Immunoassay. 1998. - V.19, № 4. - P.239-250.

224. Nielsen K., Smith P., Gall D. et al. Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of antibody to Brucella abortus in milk. //Yet. Microbiol. 1996. - Y.52 (1-2). - P.165-173.

225. Nielsen K.H., Kelly L., Gall D., Nicoletti P., Kelly W. Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis //V et. Immunol. Immunopathol. 1995. - V.46(3-4). - P.285-291.

226. Nielsen K., Lin M., Gall D., Jolley M. Fluorescence Polarization Immunoassay: Detection of Antibody to Brucella abortus //Methods. 2000,-Vol. 22(1). P- 71-76. Related Articles, Books, LinkOut.

227. Nunez-Torres E., Diaz-Aparicio E., Tenorio V.R. et al. Stability of antigen and agarose used in a double immunodiffusion serologic test for Brucella ovis II. J. Vet. Diagn. Invest. 1998. -V. 10(1). - P. 113-115.

228. Ocholi R.A., Ezeokoli C.D., Akerejola O.O., Saror D.I. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for screening cattle for Brucella antibodies in Nigeria // Vet. Q. 1996. - V.18(l). - P.22-24.

229. O'Sullivan M.J., Marks V. Method of preparation of enzymatibody conjugates for use in enzyme immunoassay //Meth. In Enzymol.- New.York, 1981.-V. 73. P.147-166.

230. Ouahrani-Bettache S., Soubrier M.P., Liautard J.P. IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains //J. Appl. Bacteriol. 1996. - V. 81, N 2. -P. 154-160.

231. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel //Arkiv for Kemi. Mineral. О Ged. 1949. - V.261, N 14. -P.l-9.

232. Patel R.D., Wood J., Gibbs A. Development of magnetic ensyme immunoassay (MELA) teihnique for determinatien of and (St. enterotoxin) immunoglobulin G-type antibodies //Biochem. Soc. Trans. 1984.- V. 12. - P. 264268.

233. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.E. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh //Biochem. Biophis. Acta.- 1964. V.82. - P.463-475.

234. Reddy D.V.R., Hariprasada R., Padma M.C., Lopal V.R. Hemagglutination test to detect Tobacco Mosaic virus antigens //Indian J. Exp. Biol. 1969. -V.7.-P. 162.

235. Reid Terrence S. Immobilization of affinity ligands using epoxy silica //11 the Int. Symp. HPLC. Proteins, Peptides and Polynucleotides.-Washington, 1991. -P.22.

236. Reambaum A., Dreuer W. Immunomicrospheres: reagents fir cell labeling and separation //Sciens. 1980.- Vol. 208.- № 4442.- P. 364-368.

237. Rijpens N.P., Jannes G., Van Asbroeck M. et al. Direct detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse hybridization with 16S-23S rRNA spacer probes // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V.62(5). - P.1683-1688.

238. Rojas N., Freer E., Weintraub A. et al. Immunochemical identification of Brucella abortus lipopolysaccharide epitopes // Clin. Diagn Lab Immunol.- 1994,-V. 1(2).-P. 206-213.

239. Romero C., Pardo M., Grillo M.J. et al. Evaluation of PCR and indirect enzyme-linked immunosorbent assay on milk samples for diagnosis of brucellosis in dairy cattle. // J. Clin. Microbiol. 1995 - V. 33 (12). - P.3198-3200.

240. Romero C., Gamazo C., Pardo M., Lopez-Goni I. Specific detection of Brucella DNA by PCR //J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33 (3). - P.615-617.

241. Romero С., Lopez-Goni I. Improwed method for purification of bacterial DNA from bovine milk for detection of Brucella spp. by PCR //Appl. Environ Microbiol. 1999. - V. 65(8). - P.3735-3737.

242. Ruiz- Bravo A., Jimemez- Valera M. Perspectivas de la microbiolo-gia: El fufuro immediato //Ars pharm. 1996. - Vol. 37. - N 2. - P.171-181.

