Моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома b5 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Смолинская, Юлия Юрьевна

• Смолинская, Юлия Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Смолинская, Юлия Юрьевна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Моделирование липидных бислоев

2.1.1. Необходимость моделирования бислоев

2.1.2. Типы моделей мембран

2.1.3. Методы моделирования

2.1.4. Моделирование молекулярной динамики бислоя

2.1.5. Верификация моделей мембран

2.2. Моделирование мембранных белков и пептидов

2.2.1. Моделирование мембранных пептидов

2.2.2. Моделирование белков в липидном бислое

2.2.3. МАО А

2.3. Функции и свойства цитохрома Ь

2.3.1. Функции, структура и свойства цитохрома Ь

2.3.2. Моделирование мембраносвязанного домена цитохрома Ь

3. Объекты и методы

3.1. Аппаратная и программная база работы

3.2. Объекты

3.3. Конструирование молекулы ДПФХ

3.4. Конструирование липидного бислоя из ДПФХ

3.5. Оптимизация бислоя из ДПФХ

3.6. Верификация модели мембраны

3.7. Подтверждение пригодности модели бислоя из ДПФХ для моделирования мембранных белков

3.8. Конструирование цитохрома Ь5 в петлевой и трансмембранной топологии

3.9. Оптимизация модели бислоя для моделирования цитохрома Ь5 в трансмембранной и петлевой топологиях

3.10. Оптимизация цитохрома Ь

4. Результаты

4.1. Построение и оптимизация модели липидного бислоя из ДПФХ

4.1.1. Моделирование МД бислоя из ДПФХ

4.1.2. Анализ результатов моделирования МД бислоя из ДПФХ 51 4.2 Моделирование цитохрома Ь5 в мембранном окружении

4.2.1. Моделирование МД цитохрома Ь5 в трансмембранной топологии

5. Обсуждение

6. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома b5»

Цитохром Ь5 является мембранным белком, который присутствует в различных клеточных мембранах. Основная физиологическая функция Ь5 - латеральный и межмембранный перенос электронов, включая восстановление цитохромов Р450 (Archakov et al., 1974), реакции десатурации жирных кислот (Strittmatter et al., 1974), биосинтез холестерола (Clarke et al., 2004) и реакции гидроксилирования (Vergeres et al., 1995).

Микросомальный цитохром Ь5 представляет собой двухдоменный мембранный белок, "заякоренный" С-концом в мембране. С помощью трипсина он может быть разделен на водорастворимый гем-содержащий глобулярный домен, сохраняющий физико-химические и окислительно-восстановительные свойства Ь5, и мембранный гидрофобный домен (Tajima et al., 1978). Пространственная структура водорастворимого домена была решена с помощью рентгеноструктурного анализа (Mathews et al., 1972а; Mathews et al., 19726) и доступна в белковом банке PDB (Berman et al., 2000). Пространственная структура мембраносвязанного домена до сих пор остается неизвестной. Предполагают 2 возможные мембранные топологии этого домена. Согласно одной из них мембранный участок Ь5 имеет форму шпильки - С-конец белка выходит из мембраны с той же стороны, где расположен белок (Ozols, 1989; Tajima et al., 1980). По другой гипотезе - мембранный домен Ь5 является трансмембранным и пересекает мембрану насквозь (Vergeres et al., 1995).

Анализ пространственной структуры белков базируется на комбинации методов молекулярной биологии, биохимии, ЯМР и кристаллографии (McPherson, 2002; Drenth, 1994). Однако такие подходы пригодны в основном для водорастворимых белков и поэтому пока определены только единичные структуры мембранных белков. Это обусловлено существующими проблемами их экспрессии и кристаллизации. Дефицит данных о молекулярном строении мембранных белков стимулирует применение методов молекулярного моделирования (Chang et al., 1996).

Поскольку конформация мембраносвязанных частей белков обусловлена взаимодействием с липидным бислоем, то для корректного моделирования мембранных белков необходимо использовать адекватную среду в виде модели липидного бислоя с двумя водными фазами с обеих сторон. В последние годы моделированию таких белков в мембранном окружении было посвящено много работ (Saiz et al., 2002; Forrest et al., 2000; Tieleman et al., 1997). Однако, до сих пор проблема создания адекватной модели липидного бислоя, хорошо отражающей свойства биологической мембраны, остается.

