Механизмы транскрипции бактериальной РНК-полимеразы и ее регуляция на уровне одиночных молекул тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Арсениев Анатолий Николаевич

• Арсениев Анатолий Николаевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Арсениев Анатолий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Функциональная роль бактериальной РНК-полимеразы

1.1.1 Структура РНК-полимеразы

1.1.2 Транскрипционный цикл

1.1.3 Регуляция бактериальной транскрипции

1.2 Лассо-пептиды

1.2.1 Структурные особенности лассо-пептидов

1.2.2 Микроцин J25

1.2.3 ^лебсидин и ацинетодин

1.2.4 Сложности in vivo характеризации лассо-пептидов и перспективы in vitro подходов

1.3 Стрептолидигин

1.3.1 Структура стрептолидигина

1.3.2 Предполагаемые механизмы действия на основе структурных данных

1.3.3 Роль магния в ингибировании стрептолидигином РНКП

1.3.4 Стрептолидигин как инструмент изучения механизма элонгации транскрипции

1.4. Одномолекулярные подходы изучения элонгации и регуляции РНКП

1.4.1 Метод оптического захвата

1.4.2 Спонтанные (повсеместные) паузы в транскрипции

1.4.3 Влияние микроцина J25 на динамику транскрипции

1.4.4 Дискретные шаги транскрипции

1.4.5 Изучение his и ops сайтов паузирования

1.4.6 Регуляция транскрипционных пауз транскрипционными факторами NusA

и NusG

1.4.7 Роль триггерной петли в регуляции скорости транскрипции

1.5 Изучение процесса транскрипции с помощью метода магнитного захвата

1.6. Метод акустической силовой спектроскопии

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Получение матрицы ДНК

2.2. Получение белков

2.2.1. Получение и очистка биотинилированной РНК-полимеразы

2.2.2. Выделение и очистка о-субъединицы

2.2.3 Выделение и очистка транскрипционных факторов GreA и GreB

2.3 Подготовка остановленного элонгационного комплекса ЭК-20

2.4 Методика проведения одномолекулярного эксперимента

2.4.1 Схема одномолекулярного эксперимента

2.4.2. Подготовка микрофлюидной камеры

2.4.3. Калибровка установки АСС

2.4.4. Детекция элонгации транскрипции методом АСС

2.4.5 Анализ одномолекулярных данных

2.5 Визуализация и анализ структуры белков

2.6 In vivo детекция совместного ингибирующего действия антибиотиков и транскрипционного фактора GreB

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Лассо-пептиды клебсидин и ацинетодин ингибируют элонгацию РНКП E. coli

3.2 Исследование элонгации транскрипции бактериальной РНК-полимеразы с использованием фотоактивируемого АТФ

3.3 Стрептолидигин индуцирует длительные паузы в процессе элонгации РНКП

3.4 Стрептолидигин ингибирует промежуточное конформационное состояние

РНКП - элементарную паузу

3.5 Факторы расщепления транскрипта GreA и GreB синергетически усиливают ингибирующее действие стрептолидигина

3.6 Модель синергетического взаимодействия Eco ЭК-GreB-Ora

3.7 Синергетическое действие стрептолидигина и транскрипционного фактора GreB in vivo

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Благодарности

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы транскрипции бактериальной РНК-полимеразы и ее регуляция на уровне одиночных молекул»

Актуальность темы исследования

Транскрипция ДНК — фундаментальный биологический процесс, лежащий в основе экспрессии генов и функционирования всех живых систем. Центральным элементом этого процесса является ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) — высококонсервативный фермент, чья активность регулируется сложным взаимодействием с ДНК, РНК, нуклеотидными субстратами и клеточными факторами. Углублённое изучение структуры РНКП, включая динамику переходов между различными конформационными состояниями, и механизмов регуляции ее активности представляет собой ключевую задачу современной молекулярной биологии, имеющую как фундаментальное, так и прикладное значение. С практической стороны, бактериальная РНКП служит мишенью для широкого спектра антибиотиков, что делает её важным объектом для разработки новых терапевтических стратегий в условиях растущей антибиотикорезистентности. Кроме того, инженерные модификации РНКП открывают перспективы для создания биотехнологических платформ, направленных на синтез целевых РНК и белков в промышленных масштабах.

Традиционные биохимические методы, ограниченные усреднённым анализом популяций молекул, не позволяют детально изучать динамику транскрипции в режиме реального времени. В диссертационной работе использован метод акустической силовой спектроскопии (АСС), который обеспечивает такую возможность за счет исследования функционирования индивидуальных молекул бактериальной РНКП с высоким пространственным и временным разрешением. Одномолекулярный подход позволяет напрямую исследовать, как биомолекулы различной природы регулируют активность РНКП, изменяя скорость элонгации, индуцируя паузы, стабилизируя специфические конформационные состояния и т. д. Эти данные также важны и для характеристики новых антибактериальных препаратов на основе

ингибиторов РНКП.

В настоящей работе исследовалось действие на РНКП лассо-пептидов, антибиотика стрептолидигина и факторов элонгации транскрипции ^геАЮгеВ). Исследование находится на стыке передовых направлений молекулярной биологии, биофизики, медицинской химии и биотехнологии.

Степень разработанности темы исследования

Предметом диссертационного исследования является бактериальная РНКП, ингибирование ее активности лассо-пептидами, антибиотиком стрептолидигином и ее регуляция транскрипционными факторами GreA и GreB, а также их совместное действие на транскрипцию вместе со стрептолидигином.

Ряд ингибиторов РНКП, включая тагетитоксин, салинамид А, молекулы класса CBR, стрептолидигин и циклические пептидные антибиотики микроцин J25 и капиструин, действуют как на стадии инициации, так и на стадии элонгации транскрипции [1-4].

Лассо-пептиды представляют собой рибосомально синтезируемые и посттрансляционно модифицированные пептиды с необычной структурой, напоминающей «лассо» и часто являются естественными антибактериальными агентами. Одним из самых известных представителей является микроцин J25.

Механизм ингибирования РНК-полимеразы микроцином J25, установленный с помощью метода оптической ловушки, описывается моделью - «пробка в бутылке»: пептид блокирует вторичный канал фермента, предотвращая доступ рибонуклеотидов к активному центру[5].Однако вновь открытые лассо-пептиды демонстрируют значительные структурные различия, что позволяет предположить вариативность их механизмов действия. Таким образом, важной задачей является выяснить, используют ли они схожий механизм ингибирования или же действуют иным образом.

