Моноклональные антитела ИПО- 10 и их применение в исследовании лимфоидных форм лейкозов человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Шлапацкая, Лариса Николаевна

• Шлапацкая, Лариса Николаевна
• кандидат биологических наук
• 1989

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шлапацкая, Лариса Николаевна

ВВЕДЕНИЕ. 3

ОБЗОР ЛИГЕРАТУШ

ГЛАВА I. Поверхностные маркеры В-лимфоцитов на различных стадиях дифференцировки. 8

ГЛАВА 2. Моноклональные антитела к дифференцировочным антигенам В-лимфоцитов и иммунологическое титрование клеток при лимфопролиферативных заболеваниях 31

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. Материал и методы исследования.41

ГЛАВА 4. Получение штамма гибридных, клеток. 57

ГЛАВА 5. Изучение специфичности МКАТ ИПО-Ю на линиях клеток лейкозов и лимфом человека, клетках крови, кроветворных и лимфоидных органов практически здоровых людей. 65

ГЛАВА 6. Изучение с помощью моноклональных антител антигенов поверхностных мембран лимфоцитов при митогенной стимуляции. 74

ГЛАВА 7. Иммунологическая характеристика клеток больных при лимфоидных формах лейкозов человека. 85

7.1. Острый лимфобластный лейкоз. 85

7.2. Хронический лимфолейкоз. 93

7.3. Волосатоклеточный лейкоз. 101

7.4. Миеломная болезнь.105

ЗАЮШЧЕНИЕ.I08-II

ВЫВОДЦ.I20-I2I

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моноклональные антитела ИПО- 10 и их применение в исследовании лимфоидных форм лейкозов человека»

Совершенствование методов диагностики опухолевых заболеваний лимфоидной ткани, является одной из актуальнейших проблем современной онкологии и гематологии. Многообразие цитологических вариантов лимфоидных форм лейкозов обусловлено злокачественной трансформацией различных по своей природе клеток-мишеней, отличающихся по стадиям созревания, на которых произошло нарушение диф-ференцировки клеток, наличием необычных фенотипических признаков при сохранении признаков нормальных клеток-аналогов (Н.С.Кисляк с соавт., 1972; Р.С.Самойлова с соавт., 1982; З.А.Бутенко с соавт. 1984; А.И.Воробьев, М.Д.Бриллиант, 1985; Murphy et al 1983).

В последние годы, наряду с классическими морфологическими и цитохимическими методами, в уточненной диагностике лимфоидных форм лейкозов стали шире применять иммунодиагностические методы с использованием моноклональных антител (МКАТ) С А. Ю.Барышников, 1984; Г. Ю.Мит ер ев с соавт., 1987; Bernard et al . , I98J; Poon , Todd , 1986; Greaves et al, 1983, 1988).

Обнаружение с помощью МКАТ новых поверхностных маркеров В-лим-фоцитов, которые являются субстратом ряда лимфоидных форм лейкозов человека, расширяет наши знания о стадиях дифференцировки клеток этого ряда, дает возможность выяснить принадлежность злокачественных клеток к одной из линий лимфопоэза, определить уровень блока дифференцировки клеток патологического клона при различных формах и цитологических вариантах заболеваний.

В нашей стране получен ряд МКАТ к поверхностным антигенам лимфоцитов человека. Среди них МКАТ против la-подобного антигена (ИКО-1), панель МКАТ против дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов серии ИКО, полученные А.Ю.Барышниковым с соавт.

1984, 1985, 1988) в Институте клинической онкологии ВОНЦ АМН СССР. В Институте иммунологии МЗ СССР А.В.Филатовым с соавт. (1986, 1987) создана панель цКкТ! против антигенов Т-лимфоцитов человека. Ими же получены МКАТ IB4, реагирующие как с В-, так и с Т-лимфоцитами. МКАТ к антигенам Т-лимфоцитов и других кроветворных клеток получены Т.И.Булычевой с соавт. в ВГНЦ МЗ СССР (1988). МКАТ к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов получены в лаборатории иммунологии ВКНЦ АМН СССР О.В.Рохлиным с соавт. (1986) и В.Б.Климовичем с соавт. (1988) в центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте МЗ СССР.

МКАТ, выявляющие дифференцировочные антигены, специфичные только для В-лимфоцитов, в отечественной литературе ранее не были описаны. Поэтому получение таких МКАТ и их использование наряду с морфологическими признаками, цитохимическими и иммунологическими маркерами для характеристики патологических клеток больных лимфоидными формами лейкозов человека является актуальной задачей.

Диссертация выполнена в соответствии с научно-техническими программами 0.69.02 "Злокачественные новообразования", 0.69.05 "Лейкозы человека и сельскохозяйственных животных" и проблемой 5.2.3 КП НТП стран-членов СЭВ "Создание новых диагностических средств и методов на основе биотехнологии, в том числе монокло-нальных антител для диагностики инфекционных, соматических, онкологических заболеваний, аллергических состояний, нарушений иммунитета".

Целью работы явилось получение и характеристика специфичности МКАТ к дифференцировочному антигену В-лимфоцитов человека и их использование наряду с отечественными и зарубежными МКАТ для изучения, классификации и дифференциальной диагностики лимфоид-ных форм лейкозов человека.

Задачи исследования:

1. Получение МКАТ против дифференцировочного антигена В-лим-фоцитов человека.

2. Изучение специфичности полученных МКАТ на линиях клеток человека различного происхождения.

