Неинвазивная визуализация гемопоэтических и опухолевых клеток с использованием молекулярно-биологических методов (экспериментальное обоснование и клинические исследования) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, доктор медицинских наук Дубровин, Михаил Михайлович

• Дубровин, Михаил Михайлович
• доктор медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Дубровин, Михаил Михайлович

Введение.стр.

Глава 1. Клиническая и молекулярная визуализация в гематологии/онкологии.

Обзор научной литературы.стр.

Применение «биомаркерного» или «суррогатного» метода визуализации для оценки пролиферации опухолей.стр.

Визуализация онкогенеза на субклеточном уровне.стр.

Комбинированный имиджинг: необходимость совмещения изображений; полученных с помощью разных визуализирующих методов.стр.

Пеинвазивная визуализация в мониторовании миграции клеток опухолей, клеток кроветворной и иммунной системы и противоопухолевой терапии

Глава 2. Материалы и методы.стр.

Исследования «суррогатных» маркёров опухолевого роста.стр.

Генные репортерные конструкции.стр.

Количественная оценка генной терапии.стр.

Разработка проб для прямой визуализации.стр.

Клеточные линии.стр.

Молкулярно-биологичские методы.стр.

Экспериментальные модели опухолей.стр.

Аппаратура.стр.

Общая характеристика больных и клинических исследований.стр.

Статистический анализ.стр.

Часть I. Результаты экспериментально-теоретических исследований:.стр.

Глава 3. Непрямой «суррогатный» имиджинг.стр.

Нуклеозиды.стр.

Аминокислоты.стр.

Глава 4. Генные репортерные системы для прямой визуализации.стр.

Транскрипторные репортерные системы.стр.

Посттранскрипторные репортеры.стр.

Многофункциональные репортерные системы.стр.

Параметричское (количественное) изображение.стр.

Глава 5. Прямая визуализация ингибиторов протеин-киназ (ИПК) для мониторирования эффекта противоопухолевых препаратов.стр.

Оценка ингибитора ПК рецептора фактора роста эпителия (ЭГФР).стр.

Оценка ингибиторов ПК семейства эгс.стр.

Часть II. Клинические исследования методов молекулярной визуализации.стр. 203:

Глава 6. Клиническая оценка функциональной визуализации опухолей с помощью прямых методов.стр.

Хронический миелолейкоз.стр.

Резистентная карцинома.стр.

Глава 7. Оценка специфичности и чувствительности мониторирования роста опухолей с помощью «суррогатных» методов визуализации.стр.

Анализ прогностической достоверности и клинической значимости стандартных «суррогатных» методов.стр.

Клинические испытания йододеоксиуридина.стр.

Сравнение фтороаминоциклопентановой кислоты и метионина в качестве

ПЭТ-радиотрейсеров для метаболической визуализации опухолей.стр.

Глава 8. Количественная оценка генной терапии опухолей с помощью непрямой

ПЭТ-визуализации.стр.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Неинвазивная визуализация гемопоэтических и опухолевых клеток с использованием молекулярно-биологических методов (экспериментальное обоснование и клинические исследования)»

Актуальность проблемы.

Развитие методов молекулярной визуализации клеток-мишеней в гематологии и онкологии продиктовано требованиями современного уровня развития медицины, ориентированного па применение лечения, специфически влияющего на патогномоничные биологические механизмы, лежащие в основе патологического процесса [Qiao J, с соавт. 2002, Pao W, с соавт. 2004]. Поиск биологических путей и подходов обусловлен необходимостью преодоления ограничений в терапевтических возможностях, связанных с лекарственной резистентностью [Shah NP, с соавт. 2004] и системной токсичностью, развивающейся при повышении терапевтических доз [S.F. Gardner, с соавт. 1993]. С одной стороны, применение узко-специализированных методов лечения требует тщательного отбора пациентов, с нарушениями именно в данном физиологическом звене. С другой, попытки влиять на гомеостаз организма на более тонком регуляторном уровне требуют тщательного контроля за функциями на клеточном и субклеточном уровне как с научной, так и с этической точки зрения [G.D. Demetri, с соавт. 2002]. Последнее отражается в ужесточении требований к разрабатываемым препаратам и биологическим компонентам, в особенности связанным с использованием рекомбинантного генетического материала и переноса донорских или аутологичных экстракорпорально выращенных клеток [Rooney СМ, с соавт. 1995].

Подобный контроль чаще всего подразумевает забор биологических проб для контроля на определенных временных интервалах [Bonini С, с соавт.1997]. Одним из недостатков такой тактики контроля являются ограниченность возможностей инвазивиого вмешательства, связанного с риском повреждения. Примером подобных ограничений могут служить необходимость повторных биопсий жизненно важных органов: головного мозга, печени или миокарда - после применения вирусной или клеточной терапии [А. Jacobs, с соавт. 2001, J.M. Hill, с соавт. 2003, Qiao J, с соавт. 2002,]. Другим недостатком является ограниченная достоверность результатов, полученных в данном образце по отношению ко всему органу или организму в целом.

Наиболее адекватным подходом для мопиторирования биологической терапии является не-инвазивная молекулярная визуализация. Методы визуализации прочно вошли в арсенал современных средств академической науки, позволяя в масштабе реального времени, наглядно и, в некоторых случаях, количественно оценить процессы, протекающие в биологических системах при минимальном вмешательстве в условия их протекания [Л. Rehemtulla, 2000, G. Koehne, 2003]. Последнее обстоятельство является одним нз решающих при выборе систем для хмолеку-лярной визуализации.

Основы развития молекулярной визуализации были заложены на стыке молекулярной биологии, ядерной медицины, фармакологии, биохимии и клеточной биологии [Gelovani Tjuvajev J, 2003]. Разработанные ещё на заре ядерной медицины принципы использования следовых концентраций радиофармпрепаратов [Sokoloff L., 1979], прямых и непрямых подходов к визуализации получили дальнейшее развитие при использовании последних достижений генной инженерии [Wang Y, 2005] и протеиномики [G.D. Luker, 2002, Piwnica-Worms D, 2005]. Вклад молекулярной визуализации, как в область породивших её базовых наук, так и в практическую или клиническую науку неоценим. Существенная часть биологических исследований в целом и большая часть экспериментальных работ по изучению биологических механизмов на животных моделях используют на различных этапах генные репортериые конструкции, позволяющие получать неинвазивным образом информацию о физиологических и патологических процессах на клеточном уровне [P. Mayer-Kuckuk, 2002].

Именно онкология и гематология стали основными областями приложения достижений молекулярной визуализации, так как в основе патологических процессов гемопоэза и онкогенеза лежат нарушения на молекулярном уровне, приводящие к расстройствам системной регуляции и тяжелым последствиям для всего организма [X. Wang, 2003, Miller VA, 2004]. Наблюдение за этими процессами становится первым шагом к созданию и проведению патогномоиичпой терапии опухоли [Lynch TJ, 2004]. Молекулярная визуализация играет также важную роль на этапах доклинических испытаний, выполняя функцию контрольного инструмента, мои итерирующего биологический эффект лечения [Qiao J, с соавт. 2002,]. В данный момент отдельные методы молекулярной визуализации начали проходить клинические испытания.

Таким образом, внедрение в клиническую практику достижений биотехнологий требует осуществления строгого контроля за используемыми в лечении препаратами и агентами. Возможности, предоставляемые в этом отношении молекулярным имиджингом (визуализацией), делают его незаменимым инструментом биомедицинской науки.

Цель исследования.

Разработать и внедрить в практику диагностическую технологию, объединяющую визуальное наблюдение и количественную оценку биологических процессов, вовлеченных в гемо-, иммуно- и онкогенез, для контроля эффективности проводимой терапии опухоли на уровне клетки-мишени, межклеточного взаимодействия и организма в целом с минимальным вмешательством, не способным повлиять на течение процесса.

Задачи:

Экспериментально-теоретические доклинические исследования:

1. Доказать преимущества использования «суррогатных» радиомеченных фармпрепаратов, имитирующих существенные (ключевые) компоненты, участвующие в регуляции гемо-поэза, опухолевом метаболизме, позволяющих количественно оцепить распространенность и характер роста опухоли с диагностической и терапевтической целями.

2. Определить возможность повышения специфичности и расширения функционального потенциала противоопухолевой терапии с помощью непрямых визуализирующих методов с использованием генных репортерных систем регулируемых на трапскрипторном и посттранскрипционном уровне передачи биологического сигнала.

3. Доказать необходимость комплексного подхода к использованию молекулярного имид-жипга и количественной оценки изображений для повышения чувствительности и специфичности визуализирующих методов исследования биологии опухолей и противоопухолевого ответа для усиления их диагностической значимости

4. Обосновать использование неинвазивной молекулярной визуализации для мониториро-вания миграции опухолевых и нормальных клеток организма на различных этапах гемо-, иммуно- и оикогенеза и противоопухолевой терапии, включая трансплантацию гемопо-этичсских стволовых клеток и адоптивную иммунотерапию.

5. Оценить применимость прямого имиджинга для определения показаний и мониториро-вания лечения опухолей с помощью биологически направленной терапии ингибиторами протеин-киназ, являющихся фармакологической мишенью для подавления функции рецепторов, поддерживающих опухолевый рост.

Клинические испытания методов молекулярной ризуализации:

1. Разработать и внедрить в клиническую практику систему прямой визуализации опухолевых клеток для определения показаний к назначению препаратов группы ингибиторов протеин-киназ, позволяющую определить чувствительность опухоли к противоопухолевой терапии, специфичность терапии по отношению к здоровым тканям и мониториро-вать ход лечения больных.

2. Оценить возможность повышения специфичности и улучшения чувствительности метода (прогностическую достоверности и клиническую значимость) диагностики и монито-рирования роста опухолей с помощью галогенизированных производных тимидина и циклических аминокислот в качестве непрямых маркеров опухолевого метаболизма по сравнению с традиционными прямыми и суррогатными методами.

