Молекулярное моделирование взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами на примере формиатдегидрогеназы и поли(ADP-рибозо)-полимеразы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Нилов, Дмитрий Константинович

• Нилов, Дмитрий Константинович
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Нилов, Дмитрий Константинович

Список сокращений.

Введение.

Литературный обзор.

1.1 Строение и механизм изучаемых ферментов.

1.1.1 Строение и механизм формиатдегидрогеназы.

1.1.2 Строение и механизм поли(АВР-рибозо)-полимеразы.

1.2 Методы молекулярного моделирования.

1.2.1 Метод молекулярного докинга.

1.2.2 Метод молекулярной динамики.

1.2.3 Гибридные QM/MM расчеты.

1.2.4 Минимизация энергии.

1.2.5 Силовое поле и пакет программ Amber.

1.2.6 Параметризация молекул.

Экспериментальная часть.

2.1 Пакеты программ, использованные в работе.

2.2 Параметризация лигандов.

2.3 Молекулярно-динамические симуляции.

2.3.1 Подготовка стартовых моделей ферментов.

2.3.2 Протокол молекулярно-динамических симуляций.

2.3.3 Управляемая молекулярная динамика.

2.3.4 QM/MM симуляция.

2.4 Молекулярный докинг.

2.5 Измерение ферментативной активности.

Результаты и обсуждение.

3.1 Моделирование формиатдегидрогеназы.

3.1.1 Особенности открытой и закрытой конформации.

3.1.2 Комплекс Михаэлиса.

3.1.3 Транспорт через субстратный канал.

3.1.4. Расчет каталитической константы.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Нилов, Дмитрий Константинович

Основные результаты и выводы

1. Показано, что в активном центре открытой конформации ФДГ возможно лишь непродуктивное связывание субстрата. Напротив, закрытая конформация обеспечивает необходимую жесткость участка связывания и образование комплекса Михаэлиса с остатками А^284, АэпМб и Не 122.

2. Описан механизм транспорта формиата в активный центр ФДГ через субстратный канал, принципиальную роль в котором играет остаток А^284. Обнаружено, что субстратный канал блокируется в закрытой конформации фермента, что обеспечивает изоляцию активного центра в процессе катализа.

3. Разработана методика компьютерного скрининга новых ингибиторов ПАРП, включающая стадию молекулярного докинга в активный центр модели фермента и стадию структурной фильтрации результатов докинга. Высокая эффективность методики подтверждена экспериментальными данными.

4. В результате скрининга специализированной библиотеки производных амидов отобран ряд новых потенциальных ингибиторов ПАРП, которые рекомендованы для синтеза и экспериментальной проверки ингибирующей активности.

Благодарности

Автор выражает признательность:

• В.К. Швядасу за руководство

• С.Н. Михайлову на научное консультирование

• A.JI. Захаренко и О.И. Лаврик за экспериментальную проверку активности ингибиторов ПАРП

• И.Г. Шебалину за ценные научные советы

• В.О. Попову за предоставленный пакет программ Amber 10

• Д.А. Суплатову, B.C. Стройлову и И.Г. Халиуллину за технические советы

Работа явилась частью исследований по темам государственного контракта №02.512.11.2247 «Поиск селективных ингибиторов поли(АГ)Р-рибоза)-полимеразы 1 человека и определение их биологических и фармакологических свойств» в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» и гранта РФФИ 09-04-92744-ННИОМа.

3.2.5. Заключение

Проведен поиск новых ингибиторов ПАРП путем виртуального скрининга библиотек химических соединений. Показано, что наиболее эффективным методом предсказания ингибиторных свойств соединений т яШсо является комбинаторный подход, соединяющий технологию молекулярного докинга с последующей структурной фильтрацией результатов. После успешного тестирования методологии поиска на известных ингибиторах ПАРП провели скрининг коммерческой библиотеки «случайных» соединений (более 300 ООО) с последующей экспериментальной проверкой ингибирующей активности отобранных веществ. В результате было выявлено несколько ингибиторов ПАРП, однако наиболее активные из них имели описанный ранее элемент скаффолда, т.е. не являлись принципиально новыми ингибиторами. Дальнейший поиск ингибиторов проводили в библиотеке производных амидов, сконструированной т яШсо с учетом структурных особенностей известных ингибиторов ПАРП. В результате был отобран ряд потенциальных ингибиторов ПАРП с оригинальной структурой, которые рекомендованы для синтеза и экспериментальной проверки ингибирующей активности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Нилов, Дмитрий Константинович, 2011 год