3. Определение специфичности МКАТ при изучении клеток крови, кроветворных и лимфоидных органов здоровых людей.

4. Изучение с помощью МКАТ антигенов поверхностных мембран культивируемых ин витро лимфоцитов при митогенной стимуляции.

5. Характеристика с помощью МКАТ поверхностного фенотипа патологических клеток крови при некоторых формах злокачественных лимфопролиферативных заболеваний (хронический лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, миеломная болезнь).

6. Выяснение возможности применения МКАТ для классификации и уточненной диагностики отдельных форм и цитологических вариантов лейкозов человека.

Научная новизна результатов исследования. Впервые в нашей стране получены и охарактеризованы МКАТ, обозначенные ИПО-Ю, выявляющие дифференцировочный антиген В-лимфоцитов человека, эк-спрессированный на различных стадиях их развития - от ранних предшественников В-лимфоцитов до иммунобластов. Антиген, распознаваемый МКАТ ИПО-Ю, не идентичен ранее охарактеризованным маркерам В-лимфоцитов таким как slg , Рс- и СЗ-рецепторы, GDI9 , CD20 , CD21 , CD22 , CD23 » CD24 , IILA-Dr энтигены.

С помощью панели МКАТ, включающей МКАТ ИПО-Ю, охарактеризован поверхностный фенотип патологических клеток больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), хроническим лимфолейкозом СХЛЛ), волосатоклеточным лейкозом (BKJI), миеломной болезнью и установлено, на каком уровне произошел блок дифференцировки клеток патологического клона. В зависимости от степени зрелости лимфоцитов периферической крови больных выделено четыре подварианта не-T-QJIJI, два подварианта Т-ОЛЛ, две группы больных ХЛЛ.

Практическая ценность работы. Проведенные исследования показали возможность использования МКАТ ИПО-Ю в комплексе с другими МКАТ к линейно-специфическим, а также дифференцировочным антигенам Т- и В-лимфоцитов, морфологическими и цитохимическими методами для уточненной дифференциации отдельных форм и цитологических вариантов системных опухолевых заболеваний лимфоидной ткани.

Внедрение результатов исследования в практику. МКАТ ИПО-Ю приняты в производство и выпускаются Кооперативным научно-произ водственным объединением "Д1агностикум". МКАТ ИПО-Ю применяются в диагностических исследованиях в лабораториях клинической иммунологии, гематологических и онкологических клиниках 33 науч ных и практических учреждений МЗ СССР, АМН СССР, МЗ УССР, МЗ РСФСР.

Основные положения диссертации изложены в 4 научных публикациях. Материалы работы доложены на конференции молодых ученых Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР (1987), Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1988), Всесоюзной конференции гематологов и трансфузиологов (Сухуми, 1988).

Основные научные положения, которые выносятся на защиту:

I. Получены МКАТ ИПО-Ю против антигена В-лимфоцитов человека, экспрессированного на различных стадиях дифференцировки кле ток этого ряда - от ранних клеток-предшественников до иммуно-бластов.

2. Антиген, распознаваемый ЖАТ ШО-Ю, не идентичен таким известным маркерам В-лимфоцитов, как поверхностные иммуноглобулины ( Big ), Рс- СЗ-рецепторы, антигены CD19 > CD20 ,HLA-Dr,

CD21 , CD22 , CD23, CD24 и, вероятно, участвует в процессе активации В-лимфоцитов.

3. Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, является маркером В-клеточных линий, В-лимфоцитов периферической крови, кроветворных и лимфоидных органов практически здоровых людей.

4. При изучении иммунологического фенотипа клеток крови больных с использованием панели реагентов, включающих МКАТ ИПО-Ю, выделено 2 подварианта T-QJDI, 4 подварианта не-Т-ОЛЛ, две группы больных с В-клеточным ХЛЛ.

Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, является маркером клеток с волосатоклеточным лейкозом и не обнаружен на клетках периферической крови больных миеломной болезнью.

Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Библиографический указатель включает 236 источников литературы (48 отечественных и 188 иностранных авторов). Диссертация иллюстрирована II рисунками, 10 таблицами и 5 микрофотографиями. Работа выполнена в отделе цитологии опухолевого роста (зав. - чл. корр. АН УССР В.Г.Пинчук) и лаборатории цитохимии и йммуноцитологии (зав. - проф. Д.Ф. Глузман) Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Шлапацкая, Лариса Николаевна

ВЫВОДЫ

1. С помощью гибридомной технологии получены МКАТ ИПО-Ю против дифференцировочного антигена В-лимфоцитов человека.

2. Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, экспрессирован на поверхностных мембранах В-клеточных линий Daudi , Hamalva ,

Raji , ЕВ-3, PHS , КШ1-8226 и отсутствует на Т-клеточных линиях различной степени зрелости МОЬТ-4, CCRP-HSB2 , Jurkat .

3. Количество ИПО-Ю4" клеток з эмбриональной печени и в периферической крови практически здоровых людей соответствует относительному содержанию клеток с поверхностными иммуноглобулинами и цитоплазматическими jj -цепями.

4. Антиген, выявляемый МКАТ ИПО-Ю, экспрессирован на различных стадиях дифференцировки В-лимфоцитов: от ранних клеток-предшественников до иммунобластов.

5. Изменение экспрессии антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю, при бласттрансформации, вызванной различными митогенами (Кон А, ФГА, ЛПС, РШ ),.свидетельствует о его возможном участий в процессах активации В-лимфсцитов.