3. Доказать преимущества многофункционального подхода в клинической визуализации противоопухолевой генной терапии, за счет комплексной оценки локализации, степени активности и безопасности применения суицидальных генных систем.

Актуальность

Использование прямых трейсеров, отражающих метаболизм опухолей, позволяет сделать новый шаг в биологической диагностике опухолей, повышая чувствительность и специфичность неинвазивных визуализирующих методов

Предложенные подходы с использованием химерных многофункциональных визуализирующих генов могут использоваться для визуализации опухолевых и гемопоэтических клеток в многочисленных исследованиях, оценивающих их расположение и функции

Радиогенная терапия является перспективным методом, позволяющим направленно доставлять радиофармпрепарат к клеткам мишеням и их микроокружению и проходящим клинические испытания.

Методы визуализации генной терапии необходимы для развития данного направления, требующего долговременного неинвазивного мониторирования и регуляции экспрессии перенесенных генов в живом организме с целью предотвращения возможных побочных эффектов от проводимого лечения.

Мониторирование лимфоцитов, введенных пациентам в терапевтических целях, позволяет проводить контроль и коррекцию проводимой иммунотерапии в масштабе реального времени в соответствии с наблюдаемым терапевтическим эффектом и предвосхищать развитие возможных побочных реакций, включая РТПХ.

Наблюдение за клетками костного мозга в посттрансплантационном периоде позволяет на ранних этапах оценивать и прогнозировать приживление трансплантата и, в случае наличия данных об отторжении, рассматривать вопрос о повторной пересадке на ранних клинических этапах с возможным сокращением сроков восстановления гематопоэза.

• Визуализация фармакокинетики и фармакодинамики малых биологически активных молекул, в частности, ингибиторов протеин киназ открывает возможности, как выбора препаратов, так и отбора пациентов для специфической противоопухолевой терапии.

Научная новизна Впервые:

• В доклинических и клинических исследованиях испытаны неметаболизируемые аминокислоты и нуклеозиды в качестве радиомеченных проб для выявления роста опухолей.

• Создан химерный ген, позволяющий получать многофункциональные изображения меченых клеток и проводить параметрическую оценку уровня активности терапевтического гена.

• Разработан метод моделирования опухолевого роста in vitro путем создания сфероидов из опухолевых клеток, меченых химерным флуоресцентным геном, для оценки дозы и эффективности радиотерапии.

• Предложен метод радиогенной терапии опухолей с использованием герпесвирусной тимидин-киназы и [Х1]ФИАУ в качестве радиофармпрепарата

• Проведена количественная оценка эффективности трансфекции растущей опухоли в живом организме литическим вирусом герпеса, введенного непосредственно в опухоль.

• Описан опухолеспецифический контроль экспрессии терапевтического гена, доставленного в опухолевые клетки с помощью аденовирусного вектор.

• Разработан метод визуализации и количественной оценки аденовирусной терапии метастазов рака толстого кишечника в печени.

• Предложено использование двух аналогичных аденовирусов для получения параметрической количественной оценки экспрессии терапевтических трансгенов в тканях опухоли.

• Осуществлено мониторирование распределения в живом организме терапевтических трансгенных бактерий, несущих репортерный ген.

• Производилось длительное неинвазивное наблюдение за распределением и перемещением в опухоль специфических противоопухолевых Т-клеток.

• Разработан радиофармпрепарат ФИАУ, аналогичный по активности тимидину, специфичный только для герпесвирусной тимидин-киназы и не накапливающийся тимидин-киназой 1 млекопитающих.

• Получены изображения процесса приживления трансплантата костного мозга в живом организме в масштабе реального времени.

• Создана система визуализирующий ген - радиоактивно-меченая проба, позволяющая неинвазивно визуализировать биологические процессы, происходящие в меченых клетках, находящихся в головном мозге за неповрежденным гематоэицефалическим барьером.

• Получены изображения связывания и накопления в тканях специфических ингибиторов протеин-киназ ЭГФР и абл.

Практическая значимость

Настоящая работа отражает серию уникальных исследований по разработке прямых и непрямых трейсеров и параметрического имиджа. Результаты исследований отражены в ряде публикаций и научных сообщений, положены в основу патентов и клинических протоколов.

Непрямые трейсеры

Нуклеозиды - бромо-фторо-урацил арабииозид предложен в качестве альтернативы тими-дину для визуализации пролиферативной активности опухоли. Разработаны показания к применению и алгоритм использования наиболее клинически эффективных фторированных и йодированных аналогов тимидина — ФЭАУ и ФИАУ, соответственно. На применении пуклеозид-ных радиотрсйсеров основан метод, позволяющий количественно оценивать пролиферацию, определяя скорость накопления нуклеотидов в клетках, путем дифференциального мечения бромо и йодопроизводными урацила.

Использование радиомеченных иуклеозидов в качестве репортерных проб для нуклеозид-киназных репортерных генов позволяет производить неинвазивпую визуализацию биологических процессов на клеточном и тканевом уровне.

В сочетании с репортерными генами нуклеозиды используются в качестве ренортерных систем для молекулярной визуализации внутриклеточных процессов с помощью управляющих элементов, чувствительных к регуляции на транскрипционном уровне.

Обоснованы принципы радиогенной терапии, позволяющей направленно доставлять радиофармпрепарат к клеткам мишеням и их микроокружению. Метод доведен до клинических испытаний.

Аминокислоты — проведены исследования распределения неметаболизирующихся аминокислот для получения ПЭТ изображений у пациентов с опухолями мозга. ПЭТ визуализация с помощью неметаболизируемых циклических аминокислот используется для неинвазивной оценки роста опухоли в ходе исследований противоопухолевой терапии, а также влияния роста опухоли на синтетические анаболические потребности клеток, экспрессию аминокислотных транспортеров и проницаемость ГЭБ.

Параметрическая визуализация

Вирусы - Разработанный метод визуализации и количественной оценки эффективности трансфекции метастазов аденокарциномы толстой кишки в печени положен в основу серии клинических исследований, мониторирующих эффективность переноса терапевтического гена. Визуализация действия вирусной противоопухолевой терапии с помощью молекулярных ре-портерных систем внедрена в лабораторные методы работы с малыми лабораторными животными для оценки распределения введённого вируса в организме, вирусной дозы, накопленной в отдельных органах и тканях. Данная методика позволяет проводить количественную оценку вирусной нагрузки и функциональной экспрессии терапевтических белков, перенесённых вирусным вектором.

Методы визуализации генной терапии необходимы для развития таргет-терапии в онкологии, требующего долговременного неинвазивного мониторироваиия и регуляции экспрессии перенесенных генов в живом организме с целью предотвращения возможных побочных эффектов от проводимого лечения.

Бактерии - разработана репортерная система, позволяющая проводить наблюдение за эффективностью нового метода в противоопухолевой терапии - бактериальной терапии опухолей - и следить за распределением используемого при этом терапевтического компонента в организме больного. Неинвазивная визуализация с помощью репортерного гена ВПГ-ТК использовалась для характеристики распределения противоопухолевых терапевтических бактерий с целью оценки бактериальной нагрузки на жизненно-важные органы и системы.

Клетки:

Лимфоциты - На основании разработанной и опубликованной нами методики визуализации Т-лимфоцитов разработан клинический протокол наблюдения за введенными нациенту генетически модифицированными анти-ЭБВ-специфичными цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Кроме того, неинвазивная молекулярная визуализация антиген-специфичных Т-клеток, введенных животным, несущим специфическую опухоль, используется в исследованиях, изучающих механизмы противоопухолевого и противовирусного Т-клеточного ответа, основные молекулярные компоненты, участвующие в процессе антиген-специфичной миграции и активации Т-клеток, а также механизмы, с помощью которых опухоли избегают контроля со стороны иммунной системы и становятся резистентными к опухолесиецифичному Т-клеточному ответу.

Предложенные подходы с использованием химерных многофункциональных визуализирующих генов могут использоваться для визуализации опухолевых и гемопоэтических клеток в многочисленных исследованиях, оценивающих их расположение и функции клеток крови и иммунной системы.

Мониторирование лимфоцитов, введенных пациентам в терапевтических целях, позволяет проводить контроль и коррекцию проводимой иммунотерапии в масштабе реального времени в соответствии с наблюдаемым терапевтическим эффектом и предвосхищать развитие возможных побочных реакций, включая РТПХ.

Костный мозг - использование визуализации ГСК позволяет на ранних этапах прогнозировать состоятельность трансплантата. Интенсивность сигнала и его прирост коррелируют с увеличением числа клеток и, таким образом, восстановлением гемопоэза.

Наблюдение за клетками костного мозга в посттрансплантационном периоде позволяет на ранних этапах оценивать и прогнозировать приживление трансплантата и, в случае наличия данных об отторжении, рассматривать вопрос о повторной пересадке на ранних клинических этапах с возможным сокращением сроков восстановления гематопоэза.

Опухолевые клетки - использование флуоресцентных белков позволяет в реальном масштабе времени наблюдать за распределением опухолевых клеток в организме.

Применение многофункциональных визуализирующих систем позволяет выявить в популяции метастатических клеток рака молочной железы наличие субпопуляций, имеющих предопределенную предрасположенность к метастазированию в различные органы и ткани.

Прямые трейсеры

Разработан метод оценки прогнозирования эффективности лечения препаратами группы ингибиторов протеин кииазы рецептора ЭРФ прессой и тарсивой (гефитиниб/имитиниб), применяющихся при лечении немелкоклеточного рака легких, с помощью радиоактивно-меченных структурных аналогов, являющихся ковалептно-связывающимися ингибиторами интересующих протеип-киназ.

