Нековалентные комплексы белков с полиалкиленоксидами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Сорокина, Елена Михайловна

• Сорокина, Елена Михайловна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сорокина, Елена Михайловна

давления

2.5. Выделение полимер—белковых комплексов

2.6. Тонкослойная хроматография

2.7. Определение содержания белка и полимера

2.8. Определение ферментативной активности

2.9. Определение термостабильности

2.10. ос-Химотрипсин и его полимер—белковые комплексы, включенные

в систему гидратированных обращенных мицелл

2.11. Определение коэффициентов седиментации комплексов

и исходного белка

2.12. Дифференциальная сканирующая калориметрия

2.13. Метод кругового дихроизма

2.14. Метод флюоресцентной спектроскопии

2.15. Определение состава комплекса полимер—белок с циклодекстрином методом ИК—спектроскопии

2.16. Получение трех-компонентных систем на основе комплексов полиэтиленгликоль-а-химотрипсин и разветвленных полимерных производных циклодекстрина

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Полимер—белковые комплексы, полученные при нагревании

3.2. Полимер—белковые комплексы, полученные под действием

повышенного давления

3.2.1. Комплексы белок—проксанол, полученные под действием повышенного давления

3.2.2. Комплексы белок—полиэтиленгликоль (ПЭГ), полученные

под действием повышенного давления

Характеристика ПЭГ—белковых комплексов

Стабильность комплексов в растворе

Ферментативные свойства ПЭГ—ХТ комплексов

Исследование ПЭГ—ХТ комплексов в системе гидратированных

обращенных мицелл

Конформационные и гидродинамические свойства

полимер—белковых комплексов

3.3. Термическая стабильность полимер—белковых комплексов

3.4. Влияние добавок ПЭГ и проксанолов на термоинактивацию ХТ

3.5. Изучение термической денатурации ХТ и его комплексов с полиалкиленоксидами с помощью метода флуоресцентной спектроскопии

3.6. Взаимодействие полимер—белковых комплексов с циклодекстринами

и их производными

3.7. Ферментативная активность комплексов полимер-белок в смешивающихся с водой органических растворителях

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ: GM—CSF — рост—стимулирующий фактор, мономер, гликозилированный 14 кДа пептид,

БПЭК — белок—полиэлектролитный комплекс,

БСА — бычий сывороточный альбумин,

БТНА — 14—бензоил—Ь—тирозин п—нитроанилид,

БТЭЭ — этиловый эфир 14—бензоил—Ь—тирозина,

ДМСО — диметилсульфоксид,

ДСК — дифференциальная сканирующая калориметрия,

ИПЭК — интерполиэлектролитный комплекс,

ММ — молекулярная масса,

ПМР — протонно—магнитный резонанс,

ППО — полипропиленоксид,

Про — блок—сополимер оксидов этилена и пропилена (проксанол, плюроник),

ПЭГ — полиэтиленгликоль,

пэо — полиэтиленоксид,

тех — метод тонкослойной хроматографии,

хт — а—химотрипсин,

цд — циклодекстрин.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Нековалентные комплексы белков с полиалкиленоксидами»

— 6 — ВВЕДЕНИЕ

В последние годы все большее распространение приобретает метод модификации белковых молекул водорастворимыми синтетическими полимерами, в частности полиэтиленгликолем (ПЭГ), с целью придания им полезных свойств для практического использования, а именно: повышение стабильности при долговременном хранении, повышение устойчивости к действию агрессивных сред, увеличение растворимости как в воде, так и в органических растворителях. Кроме того, следствием модификации является повышение устойчивости белков к протеолитическому расщеплению, и, в ряде случаев, к их необратимой термоинактивации, а также снижение иммуногенности и антигенности белковых препаратов при введении в организм и пролонгирование их действия, что имеет особое значение при создании новых лекарственных средств. В настоящее время ПЭГ—белковые конъюгаты находят широкое применение в медицине. Например, фирмой Enzon Inc. (США) разработаны и выпускаются два таких препарата: ONCASPAR (ПЭГ—Z-аспарагиназа), применяемый для лечения лимфолейкемии, и ADAGEN (ПЭГ-аденозиндезаминаза), применяемый для фермент—восстановительной терапии при наследственных заболеваниях. Фирма PolyMASK Pharmaceuticals pis. (Англия) также широко применяет технологию ПЭГ—модификации пептидов, используемых в медицине. Однако, химическая модификация белков, как правило, приводит к существенной потере их биологической активности. В большинстве случаев методы присоединения полимера основаны на включении дополнительного связующего звена (linker) между полимером и белковой глобулой. Следует отметить, что наличие этих связующих звеньев снижает

возможности использования конъюгатов белков с полимерами в биотехнологических производствах и в медицине. Связующие звенья могут оказаться иммуногенными или содержать расщепляемые связи, вследствие чего цепи полимера могут отщепляться от молекулы белка либо ферментативно, либо в результате химических процессов. Многие связующие звенья изменяют заряд групп на поверхности белковой глобулы, к которым они присоединяются, тем самым влияя на функционирование белка. Использование альдегидных производных водорастворимых полимеров — единственный метод, позволяющий присоединить полимер к белковой глобуле без включения связующего звена, — также приводит к потере биологической активности модифицируемого белка. В связи с этим представляет интерес разработка новых способов модификации, позволяющих не только стабилизировать белки, но и сохранить их биологическую активность. Целью настоящего исследования явилось изучение возможности образования нековалентных комплексов белков с полимерами под действием физических факторов (температуры или давления), что представляется перспективным вследствие более "мягкого" воздействия на белок и простоты процедуры модификации.