6. Антиген, распознаваемый МКАТ ИПО-Ю, не идентичен таким известным маркерам В-лимфоцитов, как I<g, Рс , СЗ-рецепторы, CD19 > CD20 , CD21 , CD22 , CD23 » CD24 , HIA- Dr антигены.

7. С учетом экспрессии на поверхностных мембранах бластных клеток антигена, выявляемого МКАТ ИПО-Ю, выделены следующие подварианты острого лимфобластного лейкоза: нуль-ОЛЛ, подвариант ОЛЛ с 1а+ИЛ0-Ю+ клетками, npe-npe-B-OJUI, npe-B-QJDI, Т1-0ЛЛ, Т2-0ЛЛ.

8. При изучении иммунологического фенотипа клеток при хроническам лимфолейкозе выделены две группы больных, у которых лимфоциты периферической крови отличаются по степени зрелости.

9. Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, служит маркером клеток при волосатоклеточном лейкозе. Он не обнаружен на клетках пери' ферической крови больных миеломной болезнью.

10. МКАТ ИПО-Ю, наряду с другими МКАТ и линейно-специфическим, дифференцировочным и активационными антигенами клеток лим-фоидной ткани, могут быть использованы для изучения, классификации и дифференциальной диагностики лимфоидных форм лейкозов человека.

-122-Список сокращений

МКАТ - моноклональные антитела slg - поверхностные иммуноглобулины cyig - цитоплазглатические иммуноглобулины TdT - терминальная дезокситрансфераза сЗ-рецепторы - рецепторы к третьему компоненту комплемента Ш - иг.Елунофлуopесцентная реакция ЭБВ - вирус Эпштейна-Барр pwm - митоген лаконоса ЛПС - липополисахарид Кон А - конканавалин А ФГА - фитогемагглютинин ЛПЗ - ли ш о пр о ли феративные заболевания ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз ХЛЛ - хронический лимфолейкоз ВКЛ - волосатоклеточный лейкоз НЗЛ - неходшшнская злокачественнаялимфома calla - антиген ОЛЛ "общего типа"

V *

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы все больше внимания уделяется изучению структуры и функции антигенных детерминант клеточной поверхности. Представления о гетерогенности популяции лимфоцитов в настоящее время значительно расширились. Важным дополнением явились исследования, которые показали, что различным иммунокомпетентным клеткам присущи дифференцировочные антигены, которые приобретаются клетками по мере их созревания. Моноклональные антитела к дифференцировочным антигенам Т- и В-клеток являются одним из наиболее совершенных инструментов для выявления, характеристики субпопуляций лимфоцитов, составляющих морфологический субстрат лимфопролиферативных заболеваний. Применение классических морфологических, иммунологических и цитохимических методов часто оказывается недостаточным для установления гистогенеза и уровня дифференцирозки клеток патологического клона. Привлечение для этих целей МКАТ открывает новый этап в иммунодиагностике и классификации лимфопролиферативных заболеваний. Исходя из важности этих вопросов, целью работы явилось получение МКАТ к диф-ференцировочному антигену В-лимфоцитов человека, характеристика их специфичности и последующее использование в панели МКАТ для изучения лимфопролиферативных заболеваний.

При получении МКАТ к дифференцировочным антигенам лимфоцитов чаще всего исследователи используют в качестве иммунизирующего материала клетки больных или здоровых людей с заранее известным фенотипом /5, 53, 91, 109, 170, 179/.

Мы же пошли по другому пути и избрали в роли иммуногена линию клеток Daudi , клетки которой лишены антигенов главного комплекса гистосовместимости и -микроглобулина. Подобный подход к выбору иммуногена использовался исследователями, однако в нашей стране он был осуществлен нпервые. В результате селекции смешанной культуры клеток, продуцирующих и не продуцирующих антитела на ГАТ-, ГТ- и среде для культивирования гибридом, а также после клонирования и реклонирования методом лимитирующих разведений был отобран клон гибридомы А7, продуцирующий антитела, обозначенные ИПО-Ю.

На первом этапе изучения специфичности МКАТ ИПО-Ю были использованы 12 линий клеток человека различного происхождения. Антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, подобно cd19 > cd20 , 0121 , CD22 , сгез , СЕЕ4 антигенам, не был выявлен на Т-клеточных линиях Jurkat, CCRF-HSB2, molt4 , а также на клетках К-562, полученных от больного при бластном кризе хронического миелолейкоза. Также,как и МКАТ В2, В4, Blast-1 МКАТ ИПО-Ю реагировали с небольшой популяцией клеток линии RFMI-8226. Положительная реакция этих МКАТ с клеточной линией из миеломы не удивительна, поскольку она представляет собой дифференцирующуюся in vitro культуру, часть клеток которой представлена плазматическими клетками. В то же время, среди МКАТ, определяющих cd19, CD21 антигены, существуют антитела, которые не взаимодействуют с клетками RFMI-8226 (НВ5, HD37 ) /49, 91, 177, 187/. Если cd21, CD23 антигены выявляются на линиях клеток BPMI-8226, как и антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, то данные о . экспрессии этих антигенов на линии клеток Daudi в доступной нам литературе мы не встретили. Кроме того, большинство МКАТ*. определяющих эти антигены, не реагировали с .клетками линии Namalva » а с клетками Kaji не взаимодействовали антитела к