Антибиотик стрептолидигин (Стл), вырабатывается Streptomyces ^¡сш. Стл является производным тетрамовой кислоты; он ингибирует все ферментативные

активности РНК-полимеразы: включение нуклеотидов (образование фосфодиэфирной связи), пирофосфоролиз и гидролиз РНК. Точный молекулярный механизм действия Стл на РНКП до конца не изучен и остаётся предметом дискуссий [6-8]. Современные модели, основанные на данных структурного и биохимического анализа, оставляют без объяснения несколько принципиально важных аспектов. Одним из них является роль триггерной петли (ТЬ) в действии Стл. Хотя ^ формирует несколько контактов с ацетамидной группой тетрамовой кислоты Стл и необходима для ингибирования, она необязательна для связывания Стл с РНКП [6,7,9]. Другим важным аспектом является природа распознавания Стл конформационных состояний РНКП. Неизвестно, способен ли ингибитор взаимодействовать с состояниями, связанными с паузами транскрипции, зависящими от последовательности ДНК (например, при формировании РНК шпильки), с состояниями, связанными с процессом бэктрекинга, или же он действует универсально. Согласно одной из моделей, компактная организация активного кармана, формируемого ДНК и подвижными элементами РНКП, создаёт пространство для связывания ингибитора и предполагает участие ДНК в этом взаимодействии [6,7,9]. При этом отсутствие признаков ингибирования транскрипции, зависящего от конкретной последовательности, указывает на возможное существование иного механизма действия. Альтернативный механизм предполагает, что ингибирование происходит с определённой вероятностью на каждом цикле добавления нуклеотида. Это согласуется с наблюдаемым в ансамблевых экспериментах снижением максимальной скорости катализа в реакциях добавления одного нуклеотида [6,7].

Дополнительным нерешенным вопросом остается проникновение Стл в элонгационный комплекс (ЭК). Сайт его связывания с РНКП недоступен через первичный, вторичный или РНК-выходной каналы ЭК из-за препятствий, создаваемых двуцепочечной ДНК, гибридом РНК/ДНК, ^ и РНК-продуктом[9]. Также значимым фактором, определяющим эффективность ингибирования Стл, является его Mg2+-зависимость. Этот эффект был обнаружен при исследовании ингибирования РНКП Петтш ^егторЫ1ш и выражается в резком снижении

эффективности действия Стл в условиях дефицита катионов магния [8]. Остаётся неясным, является ли эта зависимость от магния специфической особенностью ингибирования данного фермента или представляет собой общее условие, необходимое для подавления транскрипции РНКП и у других бактерий, включая E. coli.

Наконец, взаимодействие Стл с факторами расщепления транскрипта GreA/GreB (Gre) остаётся загадкой. С одной стороны, сайты связывания Gre и Стл расположенны на расстоянии ~15 Ä друг от друга [10]. С другой стороны, связывание Gre требует открытой конформации TL [10,11], тогда как связывание Стл, как предполагается, не зависит от конформации TL или способствует ее открытому положению[6,7,9].

Одномолекулярные походы, включая оптический пинцет [12,13] , магнитный пинцет [14], атомно-силовую микроскопию [15] и акустическую силовую спектроскопию [16], позволяют напрямую измерять в реальном времени сложные многостадийные стохастические процессы, такие как транскрипция, с высоким пространственным (нанометровый диапазон) и временным (миллисекундный масштаб) разрешением. В отличие от традиционных биохимических и биофизических методов, анализирующих усреднённые по популяции свойства транскрибирующих молекул РНКП [13,17,18], одномолекулярные методы позволяют охарактеризовать свойства отдельных молекул, предоставляя данные о функциональной динамике РНКП в заданных условиях.

Цель и задачи

Цель работы — Определение на уровне одиночных молекул механизмов элонгации транскрипции бактериальной РНК-полимеразы и ее регуляции биомолекулами различной природы такими как лассо-пептиды, антибиотик стрептолидигин и транскрипционные факторы Gre.

Задачи работы:

1. Разработать методику исследования элонгации транскрипции бактериальной РНК-полимеразы на уровне одиночных молекул с помощью акустической силовой спектроскопии.

2. Исследовать на уровне одиночных молекул механизмы взаимодействия бактериальной РНК-полимеразы с лассо-пептидами клебсидин и ацинетодин.

3. Охарактеризовать элонгацию транскрипции бактериальной РНКП в присутствии фотоактивируемого АТФ.

4. Исследовать на уровне одиночных молекул взаимодействие антибиотика стрептолидигина с бактериальной РНКП

5. Исследовать на уровне одиночных молекул совместное влияние стрептолидигина и транскрипционных факторов GreA и GreB на элонгацию транскрипции, и выявить механизмы, лежащие в основе такого взаимодействия.

Научная новизна

В настоящем диссертационном исследовании впервые на уровне одиночных молекул методом АСС была изучена элонгация транскрипции бактериальной РНК-полимеразой (РНКП). Это позволило получить новые данные о динамике транскрипционного процесса с высоким пространственным и временным разрешением.

Впервые с использованием метода АСС был продемонстрирован подход, обеспечивающий возможность управления транскрипцией в режиме реального времени с использованием фотоактивируемых нуклеотидов в качестве субстрата. Это открывает новые экспериментальные возможности для изучения процесса транскрипции и его регуляции различными молекулами.

Изучены механизмы действия лассо-пептидов клебсидина и ацинетодина.

Впервые показано, что мишенью для стрептолидигина является состояние элементарной паузы РНКП. Эти данные могут быть использованы для разработки новых антимикробных препаратов.

Также впервые было выявлено синергетическое действие стрептолидигина и транскрипционных факторов GreA и GreB на элонгацию транскрипции. Это открытие имеет важное значение для понимания механизма регуляции транскрипции и взаимодействия различных факторов в этом процессе и может привести к разработке нового типа комбинированных антимикробных препаратов.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в выявлении и подробном описании на уровне одиночных молекул механизмов взаимодействия РНК-полимеразы с лассо-пептидами клебсидином и ацинетодином, антибиотиком стрептолидигином, а также с транскрипционными факторами GreA и GreB. Полученные данные расширяют знания о механизмах ингибирования транскрипции и ее регуляции.