1. Popov, V.O., and Lamzin, V.S. NAD+-dependent formate dehydrogenase. (1994). Biochem. J., 301, 625-643.

2. Seelbach, K., Riebel, В., Hummel, W., Kula M.R., Tishkov, V.I., Egorov, A.M., Wandrey, C., and Kragl, U. A novel, efficient regenerating method of NADPH using a new formate dehydrogenase. (1996) Tetrahedron Lett., 37, (9), 1377-1380.

3. Тишков В.И., Попов, В.О. Механизм действия формиатдегидрогеназы и ее практическое применение. (2004) Биохимия, 69, 1537-1554.

4. Lamzin, V.S., Dauter, Z., Popov, V.O., Harutyunyan, E.H., and Wilson, K.S. High resolution structures oh holo and apo formate dehydrogenase. (1994) J. Mol. Biol., 236, 759785.

5. Шабалин И.Г., Поляков K.M., Тишков В.И., Попов В.О. Пространственная структура НАД+-зависимой формиатдегидрогеназы из бактерии Moraxella sp. C-l. (2009) Acta Naturae, 3, 98-102.

6. Popov, V.O., Tishkov, V.I. NAD+-dependent formate dehydrogenase. From a model enzyme to a versatile biocatalyst. (2003) Protein Structures: Kaleidoscope of Structural Properties and Functions, Research Signpost, Kerala, India, 441-473.

7. Попов B.O., Родионов Ю.В., Егоров A.M., Березин И.В. NAD-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. (1978) Биоорган, химия, 4, 117129.

8. Schiott, В., Zheng, Y.-J., and Bruice, Т.С. Theoretical investigation of the hydride transfer from formate to NAD and the implications for the catalytic mechanism of formate dehydrogenase. (1998) J. Am. Chem. Soc., 120, 7192-7200.

9. Torres, R.A., Schiott, В., and Bruice, T.C. Molecular dynamics simulations of ground and transition states for the hydride transfer from formate to NAD+ in the active site of formate dehydrogenase. (1999) J.Am.Chem.Soc., 121, 8164-8173.

10. Castillo, R., Oliva, M., Marti, S., and Moliner V. A theoretical study of the catalytic mechanism of formate dehydrogenase. (2008) J. Phys. Chem. В, 112, 10012-10022.

11. Тишков В.И., Галкин А.Г., Егоров A.M. NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101: клонирование, экспрессия и изучение структуры гена. (1991) Докл. Акад. Наук СССР, 317, 345-348.

12. Jagtap, P., and Szabo, С. PoIy(ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. (2005) Nat. Rev. Drug Discov., 4, 421-440.

13. Ame, J.C., Spenlehauer, C., and de Murcia, G. The PARP superfamily. (2004) Bioessays, 26, 882-893.

14. Ruf, A., Mennissier de Murcia, J., de Murcia, G., and Schulz, G.E. Structure of the catalytic fragment of poly(AD-ribose) polymerase from chicken. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7481-7485.

15. Bell, C.E., and Eisenberg, D. Crystal structure of diphtheria toxin bound to nicotinamide adenine dinucleotide. (1996) Biochemistry, 35, 1137-1149.

16. Marsischky, G.T., Wilson, B.A., and Collier, R.J. Role of glutamic acid of human poly-ADP-ribose polymerase in polymer formation. (1995) J. Biol. Chem., 270, 3247-3254.

17. Ruf, A., de Murcia, G., and Schulz, G.E. Inhibitor and NAD+ binding to poly(ADP-ribose) polymerase as derived from crystal structures and homology modeling. (1998) Biochemistry, 37, 3893-3900.

18. Ruf, A., Rolli, V., de Murcia, G., and Schulz, G.E. The mechanism of the elongation and branching reaction of poly(ADP-ribose) polymerase as derived from crystal structures and mutagenesis. (1998) J. Mol. Biol, 278, 57-65.

19. Keith, G., Desgres, J., and de Murcia, G. Use of two-dimensional thin-layer chromatography for components study of poly(adenosine diphosphate ribose) (1990) Anal. Biochem., 191, 309-313.