CD23 • Однотипность реакции МКАТ ИПО-Ю и большинства МКАТ, реагирующих с CD19, CD20, CD22 антигенами, установлена при сравнивании результатов взаимодействия этих МКАТ с ЭБВ+-линия-ми клеток Daudi, ЕВ-5, Namalva, Raji . В то же время CD19 , CD22 антигены не обнаружены на клеточных линиях Daudi, iTamalva Кроме того, МКАТ HD22 , взаимодействующие с CD22 антигеном, дают положительную реакцию с ЭБВ"линией клеток Ramos , что не характерно для МКАТ ИПО-Ю /91,212/. Только в случае МКАТ BI прослеживается корреляция во взаимодействии МКАТ BI и ИПО-Ю с одними и теми же линиями клеток. Однако нам не известно, реагируют ли МКАТ BI с клетками линии Ramos /54, 123, 156/.

Используя в качестве иммунизирующего материала линию клеток Daudi, Malavasi et al . (1984), Wiels et al • (1981) также получили МКАТ. Судя по тому, что МКАТ 38.13 взаимодействуют с линией клеток Ramos и принадлежат к IgM классу иммуноглобулинов, а МКАТ АЮ ( IgGJ ) реагируют с линиями клеток molt-4 , Jurkat они не обладают той же специфичностью что и МКАТ ИПО-Ю.

Таким образом, среди МКАТ, определяющих только антигены В-лимфоцитов и сгруппированных в кластеры дифференцировки, не установлен полный аналог МКАТ ИПО-Ю по специфичности связывания с клеточными линиями, использовавшимися в работе.

При параллельном изучении специфичности МКАТ ИПО-Ю, ИПО-З, ИКО-I на линиях клеток установлено, что эти МКАТ определяют различные антигены. Наш вывод основывался на сопоставлении относительного содержания клеток, реагирующих с МКАТ ИПО-Ю, ИПО-З, ИКО-I, характере флуоресценции различных МКАТ с клетками одной и той же линии' клеток. МКАТ ИПО-Ю давали положительную реакцию только с линиями В-клеточного происхождения.

Дифференцировка лимфоцитов традиционно изучалась по последовательности появления и исчезновения ряда маркеров на лимфоидных клетках крови, центральных и периферических органов лим-фопоэза. Эмбриональная печень является основным местом образования и развития лимфоцитов в антенатальном периоде жизни человека. В печени плода раньше, чем в костном мозге и периферической крови появляются В- и Т-лимфоциты. В то же время, тимус еще не функционирует как орган лимфопоэза и представляет собой зачаток в виде эпителиального тяжа. Исходя из этого, нам интересно было изучить экспрессию антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю. на лимфоидных клетках эмбриональной печени различных сроков развития.

Антиген, выявляемый МКАТ ИПО-Ю, появляется на клетках 8-9 недельной печени плода. На этот период приходится и появление, первых су^«+-клеток /45, 58/, что также было обнаружено в наших экспериментах. Поскольку в 8-9 недельной печени еще не обнаруживаются клетки с slg /18, 124/» а количество ИП0-Ю+ клеток превышает относительное содержание су^гДлимфоцитов, можно предположить, что антиген, выявляемый МКАТ ИПО-Ю, появляется раньше, чем обнаруживается экспрессия суju -цепей в лимфоцитах. Из-за недостаточности данных литературы о появлении В-дифференцировочных антигенов на кроветворных клетках эмбриональной печени, трудно сопоставить динамику экспрессии этих маркеров и антигена, выявляемого МКАТ ИПО-Ю. Однако известно, что em9, ud20, cd24 антигены, возможно, как и ИП0~Ю+ клетки, предшествуют появлению сзгуи+-лимфоцитов в печени плода /18/. Подобно антигену, реагирующему с МКАТ ИПО-Ю, экспрессия cd20 антигена, определяемого МКАТ BI, приходится на 15-16 неделю эмбрионального развития.

В эмбриональной печени определяются клетки, несущие пан-Т-клеточный маркер Leu4 • единичные на 12-13-й неделе и довольно многочисленные на 20-21-й неделях /122/. В печени 12-17 недельных плодов до 3,0$ клеюк содержат специфические маркеры Т-лим-фоцитов, определяемые МКАТ ОКИ, ОКТЗ, 0КТ4, 0КТ5, 0KI6, 0КТ8. Относительное содержание этих клеток к 20-й неделе возрастает до 10,0-26,0$ /49/. Таким образом, учитывая данные доступной литературы, можно прийти к выводу, что антиген, выявляемый МКАТ ИПО-Ю, является В-дифференцировочным, поскольку он появляется подобно другим маркерам В-лимфоцитов на 8-9-й неделях эмбрионального развития, и его экспрессия достигает максимума на 12-14 неделе. Число клеток эмбриональной печени с маркерами Т-лимфоци-тов возрастало после 20-й недели антенатального развития. В этот же период уменьшалось относительное содержание ИПО-Ю4" клеток. Количество ИПО-Ю4" клеток в эмбриональной печени в различные сроки развития плода коррелировало с числом су^+-клеток.

Подтверждением нашего предположения о В-клеточной направленности дифференцировки лимфоцитов, содержащих антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, послужили результаты экспериментов по обнаружению этого маркера на тимоцитах. Максимальное число ИПО-Ю4" клеток не превышало 3,5$.и соответствовало числу зЛ^+-лимфо-цитов, тогда как относительное содержание ИПО-П+клеток составляло 90,0-95,0$.