Практическая значимость работы состоит в установлении синергетического действия стрептолидигина и транскрипционных факторов GreA и GreB, что предоставляет возможность целенаправленного усиления ингибирующего эффекта на бактериальную РНК-полимеразу, и может существенно повысить эффективность терапии бактериальных инфекций.

Методология и методы исследования

В качестве основного метода исследования использована АСС, реализованная на установке компании Lumicks, размещённой в Научно-исследовательском комплексе «Нанобиотехнологии» СПбПУ.

Биотинилированная РНК-полимераза была наработана в клетках E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pIA497, экспрессирующую РНКП,

содержащую ß' субъединицу, связанную с биотинилкарбоксильным белком. Рекомбинантные белки GreA и GreB с 6xHis-тагом были экспрессированы в клетках E. coli Rosetta и очищены методами аффинной хроматографии на колонке HisTrap HP и гель-фильтрацией на колонке Superdex 75 (GE).

Элонгационный комплекс (ЭК) с 20 нуклеотидной РНК (ЭК-20) был подготовлен с использованием биотинилированной РНКП и ДНК-матрицей длиной 4413 пар оснований, содержащей промотор T7A1, ген rpoB и два терминатора rrnB. ДНК-матрица содержала модифицированные дигоксигенином нуклеотиды для иммобилизации на поверхности чипа установки АСС.

Экспериментальная установка АСС включала чип - микрофлюидную камеру с интегрированным пьезоэлементом, создающим акустические волны, которые генерируют силу, направленную на полистирольные микросферы внутри камеры. Чип АСС был обработан антителами к дигоксигенину и реагентами для предотвращения неспецифического связывания. Биотинилированный ЭК-20 был иммобилизован на поверхности чипа с помощью дигоксигенин-меченного конца ДНК матрицы, а затем в камеру добавлялись микросферы покрытые стрептавидином, которые связывались с комплексом ЭК-20 благодаря сильному биотин-стрептавидиновому взаимодействию.

Для получения элонгационных профилей - графиков, отражающих зависимость количествапройденных одиночными молекулами РНКП нуклеотидов от времени, инициировали элонгацию транскрипции, добавляя к иммобилизованному ЭК-20 буфер с 1 мМ нуклеотидтрифостатов (НТФ), и отслеживали движение РНКП, используя программное обеспечение установки АСС. Измерялись следующие параметры: средняя скорость транскрипции, мгновенная скорость между паузами, длительность пауз и частота пауз. Полученные данные обрабатывались с использованием скриптов MATLAB R2020a, а также для анализа применялась модель Extensible Worm-like Chain.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана и успешно применена методика исследования элонгации транскрипции на уровне одиночных молекул с использованием акустической силовой спектроскопии (АСС).

2. На базе установки АСС разработана инновационная методика, позволяющая контролировать процесс элонгации транскрипции с использованием фотоактивированного АТФ.

3. Показано, что лассо-пептиды клебсидин и ацинетодин ингибируют процесс элонгации транскрипции РНКП аналогично микроцину J25.

4. Установлено, что Стл индуцирует длительные (>20 секунд) транкрипционные паузы, но не влияет на мгновенную скорость движения РНКП между паузами.

5. Ингибирующее влияние Стл усиливается с ростом концентрации Mg2+.

6. Стл воздействует на элементарные промежуточные состояния РНКП, но не влияет на остановленные состояния, вызванные обратным смещением РНКП в результате бэктрекинга РНКП.

7. Синергия Gre факторов и Стл приводит к увеличению числа и длительности пауз, что еще больше снижает среднюю скорость элонгации.

Личный вклад автора

Автором диссертации был выполнен основной массив экспериментов, проводимых с использованием метода АСС. Автор разработал методику проведения исследования элонгации транскрипции на уровне одиночных молекул при помощи АСС, готовил ДНК-матрицы, разрабатывал условия проведения экспериментов. Кроме того, автор самостоятельно занимался выделением и очисткой РНК-полимеразы и необходимых транскрипционных факторов, что включало использование сложных биохимических методик и приборов. Автор также активно участвовал в разработке программного обеспечения для анализа данных, выполненного Георгием Евгеньевичем Побегаловым. Компьютерное моделирование структур было выполнено профессором Сергеем Ионовичем Боруховым. В рамках бакалаврских исследований под руководством автора студенты Михаил Андреевич Панфилов, Полина Андреевна Павлинова, Алина Сергеевна Потысьева проводили измерения, которые внесли значительный вклад в общее исследование. Михаил Алексеевич Ходорковский, Сергей Ионович Борухов и Константин Викторович Северинов принимали участие в ключевых этапах выполнения исследования, включая разработку экспериментальных стратегий, обсуждение и анализ полученных данных, подготовку научных публикаций. Их вклад способствовал эффективной реализации поставленных задач и достижению целей диссертационной работы.

Степень достоверности и апробация результатов

Экспериментальные исследования, выполненные в рамках диссертационной работы, были тщательно спланированы и реализованы с соблюдением методологических стандартов. Обработка полученных данных осуществлялась с применением общепринятых статистических методов, что обеспечило их воспроизводимость и достоверность. Основные результаты исследования опубликованы в рецензируемых высокорейтинговых журналах, таких как ACS

Chemical Biology, Nature Chemical Biology и Nucleic Acids Research (NAR), а также представлены в журнале «Научно-технические ведомости» (НТВ). Также результаты работы были представлены на научных конференциях, в том числе международных, что способствовало их признанию в профессиональном сообществе. Проведение исследований было финансово поддержано в рамках грантов Министерства науки и высшего образования РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа структурно состоит из введения, основной части, включающей обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка литературы, перечня сокращений и условных обозначений, и благодарностей. Работа изложена на 100 страницах, содержит 2 таблицы, 43 рисунка и 1 приложение. Список литературы включает 123 источника.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Функциональная роль бактериальной РНК-полимеразы

Транскрипция представляет собой ключевую стадию экспрессии генетической информации, хранящейся в ДНК. В частности, в ходе транскрипции ДНК синтезируются молекулы мРНК, выполняющие роль посредника между геномом и белками, необходимыми для жизнедеятельности клетки. Ферментом, осуществляющим транскрипцию, является ДНК-зависимая РНК-полимераза. Изучение ее структуры и механизма действия необходимо для понимания фундаментальных принципов регуляции генной экспрессии. Регуляция транскрипции лежит в основе поддержания клеточного гомеостаза, адаптации к внешним условиям. Дисрегуляция приводит к развитию патологических состояний.