243. Sanchez Chaparro M.A., Merida de la Torre F.J., Gonzalez Alegre P., Gonzalez Santos P. Transverse myelitis caused by Brucella //Rev. Clin. Esp. 1999. -Vol.199 (11). -P.778.

244. Scheu Pia M., Berghof Kornelia, Stahl U. Detection of pathogenic and Spoilage microorganisms in food with the polymerase chain reaction Food Microbiol. 1998. -15, N 1.-P. 13-31.

245. Schopf K., Khaschabi D. Experiences in the eradication of Brucella ovis infections in sheep in Tyrol // Tierarztl. Prax. Ausg. G Grosstiere Nutztiere. -1997. V.25(5). - P.413-416.

246. Sifuentes-Rincon A.M., Revol A., Barrera-Saldana H.A.Detection and differentiation of the six Brucella species by polymerase chain reaction // Mol. Med. 1997. - V.3.(ll). -P.734-739.

247. Silva I., Dangolla A., Kulachelvy K. Seroepidemiology of Brucella abortus infection in bovids in Sri Lanka //Prev. Vet. Med. 2000. - Vol. 3;46(1):51.- P. 9. - Related Articles, Books, LinkOut.

248. Srulowski K., Iwaniak W., Pilaszek J., Iruszcrynski M., Chrobocin-ska M. Zhe ELISA for examination of hare sera for anti-Brusella antibodies //Compar.Immunol., Microbiol. And Infect.Diseases. 1999. - Vol. 22,- N 1. - P. 33- 40.

249. Staak C., Draeger A., Bahn P., Dorn C., Ortmann G.Comparison of the results from commercially available Brucella ELISA test kits for the investigation of bovine sera //Berl. Munch Tierarztl. Wochenschr. 1997. - V. 110(6). -P.206-210.

250. Stahe S.P., Marmonier A., Micoud M.I. Diagnosis of human brucellosis with ELISA //Lancet.-1982,- V. 11, N 8299,- P. 669.

251. Stavitsky A.B. Haemagglutination and haemagglutination-inhibition reactions with tannic acid and bis-diazotired benzidin- hrotein-conjugated erythrocytes //In: Immunological methods.- Ed. Ackroyd J.F.- Oxford. - 1964.

252. Sting R., Ortmann G. Erfahrungen mit einfachen ELISA-Testsystemes fur die Brucellose Serologie bei Rind, Schaf und Ziege //Berlin. Und munch. Wochenschr.- 2000. - Vol.113,- N 1. -P. 22-28.

253. Stone S.S., Patterson J.M., Deyoe B.L. Extraction, separation and partial characterization of Brucella abortus antigens // Amer. J. Vet. Res. 1982. - V. 45, № 1. -P.149-153.

254. Stortz H. (Шторц X.) Иммунофлуоресценция //Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - С.128-148.

255. Suares С.В., Pacheco G.A., Vigliocco A.M. Characterisation of Brucella ovis surface antigens // Vet. Microbiol. 1988. - V.18, №3-4. - P. 349356.

256. Sun Т., Zhang Q., Sun Z. Analyze on the epidemiologic characteristics of brucellosis and in Inner Mongolia through rhe observation of the change ammong brucella species //Chung. Hua. Ping Hsueh Tsa. Chin. 1998. - V.19 (5). - P.267-270.

257. Tabatabai L.B., Deyoe B.L. Biochemical and biological properties of soluble protein preparations from Brucella abortus //3-rd Int. Symp. in Brucellosis Algiers, 18 20 Apr. - 1983,- Basel, 1984,- P. 199 - 211.

258. Tabatabai L.B., Deyoe B.L. Specific enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine antibody to Brucella abortus //J. Clin. Microbiol.-1984.-V. 20,N2.-P. 209-213.

259. Tang Yi Wei, Procop G., Persing D., Molecular diagnostics of infectious diseases //Clin. Chem. 1997. - Vol. 43,- N 11. - P. 2021-2038.