В периферической крови здоровых людей 11,5-29,4$ мононуклеа-ров, а в миндалинах больных хроническим тонзиллитом 32,0-63,0$ клеток были ИПО-Ю4". У всех обследованных нами доноров число ИПО-Ю4" мононуклеаров периферической крови не превышало относительного содержания slg+ лимфоцитов. Среди В-лимфоцитов миндалин обнаружена популяция ИП0-Ю+ slg" клеток. Если среди клеток крови относительное содержание ИК0-1+ клеток находилось в пределах числа ИП0-10+ лимфоцитов, то среди клеток миндалин такая закономерность не была установлена. Число ИК0-1+ клеток значительно превышало количество клеток, реагирующих с МКАТ ИПО-Ю. Учитывая, что клетки миндалин являются моделью реактивно измененной лимфоидной ткани, столь высокий процент (96,0$) ИК0-1+ клеток объясняется присутствием среди популяции'выделенных лимфоцитов как В-клеток, так и активированных форм Т-кле-ток. Эти исследования подтверждают наш вывод о различной специфичности МКАТ ИПО-Ю и ИКО-1. По данным Dttrken et al • (1986), Hadler (1986), Horda et al . (1985), Link et al . (1986),

Anderson et al . (1935), антигены В-лимфоцитов человека CD19 CD20 , CD21 , CD22 обнаружены на 48,0-57,0% клеток миндалин. Наши результаты по определению относительного содержания ИПО-Ю клеток миндалин согласуются с этими данными и дают основания предположить, что МКАТ ИПО-Ю определяют В-клеточный дифференци ровочный антиген.

При изучении специфичности МКАТ ИПО-Ю на клетках периферической крови нами была использована фракция мононуклеаров. Приблизительно равное относительное содержание ИПО-Ю*" и slg+ -клеток позволяет нам судить о маркере, определяемом МКАТ ИПО-Ю как В-дифференцировочном. Кроме того, гранулоциты периферической крови не реагировали с МКАТ ИПО-Ю. Эти выводы были подтверждены результатами исследований, проведенных в Белорусском НИИ гематологии и переливания крови М.Н.Потапневым. Им были выделены отдельные субпопуляции Т- и В-лимфоцитов периферической крови доноров. При постановке ИФ-теста с МКАТ ИПО-Ю 97,0-98,0%

В-клеток реагировали с МКАТ ИПО-Ю. Т-лимфоциты с этими MI CAT не взаимодействовали.

Таким образом, в результате изучения экспрессии МКАТ ИПО-Ю на клетках крови и кроветворных органов здоровых людей нами было установлено, что содержание ИП0-Ю+ клеток соответствовало числу slg+ лимфоцитов, т.е. клеток, содержащих универсальный маркер В-лимфоцитов.

Следующим этапом нашей работы было изучение экспрессии антигена, выявляемого МКАТ ИПО-Ю, при параллельном использовании МКАТ ИКО-I, ДАКО TI на клетках бласттрансформированных культур, которые являются моделью для изучения маркеров дифференцировки лимфоцитов. В стимулированных В-клеточными митогенами jEWM. и ЛПС клетках периферической крови не наблюдалось различий в динамике экспрессии антигенов, определяемых МКАТ ИКО-I и ИПО-Ю. В первые 24-72 часа культивирования наблюдалось снижение числа ИПО-Ю+-клеток, которое в некоторых случаях PWjf- -стимулированных культур достигало нуля. Клетки же, реагирующие с МКАТ ИПО-Ю, давали реакцию в виде "шапочек". В ходе дальнейшего культивирования клеток периферической крови доноров с В-клеточными мито

1 4генами происходило увеличение числа ИПО-Ю клеток, которое достигало, максимума на 7-й день после стимуляции :P.WM. и на 4-й день после воздействия ЛПС. Максимальное число ИП0-Ю+ клеток не на много превышало исходный уровень лимфоцитов, реагирующих с МКАТ ИПО-Ю, что мо?шо объяснить постепенной утратой клетками этого маркера на поздних антигензависимых стадиях дифференцировки В-лимфоцитов. Клетки с признаками плазматизации были лишены антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю. Чем же объяснить снижение числа ИП0-Ю+ клеток в первые 48-72 часа культивирования?

Возможно^это связано с тем, что антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, является рецептором для митогенов или играет роль в процессах активации В-лимфоцитов. При этом в начале стимуляции идет его слущивание с клеточной поверхности В-лимфоцитов (о чем свидетельствует характер реакции по определению этого маркера в виде "шапочек" и потеря антигена клеткой), а затем дальнейший ресинтез антигена, что ведет к увеличению относительного содержания лимфоцитов, реагирующих с «КАТ ИПО-Ю.

ФГА и Кон А, которые стимулируют преимущественно Т-лимфоци-ты, не оказывали стимулирующего эффекта на ИП0-Ю+-клетки, число которых в ходе эксперимента уменьшалось.

Таким образом, при изучении поверхностного фенотипа бласт-трансформированных культур нами установлено, что экспрессия антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю, изменяется. При этом, увеличение относительного содержания ИПО-Ю+-клеток наблюдается лишь в культурах, подвергшихся действию ЛПС - В-клеточного тимус-независимого митогена и 2WM'. , вызывающего Т-зависимую диффе-ренцировку В-лимфоцитов.