1.1.1 Структура РНК-полимеразы

РНК-полимеразы бактерий, архей и эукариот гомологичны и имеют похожую структуру. В 1999 году была опубликована первая кристаллическая структура высокого разрешения кор-фермента термостабильной РНК-полимеразы из бактерии Петтш aquaticus [19], за которой последовали структуры эукариотической РНКП II из & cerevisiae [20] (Рисунок.1). В последующие годы были получены многочисленные структуры бактериальных РНКП, среди которых стоит отдельно выделить структуры термофильных ферментов из Пегтш ^егторЫ1ш, ставшие модельной системой для детального анализа РНКП в различных функциональных состояниях транскрипционного цикла [9,21,22].

Thermus aquaticus RNAP Saccharomyces cerevisiae RNAP II

3.3-A resolution, PDBcode: 1HQM (Zhang et al., 1999) 2.8-A resolution, PDB code: 1150 (Cramer et al„ 2001)

Рисунок 1 - А. Структура бактериальной РНКП (T. aquaticus) с разрешением 3,3 Á. Б. Структура эукариотической РНКП II (S. cerevisiae) с разрешением 2,8 Á [23]

Структуры РНК-полимераз термофильных бактерий послужили основой для моделирования механизмов инициации, элонгации и паузирования, а также легли в основу сравнительных исследований с эукариотическими полимеразами, способствуя пониманию универсальных принципов катализа синтеза РНК [22,24].

В 2013 году, тремя научными группами с использованием методов рентгеноструктурного анализа и крио-электронной микроскопии были независимо определены структуры РНК-полимеразы бактерии E. coli: Бае и соавторы описали структуру инициирующего комплекса и механизмы промоторного распознавания; Мураками получил данные о о70-холоферменте, раскрывающие взаимодействия функциональных доменов; а Жу и Стейц определили структуру элонгационного комплекса [25-27].

У прокариот имеется одна РНК-полимераза, ответственная за синтез всех типов РНК. Фермент функционирует в виде кор- и холофермента. Кор-фермент состоит из субъединиц a2ßß'ro и обладает каталитической активностью, но не способен инициировать транскрипцию с промоторов (Рисунок 2 А, Б). Добавление о-фактора формирует холофермент, способный к специфическому распознаванию

промоторов. Трёхмерная структура о70-холофермента E. coli даёт целостное представление об архитектуре субъединичного комплекса и распределении его функциональных доменов [26] (Рисунок 2 А, Б).

Рисунок 2 - Трехмерная кристаллическая структура о70 холофермента РНК-полимеразы E .coli [26]. А. Вид со стороны вторичного канала, ведущего к активному центру. Б. о-связывающий сайт. Субъединицы окрашены: aI (желтый), all (зеленый), ß (голубой), ß' (розовый), ю (серый), о70 (оранжевый)

Ключевыми структурными элементами РНКП являются главный канал, расположенный между ß'- и ß-субъединицами (Рисунок 2), в котором происходит связывание ДНК и синтез РНК, и вторичный канал, обеспечивающий доступ рибонуклеотидов к активному центру и его взаимодействие с регуляторными белками. Главный канал соединяется со вторичным в области активного центра, внутри которого находятся подвижные домены — триггерная петля и a-спиральный мостик (Bridge Helix), критически важные для точности и эффективности катализа.

канал

1.1.2 Транскрипционный цикл

Цикл транскрипции включает инициацию, элонгацию и терминацию (Рисунок 3). Инициация начинается со связывания холофермента с промотором.

Сначала формируется закрытый, затем открытый комплекс, после чего начинается синтез коротких «абортивных» РНК [28-30]. При достижении длины транскрипта ~10 нт происходит переход к стадии элонгации, сопровождающийся отсоединением о-субьединицы (о фактора) [31,32] (Рисунок 3).

Рисунок 3 - Цикл транскрипции бактериальной РНК-полимеразы. Адаптировано Molecular Biology of the Cell, 6 издание [33]

Элонгация осуществляется кор-ферментом, формирующим стабильный элонгационный комплекс. Синтез РНК происходит неравномерно: фермент может временно останавливаться (паузы), прекращать продвижение по матрице ДНК

(арест) или возвращаться назад (бэктрэкинг) для исправления ошибок. Паузы могут быть спонтанными или индуцированными специфическими последовательностями ДНК и РНК, а также взаимодействиями с белковыми факторами траснкрипции [34]. Арест возникает при взаимодействии РНК-полимеразы с барьерами различной природы (вторичные структуры РНК, стабильные ДНК-РНК гибриды, топологические напряжения ДНК, белковые комплексы) или ошибках в синтезе и может быть преодолен при изменении конформации РНКП и/или вмешательства транскрипционных факторов. Одним из ключевых механизмов восстановления активности РНК-полимеразы в таких ситуациях является бэктрекинг — обратное перемещение фермента вдоль ДНК-матрицы, сопровождаемое эндонуклеазной активностью, направленной на удаление неправильно включённых рибонуклеотидов [35-38]. Восстановление каталитической активности может осуществляется с участием транскрипционных факторов GreA и GreB: первый способствует гидролизу коротких фрагментов РНК (2-5 нт), а второй более протяжённых (до 10-15 нт) участков транскрипта [13,35,39,40]. Это позволяет РНК-полимеразе возобновить транскрипцию и предотвратить накопление ошибок в РНК-продукте.

Терминация - заключительная стадия цикла транскрипции (Рисунок 3), инициируется при достижении РНК-полимеразой специфической терминаторной последовательности на ДНК и может происходить по одному из двух основных механизмов. Rho-независимая терминация основана на формировании в синтезируемой РНК стабильной шпилечной вторичной структуры, за которой следует участок, содержащий последовательность поли-У. Такая структура дестабилизирует элонгационный комплекс и приводит к его распаду [41,42]. Rho-зависимая терминация требует участия гексамерного РНК-связывающего белка Rho, обладающего РНК-зависимой АТФазной и хеликазной активностью. Rho распознаёт специфические участки в РНК (г^-сайты), движется вдоль цепи и способствует последующей диссоциации РНКП [43,44].

РНК-полимераза взаимодействует с множеством других молекулярных систем, включая аппараты трансляции и репликации. Движение репликационной

вилки может привести к столкновениям с транскрипционными комплексами, особенно когда оба процесса используют одну матричную нить ДНК. Такие столкновения могут вызывать приостановку репликации или транскрипции и требуют участия специальных факторов [45,46]. Транскрипция и трансляция в бактериях также тесно скоординированы: рибосомы, следующие за РНКП, предотвращают бэктрэкинг. При торможении трансляции транскрипция также замедляется, что подтверждает функциональную связь этих процессов [47].