— 8 —

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сорокина, Елена Михайловна, 1999 год

— 132 — ЛИТЕРАТУРА

1. Белова А.Б., Можаев В.В., Левашов A.B., Сергеева М.В., Мартинек К.; Хмельницкий Ю.Б. Взаимосвязь физико-химических характеристик органических растворителей с их денатурирующей способностью по отношению к белкам. // Биохимия. 1991. Т. 56. С. 1923—1945.

2. Бур штейн Э.Л. Собственная люминесценция белка (природа и применение). / Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1977. Вып. 7. ВИНИТИ, Москва.

3. Бычкова В.Е. О функциональной роли ненативных белков. // Успехи биол. химии. 1997. Т. 37. С. 49-99.

4. Валуев Л.И., Зефирова О.Н. Многокомпонентные каталитические системы на основе соиммобилизованных биологически активных соединений. // Успехи биол. химии. 1994. Т. 34. С. 111-130.

5. Гладилин А.К., Левашов A.B. Катализ надмолекулярными фермент-полимерными комплексами (ассоциатами) в органических средах. // Успехи биологической химии. 1996. Т. 36. С. 141—161.

6. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. / М.: Мир. 1966. 826 с.

7. Ефремова Н.В., Курганов Б.И., Топчиева И.Н. Конъюгаты а—химотрипсина с полиалкиленоксидами в гидратированных обращенных мицеллах. // Биохимия. 1996. Т. 61. С. 164-172.

8. Ефремова Н.В., Можаев В.В., Топчиева И.Н. Термическая стабильность конъюгатов а—химотрипсина с водорастворимыми полиалкиленоксидами. // Биохимия. 1992. Т. 57. № 3. С. 342-347.

9. Ефремова Н.В., Топчиева И.Н. Супрамолекулярные структуры на основе конъгатов белков с полиалкиленоксидами. Комплексы с |3—циклодекстрином. // Биохимия. 1993. Т. 58. № 7. С. 1071-1076.

10. Жулин В.М., Гониберг М.Г., Загорбинена В.Н. // Изв. АН СССР. 1962. Сер. хим. № 4. С. 716-722.

11. Зезин А.Б., Рогачева В.Б. Полиэлектролитные комплексы. // в кн. Успехи химии и физики полимеров (ред. А.АБерлин и др.). М.: Химия. 1973. С. 3—30.

12. Изумрудов В.А., Бронич Т.К., Новикова М.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Реакция замещения в трехкомпонентных макромолекуулярных системах. // Высокомолек. соединения. 1982. Т. А24. № 2. С.339-342.

13. Изумрудов В.А., Зезин А.Б. Конформации полиэлектролитов и реакции образования полиэлектролитных комплексов. // Высокомолек. соед. 1979. Т. А18. № 9. С. 2127-2135.

14. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Макромолекулярный обмен в растворах комплексов глобулярных белков с неприродными полиэлектролитами. //Докл. АН СССР. 1984а. Т. 275. С. 1120-1123.

15. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов глобулярных белков с полиэлектролитами. // Докл. АН СССР. 19846. Т. 291. С. 1150-1154.

16. Изумрудов В.А., Марголис A.J1., Шестюк С.Ф., Швядас В.—Ю.К., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Свойства нестехиометричных полилектролитных комплексов, содержащих ферменты. //Докл. АН СССР. 1983. Т. 269. № 3. С. 631—634.

17. Кабанов В.А., Евдаков В.П., Мустафаев М.И., Антипина А.Д. Кооперативное связывание сывороточного альбумина кватернизованными поли—4-винилпиридинами и структура образующихся комплексов. // Молек. биол. 1977. Т. 11. С. 582-597.

18. Кабанов В.А., Мустафаев В.И. Влияние ионной силы и pH среды на поведение БСА с поли—4—винил—N—этилпиридинийбромидом в водных растворах. // Высокомолек. соединения. 1981. Т. А 23. С. 255—260.

19. Кабанов В.А., Мустафаев М.И., Блохина В.Д., Агафьева B.C. О конкурентных взаимоотношениях фракций белков сыворотки при обрзовании комплексов с поликатионами. // Молек. биол. 1980. Т. 14. С. 64—74.

20. Кабанов В.А., Паписов И.М. Комплексообразование между комплементарными синтетическими полимерами и олигомерами в разбавленных растворах. // Высокомолек. соед., 1979, Т. А 21. № 2. С. 243-281.