Изучение поверхностных маркеров патологических клеток больных с ЛПЗ показало, что антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю, обнаруживается только на клетках больных с В-кл'еточными формами и вариантами гемобластозов. Иммунологическое типирование клеток больных острым лимфобластным лейкозом, хроническим лимфолей-козом, волосатоклеточным лейкозом, миеломной болезнью позволило представить схему экспрессии некоторых маркеров В-лимфоцитов, а также антигена, выявляемого МКАТ ИПО-Ю (рис. 16). ОЛЛ в зависимости от иммунологического фенотипа бластных клеток был подразделен на б подвариантов. Четыре из них - подварианты не-Т-СШ1. У больных с нуль-ОЛЛ лейкозные клетки были представле

1а-вариант ОЛЛ пренуль-ОЛЛ с ИПО-Ю клет- пре-В пре-В ХЛЛ-I ВКЛ ХМ-II Миеломна- болезнь | , qfftl , ш | .

1а-подобный антиген Z

ИПО-Ю

IL-2 су Ig slg cALLA ранние предшественники пре- пре-В незрелые зрелые В-лим-иммуно- плащматичэские

В лимЪопитон пре-В лимфо - В-лимфо- {юциты бласты клетки v ц лимфо- циты питы циты

Рисунок 16.

СХЕМА ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРОВ В-ЛИМФОЦИТОВ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ ДОФФЕРЕНЦИРОВКИ/ ны наименее зрелыми клетками, блок дифференцировки которых произошел на стадии ранних предшественников лимфоцитов. Они имели, следующий фенотип: ИК0-1+, ИПО-Ю", сАЫА", суJUT, slg" • Наличие МКАТ ИПО-Ю позволило выделить новый 1а-вариант ОЛЛ с ИП0-Ю+ клетками. Фенотип лимфоцитов этой группы больных соответствовал ИК0-1+, ИП0-Ю+, cALLA"» с у/С/", slg" клеткам. В-лимфоциты этой группы больных не содержали сАЫА, сyju , что привело нас к выводу о том, что антиген, определяемый МКАТ ИПО-10, обнаруживается впервые на стадии ранних предшественников В-лимфоцитов,. вслед за la-подобным антигеном. По-видимому, появление ИП0-10+ клеток предшествует стадии сАИА+ В-лимфоцитов. , +

Лейкозные клетки больных с фенотипом ИКО-1 , ИПО-Ю , IB4", сА1ЬА+, су , slg" были выделены в подвариант пре-пре-В-ОЛЛ. В работах А.Ю.Барышникова (1984), Greaves et al . (1981), Katib (1985) выделен О-ОЛЛ, хотя'Foon, Told "(1986) больных с подобным фенотипом злокачественных клеток сгруппировали в пре-пре-В подвариант ОЛЛ. Нам кажется целесообразным выделение пре-пре-В подварианта ОЛЛ, поскольку он более точно характеризует степень зрелости клеток патологического клона.

Среди других не-Т разновидностей ОЛЛ подвариант пре-В ОЛЛ отличался наличием более зрелых клеток В-ряда по сравнению со злокачественными клетками больных ОЛЛ, дифференцировка которых блокировалась на стадии пре-В лимфоцитов. В этом случае бласт-ные клетки имели фенотип: ИК0-1+, ИП0-Ю+, 1В4+, сАЫА+, су(/+ slg".

Группа Т-ОЛЛ включала больных, бластные клетки которых имели характеристики незрелых Т-лимфоцитов и переходных тимоцитов -кортикально-медуллярных со следующим фенотипом: TI) ИКО-1", ИПО-Ю", ИК0-П+, ИК0-16+, TI", Т2+, Т8", суjlT, slg"

Т2) ИКО-1", ИПО-Ю", ИКО-П+, ИК0-1б+, TI+, Т2+, Т8", су Ju, slg"

При изучении морфологических и цитохимических особенностей клеток больных ХЛЛ, мы учитывали результаты исследований ранее проведенные в лаборатории цитохимии и иммуноцитологии Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР (Д.Ф.Глузман и др., 1982, С.П.Сидоренко, 1980), данные Grossi (1982), Е.Н. Злобиной (1986), что дало основание выделить две'группы больных. Первую группу составляли больные, клетки которых по цитоморфоло-гическим признакам были представлены малыми или средними лимфоцитами с большим ядерно-цитоплазматическим отношением. Ядра округлой формы, иногда с выемкой. Эти клетки давали отрицательную, умеренно-диффузную или мелкогранулярную реакцию на кислую фос-фатазу и неспецифическуюэстеразу. Интенсивность реакции при определении кислой фосфатазы и неспецифической зстеразы в лимфоцитах больных ХЛЛ была значительно ниже, чем в норме, что, вероятно, связано с уменьшением числа лизосом или со сниженной активностью лизосомальных гидролитических ферментов. Такая реакция на кислую фосфатазу и неспецифическую эстеразу характерна для патологических В-лимфоцитов на ранней антнгензависимой или поздней антигеннезависимой стадии дифференцировки. Клетки этих больных не содержали СЗ-рецепторы. Вторая группа больных ХЛЛ характеризовалась довольно высокой степенью плазматизации лейкозных клеток. В большинстве клеток обнаружена высокая активность кислой фосфатазы с распределением продукта реакции в виде единичных крупных гранул и умеренная активность неспецифической эстеразы. Для клеток этих больных характерно наличие СЗ-рецепторов.

