Мутационный анализ возможных сайтов фосфорилирования транспортного белка вируса табачной мозаики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Каргер, Елена Мировна

• Каргер, Елена Мировна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Каргер, Елена Мировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ВТМ И ВИРУСНЫЙ ЦИКЛ

ПЛАЗМОДЕСМЫ И ТБ ВТМ

ТБ-ОБУ С ЛОВ ЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ ВИРУСНОЙ РНК

КЛЕТОЧНЫЕ КОМПОНЕНТЫ,УЧАСТВУЮЩИЕ В ТАНСПОРТЕ

Роль телец включения

Роль микротрубочек

Роль микрофиламентов

ДРУГИЕ ХОЗЯЙСКИЕ ФАКТОРЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В 21 ИНФЕКЦИИ

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ТБ ВТМ

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ В РАСТЕНИЯХ

РАТИТЕЛЬНЫЕ МАП КИНАЗЫ

Общая характеристика

51РК и WIPK-кинaзы, участвующие в ответе на стресс

РАСТИТЕЛЬНЫЕ КАЗЕИНОВЫЕ КИНАЗЫ I И II (КК1 и КК2)

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТБ ФИТОВИРУСОВ

Фосфорилирование ТБ ВТМ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ

Кинирование белков и получение триптических пептидов

Двумерное картирование пептидов и фосфоаминокислотный анализ

Анализ аминокислотной последовательности пептидов

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ 40 ФРАКЦИЙ

Получение препарата фракции клеточных стенок

Получение препарата фракции Р

Получение микросомальных фракций

АНАЛИЗ МИКРОСОМАЛЬНЫХ ФРАКЦИЙ

Кинирование in vitro

Анализ влияния двухвалентных катионов на киназную 41 активность

Анализ присутствия BiP

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ IN VITRO

Протеинкиназа С

Фракция клеточных стенок

КИНИРОВАНИЕ В ГЕЛЕ

ПОЛУЧЕНИЕ РНП-КОМПЛЕКСОВ

АНАЛИЗ РНП НА НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ФИЛЬТРАХ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ЗАРАЖЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИД

Получение конструкций с С-концевыми мутантами

Получение конструкций с мутациями в положении

ТРАНСКРИПЦИЯ, ЗАРАЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ И АНАЛИЗ 46 ЗАРАЖЕНИЯ

Формирование РНП

Измерения с помощью АСМ

РАБОТА С АГРОБАКТЕРИЯМИ

Трансформация агробактерий

Агроинфильтрация

ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ БЕЛКОВ

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К BiP

КРУГОВОЙ ДИХРОИЗМ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ С-КОНЦА ТБ ВТМ НА СВОЙСТВА РНП

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ РНК-ТБ ВТМ 53 МЕТОДОМ АСМ

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ С-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ ТБ В 58 ТРАНСПОРТЕ ВТМ

ХАРАКТЕРИСТИКА КИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЭР- 60 ОБОГАЩЕННЫХ ФРАКЦИЙ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ САЙТОВ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ТБ ВТМ 62 МИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИЕЙ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТРЕОНИНА В ПОЛОЖЕНИИ 104 НА 66 ТРАНСПОРТНЫЕ СВОЙСТВА ТБ ВТМ

ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ МУТАНТНЫХ ТБ

ВЫВОДЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Каргер, Елена Мировна

1. Установлено, что делеция 11 или 33 С-концевых аминокислот в ТБ ВТМ, также как замена четырех потенциальных сайтов фосфорилирования в С-конце, приводит к неспособности таких мутантных белков формировать инфекционные комплексы с вирусной РНК.

2. Впервые изучена структура комплексов РНК-ТБ ВТМ, сформированных in vitro, методом ACM. На основе данных атомно-силовой микроскопии высказано предположение о структуре этих комплексов. Показано, что фосфорилирование ТБ ВТМ протеинкиназой С дестабилизирует комплекс, делая РНК доступной для РНКазы А и подверженной разрушению в слабой ионной силе.3. Использование инфекционных РНК-транскриптов ВТМ позволило выявить, что мутации ТБ ВТМ по С-концевым сайтам фосфорилирования не оказывают влияния на ближний транспорт мутантных вирусов.4. Охарактеризована ТБ ВТМ-специфичная киназная активность, присущая ЭР-обогащенным микросомальным фракциям. Показано, что треонин в положении 104 ТБ ВТМ фосфорилируется in vitro микросомальной фракцией.5. Замещение треонина 104 на аланин не приводит к нарушению транспорта, в то время, как его замена на аспарагиновую кислоту сильно снижает способность белка осуществлять транспортные функции, возможно, за счет его дестабилизации.