260. Tcherneva E., Rijpens N., Naydensky C., Herman L.Repetitive element sequence based polymerase chain reaction for typing of Brucella strains //Vet. Microbiol. 1996. - V. 51. N1-2. - P. 169-178.

261. Tcherneva E., Rijpens N., Jersek В., Herman L.M. Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis //J.- Appl. -Microbiol. 2000. - Vol. 88 (1).- P. 69-80.

262. Thorpe G., Kricka L. Incorporation of enhanctd chemiliminescent reactions into fully automated enzyme immunoassay //J. Bioiumin. Chemiliemines.- 1989,- V. 3, N 2,- P. 97 100.

263. Tounkara K., Maiga S., Traore A., Seek B.M., Akakpo A.J. Epidemiology of bovine brucellosis in Mali: serologic investigation and initial isolation of strains of Brucella abortus //Rev. Sci. Tech. 1994. - V.13(3). - V. 777-786.

264. Tryland M., Kleivane L., Alferdsson A. et al. Evidence of Brucella infection in marine mammals in the North Atlantic Ocean // Vet. Rec. 1999. -V.144(21). - V. 588-592.

265. Vigliocco A.M., Silva Paulo P.S., Mestre J. et al. Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of ovine antibody to Brucella ovis //Vet. Microbiol. 1997. - V. 54, N 3-4. - P. 357-368.

266. Voller A., Sidwell D.E., Bartlett A., Fleck D.G., Porkns M., Aladehin B. A microplate enzyme immunoassay for toxoplasma antibody //J. Clin. Pathol. 1976. - V. 29, N 2. - P. 150 - 153.

267. Waites Will M. Principles of rapid testing and a look to the future //Ind. J. Dairy Technol. 1997. - Vol.50. - N 2. - P. 57-60.

268. Wallach J.C., Miguel S.E., Baldi P.C. Urban outbreak of a Brucella melitensis infection in an Argentine family: clinical and diagnostic aspects //FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1994. - V. 8 (1). - V.49-56.

269. Warburg O., Christian W. Isolierung und kristalisation des Garug-stermens enjlase // Biochem. Z.-1941,- V.310. -P.384-421.

270. Weinbach R. Die Verwendbarkeit formolbehandelfer Erythrocyten als Antigentrager in der indirecten Haemagglutinatin. 2 -"Schweiz. Z. Allg. Path."- 1958.-v. 21.-P. 1043.

271. Weinbach R. Die Verwendbarkeit formolbehandelfer Erythrocyten als Antigentrager in der indirecten Haemagglutinatin. -1 "Schweiz. Z. Allg. Path."- 1959.-v. 22.-P. 1.

272. Weller Т.Н., Coons A.H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. 1954. -V.86. -P.789-794.

273. Weston P.D., Devries G.A., Wriggleworth R. Conjugation of enzyme to immunoglobulins using dimallimids //J. Bioch. Biophys. Acta. 1980. -V. 612. - P.40-49.

274. Westhal O., Luderitz O., Bister F. Veber dia Extraxtion von Bak-terien mit Phenol. Wasser.- "Z. Naurforsch.". - 1952. -Bd. 76,- S. - 148.

275. Weynants V., Gilson D., Cloeckaert A. et al. Characterization of smooth lipopolysaccharides and О polysaccharides of Brucella species by competition binding assays with monoclonal antibodies //Infect. Immun. 1997. -V. 65, N5.-P. 1939-1943.

276. Yagupsky P., Peled N., Riesenberg K., Banai M. Exposure of hospital personnel to Brucella melitensis and occurrence of laboratory-acquired disease in an endemic area //Scand .- J.- Infect.- 2000. Vol. 32 (1). P. 5-31.

277. Young H., Moyes A., De Ste Croix I., McMillian A. A new recombinant antigen latex agglutination test (Syphilis Fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis Hint. J. STD AIDS. 1998. - Vol. 9 (4). - P. 196-200.

278. Yu H. Comparative and electrochemiluminescent immunoassay //J. Immunol. Meth. 1998. - Vol. 218. -N 1-2. -P.l-8.