При параллельном исследовании поверхностных антигенов с помощью панели МКАТ, также выделено 2 группы больных. Иммунологический фенотип клеток больных ХИЛ I группы "соответствовал В-лимфоцитам, представленным на поздней аитигеннезависимой или ранней антигензависимой стадии дифференцировки - ИК0-1+, ИПО-Ю4", Т1+(ЛТ1+), су jlT» slg+ . Лимфоциты больных II группы ХЛЛ имели фенотип: ИКО-I4", ИПО-Ю", Т1+(ЛТ1+), суju+ , slg" . Лейкозные клетки больных II группы были более зрелыми, чем клетки больных ХЛЛ-I и часть имели признаки плазматизации. Потеря антигена, определяемого МКАТ ИПО-Ю на патологических клетках больных ХЛЛ-11; по-видимому происходит раньше исчезновения Tacit la-подобного антигенов.

При изучении иммунологического фенотипа больных миеломной болезнью обнаружено отсутствие ИП0-Ю+ клеток, что также свидетельствует об исчезновении этого антигена на поздних стадиях дифференцировки В-лимфоцитов.

Во всех изученных случаях ВКЛ МКАТ ИПО-Ю реагировали с клетками больных. Кроме того, антиген, определяемый -МКАТ ИПО-Ю, обнаруживался на волосатых клетках вместе с активационными антигенами, выявляемыми МКАТ ИПО-З, ИПО-4, ДАКО IL-2. Эти данные подтверждали результаты иммунологических исследований,, свидетельствующих о том, что волосатые клетки имеют характеристики В-лимфоцитов на антигензависимой стадии дифференцировки.

Таким образом, в результате изучения иммунологической характеристики патологических клеток больных ЛПЗ установлено, что антиген, определяемый МКАТ ИПО-Ю,' появляется на стадии ранних предшественников В-лимфоцитов и исчезает на поздних антигенза-висимых стадиях дифференцировки клеток В-ряда. Этот антиген не является маркером плазматических клеток, клеток гранулоцитарно-го ряда.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шлапацкая, Лариса Николаевна, 1989 год

1. Агаджян M. ДифференцироЕка и активация В-лимфоцитов // Усп. " to6p. биологии. - 1987. -104 , № I. - 55-70.

2. Альпидовский В.К., Полянская A.M., Дульцина С М . и др. О Борсинчатоклеточном лейкозе // Пробл. гематологии и переливания крови. - 1976. - 21, - № 3. - 54-58.

3. Андреева Н.Е. Парапротеинемические гемобластозы // Гуковод- ство по гематологии. - М.; Медицина, 1985. - 290-314.

4. Барышников А.Ю. Моноклональные антитела в изучении лейкоза человека // Итоги науки и техники. Серия Онкология. - М.: ВИНИТИ - 1984. - 1 3 . - 243-279.

5. Барышников А.Ю. Моноклональные антитела к ксеногенные антисыворотки в диагностике лейкоза и лимфосарком: Автореф. дис. д-ра мед. наук. - М., 1984. - 46 с.

6. Барышников А.Ю., Тупицын Н.Н., Крыжанов М., Блохина Н.Н., Кадагидзе З.Т. Панель моноклональных антител и антисывороток для диагностики гемобластозов человека // Докл. АН СССР. -1985. - ^г» № 3 - 753-760.

7. Брондз Б.Д., Рохлин 0.В.'Молекулярные и клеточные основы иммунологического распознавания. - М.: Наука, 1978. - 335 с.

8. Булычева Т.Н., Новикова Н.Н., Митерев Т.Ю. и др. Моноклональные антитела BGA-I6, направленные к поверхностному Т-клеточ-ному антигену здоровых и больных лейкозами лиц // Гематология и трансфузиология - 1988. - № 12. - 45-47. -

9. Ветрова Е.П., Сидоренко СП., Евсевьева А.И. и др. Монокло- нальные антитела ИПО-3 против антигена В-бластов человека // Биотехнология. - 1987. - 3, № 6. - 738-747.

10. Владимирская Е.В. О происхождении лейкозных клонов //Пробл. гематологии и переливания крови. - 1982. - № 9. - 8-14.

11. Воробьев А.И., Бриллиант М.Д. Классификация лейкозов // руководство по гематологии. - 2-е изд. - М.: Медицина, 1985, I. - C.I8I-22I.

12. Воробьев А., Чертков Ч. Связь классификации опухолей системы крови с современной системой кроветворения // Тер. архив.-1974. - 46, № 8. - 3-12.

13. Гариб Ф.Ю., Залялива Л.В. Содержание лимфоцитов с рецепторами и -клеток у здоровых людей в возрастном аспекте и у больных хроническим.лимфолейкозом // Тез. докл. Всесоюз. конф. -Новосибирск, 1984. - .С4-5.

14. Глузман Д.Ф. Диагностическая цитохимия гемобластозов. - Киев: Наук, думка, 1978. - 216 с.

15. Глузман Д.Ф., Бебешко В.Г., Надгорная В.А. и др. Эмбриональное кроветворение и гемобластозы у детей. - Киев: Наук, думка, 1988. - 198 с.

16. Глузман Д.Ф., Сидоренко СП., Надгорная В.А. Цитохимия и иммуноцитология злокачественных лимфопролиферативных заболеваний. - Киев: Наук, думка, 1982. - 239 с. - 125 -

17. Глузман Д.Ф., Сидоренко СП., Полудненко Л.Ю. и др. Поверхностные рецепторы и цитохимические особенности клеток кро-ГV • ви при хроническом лимфолейкозе // Эксперим. онкология. -1980. - 2, № 5. - 45-51.