Для оценки клинического влияния и выработки показаний к применению ингибиторов аЫ-протеин-киназы (глнвек (8Т1-571)) в лечении ОПУД опухолей и хронических миело-лейкозов разработан метод использования радиофармпрепаратов семейства эгс-ингибиторов, позволяющий предсказывать чувствительность опухоли в живом организме и в культуре клеток к определенному виду фармакологических препаратов класса ингибиторов ПК.

Неинвазивныи имиджинг с использованием ингибиторов ЭРФ-тирозин киназ применяется в исследованиях роли различных мутаций ЭРФ в чувствительности опухолей к химиотерапии новым классом фармпрепаратов - ПК-ингибиторами.

Предложено применение визуализации ингибиторов семейства сарк киназ - для скрининга относительной чувствительности новых препаратов данного семейства, а также для косвенной оценки терапевтического эффекта лечения отдельными ингибиторами различных ПК, обладающих кросс-реактивностью с срк- киназой.

Внедрение в практику:

Стадию клинического внедрения прошли ряд методов, разработанных в ходе описанных ниже исследований:

Суррогатный» визуализационный подход проходит клинические испытания на базе МСКОЦ. На данный момент в исследования возможности использования радиомеченных циклических аминокислот (ФАЦБК, ФАЦПК) вовлечены б пациентов, проведено 9 исследований, включая 3 повторных наблюдения.

В исследованиях 1-2 фазы по накоплению опухолями мозга радиомеченного йодоуридина был набран 21 больной. Исследования к настоящему моменту завершены.

В совместном исследовании 1-ой фазы по визуализации вирусной противоопухолевой терапии метастазов рака толстого кишечника на базе Госпиталь Маунт Синай при участии МСКОЦ проведены эксперименты с 4 пациентами.

Результаты исследований, проведенных в рамках данной работы, использованы в Институте Макса Планка, на базе Клинике Университета Кёльна, для проведения серии клинических экспериментов по суицидальной терапии резидуального заболевания после резекции глиобласто-мы с помощью адено-ассоциированых вирусов, несущих суицидально-визуализационный ген ВПГ-ТК. В ходе 1 Фазы испытаний визуализация [1241]ФИАУ применялась для оценки распространённости трансфекции и уровня экспрессии трансгена у 7 пациентов до начала терапии ганцикловиром.

Визуализация Т-клеток - в непосредственном взаимодействии с клиническими подразделениями МСКОЦ (отделение педиатрии, служба трансплантации костного мозга, отделение гастроэнтерологии, программа рака лёгкого) в ходе обследования пациентов внедрены методы биологической оценки и визуализации эффективности Т-клеточиой противоопухолевой терапии аденокарциномы толстой кишки, немелкоклеточного рака лёгкого и ЭБВ-ассоциированной лимфомы на основе молекулярного анализа.

Результаты, полученные в ходе исследований прямой визуализации, внедрены в создание скрининговой системы, позволяющей в ходе анализа полученных при биопсии или резекции опухолевых тканей, устанавливать чувствительность опухоли к терапии препаратами класса необратимых ингибиторов протеин-киназа ЭГФР.

Подготовлены клинические протоколы для внедрения новых трейсеров: ФЕАУ для репор-терной визуализации ВПГ-ТК и ФБрАУ для «суррогатной» визуализации клеточной пролиферации.

На доклиническом этапе также внедрен широкий диапазон разработок.

Разработанный и охарактеризованный ФЕАУ используется для репортерной визуализации лабораторными подразделениями отделов педиатрии, ядерной медицины, радиологии, радиотерапии, химиотерапии и службы трансплантации костного мозга МСКОЦ, а также отделением экспериментальной радиологии М.Д.Андерсон Онкологического Центра и отделением ТГСК НИИ детской гематологии

Для испытаний противоопухолевых препаратов в отделении фармакологии применяется трансфекция клеток линий, используемых для создания моделей опухолей, генной репортерной системой ХШП-70. В отделении радиотерапии для исследований чувствительности и ответа клеточных линий и эндотелиоцитов на лучевую терапию в культурах тканей и животных моделях используется репортерная система р53. Отделением фармакологии используются радиоме-ченные ингибиторы протеин-киназ для отбора новых терапевтически эффективных препаратов данного семейства с помощью прямой визуализации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Радиомечепные аналога тимидина и циклические аминокислоты, используемые в качестве радиофармпрепаратов, позволяют повысить чувствительность неинвазивной визуализационной оценки локализации и пролиферативпого потенциал опухоли в реальном времени и определение границ опухолевой инфильтрации.

2. Транскрипционно-регулируемые генные репортерные системы можно использовать в качестве инструмента визуализации и контроля передачи сигнала молекулярно-биологических процессов, вовлеченных в онкогенез на субклеточном уровне.

3. Совмещение структурной и функциональной информации позволяет повысить специфичность и чувствительность отдельных методов неинвазивной радиологической и молекулярной визуализации в доклинических исследованиях механизмов развития и лечения экспериментальных моделей опухолей.

4. С помощью неинвазивного молекулярного имиджинга можно определять характер движения и перераспределения цитотоксических Т-лимфоцитов в реальном масштабе времени в течение всего периода их существования в организме реципиента адоптивной иммунотерапии.

5. Метод прямой визуализации позволяет оценивать биологический эффект при разработке противоопухолевых препаратов группы необратимых ингибиторов протеин-киназ.

6. Накопление радиомеченных аналогов тимидина и циклических аминокислот позволяет повысить достоверность диагноза распространенности опухоли и клиническую значимость метода позитро-эмиссионной томографии у пациентов с опухолями головного мозга

7. Иеинвазивпая визуализация генов с двойной репортерно-суицидальной функцией (ВПГ-ТК) позволяет осуществить контроль за распределением вирусного вектора, локализацией и уровнем активации терапевтического гена при генной суицидальной терапии метастазов рака толстой кишки в печень с помощью аденовирусного вектора.

8. Определения показаний к назначению препаратов группы ингибиторов тирозин ки-наз может быть осуществлено при помощи радиомеченных аналогов данных фармацевтических соединений, применяемых для прямой неинвазивной визуализации опухоли в организме в целом.

Место выполнения работы

Экспериментально-теоретическая часть выполнена на базе Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологического Центра, Нью-Йорк, США. Исследования проводились в отделениях педиатрии, нейроонкологии, трансплантации костного мозга, радиологии, ядерной медицины и терапии. Часть экспериментально-теоретических исследований также проводилась при участии отделения экспериментальной радиологии М.Д.Андерсон Онкологического Центра, отделения гастроэнтерологии Больницы Маунт Синай и программы генетики Университета Нью Джерси, США. В исследованиях использованы материалы совместных разработок с компаниями Авантис и Вион Фармасьютикалс, США.

Клиническая часть работы, включая ретроспективный анализ популяций онкологических и гематологических пациентов и клинические испытания, проводилась на базе отделений педиатрии МСКОЦ и Нью-Йоркской Пресвитерианской Больницы, нейроонкологии и терапии МСКОЦ, а также отделений гастроэнтерологии МСКОЦ и Больницы Маунт Синай, Нью-Йорк, США, и научно-клинического отделов ФГУ ФГНЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, Москва, РФ.

Апробация работы

Материалы и основные положения работы доложены на VI и VIII Всероссийских Конгрессах «Человек и Лекарство» (Москва, 2001 и 2003 гг.), на 47, 49 и 50 Ежегодном съездах Общества Ядерной Медицины (Ст.Луис, 2000, Лос-Анджелес, 2003 и Новый Орлеан, 2004), Съезде по Экспериментальной Биологии Американской Анатомической Ассоциации (Вашингтон, 2004), Совещании Национального Института Неврологии «Визуализационные маркеры Эпи-лептогенеза: Новые Направления Исследований» (Вашингтон, 2004), Высокогорной Конференции по Ядерной Медицине (Вейл, 2003), клинических конференциях Отеления Радиологии Медицинского центра Университета Пенсильвании (Филадельфия, 2003) и Детского Отделения Нью-Йоркской Пресвитерианской Больницы (Нью-Йорк, 2005), научно-практических конференциях сотрудников МСКОЦ и ФНКЦ ДГОИ Росздрава (2001-2005г.).

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Дубровин, Михаил Михайлович

ВЫВОДЫ:

1. В серии культуральных и доклинических исследований на животных нами была доказана возможность применения ряда новых радиофармпрепаратов групп нуклеозидов (ИУдР и [76Br]-BrFAU) и аминокислот ([18Р]ФАЦБК) в качестве радиологических проб для неинвазивного наблюдения за пролиферативной и метаболической активностью опухоли. При этом преимуществом в специфичности сигнала обладают неметаболизируемые соединения.

2. Генные репортерные системы для непрямой визуализации биологических процессов позволяют проводить количественную радиологическую и оптическую регистрацию репортерного сигнала для неинвазивной визуализации приживления трансплантата костного мозга, апоптоза, опухолевой гипоксии, взаимодействия Т-клеток и опухоли и других процессов, вовлеченных в онкогенез, в реальном масштабе времени.

3. Многофункциональные репортерные генные системы и использование различных методов визуализации позволяют с помощью молекулярного имиджинга мониторировать взаимодействие CD4 и CD8 Т-клеток. Сочетание структурной и функциональной информации повышает разрешающую способность при анализе микрометастазов аденокарциномы по сравнению с индивидуальными методами и обеспечивает достоверность интерпретации результатов визуализации.

4. Визуализация противоопухолевого иммунного ответа в ходе адоптивной Т-клеточной терапии ЭБВ-лимфомы позволило не только мониторировать необходимую дозу клеток и их специфические и неспецифические реакции на опухоль и нормальные ткани организма, но также наблюдать за механизмами действия лимфоцитов и определить необходимость введения повторной дозы ЦТЛ.