1.1.3 Регуляция бактериальной транскрипции

Транскрипция у бактерий представляет собой динамически регулируемый процесс, на всех этапах которого активность РНК-полимеразы контролируется различными клеточными факторами. Эти регуляторные воздействия осуществляются с участием транскрипционных факторов, малых РНК, метаболитов и сигнальных молекул вторичных посредников [1,24,48-50].

Функциональное состояние РНКП может изменяться как в результате связывания регуляторов с ферментом, так и через аллостерические перестройки его подвижных структурных элементов. Особое значение в регуляции транскрипции принадлежит процессам, контролирующим стадию инициации, таких как связывание РНКП с промотором, активацию или репрессию транскрипции с помощью о-факторов и других белков, таких как анти-сигма факторы и фактор КшА [28,31].

РНК-полимераза бактерий одновременно является мишенью для множества природных и синтетических антибиотиков [1,4,51,52]. Антибиотики могут нарушать взаимодействие РНКП с ДНК-матрицей, с РНК-продуктом или субстратами (рибонуклеозидтрифосфатами), либо препятствовать перемещению фермента вдоль ДНК (транслокации) [1,53]. На сегодняшний день только некоторые препараты, действующие на инициацию транскрипции — рифамицины и фидаксомицин (липармицин) — одобрены для клинического применения [54,55].

K ингибиторам, мишенью которых служит каталитическая активность РНКП, относятся тагетитоксин [4,56], салинамид A [57], соединения класса CBR [3], стрептолидигин [6,7], а также лассо-пептиды микроцин J25 [58,59], капиструин [60] и другие. Большинство этих соединений ограничивает динамику подвижных элементов активного центра РНКП, критически важные для катализируемого добавления нуклеотидов. К числу таких структурных элементов относятся спираль-мостик (в' bridge helix), F-петля (в' F-loop), триггерная петля (в' trigger loop) и вилка-2 (в fork-2 loop) [1-4].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Арсениев Анатолий Николаевич, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Artsimovitch I. h gp. A New Class of Bacterial RNA Polymerase Inhibitor Affects Nucleotide Addition // Science. 2003. T. 302, № 5645. C. 650-654.

2. Bae B. h gp. CBR antimicrobials inhibit RNA polymerase via at least two bridge-helix cap-mediated effects on nucleotide addition // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2015. T. 112, № 31.

3. Malinen A. M. h gp. CBR antimicrobials alter coupling between the bridge helix and the ß subunit in RNA polymerase // Nat Commun. 2014. T. 5. C. 3408.

4. Yuzenkova Y. h gp. Tagetitoxin inhibits transcription by stabilizing pre-translocated state of the elongation complex // Nucleic Acids Research. 2013. T. 41, № 20. C. 9257-9265.

5. Adelman K. h gp. Molecular mechanism of transcription inhibition by peptide antibiotic Microcin J25 // Mol Cell. 2004. T. 14, № 6. C. 753-762.

6. Temiakov D. h gp. Structural basis of transcription inhibition by antibiotic streptolydigin // Mol Cell. 2005. T. 19, № 5. C. 655-666.

7. Tuske S. h gp. Inhibition of Bacterial RNA Polymerase by Streptolydigin: Stabilization of a Straight-Bridge-Helix Active-Center Conformation // Cell. 2005. T. 122, № 4. C. 541-552.

8. Zorov S. h gp. Antibiotic Streptolydigin Requires Noncatalytic Mg 2+ for Binding to RNA Polymerase // Antimicrob Agents Chemother. 2014. T. 58, № 3. C. 1420-1424.

9. Vassylyev D. G. h gp. Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase // Nature. 2007. T. 448, № 7150. C. 163-168.

10. Abdelkareem M. h gp. Structural Basis of Transcription: RNA Polymerase Backtracking and Its Reactivation // Molecular Cell. 2019. T. 75, № 2. C. 298-309.e4.

11. Roghanian M., Yuzenkova Y., Zenkin N. Controlled interplay between trigger loop and Gre factor in the RNA polymerase active centre // Nucleic Acids Res. 2011. T. 39, № 10. C. 4352-4359.

12. Abbondanzieri E. A. h gp. Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase // Nature. 2005. T. 438, № 7067. C. 460-465.

13. Shaevitz J. W. h gp. Backtracking by single RNA polymerase molecules observed at near-base-pair resolution // Nature. 2003. T. 426, № 6967. C. 684-687.

14. Dulin D. h gp. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications // Nat Rev Genet. 2013. T. 14, № 1. C. 9-22.

15. Mohapatra S. h gp. Single-Molecule Analysis and Engineering of DNA Motors // Chem. Rev. 2020. T. 120, № 1. C. 36-78.

16. Sitters G. h gp. Acoustic force spectroscopy // Nat Methods. 2015. T. 12, № 1. C. 47-50.

17. Davenport R. J. h gp. Single-molecule study of transcriptional pausing and arrest by E. coli RNA polymerase // Science. 2000. T. 287, № 5462. C. 2497-2500.

18. Mejia Y. X., Nudler E., Bustamante C. Trigger loop folding determines transcription rate of Escherichia coli's RNA polymerase // Proc Natl Acad Sci U S A. 2015. T. 112, № 3. C. 743-748.

19. Zhang G. h gp. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution // Cell. 1999. T. 98, № 6. C. 811-824.

20. Cramer P., Bushnell D. A., Kornberg R. D. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution // Science. 2001. T. 292, № 5523. C. 18631876.

21. Vassylyev D. G. h gp. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution // Nature. 2002. T. 417, № 6890. C. 712-719.

22. Weixlbaumer A. h gp. Structural basis of transcriptional pausing in bacteria // Cell. 2013. T. 152, № 3. C. 431-441.

23. Kang J. Y. h gp. Mechanisms of Transcriptional Pausing in Bacteria // Journal of Molecular Biology. 2019. T. 431, № 20. C. 4007-4029.

24. Vassylyev D. G. h gp. Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase // Nature. 2007. T. 448, № 7150. C. 157-162.

25. Bae B. h gp. Phage T7 Gp2 inhibition of Escherichia coli RNA polymerase involves misappropriation of o70 domain 1.1 // Proc Natl Acad Sci U S A. 2013. T. 110, № 49. C. 19772-19777.