18. Злобина. Гетерогенность иммунологического фенотипа лийкоз- ных клеток больных В-клеточным вариантом хронического лим-фолейкоза. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 1986. -20 с.

19. Егоров А., Диков И. Структура и механизм действия антител // й{урн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И.Менделеева. - 1982. - 27, № 4 - C.2I-28.

20. Ильчевич Н.В., Лисянный И.И., Янчий Р.И. Антитела и регуляция функций организма. - Киев: Наук, думка, 1986. - 2 ^ с.

21. Лушкинов Е.Ф., Цодикова Л.Б. Актуальные вопросы морфологии лимфогранулематоза // Диагностика и лечение лимфогранулематоза. - Обнинск, 1972. - 5-16.

22. Незлин Р.С. Обмен иммуноглобулинов. - М.: Медицина, 1972. - 243 с.

23. Образование антител // Под. ред. Глинна Л., Стыоарда М. - М.; Мир, 1983. - 196 с.

24. Пинчук В.Г., Глузман Д.Ф., Сидоренко С П . Маркеры дифферен- . цировки лимфоцитов и принципы классификации опухолевых заболеваний лимфоидной ткани // Эксперим. онкология. - 1983. -5, № 5. - 6-13.

25. Пинчук В.Г., Сидоренко СП., Ветрова Е.П. и др. Моноклональ- ные антитела к клеткам лимфобластоидной линии -1788. Эксперим. онкология - 1986 - 8, № 6. - 41-46.

26. Родт X., Тиль Э., Нетцель Б. и др. Характеристика лейкеми- ческих клеток с помощью антисыворотки против мембранных антигенов // IX Междунар. симпоз. по сравнительному изучению лейкозов и родственных заболеваний. - Огхуми, 1979. - C.I53-154.

27. Рохлин О.В. Генетика иммуноглобулинов // Иммуногенез и клеточная дифференцировка. - М.: Медицина, 1978. - C4I-46.

28. Рохлин О.В. Моноклепальные антитела в биотехнологии и медицине // Биотехнология/ Под ред. А.Болева. - М.: Наука, у 1984. - 288-295. >^ - 127 -

29. Сидоренко С П . Цитохимические особенности Т- и В-лимфоцитов при некоторых формах злокачественных лимфопролиферативных 'Ь^ • '*iзаболеваниях: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Киев, 1980. - 24 с. .

30. Сидоренко СП., Уманский Ю.А. Поверхностный фенотип Т- и В- лимфоцитов периферической крови и миндалин человека // Им-• мунология, - 1980. - 1 , № 4 - C.I0-I2.

31. Сидорова Е.В. Молекулярные механизмы биосинтеза иммуноглобулина // Иммуногенез и клеточная дифференцировка. - М.: Медицина, 1978. - 67-101.•

32. Скляренко Л.М. Цитохимические и иммунологические маркеры бластных клеток при различных вариантах острого лимфобласт-ного лейкоза у детей: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. -luieB, 1985. - 16 с.

33. Уманский Ю.А., Пинчук В.Г. Лимфоциты и опухолевый рост. - Киев.: Наук, думка, 1982. - 254 с.

34. Уманский Ю.А., Сидоренко СП., Юдин В.М. Сравнительное изучение различных видов розеткообразукщих клеток периферической крови и миндалин человека // }йурн. микроб,, зпидем., иммунобиологии. - 1979. - № I. - С94-96.

35. Филатов А.В., Бачурин П.С, Королев А.Г. и др. Получение и свойства маноклональных антител против и лимфо- -цитов человека // Биотехнология, 1987. - № 6. - С 756-762.

36. Чепелева М.А. Патология лимфатических узлов (клинико-мор- фологические исследования). - Киев.: Госмедиздат УССР, { ^ ^ . 1962. - 320 с.

37. Чертков И., Фриденштейн А. Клеточные основы кроветворения. - М.: Медицина, 1977. - 270 с.

43. Foon К., Schroff R., Gale R. Surface markers on leukemia and lymphoma cells: recent advances // Blood. - 1982. " 60, N I. <Д.^ . -P..I-I9., -

67. La la P . , Layton J . , Nossal G. Maturat ion of В lymphocytes.

73. Ъеа Т., Porre 0., Michaelson Т. et al. Shared idiotypes of human peripheral blood band T lymphocytes // J. Immunol. -'}- 1979. - 122, N 6. - P. 24I3-24I7.,

76. Leventhal В. , Weiner M.' Leukemia an t igens / / The Year in Hematology. - New York-London, 1978. - P . 465-479.

85. Miller K. The stimulation of human В and T lymphocytes by various lectins // Immunobiol. - 1983. " 165, N 1-2. - P. 132-146. •

97. Pe rn i s B. Lymphocyte membrane immunoglobulins? an overview / / • ^ Comprehensive Immunology. Immunoglobulins. - New Yoric, 1978. - 3j^ - :P. 357-372.

120. Tyan M. Development of immune competence // Mech. Age Dev. - 1979. - It N 1-2. - P. 79-86.

121. Vitetta E., Uhr J. Cell surface immunoglobulin. Release from murine splenic lymphocytes // J. Exp. Med. - 1972. - 136, N 4. - P . 676-696.