20. Banasik, M., and Ueda, K. Inhibitors and activators of ADP-ribosylation reactions. (1994) Mol. Cell. Biochem., 138, 185-197.

21. Milam, K.M., and Cleaver, J.E. Inhibitors of poly(adenosine diphosphate-ribose) synthesis: effect on other metabolic processes. (1984) Science, 223, 589-591.

22. Durkacz, B.W., Omidiji, O., Gray, D.A., and Shall, S. (ADP-ribose)n participates in DNA excision repair. (1980) Nature (London), 283, 593-596.

23. Purnell, M.R., and Whish, W.J.D. Novel inhibitors of poly(ADP-ribose) synthetase. (1980) Biochem. J., 185, 775-777.

24. Borek, C., Morgan, W.F., Ong, A., and Cleaver, J.E. Inhibition of malignant transformation in vitro by inhibitors of poIy(ADP-ribose) synthesis. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 243-247.

25. Purnell, M.R., Kidwell, W.R., Minshall, L., and Wish, W.J.D. Specificity of poly-(ADP-ribose) synthetase inhibitors. (1985) ADP-ribosylation of proteins, Springer-Verlag, Berlin, 98-105.

26. Farzaneh, F., Shall, S., Michels, P., and Borst, P. ADP-ribosyltransferase activity in Trypanosoma brucei. (1985) ADP-ribosylation of proteins, Springer-Verlag, Berlin, 367371.

27. Bauer, P.I., Hakam, A., and Kun, E. Mechanisms of poly(ADP-ribose) polymerase catalysis; mono-ADP-ribosylation of poly(ADP-ribose) polymerase at nanomolar concentrations of NAD. (1986) FEBS Lett., 195, 331-338.

28. Rankin, P.W., Jacobson, E.L., Benjamin, R.C., Moss, J., and Jacobson, M.K. Quantitative studies of inhibitors of ADP-ribosylation in vitro and in vivo. (1989) J. Biol. Chem., 264, 4312-4317.

29. Banasik, M., Komura, H., Shimoyama, M., and Ueda, K. Specific inhibitors of poly(ADP-ribose) synthetase and mono(ADP-ribosyl)transferase. (1992) J. Biol. Chem., 267, 15691575.

30. Tavassoli, M., and Shall, S. Covalent modification of poly(ADP-ribose) polymerase by reactive benzamides. (1992) ADP-ribosylation reactions, Springer-Verlag, New York, 290296.

31. Cepeda, V., Fuertes, M.A., Castilla, J., Alonso, C., Quevedo, C., Soto, M., and Perez, J.M. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) inhibitors in cancer chemotherapy. (2006) Recent Pat. Anticancer Drug Discov., 1, 39-53.

32. Virag, L., and Szabo, C. The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. (2002) Pharmacol. Rev., 54, 375-429.

33. Solis, F.J. and Wets, R.J.-B. Minimization by random search techniques. (1981) Math. Operations Res., 6, 19-30.

34. Hockney, R.W., Goel, S.P., and Eastwood, J. Quiet highresolution computer models of a plasma. (1974) J. Comp. Phys., 14, 148-158.

35. Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., and Schulten, K. Molecular dynamics study of unbinding of the Avidin-Biotin complex. (1997) Biophysical J., 72, 1568-1581.

36. Isralewitz, B., Gao, M., and Shulten, K. Steered molecular dynamics and mechanical functions of proteins. (2001) Curr. Opin. Struct. Biol., 11, 224-230.

37. Crespo, A., Marti, M.A., Estrin, D.A., and Roitberg, A.E. Multiple-steering QM-MM calculation of the free energy profile in chorismate mutase. (2005) J. Am. Chem. Soc., 127, 6940-6941.

38. Jensen, M.O., Park, S., Tajkhorshi, E., and Schulten, K. Energetics of glycerol conduction through aquaglyceroporin GlpF. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6731-6736.

39. Jarzynsky, C. Nonequilibrium equality for free energy differences. (1997) Phys. Rev. Lett., 78, 2690-2693.

40. Berendsen, H.J.C., van der Spoel, D., and van Drunen, R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. (1995) Com. Phys. Comm., 91, 43-56.

41. Walker, R.C., Crowley, M.F., and Case, D.A. The implementation of a fast and efficient hybrid QM/MM potential method within the Amber 9.0 sander module. (2008) J. Computat. Chem., 29, 1019-1031.

42. Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, and A., Simmerling, C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved. (2006) Proteins, 65, 712-725.

43. Wang, J., Wolf, R.M., Caldwell, J.W., Kollman, P.A., and Case, D.A. Development and testing of a general Amber force field. (2004) J. Comput. Chem., 25, 1157-1174.

44. Schaftenaar, G., Noordik, J.H. Molden: a pre- and post-processing program for molecular and electronic structures. (2000)/. Comput.-AidedMol. Design, 14, 123-134.

45. Humphrey, W., Dalke, A., and Schulten K. VMD Visual Molecular Dynamics. (1996) J. Molec. Graphics, 14.1, 33-38.67 http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/68 http://parallel.ru/cluster/

46. Walker, R.C., de Souza, M.M., Mercer, I.P., Gould, I.R., and Klug, D.R. Large and fast relaxations inside a protein: calculation and measurement of reorganization energies in alcohol dehydrogenase. (2002) J. Phys. Chem. B., 106, 11658-11665.

47. Pavelites, J.J., Gao, J.L., Bash, P.A., and Mackerell, A.D. Molecular mechanics force field for NAD+, NADH, and the pyrophosphate groups of nucleotides. (1997) J. Comput. Chem., 18, 221-239.71 http://www.pharmacy.manchester.ac.uk/bryce/amber

48. Walker, R.C., Crowley, M.F., and Case, D.A. The implementation of a fast and efficient hybrid QM/MM potential method within the Amber 9.0 sander module (2008) J. Computat. Chem., 29, 1019-1031.

49. Dewar, M.J.S., Zoebisch, E.G., Healy, E.F., and Stewart, J.J.P. AMI: A new general purpose quantum mechanical molecular model. (1985) J. Am. Chem. Soc., 107, 3902-3909.

50. Stewart, J.J.P. Optimization of parameters for semiempirical methods I. Method. (1989)./. Comput. Chem., 10, 209-220.

51. Rocha, G.B., Freire, R.O., Simas, A.M., and Stewart, J.J.P. RM1: A reparametrization of AMI for H, C, N, О, P, S, F, CI, Br and I. (2006) J. Сотр. Chem., 27, 1101-1111.

52. STK library (2007) Vitas-M Laboratory, http://www.vitasmlab.corn/

53. Суханова M.B., Ходырева C.H., Лаврик О.И. Поли(АДФ-рибоза) полимераза 1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК полимеразой р. (2004) Биохимия, 69, 686-698.

54. Seabra, G. de М., Walker, R.C., and Roitberg, A.E. Are current semiempirical methods better than force fields? A study from the thermodynamics perspective. (2009) J. Phys. Chem. A, 113, 11938-11948.

55. Ламзин B.C., Асадчиков B.E., Попов B.O., Егоров A.M., Березин И.В. Конформационные изменения бактериальной формиатдегидрогеназы при комплексообразовании с кофактором и его аналогами (1986) Докл. Акад. Наук СССР, 291,1011-1014.

56. Tishkov, V.I., Galkin, A.G., and Yegorov, A.M. Kinetic isotope effect and the presteady-state kinetics of the reaction catalysed by the bacterial formate dehydrogenase. (1989) Biochimie, 71, 551-557.

57. Kinoshita, Т., Nakanishi, I., Warizaya, M., Iwashita, A., Kido, Y., Hattori, K., and Fujii, T. Inhibitor-induced structural change of the active site of human poly(ADP-ribose) polymerase. (2004) FEBSLett., 556, 43-46.

58. Novikov, F.N., Stroylov, V.S., Stroganov, O.V., and Chilov, G.G. Improving performance of docking-based virtual screening by structural filtration. (2010) J. Mol. Model., 16, 12231230.

59. Geraets, L., Moonen, H.J., Wouters, E.F., Bast, A., and Hageman, G.J. Caffeine metabolites are inhibitors of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose)polymerase-l at physiological concentrations. (2006) Biochem. Pharmacol., 72, 902-910.

60. Steinhagen, H., Gerisch, M., Mittendorf, J., Schlemmer, K.H., and Albrecht, B. Substituted uracil derivatives as potent inhibitors of poly(ADP-ribose)polymerase-l (PARP-1). (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 3187-3190.