26. Murakami K. S. X-ray crystal structure of Escherichia coli RNA polymerase o70 holoenzyme // J Biol Chem. 2013. T. 288, № 13. C. 9126-9134.

27. Zuo Y., Wang Y., Steitz T. A. The mechanism of E. coli RNA polymerase regulation by ppGpp is suggested by the structure of their complex // Mol Cell. 2013. T. 50, № 3. C. 430-436.

28. Feklistov A., Darst S. A. Structural basis for promoter-10 element recognition by the bacterial RNA polymerase o subunit // Cell. 2011. T. 147, № 6. C. 1257-1269.

29. Ruff E. F., Record M. T., Artsimovitch I. Initial events in bacterial transcription initiation // Biomolecules. 2015. T. 5, № 2. C. 1035-1062.

30. Zhang Y. h gp. Structural basis of transcription initiation // Science. 2012. T. 338, № 6110. C. 1076-1080.

31. Mooney R. A., Darst S. A., Landick R. Sigma and RNA polymerase: an on-again, off-again relationship? // Mol Cell. 2005. T. 20, № 3. C. 335-345.

32. Murakami K. S. h gp. Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex // Science. 2002. T. 296, № 5571. C. 1285-1290.

33. Alberts B. h gp. Molecular Biology of the Cell. Sixth edition, Onkine-Ausgabe. New York: Garland Science, 2015. 1 c.

34. Larson M. H. h gp. A pause sequence enriched at translation start sites drives transcription dynamics in vivo // Science. 2014. T. 344, № 6187. C. 1042-1047.

35. Borukhov S., Lee J., Laptenko O. Bacterial transcription elongation factors: new insights into molecular mechanism of action // Molecular Microbiology. 2005. T. 55, № 5. C. 1315-1324.

36. Borukhov S., Sagitov V., Goldfarb A. Transcript cleavage factors from E. coli // Cell. 1993. T. 72, № 3. C. 459-466.

37. Komissarova N., Kashlev M. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded // Proc Natl Acad Sci U S A. 1997. T. 94, № 5. C. 1755-1760.

38. Toulme F. h gp. GreA and GreB proteins revive backtracked RNA polymerase in vivo by promoting transcript trimming // EMBO J. 2000. T. 19, № 24. C. 6853-6859.

39. Koulich D. h gp. Domain organization of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB // Journal of Biological Chemistry. Ä© 1997 ASBMB. Currently published by Elsevier Inc; originally published by American Society for Biochemistry and Molecular Biology., 1997. T. 272, № 11. C. 7201-7210.

40. Opalka N. h gp. Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase // Cell. 2003. T. 114, № 3. C. 335-345.

41. Peters J. M., Vangeloff A. D., Landick R. Bacterial transcription terminators: the RNA 3'-end chronicles // J Mol Biol. 2011. T. 412, № 5. C. 793-813.

42. Wilson K. S., von Hippel P. H. Transcription termination at intrinsic terminators: the role of the RNA hairpin // Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. T. 92, № 19. C. 87938797.

43. Peters J. M. h gp. Rho and NusG suppress pervasive antisense transcription in Escherichia coli // Genes Dev. 2012. T. 26, № 23. C. 2621-2633.

44. Richardson J. P. Rho-dependent termination and ATPases in transcript termination // Biochim Biophys Acta. 2002. T. 1577, № 2. C. 251-260.

45. Dutta D. h gp. Linking RNA polymerase backtracking to genome instability in E. coli // Cell. 2011. T. 146, № 4. C. 533-543.

46. Merrikh H. h gp. Co-directional replication-transcription conflicts lead to replication restart // Nature. 2011. T. 470, № 7335. C. 554-557.

47. Sergey Proshkin, A.Rachid Rahmouni, Alexander Mironov E. N. Cooperation Between Translating Ribosomes and RNA Polymerase in Transcription Elongation // SCIENCE. 2010. T. 328, № April. C. 504-509.

48. Gourse R. L. h gp. Transcriptional Responses to ppGpp and DksA // Annu Rev Microbiol. 2018. T. 72. C. 163-184.

49. Laptenko O. h gp. Transcript cleavage factors GreA and GreB act as transient catalytic components of RNA polymerase // EMBO J. 2003. T. 22, № 23. C. 63226334.

50. Perederina A. h gp. Regulation through the Secondary Channel—Structural Framework for ppGpp-DksA Synergism during Transcription // Cell. 2004. T. 118, № 3. C. 297-309.

51. Ma C., Yang X., Lewis P. J. Bacterial Transcription as a Target for Antibacterial Drug Development // Microbiol Mol Biol Rev. 2016. T. 80, № 1. C. 139-160.

52. Mosaei H., Harbottle J. Mechanisms of antibiotics inhibiting bacterial RNA polymerase // Biochem Soc Trans. 2019. T. 47, № 1. C. 339-350.

53. Belogurov G. A. h gp. Transcription inactivation through local refolding of the RNA polymerase structure // Nature. 2009. T. 457, № 7227. C. 332-335.

54. Artsimovitch I., Seddon J., Sears P. Fidaxomicin is an inhibitor of the initiation of bacterial RNA synthesis // Clin Infect Dis. 2012. T. 55 Suppl 2, № Suppl 2. C. S127-131.

55. Yang X., Ma C., Lewis P. J. Identification of inhibitors of bacterial RNA polymerase // Methods. 2015. T. 86. C. 45-50.

56. Artsimovitch I. h gp. Tagetitoxin inhibits RNA polymerase through trapping of the trigger loop // J Biol Chem. 2011. T. 286, № 46. C. 40395-40400.

57. Degen D. h gp. Transcription inhibition by the depsipeptide antibiotic salinamide A // Elife. 2014. T. 3. C. e02451.

58. Delgado M. A. h gp. Escherichia coli RNA polymerase is the target of the cyclopeptide antibiotic microcin J25 // J Bacteriol. 2001. T. 183, № 15. C. 45434550.

59. Pavlova O. h gp. Systematic structure-activity analysis of microcin J25 // J Biol Chem. 2008. T. 283, № 37. C. 25589-25595.

60. Braffman N. R. h gp. Structural mechanism of transcription inhibition by lasso peptides microcin J25 and capistruin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2019. T. 116, № 4. C. 1273-1278.

61. Arnison P. G. h gp. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature // Nat Prod Rep. 2013. T. 30, № 1. C. 108-160.