5. Методы, основанные на принципе прямой визуализации радиомеченными аналогами ингибиторов протеин-киназ [ 1]АГ иДВ, позволяют оценивать биологический эффект при разработке противоопухолевых препаратов групп ЭГФР и абл-ерк ингибиторов, соответственно.

6. Прямая визуализация с применением радиомеченных ингибиторов ПК позволяет путем биологического анализа клинических образцов опухоли определить чувствительность ХМЛ к терапии иматинибом, и аденокарциномы - к лечению гефитинибом и мониторировать терапию препаратами данной группы.

7. Клинические испытания 1-2 фазы показали возможность использования

1 " 18 [ т]ИУдР и [ Р] ФАЦБК для повышают разрешающую способность «суррогатного метода» молекулярной визуализации с помощью ПЭТ для неинвазивно-го мониторирования пролиферативпых и метаболических характеристик опухо

• о ли по сравнению со стандартными радиофармпрепаратами. [ Р]ФАЦБК имеет преимущество в выявлении инфильтративного роста опухоли. Повышение на

124 т *"* копления [ 1]ИУдР коррелирует с ухудшением выживаемости пациентов.

8. Неипвазивное наблюдение за генной противоопухолевой терапией с помощью гена двойного суицидально-визуализационного применения ВПГ-ТК и его специфичного субстрата [,241]ФИАУ позволяет осуществлять контроль за локализацией и уровнем экспрессии терапевтического гена в метастазах рака толстой кишки в печень

9. Репортерные системы позволяют контролировать процессы иммуно, гемато и опкогенеза и являются основой для дифференциальной терапии.

Практические рекомендации Для повышения точности предхирургической диагностики опухоли и определения терапевтическиих возможностей для опухолей мозга рекомендуется использовать оценку локализации и активности метаболических потребностей опухолей головного мозга с применением ПЭТ с [,8Р]ФАБЦК. По интенсивности накопления радиофармпрепарата можно определять интенсивность метаболизма опухоли и эффективность применения цитостатических препаратов группы антиметаболитов. При необходимости оценку и мониторинг активности пролиферации опухоли следует использовать неинвазивной ПЭТ визуализацию с [1241]ЙУдР или [76Вг]БрФАУ. Для получения оптимального соотношения опухоль/фон нормальных тканей при минимальном распаде радиофармпрепарата оценку изображения обоих нуклеозид-пых радиотрейсеров следует проводить через 4 часа после введения. В качестве клинически применимого метода для радиологической визуализации гена ВПГ-ТК в составе репортерных систем для мониторирования вирусных и бактериальных векторов для противоопухолевой терапии следует использовать [1241]ФИАУ для получения изображений с низкой фоновой активностью и частотой

1 Я наблюдений реже 8 дней. [ Р]ФЕАУ в сочетании с ВПГ-ТК позволяет добиться высокой частоты наблюдений. Выбор радиофармпрепарата должен зависеть от задач исследования.

1311]ФИАУ можно использовать для проведения специфической радиогенной терапии тканей трансфецированных ВПГ-ТК.

В случае необходимости использования репортерных генов человеческого происхождения в исследовательских и клинических протоколах неипвазивную молекулярную визуализацию следует проводить с чНАТ и [*1]МИБГ и/или чПИС и [*Г] (йодидом).

Молекулярный имиджинг обеспечивает контроль за клетками, введенными реципиенту в ходе адоптивной терапии опухолей Т-лимфоцитами, генетически модифицированными для экспрессии ВПГ-ТК. В контроль включена как возможность наблюдения, так и управления клетками за счет суицидального эффекта ганцикло-вира.

Репортерные гены следует использовать для мониторинга трансплантации генетически измененного костного мозга. Они позволяют на ранних этапах неинвазивпо оценить скорость и успешность приживления трансплантата.

Экспериментальное наблюдение за опухолевыми метастазами эффективно, экономно и биологически безопасно проводить, используя оптические визуализирующие системы, не требующие дорогого оборудования и расходных материалов (радиоизотопов)

Использование активационных систем в гипоксичных опухолевых тканях позволит не только специфически оценивать уровень оксигенации тканей, и, соответственно, уровень протекания окислительно-восстановительных реакций, образования про-ангиогенных биологически активных веществ и свободных радикалов, но и специфически влиять на гипоксичные ткани опухолей.

Применение селективной активации генов, вовлеченных в р53-опосредованную регуляцию клетки, позволяет контролировать процессы апоптоза опухоли и противоопухолевых терапевтических лимфоцитов.

Оценка активации ЦТЛ с помощью транскрипционно регулируемой репортерной системы необходима для наблюдения за их противоопухолевым эффектом с одной стороны, и инактивации возможной реакции трансплантат против хозяина, с другой.

Для определения чувствительности к ингибиторам ПК следует использовать метод прямой визуализации активации протеин киназного пути передачи сигнала в опухолевых клетках с помощью радиомеченных ПКИ аналогов.

In vivo мониторинг терапии ингибиторами ПК может успешно осуществляться путем использования прямой ПЭТ визуализации после введения следовых концентраций радиомеченных аналогов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Внедрение новых методов молекулярной неинвазивной визуализации призвано сыграть важную роль в развитии биологически-направленной медицины. В настоящей работе нами предложен широкий диапазон методов, позволяющий осуществить всесторонний подход к изучению физиологии гемопоэтических и опухолевых клеток в живом организме.

Разработка «суррогатной» визуализации была направлена на преодоление недостатков современных стандартных методов визуализации. Для правильного понимания предложенных подходов, необходимо рассмотреть недостатки каждого метода. Наибо

1 Я лее распространенным является ПЭТ визуализация с [ Р]ФДГ. Интерпретация результатов данного исследования основана на концепции кинетического уравнения, описывающего метаболизм радиофармпрепарата. Исходя из двухкамерной модели распределения при необратимом связывании ФДГ, как это происходит в тканях головного мозга, лимитирующей скорость реакцией является транспорт внутрь клетки. Таким образом, визуализация опухолей мозга с ФДГ отражает активность транспортеров глюкозы. Экспрессия данных транспортеров повышается в некоторых опухолевых тканях в ответ на гипоксию и энергетический дефицит. Регуляция экспрессии транспортеров осуществляется широким диапазоном транскрипторных факторов стресса, включая ГИФ-1. Таким образом, визуализация с ФДГ отражает неспецифические стрессорные процессы, протекающие в опухоли. Гетерогенность и непостоянство процессов, протекающих в опухоли, обуславливают трудности с интерпретацией ФДГ сигнала. Эти трудности еще более очевидны для опухолей немозговой локализации, где вступают в действие фосфорилазы, дефосфорелирующие субстрат. Для таких тканей ФДГ-накопление косвенно отражает активность глюко-гексокиназы.

Проведенное нами сравнительное исследование прогностической значимости визуализации с ФДГ доказало субоптимальную достоверность положительного сигнала накопления ФДГ. Вторым биологически обусловленным недостатком данного метода «суррогатной» визуализации является стрессовая природа индукции сигнала. Положительное накопление возможно только в тканях, испытывающих кислородно-метаболическую недостаточность. Периферия опухоли, в особенности зона инфильтра-тивного роста, не находятся в состоянии метаболического стресса, так как адекватно обеспечиваются за счёт кровоснабжения нормальных тканей. Таким образом, опухолевая инфильтрация оказывается невидимой на ФДГ сканограммах, что снижает, в соответствие с полученными нами данными, достоверность предоперационной диагностики с помощью ПЭТ.

Опыт метаболической визуализации опухолей, накопленный ранее, показал преимущества визуализации с помощью аминокислот. Возможность использования в качестве радиофармакологических проб для «суррогатной» визуализации неметаболизируе-мых аминокислот, таких как рассматриваемый нами ФАЦБК, позволяет избежать основных недостатков метаболического имиджинга. Испытания ФАЦБК для ПЭТ визуализации опухолей головного мозга подтвердили специфичность препарата, накапливающегося в опухоли. ПЭТ с ФАЦБК позволил улучшить процесс планирования хирургического удаления опухоли, что имеет особое значение для опухолей мозга, так как полная резекция является ключевым условием достижения полной ремиссии.

В терапии ряда опухолей, таких как астроцитома, помимо точной топической диагностики критическое значение имеет определение стадии и атшшзма опухоли, поскольку тактика лечения различается для опухолей низкой и высокой степени злокачественности. Стандартом проведения подобной диагностики является получение биопта-та опухоли с последующим морфологическим анализом, включающим количество мито-тических ¡слеток, как показатель пролиферативной активности. В клинической практике во многих случаях при планировании лечения астроцитом объем материала доступного для морфологического анализа, ограничен нункционной биопсией. Астроцитомы также часто характеризуются гетерогенностью, при которой тип пролиферации биоптата может не отражать адекватно ситуацию в других частях опухоли. В связи с этим возможность неинвазнвно мониторировать опухолевую пролиферацию, используя ПЭТ с помощью ИУдР, представляет определенные преимущества. Для большинства рассмотренных больных с высокой степенью атипизма опухоли высокая пролиферация коррелировала с активацией гексокиназного пути метаболизма глюкозы. Вместе с тем отмечались участки гетерогенного накопления. ИУдР, который также играл важную роль в дифференциации лресистирующей опухоли и пострадиационных изменений в облученной ткани, так как в результате любой терапии объем «плюс-ткани» может не сокращаться, в то время как большая часть объёмного образования будет представлена некротической тканыо.

Описанное в данной работе использование синтетических радиомечепиых нук-леотидов и циклических аминокислот позволяет косвенно оценивать скорость пролиферации и метаболическую активность опухоли, соответственно. В ряде медицинских центров в мире при проведении «суррогатной» визуализации предпринимаются также попытки использования для пеметаболизируемых аминокислот и нуклеозидов. Проведенные нами клинические испытания принципиально подтверждают возможность подобного подхода. В ходе испытаний были также определены условия, позволяющие добиться оптимального соотношения сигнала к фону, учитывая сочетание факторов биологической стабильности радиопробы- и ее фармакокинстики.