Оценку достоверности построенной модели бислоя и ее пригодности для моделирования мембранных белков необходимо проводить на основе расчетных и экспериментальных данных (Ивков и др., 1981; Ивков и др., 1982). Для верификации модели бислоя могут быть использованы такие расчетные параметры, как объем и площадь поверхности бислоя, приходящиеся на одну молекулу фосфолипида; распределение различных групп атомов вдоль нормали к бислою; ориентация отдельных метиленовых фрагментов алифатической цепи (параметр порядка) (McCabe et а]., 1994). Для проверки пригодности модели бислоя для моделирования его структуры необходимо выполнение контрольного моделирования с использованием периферического белка, структура и топология которого известны. В белковом банке PDB (Вегшап et al., 2000) имеется всего 88 структур мембраносвязанных белков (http://blanco.biomol.uci.edu /MembraneProteinsxtal.html), большинство из которых являются большими интегральными белками (Ulmschneider et al., 2001). Поэтому в качестве контрольного мембраносвязанного периферического белка была выбрана моноаминооксидаза А (МАО А). Ее структура и мембранная топология недавно были решены методами белковой кристаллографии (Ma et al., 2004).

Целью данной работы было моделирование пространственной структуры цитохрома Ь5 в мембранном окружении и анализ возможных вариантов топологии мембраносвязанного домена этого белка.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать равновесную модель фосфолипидного бислоя из молекул дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) в водном окружении.

2. Проверить пригодность модели фосфолипидного бислоя для моделирования периферических мембранных белков на примере моноаминоксидазы А (МАО А).

3. Выполнить моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома Ь5 в мембранном окружении.

4. Выполнить анализ возможных вариантов мембранной топологии цитохрома Ь5 и сравнить их с известными экспериментальными данными.

Научная новизна и практическая значимость работы

Построена модель липидного бислоя, которая хорошо согласуется с известными экспериментальными данными (объем и площадь, занимаемые одной молекулой ДПФХ, толщина бислоя, порядок ацильных цепей, профили плотности атомов). На примере мембранного белка МАО А было показано, что модель бислоя может быть использована для моделирования мембранных белков.

Впервые выполнено моделирование молекулярной динамики полноразмерного цитохрома Ь5 в мембранном окружении в трансмембранной и петлевой топологиях. Моделирование показало стабильность обоих вариантов, что предполагает существование Ь5 в двух топологиях и объясняет противоречивые экспериментальные данные.

Впервые показано, что конформация участка, соединяющего водорастворимый и мембраносвязанный домены может играть важную функциональную роль в регуляции взаимодействия цитохрома Ь5 с редокс-партнерами.

Полученные модели полноразмерного цитохрома Ь5 могут быть использованы для изучения взаимодействия цитохрома Ь5 с редокс-партнерами в плоскости мембраны.

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на следующих конференциях:

1. 2th International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow-Pies-Moscow, 2004);

2. XII Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство" (Москва, 2005);

3. 4-я Национальная конференция "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины" (Москва, 2005);

4. 4-я Всероссийская конференция "Молекулярное моделирование" (Москва, 2005);

5. 14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics (Dallas, USA, 2005).

Апробация диссертации состоялась 5 мая 2005 года на межлабораторном семинаре ГУ НИИ биомедицинской химии им В.Н. Ореховича РАМН.

По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Построена модель липидного бислоя из ДПФХ, которая хорошо согласуется с экспериментальными данными. На примере мембранного белка МАО А, структура которого известна, показано, что модель бислоя может быть успешно использована для моделирования и изучения топологии мембранных белков.

2. Построены модели цитохрома Ь5 в мембранном окружении в трансмембранной и петлевой топологиях. Моделирование молекулярной динамики показало стабильность обоих вариантов, что предполагает существование Ь5 в двух топологиях и объясняет противоречивые экспериментальные данные.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Смолинская, Юлия Юрьевна

6. ВЫВОДЫ

1. Построена компьютерная модель среды для моделирования периферических мембранных белков, состоящая из липидного бислоя и двух водных фаз. На примере мембранного белка моноаминоксидазы А с известной пространственной структурой и мембранной топологией показано, что данная среда может быть использована для моделирования мембранных белков.

2. Построены модели цитохрома Ь5 в трансмембранной и петлевой топологиях. Моделирование молекулярной динамики показало стабильность обоих вариантов, что предполагает возможное существование Ь5 в двух топологиях и объясняет различные экспериментальные данные.

3. Анализ построенных моделей цитохрома Ь5 показал, что конформация участка Ser89-Aspl03, соединяющего водорастворимый и мембраносвязанный домены, может играть важную роль в регуляции взаимодействия цитохрома Ь5 с его редокс-партнерами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Смолинская, Юлия Юрьевна, 2005 год

1. Abeles I., Frey P., Jencks W. Biochemistry. Jones and Bartlett. Boston. 1992. 218.

2. Allen F.H. The Cambridge Structural Database: a quarter of a million crystal structures and rising.// Acta Cryst. 2002. B58. 380-388. (http://www.ccdc.cam.ac.uk)

3. Allen T.W., Bastug Т., Kuyucak S., Chung S.H. Gramicidin A channel as a test ground for molecular dynamics force fields.// Biophys. J. 2003. 84. 4. 2159-68.

4. Archakov A.I., Karyakin A.V., Skulachev V.P. Intermembrane electron transfer in mitochondrial and microsomal systems.// FEBS Lett. 1974. 39. 239-242.