62. Hegemann J. D. h gp. Lasso peptides: an intriguing class of bacterial natural products // Acc Chem Res. 2015. T. 48, № 7. C. 1909-1919.

63. Maksimov M. O., Pan S. J., James Link A. Lasso peptides: structure, function, biosynthesis, and engineering // Nat Prod Rep. 2012. T. 29, № 9. C. 996-1006.

64. Solbiati J. O. h gp. Sequence analysis of the four plasmid genes required to produce the circular peptide antibiotic microcin J25 // J Bacteriol. 1999. T. 181, № 8. C. 26592662.

65. Yuzenkova J. h gp. Mutations of bacterial RNA polymerase leading to resistance to microcin j25 // J Biol Chem. 2002. T. 277, № 52. C. 50867-50875.

66. Li Y. h gp. Characterization of Sviceucin from Streptomyces Provides Insight into Enzyme Exchangeability and Disulfide Bond Formation in Lasso Peptides // ACS Chem Biol. 2015. T. 10, № 11. C. 2641-2649.

67. Hegemann J. D. h gp. Lasso peptides from proteobacteria: Genome mining employing heterologous expression and mass spectrometry // Biopolymers. 2013. T. 100, № 5. C. 527-542.

68. Yan K.-P. h gp. Dissecting the maturation steps of the lasso peptide microcin J25 in vitro // Chembiochem. 2012. T. 13, № 7. C. 1046-1052.

69. Maksimov M. O., Pelczer I., Link A. J. Precursor-centric genome-mining approach for lasso peptide discovery // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. T. 109, № 38. C. 15223-15228.

70. Mukhopadhyay J. h gp. Antibacterial peptide microcin J25 inhibits transcription by binding within and obstructing the RNA polymerase secondary channel // Mol Cell. 2004. T. 14, № 6. C. 739-751.

71. Tan S. h gp. The Lasso Peptide Siamycin-I Targets Lipid II at the Gram-Positive Cell Surface // ACS Chem Biol. 2019. T. 14, № 5. C. 966-974.

72. Knappe T. A. h gp. Isolation and structural characterization of capistruin, a lasso peptide predicted from the genome sequence of Burkholderia thailandensis E264 // J Am Chem Soc. 2008. T. 130, № 34. C. 11446-11454.

73. Kuznedelov K. h gp. The antibacterial threaded-lasso peptide capistruin inhibits bacterial RNA polymerase // J Mol Biol. 2011. T. 412, № 5. C. 842-848.

74. Allen C. D. h gp. Thermal Unthreading of the Lasso Peptides Astexin-2 and Astexin-3 // ACS Chem Biol. 2016. T. 11, № 11. C. 3043-3051.

75. Zimmermann M. h gp. The astexin-1 lasso peptides: biosynthesis, stability, and structural studies // Chem Biol. 2013. T. 20, № 4. C. 558-569.

76. Metelev M. h gp. Acinetodin and Klebsidin, RNA Polymerase Targeting Lasso Peptides Produced by Human Isolates of Acinetobacter gyllenbergii and Klebsiella pneumoniae // ACS Chem Biol. 2017. T. 12, № 3. C. 814-824.

77. Burkhart B. J. h gp. A prevalent peptide-binding domain guides ribosomal natural product biosynthesis // Nat Chem Biol. 2015. T. 11, № 8. C. 564-570.

78. Koos J. D., Link A. J. Heterologous and in Vitro Reconstitution of Fuscanodin, a Lasso Peptide from Thermobifida fusca // J Am Chem Soc. 2019. T. 141, № 2. C. 928-935.

79. Dangkulwanich M. h gp. Molecular Mechanisms of Transcription through Single-Molecule Experiments // Chem. Rev. 2014. T. 114, № 6. C. 3203-3223.

80. Larson M. H., Landick R., Block S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: one singular sensation, every little step it takes // Mol Cell. 2011. T. 41, № 3. C. 249262.

81. Tetone L. E. h gp. Dynamics of GreB-RNA polymerase interaction allow a proofreading accessory protein to patrol for transcription complexes needing rescue // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2017. T. 114, № 7.

82. Deboer C. h gp. Streptolydigin, a new antimicrobial antibiotic. I. Biologic studies of streptolydigin // Antibiot Annu. 1955. T. 3. C. 886-892.

83. McClure W. R. On the mechanism of streptolydigin inhibition of Escherichia coli RNA polymerase // J Biol Chem. 1980. T. 255, № 4. C. 1610-1616.

84. Plevani P. h gp. In vivo and in vitro effects of rifampicin and streptolydigin on transcription of Kluyveromyces lactis in the presence of nystatin // Nucleic Acids Res. 1975. T. 2, № 2. C. 239-255.

85. Siddhikol C., Erbstoeszer J. W., Weisblum B. Mode of action of streptolydigin // J Bacteriol. 1969. T. 99, № 1. C. 151-155.

86. Karwowski J. P. h gp. Tirandalydigin, a novel tetramic acid of the tirandamycin-streptolydigin type. I. Taxonomy of the producing organism, fermentation and biological activity. // J. Antibiot. 1992. T. 45, № 7. C. 1125-1132.

87. Mazumder A. h gp. RNA polymerase clamp conformational dynamics: long-lived states and modulation by crowding, cations, and nonspecific DNA binding // Nucleic Acids Res. 2021. T. 49, № 5. C. 2790-2802.

88. Sosunov V. h gp. Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase // EMBO J. 2003. T. 22, № 9. C. 2234-2244.

89. Nudler E. RNA polymerase active center: the molecular engine of transcription // Annu Rev Biochem. 2009. T. 78. C. 335-361.

90. Ashkin A. h gp. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles // Opt Lett. 1986. T. 11, № 5. C. 288.

91. Heller I. h gp. Optical tweezers analysis of DNA-protein complexes // Chem Rev. 2014. T. 114, № 6. C. 3087-3119.

92. Yin H. h gp. Transcription against an applied force // Science. 1995. T. 270, № 5242. C. 1653-1657.

93. Schafer D. A. h gp. Transcription by single molecules of RNA polymerase observed by light microscopy // Nature. 1991. T. 352, № 6334. C. 444-448.

94. Wang M. D. h gp. Force and Velocity Measured for Single Molecules of RNA Polymerase // Science. 1998. T. 282, № 5390. C. 902-907.