Оба рассмотренных метода « суррогатной» визуализации занимают свою нишу в диагностике опухолей, улучшая ранее описанные методы радиологии.

Внедрение прямой визуализации ИПК является вариантом использования хорошо известного подхода имиджинга с использованием радиомеченных лекарственных препаратов. Особую клиническую значимость данный метод приобретает с быстрым прогрессирующим развитием специфических ПК ингибиторов как класса противоопухолевых препаратов. Учитывая их специфичность, единственное, что может обеспечить повышение эффективности терапии ИПК, является точная и адекватная диагностика опухолей и определение индивидуальной чувствительности опухолей к ИПК. Использование прямой визуализации позволило нам не только проводить отбор пациентов или подбор индивидуальной терапии для отдельно взятого больного, но и мониторировать процесс терапии, определяя ответ опухоли. Прямая визуализация аналогами ИПК может иметь также важную роль в диагностике опухолей, резистентных к лечению определенным типом ИПК, которые могут оказаться чувствительными к другим препаратам данной группы, как это было показано ранее.

В основе дальнейшего прогресса специфической биологической противоопухолевой терапии лежит более полное понимание путей передачи биологических сигналов, вовлеченных в опкогенез. Использование регулируемых генных репортерных систем обеспечивает универсальный подход к моииторированшо активации отдельных механизмов злокачественной трансформации. Исследование упомянутых механизмов, включая рассмотренные в данной работе ГИФ, р53, ХШП и пр., позволяет, как разработать новые специфические подходы к блокированию данных путей, так и использовать их активацию в опухолевых клетках для положительной регуляции противоопухолевых терапевтических подходов. Транскрипторно активируемые терапевтические гены позволяют либо доставить специфическую терапию в клетку, экспрессирующую активированную систему, либо скорректировать экспрессию гена.

Другой областью, где находят широкое применение методы молекулярной визуализации, является противоопухолевый иммунитет. Наблюдение за лимфоцитами позволило не только определить оптимальное сочетание и дозу различных компонентов противоопухолевого ответа, но и наблюдать за распределением лимфоцитов в организме. Наблюдение за лимфоцитами позволяет заранее прогнозировать развитие нежелательных реакций с участием трансплантированных генетически модифицированных лимфоцитов, а также, при необходимости, устранять их, используя суицидальные свойства таких репортерпых систем, как ВПГ-ТК/ганцикловир или вновь разработанных нами чНАТ/метайодобензилгуанидип. Подобные генетические модификации трансплантируемых лимфоцитов уже давно внедрены в клиническую практику. Таким образом, разработанный нами метод визуализации дополнит и расширит диапазон клинических возможностей.

Трансплантация генетически модифицированного костного мозга внедряется в клинику как для коррекции генетических дефектов кроветворения (талассемии, СКИД и т.п.), так и с целью возможной профилактики РТПХ. Добавление возможностей визуализации обеспечивает как контроль приживления трансплантата, так и возможность длительного наблюдения за развитием клеток, происходящих из трансплантированного костного мозга.

Развитие молекулярной визуализации обогащает арсенал средств клинической и базовой науки, изучающей развитие опухолей и ответ организма на опухолевый процесс.

Исследования, представленные в дайной работе, объединены общей идеей создания возможности доступной зрительному восприятию и приборному измерению качественной и количественной оценки биологических процессов в организме пациента и лабораторных условиях путем сочетания клинических, радиологических и оптических лабораторных методов визуализации. Широта спектра исследований не случайна. Она отражает развитие всех направлений молекулярной визуализации, позволяющих иметь арсенал научных инструментов для выбора одного или сочетания наиболее соответствующих целям и задачам терапевтического вмешательства или исследования.

Возможности, предоставляемые молекулярной визуализацией, охватывают все аспекты гематологии-онкологии от оценки развития костного мозга до формирования опухоли и развития противоопухолевого иммунного ответа. Гибкость разрабатываемых репортерных систем позволяет создавать модификации, специфические для изучаемого объекта или лечебного протокола. Также существует возможность выбора визуализирующей методики в зависимости от технического оснащения клиники или научного института. Экономическая эффективность исследований варьирует от ресурсоёмкого синтеза эмиттеров позитронов до экономичных гамма изотопов (99мТс). Таким образом, внедрение технологии молекулярной визуализации доступно и уже происходит во многих лечебных и научных центрах.

Учитывая непосредственную направленность описываемого комплекса исследований на разработку клинически применимых методов изучения онкогенеза, молекулярный имиджинг приобретает особую социальную значимость. Визуализирующие методы, позволяя достичь раннего выявления пациентов с первичными и рецидивирующими новообразованиями, провести выделение групп пациентов, чувствительных к определенным видам терапии, наблюдать за ходом лечения, помогут снизить стоимость, сократить продолжительность и повысить эффективность лечения. Подобный подход может повысить экономическую эффективность лечения онкологических пациентов.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Дубровин, Михаил Михайлович, 2006 год

1. Mayer-Kuckuk P, Menon LG, Blasberg RG, Bertino JR, Banerjee D Role of reporter gene imaging in molecular and cellular biology. Biol Chem. 2004 May;385(5):353-61. Review.

2. Blasberg RG, Gelovani J. Molecular-genetic imaging: a nuclear medicine-based perspective. Mol Imaging. 2002 Jul;l(3):280-300. Review.

3. Blasberg RG, Gelovani-Tjuvajev J. In vivo molecular-genetic imaging. J Cell Biochem Suppl. 2002;39:172-83. Review.

4. Massoud TF, Gambhir SS Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 2003 Mar l;17(5):545-80. Review.

5. Serganova 1, Blasberg R Reporter gene imaging: potential impact on therapy. Nucl Med Biol. 2005 0ct;32(7):763-80.

6. Reddy MP, Reddy P, Lilien DL. F-18 FDG PET imaging in gastrointestinal stromal tumor. Clin Nucl Med. 2003 Aug;28(8):677-9.

7. Couturier O, Luxen A, Chatal JF, Vuillez JP, Rigo P, Hustinx R Fluorinated tracers for imaging cancer with positron emission tomography. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2004 Aug;31 (8): 1182-206. Epub 2004 Jul 6. Review

8. Ogawa T, Inugami A, Hatazawa J, Kanno I, Murakami M, Yasui N, Mineura K, Uemura K. Clinical positron emission tomography for brain tumors: comparison of fludeoxyglucose F 18 and L-methyl-1 lC-methionine. AJNR Am J Neuroradiol. 1996 Feb;17(2):345-53.

9. Nunez R, Macapinlac HA, Yeung HW, Akhurst T, Cai S, Osman I, Gonen M, Riedel E, Scher HI, Larson SM Combined 18F-FDG and 1 lC-methionine PET scans in patients with newly progressive metastatic prostate cancer. J Nucl Med. 2002 Jan;43(l):46-55

10. Chen W, Cloughesy T, Kamdar N, Satyamurthy N, Bergsneider M, Liau L, Mischel P, Czernin J, Phelps ME, Silverman DH. Imaging proliferation in brain tumors with 18F-FLT PET: comparison with 18F-FDG J Nucl Med. 2005 Jun;46(6):945-52.

11. Chung JK, Lee YJ, Kim SK, Jeong JM, Lee DS, Lee MC. Comparison of 18F.fluorodeoxyglucose uptake with glucose transporter-1 expression and proliferation rate in human glioma and non-small-cell lung cancer. Nucl Med Commun. 2004 Jan;25(l):l 1-7.

12. Schwarzacher HG, Schnedl W. Position of labelled chromatids in diplochromosomes of endo-reduplicated cells after uptake oftritiated thymidine. Nature. 1966 Jan 1 ;209(18): 107-8

13. Shields AF, Larson SM, Grunbaum Z, Graham MM. Short-term thymidine uptake in normal and neoplastic tissues: studies for PET. J Nucl Med. 1984 Jul;25(7):759-64

14. Shields AF, Graham MM, Kozawa SM, Kozell LB, Link JM, Swenson ER, Spence AM, Bassingthwaighte JB, Krohn KA. Contribution of labeled carbon dioxide to PET imaging of carbon-11-labeled compounds. J Nucl Med. 1992 Apr;33(4):581-4.

15. Shields AF, Mankoff D, Graham MM, Zheng M, Kozawa SM, Link JM, Krohn KA. Analysis of 2-carbon-11-thymidine blood metabolites in PET imaging. J Nucl Med. 1996 Feb;37(2):290-6.

16. Eary JF, Mankoff DA, Spence AM, Berger MS, Olshen A, Link JM, et al. 2-C-l l.thymidine imaging of malignant brain tumors. Cancer Res 1999;59:615-21.

17. Zasadny KR, Wahl RL. Standardized uptake values of normal fissues at PET with 2-fluorine-18.-fluoro-2-deoxy-D-glucose: variations with body weight and a method for correction. Radiology 1993;189:847-50.

18. Shields AF, Grierson JR, Kozawa SM, Zheng M. Development of labeled thymidine analogs for imaging tumor proliferation. Nucl Med Biol 1996;23:17-22

19. Grierson JR, Shields AF. Radiosynthesis of 3'-deoxy-3'-18F. fluorothymidine: [18FJFLT for imaging of cellular proliferation in vivo. Nucl Med Biol 2000;27:143-56.

20. Choi SJ, Kim JS, Kim JH, Oh SJ, Lee JG, Kim CJ, Ra YS, Yeo JS, Ryu JS, Moon DH18F.3'-deoxy-3'-fluorothymidine PET for the diagnosis and grading of brain tumors. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2005 Jun;32(6):653-9. Epub 2005 Feb 15.