5. Areas E.P., Pascutti P.G., Schreier S., Mundin K.C., Bisch P.M. Molecular dynamics at a cytoplasm/membrane interface of a signal sequence from an E. coli maltoporin.// Braz. J. Med. Biol. Res. 1994. 27. 527-33.

6. Bachar, M., Becker, O.M. Protein-induced membrane disorder: a molecular dynamics study of melittin in a dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer.// Biophys. J. 2000. 78. 13591375.

7. Balali-Mood K, Harroun ТА, Bradshaw JP. Molecular dynamics simulations of a mixed DOPC/DOPG bilayer.// Eur Phys J E Soft Matter. 2003. 1.135-40.

8. Banci L., Bertini I., Branchini B.R., Hajieva P., Spyroulias G.A., Turano P. Dimethyl propionate ester heme-containing cytochrome b5: structure and stability. //J.Biol.Inorg.Chem. 2001. 6. 490-503.

9. Bechinger B. Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin.//J. Mem. Biol. 1997.156.197-211.

10. Ben-Tal N., A. Ben-Shaul A. Nicholls and B. Honig. Free-energy determinants of alpha-helix insertion into lipid bilayers.// Biophys. J. 1996. 70.1803-1812.

11. Berendsen H.J.C., D. van der Spoel, van Drunen R. GROMACS:A message-passing parallel molecular dynamics implementation.// Сотр. Phys. Comm. 1995. 95. 43-56.

12. Berendsen H.J.C., J.P.M. Postma, W. F. Van Gunsteren, A. DiNola, J.R. Haak. Molecular dynamics with coupling to an external bath.// J. Chem. Phys. 1984. 81. 3684-3690.

13. Berger O., Edholm O., Jahnig F. Molecular dynamics simulations of a fluid bilayer of dipalmitoylphosphatidylcholine at full hydration, constant pressure, and constant temperature.// Biophys. J. 1997. 72. 2002-2013.

14. Berman H.M., Westbrrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank.// Nucleic Acids Res. 2000. 28. 235-242. (http://www.rcsb.org/pdb/)

15. Berneche S., Nina M., Roux B. Molecular dynamics simulation of melittin in a dimyristoylphosphatidylcholine bilayer membrane.// Biophys. J. 1998. 75.1603-1618.

16. Biggin P.C., Sansom M.S. Interactions of alpha-helices with lipid bilayers: a review of simulation studies.// Biophys Chem. 1999.76.3.161-183.

17. Biggin P.C., Sansom M.S.P. Simulation of voltage-dependent interactions of c-helical peptides with lipid bilayers.// Biophys. Chem. 1996. 60. 99-110.

18. Blazyk J.F., Melchoir D.L., Steim J.M. An automated differential scanning dilatometer.// Anal Biochem. 1975. 68.2.586-599.

19. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.J., Swaminathan S., Karplus M. CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations.//J. Сотр. Chem. 1983. 4. 187-217.

20. Buldt G., Gaily H.U., Seelig J., Zaccai G. Neutron diffraction studies on phosphatidylcholine model membranes. I. Head group conformation.// J Mol. Biol. 1979. 134.4. 673-691.

21. Buldt G., Gaily H.U., Seeling J., Zaccai G. Neutron diffraction studies on phosphatidylcholine model membranes. I. Head group conformation. //J. Mol. Biol. 1979. 134. 673-691.

22. Burkhart B.M., Li N., Langs D.A., Pangborn W.A., Duax W.L. The conducting form of gramicidin A is a right-handed double-stranded double helix.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1998. 95. 22.12950-12955.

23. Capener C.E., Sansom M.S.P. MD Simulations of а К channel model-sensitivity to changes in ions, waters and membrane environment.// J. Phys. Chem. В 2002.106. 4543-4551.

24. Chang Y.T., Stiffelman O.B., Loew G.H. Computer modeling of 3D structures of cytochrome P450.//Biochimie. 1996. 78. 771-779.

25. Clarke T.A., Im S.C., Bidwai A., Waskell L. The role of the length and sequence of the linker domain of cytochrome b5 in stimulating cytochrome P450 2B4 catalysis.// J. Biol. Chem. 2004. 279. 35.36809-36818.

26. Darden Т., York D., Pedersen L. Particle mesh ewald: An N log (N) method for ewald sums in large systems.// J. Chem. Phys. 98.1993.10089-10092.

27. Deber C.M., Li S.C. Peptides in membranes: helicity and hydrophobicity.// Biopolymers. 1995.37. 295-318

28. Douliez J.-P., Leonard A., Dufourc EJ. Restatement of order parameters in biomembranes: calculation of C-C bond order parameters from C-D quadrupolar splittings.// Biophys. J. 1995. 68.1727-1739.

29. Drenth J. Principles of Protein X-ray Crystallography.// Springer Verlag, New York. 1994. 341.30