95. Neuman K. C. h gp. Ubiquitous Transcriptional Pausing Is Independent of RNA Polymerase Backtracking // Cell. 2003. T. 115, № 4. C. 437-447.

96. Adelman K. h gp. Single molecule analysis of RNA polymerase elongation reveals uniform kinetic behavior // Proc Natl Acad Sci U S A. 2002. T. 99, № 21. C. 1353813543.

97. Forde N. R. h gp. Using mechanical force to probe the mechanism of pausing and arrest during continuous elongation by Escherichia coli RNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. T. 99, № 18. C. 11682-11687.

98. Artsimovitch I., Landick R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. T. 97, № 13. C. 7090-7095.

99. Herbert K. M. h gp. Sequence-resolved detection of pausing by single RNA polymerase molecules // Cell. 2006. T. 125, № 6. C. 1083-1094.

100.Landick R. The regulatory roles and mechanism of transcriptional pausing // Biochem Soc Trans. 2006. T. 34, № Pt 6. C. 1062-1066.

101.Herbert K. M. h gp. E. coli NusG Inhibits Backtracking and Accelerates Pause-Free Transcription by Promoting Forward Translocation of RNA Polymerase // Journal of Molecular Biology. 2010. T. 399, № 1. C. 17-30.

102.Zhou J. h gp. Applied force provides insight into transcriptional pausing and its modulation by transcription factor NusA // Mol Cell. 2011. T. 44, № 4. C. 635-646.

103.Lipfert J., Hao X., Dekker N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers // Biophys J. 2009. T. 96, № 12. C. 5040-5049.

104.Dulin D. h gp. Elongation-Competent Pauses Govern the Fidelity of a Viral RNA-Dependent RNA Polymerase // Cell Reports. 2015. T. 10, № 6. C. 983-992.

105.Janissen R. h gp. High-throughput single-molecule experiments reveal heterogeneity, state switching, and three interconnected pause states in transcription // Cell Reports. 2022. T. 39, № 4. C. 110749.

106.Revyakin A. h gp. Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching // Science. 2006. T. 314, № 5802. C. 1139-1143.

107.Revyakin A. h gp. Single-molecule DNA nanomanipulation: detection of promoter-unwinding events by RNA polymerase // Methods Enzymol. 2003. T. 370. C. 577598.

108.Mejia Y. X. h gp. Thermal probing of E. coli RNA polymerase off-pathway mechanisms // J Mol Biol. 2008. T. 382, № 3. C. 628-637.

109.Saba J. h gp. The elemental mechanism of transcriptional pausing // eLife. 2019. T. 8. C. e40981.

110.Janissen R. h gp. High-throughput single-molecule experiments reveal heterogeneity, state switching, and three interconnected pause states in transcription // Cell Reports. 2022. T. 39, № 4. C. 110749.

111.Depken M., Galburt E. A., Grill S. W. The origin of short transcriptional pauses // Biophys J. 2009. T. 96, № 6. C. 2189-2193.

112.Kamsma D. h gp. Tuning the Music: Acoustic Force Spectroscopy (AFS) 2.0 // Methods. 2016. T. 105. C. 26-33.

113.Kamsma D., Wuite G. J. L. Single-Molecule Measurements Using Acoustic Force Spectroscopy (AFS) // Methods Mol Biol. 2018. T. 1665. C. 341-351.

114.Sorkin R. h gp. Probing cellular mechanics with acoustic force spectroscopy // Mol Biol Cell. 2018. T. 29, № 16. C. 2005-2011.

115.Taris K.-K. H., Kamsma D., Wuite G. J. L. Single-Cell Measurements Using Acoustic Force Spectroscopy (AFS) // Methods Mol Biol. 2024. T. 2694. C. 467477.

116.Wang Y. J. h gp. Combining DNA scaffolds and acoustic force spectroscopy to characterize individual protein bonds // Biophys J. 2023. T. 122, № 12. C. 25182530.

117.Paik D. H., Roskens V. A., Perkins T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: an efficient, ligation-free method // Nucleic Acids Res. 2013. T. 41, № 19. C. e179.

118.Svetlov V., Artsimovitch I. Purification of bacterial RNA polymerase: tools and protocols // Methods Mol Biol. 2015. T. 1276. C. 13-29.

119.Burgess R. R. Purification of overproduced Escherichia coli RNA polymerase sigma factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from Sarkosyl // Methods Enzymol. 1996. T. 273. C. 145-149.

120.Zhi H., Jin D. J. Purification of highly-active and soluble Escherichia coli sigma 70 polypeptide overproduced at low temperature // Methods Enzymol. 2003. T. 370. C. 174-180.

121.Borukhov S., Goldfarb A. Purification and assay of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB // Methods Enzymol. 1996. T. 274. C. 315-326.

122.Odijk T. Stiff Chains and Filaments under Tension // Macromolecules. 1995. T. 28, № 20. C. 7016-7018.

123.Janissen R. h gp. Global DNA Compaction in Stationary-Phase Bacteria Does Not Affect Transcription // Cell. 2018. T. 174, № 5. C. 1188-1199.e14.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Благодарности

Автор диссертационной работы выражает глубокую признательность своим научным руководителям — Михаилу Алексеевичу Ходорковскому и Константину Викторовичу Северинову — за бесценное научное руководство, экспертизу и предоставленную возможность реализации уникальных научных изысканий, которые легли в основу настоящего исследования. Отдельная благодарность направлена Сергею Ионовичу Борухову за погружение в многогранный мир транскрипции, а также за щедрое интеллектуальное наставничество, подкреплённое беспрецедентным опытом в области молекулярной биологии.

Искренняя признательность выражена коллегам — Георгию Побегалову, Антону Сабанцеву, Михаилу Панфилову, Полине Павлиновой и Алине Потысьевой — за неоценимую помощь в проведении экспериментальных исследований, плодотворную коллаборацию и творческую свободу, позволившую воплощать в жизнь смелые научные идеи.

Автор выражает благодарность коллективу НИК «Нанобиотехнологии» в лице Александра Алексеева, Александры Васильевой, Марины Абрамовой, Алексея Ведяйкина, Наталии Морозовой, Марии Якуниной, Алексея Мельникова и Павла Сердобинцева — за профессиональную синергию, методическую поддержку и создание уникальной научной среды, способствующей прорывным открытиям.

Особенные слова признательности хочу выразить Валентине Арсениевой, за неугасающую веру в научные устремления автора и безусловную поддержку.