21. Shields AF, Grierson JR, Dohmen BM, Machulla HJ, Stayanoff JC, Law horn-Crews JM, Obradovich JE, Muzik O, Mangner TJ. Imaging proliferation in vivo with F-18JFLT and positron emission tomography. Nat Med. 1998 Nov;4(l 1): 1334-6

22. Sun II, Mangner TJ, Collins JM, Muzik O, Douglas K, Shields AF. Imaging DNA synthesis in vivo with 18F-FMAU and PET. J Nucl Med. 2005 Feb;46(2):292-6.

23. Sun H, Sloan A, Mangner TJ, Vaishampayan U, Muzik O, Collins JM, Douglas K, Shields AF Imaging DNA synthesis with 18FJFMAU and positron emission tomography in patients with cancer. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2005 Jan;32(l): 15-22.

24. Kao CH, Waki A, Sassaman MB, Jagoda EM, Szajek LP, Ravasi L, Shimoji K, Eckelman WC. Evaluation of 76Br.FBAU 3',5-dibenzoate as a lipophilic prodrug for brain imaging. Nucl Med Biol. 2002 Jul;29(5):527-35.

25. Busch H, Davis JR, Honig GR, Anderson DC, Nair PV, Nyhan WL. The uptake of a variety of amino acids into nuclear proteins of tumors and other tissues. Cancer Res. 1959;19:1030 -1039.

26. Isselbacher KJ. Sugar and amino acid transport by cells in culture: differences between normal and malignant cells. N Engl J Med. 1972;286:929 -933.

27. Langstrom B, Antoni G, Gullberg P, et al. Synthesis of L- and C-methyl-l lCJmethionine. J Nucl Med. 1987;28:1037-1040.

28. Skvortsova TIu, Brodskaia ZL, Rudas MS, Mozhaev SV, Gurchin AF, Medvedev SV. Positron emission tomography in the diagnosis of recurrent growth of brain tumors. Zh Vopr Neirokhir Im N N Burdenko. 2005 Apr-Jun;(2):3-7; discussion 7. Russian.

29. Tang BN, Levi vier M, Heureux M, Wikler D, Massager N, Devriendt D, David P, Dumarey N, Corvilain B, Goldman S. (1 l)C-methionine PET for the diagnosis and management of recurrent pituitary adenomas. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2005 Oct 15

30. Toth G, Lengyel Z, Balkay L, Salah MA, Tron L, Toth C. Detection of prostate cancer with 11C-methionine positron emission tomography. J Urol. 2005 Jan;173(l):66-9; discussion 69.

31. Chung JK, Kim YK, Kim SK, Lee YJ, Paek S, Yeo JS, Jeong JM, Lee DS, Jung HW, Lee MC. Usefulness of 1 lC-methionine PET in the evaluation of brain lesions that are hypo- or isometabolic on 18F-FDG PET. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2002 Feb;29(2): 176-82.

32. Nakagawa M, Kuwabara Y, Sasaki M, Koga H, Chen T, Kaneko O, Hayashi K, Morioka T, Masuda K1 lC-methionine uptake in cerebrovascular disease: a comparison with 18F-fDG PET and 99mTc-HMPAO SPECT. Ann Nucl Med. 2002 May;16(3):207-11.

33. Buonomo C, Mills P, Hilton J, Anderson JH, Wong DF, Dannals RF. Labeled plasma metabolites of L-methyl-hydrogen-3-methionine and L-methyl-carbon-14-methionine in the dog. Am J Physiol Imaging. 1988;3(4):178-81.

34. Daemen BJG, Elsinga PH, Paans AMJ, Lemstra W, Konings AWT, Vaalburg W. Suitability of rodent tumor models for experimental PET with L-l-l 1C.- tyrosine and 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose. IntJ RadAppl Instrum B. 1991; 18:503-511.

35. Luurtsema G, Medema J, Elsinga PH, Visser GM, Vaalburg W. Robotic synthesis of L-l 1C.-tyrosine. Appl Radiat Isot. 1994;45:821- 828.

36. Willemsen AT, van Waarde A, Paans AM, et al. In vivo protein synthesis rate determination in primary or recurrent brain tumors using L-l-l lC.-tyrosine and PET. J Nucl Med. 1995;36:411—419

37. Daemen BJG, Elsinga PH, Mooibroek J, et al. PET measurements of hyperthermia- induced suppression of protein synthesis in tumors in relation to effects on tumor growth. J Nucl Med. 1991;32:1587-1592.

38. Kersemans V, Cornelissen B, Kersemans K, Bauwens M, Achten E, Dierckx RA, Mertens J, Siegers G. In vivo characterization of 123/125I-2-iodo-L-phenylalanine in an RIM rhabdomyosarcoma athymic mouse model as a potential tumor tracer for SPECT.

39. J Nucl Med. 2005 Mar;46(3):532-9

40. Langen KJ, Roosen N, Coenen HH, et al. Brain and brain tumor uptake of L-3-123I.iodo-alpha-methyl tyrosine: competition with natural L-amino acids. J Nucl Med. 1991;32:1225-1229

41. Langen KJ, Coenen HH, Roosen N, et al. SPECT studies of brain tumors with L-3-1231. iodo-alpha-methyl tyrosine: comparison with PET, 124IMT and first clinical results. J Nucl Med. 1990;31:281-286.

42. Jager PL, Franssen EJ, Kool W, et al. Feasibility of tumor imaging using L-3-iodine-123.-iodo-alpha-methyl-tyrosine in extracranial tumors. J Nucl Med. 1998;39:1736 -1743.

43. Riemann B, Stogbauer F, Kopka K, et al. Kinetics of 3-(123)lJiodo-l-alphamethyltyrosine transport in rat C6 glioma cells. EurJNuclMed. 1999;26:1274- 1278.

44. Jager PL, Plaat BE, Vries de EG, et al. Imaging of soft-tissue tumors using L-3-iodine-123.iodo-alpha-methyl-tyrosine SPECT: comparison with proliferative and mitotic activity, cellularity and vascularity. Clin Cancer Res. 2000;6: 2252-2259.

45. Shoup TM, Olson J, Hoffman JM, Votavv J, Eshima D, Eshima L, Camp VM, Stabin M, Votavv D, Goodman MM. Synthesis and evaluation of 18F.l-amino-3-fluorocyclobutane-l-carboxylic acid to image brain tumors. J Nucl Med. 1999 Feb;40(2):331-8.

46. T. Peng, T.R. Golub, and D.M. Sabatini, "The immunosuppressant rapamycin mimics a starvationlike signal distinct from amino acid and glucose deprivation. Mol Cell Biol., vol.22, pp. 5575-5584, Aug. 2002.

47. K.A. Frauwirth, J.L. Riley, M.H. Harris, R.V. Parry, J.C. Rathmell, D.R. Plas, R.L. Elstrom, C.H. June, and C.B. Thompson, "The CD28 signaling pathway regulates glucose metabolism", Immunity, vol. 16, pp. 769-777, Jun. 2002.

48. J.G. Tjuvajev , A. Joshi, J. Callegari, L. Lindsley, R. Joshi, J. Balatoni, R. Finn, S.M. Larson, M.

49. Sadelain, and R.G. Blasberg, "A general approach to the non-invasive imaging of transgenes using249cis-linked herpes simplex virus thymidine kinase", Neoplasia, vol. 1, pp. 315-320, Oct. 1999.

50. R. Mayerhofer, K. Araki, and A.A. Szalay, "Monitoring of spatial expression of firefly luciferase in transformed zebra fish", J Biolumin. Chemilumin., vol. 10, pp. 271-275, Sept.- Oct. 1995.

51. J. Bennett, D. Duan, J.F. Engelhardt, and A.M. Maguire, "Real-time, noninvasive in vivo assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction", Investigative Ophthalmology & Visual Science, vol. 38, pp. 2857-2863, Dec. 1997.

52. A. Rehemtulla, L.D. Stegman, S.J. Cardozo, S.Gupta, D.E. Hall, C.H. Contag and B.D. Ross,"Rapid and quantitative assessment of cancer treatment response using in vivo bioluminescence imaging," Neoplasia, vol.2, pp. 491-495, Nov.-Dec. 2000.

53. R. Weissleder, M. Simonova, A. Bogdanova, S. Bredow, W.S. Enochs, and A. Bogdanov, "MR imaging and scintigraphy of gene expression through melanin induction", Radiology, vol. 204, pp. 425-429, Aug. 1997.

54. A.Y. Louie, M.M. Huber, E.T. Ahrens, U. Rothbacher, R. Moats, R.E. Jacobs, S.E. Fraser , and T.J. Meade, "In vivo visualization of gene expression using magnetic resonance imaging", Nat. Biotechnol., vol. 18, pp. 321-325, Mar. 2000.

55. MacGregor GR, Mogg AE, Burke JF, Caskey CT. Histochemical staining of clonal mammalian cell lines expressing E. coli beta galactosidase indicates heterogeneous expression of the bacterial gene. Somat Cell Mol Genet. 1987 May;13(3):253-65.

56. Dachs GU, Tupper J, Tozer GM. From bench to bedside for gene-directed enzyme prodrug therapy250of cancer. Anticancer Drugs. 2005 Apr; 16(4):349-59. Review.

57. Doubrovin M, Balatoni J, Finn R, Sgouros G and Tjuvajev JG Radio-gene therapy of gliomas with HSVl-tk gene and high dose 1311JFIAU. [Abstract # 979. Proceedings of the American Association for Cancer Research, 1999; 40: 147.

58. Re GG, Hazen-Martin DJ, Sens DA, Garvin AJ. Nephroblastoma (Wilms* tumor): a model system of aberrant renal development. Semin Diagn Pathol. 1994 May;l l(2):126-35. Review

59. Harris SL, Levine AJ The p53 pathway: positive and negative feedback loops. Oncogene. 2005 Apr 18;24(17):2899-908. Review.

60. Jascur T, Gilman J, Mustelin T. Involvement of phosphatidylinositol 3-kinase in NFAT activation in T cells. J Biol Chem. 1997 May 30;272(22): 14483-8. TKP

61. Woodrow M, Clipstone NA, Cantrell D p21ras and calcineurin synergize to regulate the nuclear factor of activated T cells. J Exp Med. 1993 Nov 1; 178(5): 1517-22.

62. Tanguay RM. Transcriptional activation of heat-shock genes in eukaryotes. Biochem Cell Biol. 1988 Jun;66(6):584-93. Review.

63. Karin M. Signal transduction and gene control. Curr Opin Cell Biol. 1991 Jun;3(3):467-73. Review

64. HIavaty J, Portsmouth D, Stracke A, Salmons B, Gunzburg WH, Renner M. Effects of sequences of prokaryotic origin on titer and transgene expression in retroviral vectors. Virology. 2004 Dec5;330(1):351-60.

65. Stevenson M, Volsky DJ Activated v-myc and v-ras oncogenes do not transform normal human lymphocytes. Mol Cell Biol. 1986 Oct;6(10):3410-7.

66. Ernstsson S, Pierrou S, Hulander M, Cederberg A, Hellqvist M, Carlsson P, Enerback S Characterization of the human forkhead gene FREAC-4. Evidence for regulation by Wilms' tumor suppressor gene (WT-1) and p53. J Biol Chem. 1996 Aug 30;271(35):21094-9.

67. Wang Y, Farmer G, Soussi T, Prives C Xenopus laevis p53 protein: sequence-specific DNA binding, transcriptional regulation and oligomerization are evolutionarily conserved. Oncogene.1995 Feb 16;10(4):779-84.

68. Ko LJ, Prives C. p53: puzzle and paradigm. Genes Dev. 1996 May 1; 10(9): 1054-72. Review.

69. Hooijberg E, Bakker AQ, Ruizendaal JJ, Spits H. NFAT-controlled expression of GFP permits visualization and isolation of antigen-stimulated primary human T cells. Blood. 2000 Jul 15;96(2):459-66.

70. Brown JM. Exploiting the hypoxic cancer cell: mechanisms and therapeutic strategies. Mol Med Today. 2000 Apr;6(4): 157-62. Review.

71. Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, Agani F, Leung SW, Koos RD, Semenza GL. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol.1996 Sep;16(9):4604-13.

72. Flynn GC, Chappell TG, Rothman JE. Peptide binding and release by proteins implicated as catalysts of protein assembly. Science. 1989 Jul 28;245(4916):385-90.

73. Stephanou A, Isenberg DA, Nakajima K, Latchman DS. Signal transducer and activator of transcription-1 and heat shock factor-1 interact and activate the transcription of the Hsp-70 and Hsp-90beta gene promoters. J Biol Chem. 1999 Jan 15;274(3): 1723-8

74. Smith DF, Whitesell L, Nair SC, Chen S, Prapapanich V, Rimerman RA Progesterone receptor252structure and function altered by geldanamycin, an hsp90-binding agent. Mol Cell Biol. 1995 Dec;15(12):6804-12

75. P. Ray P, A.M. Wu, S.S. Gambhir, "Optical bioluminescence and positron emission tomography imaging of a novel fusion reporter gene in tumor xenografts of living mice", Cancer Res., vol. 63, pp. 1160-1165, Mar. 2003.

76. S. Hasegawa, M.Yang, T. Chishima, Y. Miyagi, H. Shimada, A.R. Moossa, and R.M. Hoffman, "In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis", Cancer Gene Therapy, vol. 7, pp. 1336-1334, Oct. 2000.

77. R.M. Hoffman, "Visualization of GFP-expressing tumors and metastasis in vivo", Biotechniques, vol. 30, pp. 1016-1022, May 2001.

78. S. Pelletier, "Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA", Nature, vol. 334, pp. 320-325, 1988.

79. A.B. Sachs, P. Sarnow, and M.W. Hentze, "Starting at the Beginning, Middle, and End Translation Initiation in Eukaryotes", Cell, vol. 89, pp. 831-838, Jun. 1997.

80. B.E. Rogers, K.R. Zinn, and D.J. Buchsbaum, "Gene transfer strategies for improvingradiolabeled peptide imaging and therapy", QJNucl. Med., vol.44, pp. 208-223, Sept. 2000.

81. V.A. Kolb, E.V. Makeyev, and A.S. Spirin, "Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in a prokaryotic translation system," J Biol Chcm., vol. 275, pp. 16597-601, Jun. 2000.

82. J.F. Thompson, L.S. Hayes, D.B. Lloyd, "Modulation of firefly luciferase stability and impact on studies of gene regulation", Gene, vol. 103, pp. 171-177, Jul. 1991.

83. R.N. Day, M. Kawecki, and D. Berry, "Dual function reporter protein for analysis of gene expression in living cells", Biotechnology, vol.25, pp. 852-854, Nov. 1998.

84. Deshmukh A, Scott JA, Palmer EL, Hochberg FH, Gruber M, Fischman AJ Impact of fluorodeoxyglucose positron emission tomography on the clinical management of patients with glioma. Clin Nucl Med. 1996 Sep;21(9):720-5.

85. Finlay JL, Uteg R, Giese WL. Brain tumors in children. II. Advances in neurosurgery and radiation oncology. Am J Pediatr Hematol Oncol. 1987 Fall;9(3):256-63. Review, clin vis

86. Gossmann A, Eich HT, Engert A, Josting A, Muller RP, Diehl V, Lackner KJ. CT and MR imaging in Hodgkin's disease—present and future. Eur J Haematol Suppl. 2005 Jul;(66):83-9. Review.

87. Bradbury M, Hricak II Molecular MR imaging in oncology. Magn Reson Imaging Clin N Am. 2005 May;13(2):225-40. Review.

88. Schaefer-Prokop C, Prokop M. New imaging techniques in the treatment guidelines for lung cancer. Eur Respir J Suppl. 2002 Feb;35:71s-83s. Review.

89. Macapinlac HA. FDG PET and PET/CT imaging in lymphoma and melanoma. Cancer J. 2004

90. Jul-Aug; 10(4):262-70. Review. PET-CT

91. Hudson MM, Krasin MJ, Kaste SC. PET imaging in pediatric Hodgkin's lymphoma. Pediatr

92. Radiol. 2004 Mar;34(3): 190-8. Epub 2004 Jan 27. Review.

93. Gijtenbeek JM, Wesseling P, Maass C, Burgers L, van der Laak JA Three-dimensional reconstruction of tumor microvasculature: Simultaneous visualization of multiple components in paraffin-embedded tissue. Angiogenesis. 2005 Nov 19;: 1-9

94. Shah GD, DeAngelis LM. Treatment of primary central nervous system lymphoma. Hematol Oncol Clin North Am. 2005 Aug;19(4):611-27, v. Review.

95. Mogul MJ. Unrelated cord blood transplantation vs matched unrelated donor bone marrow transplantation: the risks and benefits of each choice.

96. Bone Marrow Transplant. 2000 May;25 Suppl 2:S58-60. Review, bmt opt for pts

97. X. Wang, M. Rosol, S. Ge, D. Peterson, G. McNamara, H. Pollack, D.B. Kohn, M.D. Nelson, and G.M. Crooks, "Dynamic tracking of human hematopoietic stem cell engraftment using in vivo bioluminescence imaging", Blood, vol. 102, pp. 3478-82, Nov. 2003.

98. J.M. Hill, A.J. Dick, V.K. Raman, R.B. Thompson, Z.X. Yu, K.A. Hinds, B.S. Pessanha, M.A.255

99. Guttman, T.R. Varney B.J. Martin, C.E. Dunbar, E.R. McVeigh, and R.J. Lederman, "Serial cardiac magnetic resonance imaging of injected mesenchymal stem cells", Circulation, vol. 108, pp. 1009-1014, Aug. 2003.

100. C. Stamm, B. Westphal, H.D. Kleine, M. Petzsch, C. Kittner, H. Klinge, C. Schumichen, C.A. Nienaber, M. Freund, and G. Steinhoff, "Autologous bonc-marrow stem-cell transplantation for myocardial infarction", Lancet, vol. 361, pp. 45-46, Jan. 2003.

101. O'Reilly RJ, Small TN, Papadopoulos E, Lucas K, Lacerda J, Koulova L., Biology and adoptive cell therapy of Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disorders in recipients of marrow allografts. Immunol Rev. 1997 Jun; 157:195-216. Review.

102. Heslop HE. Biology and treatment of epstein-barr virus-associated non-hodgkin lymphomas. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2005;:260-6.

103. Lucas KG, Small TN, Heller G, Dupont B, O'Reilly RJ Lucas The development of cellular immunity to Epstein-Barr virus after allogeneic bone marrow transplantation. Blood. 1996 Mar 15;87(6):2594-603.,

104. Zatz, M.M. and Lance, E.M. The distribution of chromium 51-labelled lymphoid cells in the mouse. 1970 Cell. Immunol. 1, 3.

105. Gobuty AH, Robinson RG, Barth RF.Organ distribution of 99mTc- and 51Cr-labeled autologous peripheral blood lymphocytes in rabbits. J Nucl Med. 1977 Feb; 18(2): 141-6.

106. Papierniak CK, Bourey RE, Kretschmer RR, Gotoff SP, Colombetti LG. Technetium-99m labeling of human monocytes for chemotactic studies. J Nucl Med. 1976 Nov;17(l l):988-92.

107. Korf J, Veenma-van der Duin L, Brinkman-Medema R, Niemarkt A, de Leij LF. Divalent cobalt as a label to study lymphocyte distribution using PET and SPECT. J Nucl Med. 1998 May;39(5):836-41.

108. Korf J, Veenma-van der Duin L, Brinkman-Medema R, Niemarkt A, de Leij LF (1998) Divalent cobalt as a label to sudy lymphocytes distribution using PET and SPECT. J Nuc Med 39(5), 836-841.

109. Wagstaff J, Gibson C, Thatcher N, Ford WL, Sharma H, Benson W, Crowther D (1981) A method for following human lymphocyte traffic using indium-Ill oxine labeling. Clin Exp Immunol 43(3), 435-42.

110. Constantin G, Laudanna C, Butcher EC.Novel method for following lymphocyte traffic in mice using 3H.glycerol labeling. J Immunol Methods. 1997 Apr 1 l;203(l):35-44.

111. Mandell RB, Mandell LZ, Link CJ Jr. (1999) Radioisotope concentrator gene therapy using the sodium/iodide symporter gene. Cancer Res; 59(3):661-8.

112. Atkins RC, Ford WL. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. I. The migration of responding and nonresponding donor lymphocytes. J Exp Med. 1975 Mar l;141(3):664-80.

113. Rose ML, Parrott DM, Bruce RG.I. Effect of Trichinella spiralis infection on the migration of mesenteric lymphoblasts and mesenteric T Iymphoblasts in syngeneic mice. Immunology. 1976 Nov;31(5):723-30.

114. Ettinghausen SE, Rosenberg SA. Immunotherapy of murine sarcomas using lymphokine activated killer cells: optimization of the schedule and route of administration of recombinant interleukin-2. Cancer Res. 1986 Jun;46(6):2784-92.

115. Schelper RL, Adrian EK Jr. Non-specific esterase activity in rcactive cells in injured nervous tissue labeled with 3H-thymidine or 125iododeoxyuridine injected before injury. J Comp Neurol. 1980 Dec 15; 194(4):829-44.

116. Schelper RL, Adrian EK Jr. Monocytes become macrophages; they do not become microglia: a light and electron microscopic autoradiographic study using 125-iododeoxyuridine. J Neuropathol Exp Neurol. 1986 Jan;45(l): 1-19.

117. Tjuvajev JG, Macapinlac HA, Daghighian F, Scott AM, Ginos JZ, Finn RD, Kothari P, Desai R, Zhang J, Beattie B, et al. Imaging of brain tumor proliferative activity with iodine-131-iododeoxyuridine. JNucl Med. 1994 Sep;35(9):1407-17.

118. Bunn PA Jr, Carrasquillo JA, Keenan AM, Schroff RW, Foon KA, Hsu SM, Gazdar AF, Reynolds JC, Perentesis P, Larson SM. Imaging of T-cell lymphoma by radiolabeled monoclonal antibody. Lancet. 1984 Nov 24;2(8413): 1219-21.

119. Signore A, Chianelli M, Annovazzi A, Rossi M, Maiuri L, Greco M, Ronga G, Britton KE, Picarelli A (2000) Imaging active limphocytic infiltration in celiac disease with iodine-123-interleukin-2 and the response to diet. EurJNuc Med 27(12), 1754-9.

120. Yeh TC, Zhang W, Ildstad ST, Ho C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn Reson Med 1995 Feb;33(2):200-8.

121. Dodd SJ, Williams M, Suhan JP, Williams DS, Koretsky AP, Ho C. Biophys J 1999 Jan;76(l

122. Pt 1): 103176. Dodd J Immunol Methods 2001 Oct l;256(l-2):89-105

123. Hardy J, Edingcr M, Bachmann MH, Negrin RS, Fathman CG, Contag CH (2001) Bioluminescence imaging of lymphocyte trafficking in vivo. Exp Hematol 29, 1353-60.

124. Collett MS, Erikson RL Protein kinase activity associated with the avian sarcoma virus src gene product. Proc Natl Acad Sei USA. 1978 Apr;75(4):2021-4.

125. Pastan I, Willingham M. Cellular transformation and the 'morphologic phenotype' of transformed cells. Nature. 1978 Aug 17;274(5672):645-50. Review.

126. Honma Y, Okabe-Kado J, Hozumi M, Uehara Y, Mizuno S. Induction of erythroid differentiation of K562 human leukemic cells by herbimycin A, an inhibitor of tyrosine kinase activity. Cancer Res. 1989 Jan 15;49(2):331-4.

127. Cortes J, Kantarjian H. New targeted approaches in chronic myeloid leukemia. J Clin Oncol. 2005 Sep 10;23(26):6316-24. Review.

128. Schindler T., Bommann W., Pellicena P., Miller W.T., Clarkson B. and Kuriyan J. (2000) Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase. Scicnce, 289:1938-1942.

129. Sawyers C.L. (1999) Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med, 340:1330-1340.

130. Dinulescu DM, Wood LJ, Shen L, Loriaux M, Corless CL, Gross AW, Ren R, Deininger MW, Druker BJ. c-CBL is not required for leukemia induction by Bcr-Abl in mice. Oncogene. 2003 Dec 4;22(55):8852-60,

131. Druker B.J., Tamura S., Buchdunger E., Ohno S., Segal G.M., Fanning S., Zimmermann J. and Lydon N.B. (1996) Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med, 2:561-566.

132. Moasser M. M., Srethapakdi M., Sachar K. S., Kraker A. J., Rosen N. Inhibition of Src kinases by a selective tyrosine kinase inhibitor causes mitotic arrest. Cancer Res., 59: 6145-6152, 1999.

133. Sordella R, Bell DW, Haber DA, Settleman J. Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways. Science. 2004 Aug 20;305(5687):1163-7. Epub 2004 Jul 29.

134. Katzenellenbogen BS, Miller MA, Eckert RL, Sudo K. Antiestrogen pharmacology and mechanism of action. J Steroid Biochem. 1983 Jul; 19( 1 A):59-68.

135. Ben-David I, Rozen Y, Ortu G, et al. Radiosynthesis of ML03, a novel positron emission tomography biomarker for targeting epidermal growth factor receptor via the labeling synthon: 1 lCJAcryloyl chloride. Appl Radiat Isot 2003; 58:209-17.

136. Shah NT, Miller VA. Antitumor activity and tolerability of gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer treated in an expanded access program. Clin Lung Cancer. 2003 Nov;5(3): 182-6.

137. Sordella R, Bell DW, Haber DA, Settleman J Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways. Science. 2004 Aug 20;305(5687):1163-7. Epub 2004 Jul 29.

138. Ohe Y Chemoradiotherapy for lung canccr: current status and perspectives. Int J Clin Oncol. 2004 Dec;9(6):435-43. Review.

139. Druker B.J., Sawyers C.L., Kantarjian H., Resta D.J., Reese S.F., Ford J.M., Capdeville R. and

140. Talpaz M. (2001) Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med, 344:1038-1042.

141. Gorre M.E., Mohammed M., Ellwood K., Hsu N., Paquette R.L., Rao N. and Sawyers C.L. (2001) Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.1. Science, 293:876-880.

142. Balter M. Gene therapy on trial. Science. 2000 May 12;288(5468):951-7. exp

143. Habib NA, Hodgson HJ, Lemoine N, Pignatelli M A phase I/I I study of hepatic artery infusion with wtp53-CMV-Ad in metastatic malignant liver tumours. Hum Gene Ther. 1999 Aug 10;10(12):2019-34.

144. Richards CA, Austin EA, Huber BE Transcriptional regulatory sequences of carcinoembryonic antigen: identification and use with cytosine deaminase for tumor-specific gene therapy.

145. Kennedy PG, Steiner I. The use of herpes simplex virus vectors for gene therapy in neurological diseases. Q J Med. 1993 Nov;86(l l):697-702. Review.

146. Muller SR, Sullivan PD, Clegg DO, Feinstein SC. Efficient transfection and expression of heterologous genes in PC 12 cells. DNA Cell Biol. 1990 Apr;9(3):221-9.

147. Smitt PS, Driesse M, Wolbers J, Kros M, Avezaat C Treatment of relapsed malignant glioma with an adenoviral vector containing the herpes simplex thymidine kinase gene followed by ganciclovir. Mol Ther. 2003 Jun;7(6):851-8.

148. Kitayama S, Kumagai K, Morita K, Dohi T Identification and functional characterization of the novel isoforms of bovine norepinephrine transporter produced by alternative splicing. Brain Res. 2002 May 3;934(2): 152-6.

149. Riviere I, Brose K, and Mulligan RC. (1995) Effects of retroviral vector design on expression of human adenosine deaminase in murine bone marrow transplant recipients engrafted with genetically modified cells. Proc Nail Acad Sci USA 92, 6733-?.

150. J. Che, Doubrovin M, Blasberg RG. Imaging hNIS. Mol. Imaging. 2005 4(2): 128-36.

151. Qiao J, Doubrovin M. Sauter BV, Huang Y, Guo ZS, Balatoni J, Akhurst T, Blasberg RG, Tjuvajev JG, Chen SH, Woo SL. Tumor-specific transcriptional targeting of suicide gene therapy Gene Ther. 2002 Feb;9(3):168-75.

152. Kern S.E/. KinzlerK.W., Bruskin A., Jarosz D., Friedman P., Prives C., and Vogelstein B. Science 1991 252, 1708-11.

153. Early PW, Davis MM, Kaback DB, Davidson N, Hood L Immunoglobulin heavy chain organization in mice: analysis of myeloma genomic code containing variable and alpha concstant regions Proc Natl Acad Sci 1979 76:857-61.

154. Keller C, Hyrien O, Knippers R, Krude T Site-specific and temporally controlled initiation of DNA replication in a human cell-free system. Nucleic Acids Res. 2002 May 15;30(10):2114-23.