21. Каменская Э.О., Сакодынская И.К., Левашов A.B. Зависимость каталитической активности иммобилизованного а—химотрипсина в водно—органических смесях от композиции микроокружения (жесткой матрицы и гидратирующих добавок). // Биоорг. химия. 1995. Т. 21. № 11, С. 825-827.

22. Коршак В.В., Штильман М.А. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. / М.: Наука. 1984. 262 с.

23. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. / М.: Высшая школа. 1980. С. 222.

24. Кудряшова Е.В, Белова А.Б., Виноградов A.A., Можаев В.В. Влияние гидрофобных свойств поверхности белка на его устойчивость к денатурации

органическими растворителями (на примере а-химотрипсина). // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 274-280.

25. Курганов Б.И., Топчиева И.Н. Конъюгаты белков с полиэтиленгликолем. // Успехи биологической химии. 1991. Т. 32. С. 63—86.

26. Курганов Б.И., Топчиева И.Н. Рефолдинг белков с участием искусственных шаперонов. // Биохимия. 1998. Т. 63. № 4. С. 491—499.

27. Левашов A.B., Клячко Н.Л., Мартинек К. Катализ ферментами, включенными в обращенные мицеллы поверхностно—активных веществ в органических растворителях. // Биоорган, химия. 1981. Т. 7. № 5. С. 670—679.

28. Мартин Й. Фолдинг белка, протекающий с участием шаперониновой системы GroEL/GroES . // Биохимия. 1998. Т. 63. № 4. С. 441-452.

29. Мартинек К., Березин И.В. Стабилизация ферментов — ключевой фактор при внедрении биокатализатора в практику. // Успехи химии. 1980. Т. 49. С. 737—770.

30. Мартинек К., Левашов A.B., Клячко H.A., Хмельницкий Ю.Л., Березин И.В. Мицеллярная энзимология. // Биол. мембраны. 1985. Т. 2. С. 669—695.

31. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. / 1971. М.: Изд—во "Наука". С. 57.

32. Осипова C.B., Топчиева И.Н., Касаикин В.А. Влияние температуры на структурообразование блоксополимеров окиси этилена и окиси пропилена в водных растворах. // Высокомолек. соединения. 1990. Т. 32Б. № 5. С. 240—244.

33. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. / М., Изд—во "Наука". 1981. С. 174—276.

34. Паписов И.М. Некрасова H.A., Паутов В.Д., Кабанов В.А. Кооперативная макромолекулярная реакция замещения в системе полиметакриловая

кислота—комплекс полиакриловой кислоты с полиэтиленгликолем. // Докл. АН СССР. 1974. Т. 214. № 4. С. 861-864.

35. Платэ H.A., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. / М.: Химия. 1986.294 с.

36. Поглазов Б.Ф., Ливанова Н.Б., Островская М.В. Взаимодействие актина с киназой фосфорилазы. //Докл. АН СССР. 1982. Т. 263. № 1. С. 221-224.

37. Рейхардт X. Растворители в органической химии. / 1973. Химия. Ленинград.

38. Северин С.Е., Курочкин С.Н., Кочетов С.Н. Изучение ферментов и их активных центров методом химической модификации. // Успехи биологической химии. 1974. Т. 15. С. 65-84.

39. Суханов В.А. Механизмы гормональной регуляции роста опухолевых клеток. // Успехи биологической химии. 1995. Т. 35. С. 97—134.

40. Топчиева И.Н. Применение полиэтиленгликоля в биотехнологии. // Успехи химии. 1980. Т. 49. С. 494-514.

41. Топчиева И.Н. Конъюгаты белков с полиэтиленгликолем (обзор). // Хим.—фарм. журнал. 1989а. Т. 23. С. 719-725.

42. Топчиева И.Н., Герасимов В.И., Панова И.Г., Карезин К.И., Ефремова Н.В. Наноструктуры на основе полиалкиленоксидов и циклодекстринов. // Высокомолек. соединения. Сер. А. 1998а. Т. 40. С. 310—318.

43. Топчиева И.Н., Ефремова Н.В., Курганов Б.И. Аддукты белков с водорастворимыми полиалкиленоксидами. // Успехи химии. 1995а. Т. 64: № 3. С. 293-306.

44. Топчиева И.Н., Ефремова Н.В., Снитко Я.Э., Хворов Н.В. Термоиндуцированное комплексообразование между а—химотрипсином и амфифильным блок-сополимером. //Докл. РАН. 1994а. Т. 339. С. 498—502.

45. Топчиева И.Н., Мишник П., Кюн Г., Карезин К.И., Елецкая C.B. Букетные структуры на основе циклодекстринов, модифицированных полиэтиленоксидом — новый тип дифильных веществ. // Докл. РАН. 19986. Т. 360. № 3. С. 364—367.

46. Топчиева И.Н., Момот И.Г., Курганов Б.И., Чеботарева H.A. Солюбилизирующая способность конъюгатов белков с водорастворимыми полиэфирами. //Докл. АН СССР. 1991. Т. 316. № 1. С. 242-246.

47. Топчиева H.H., Мохова E.H., Кириллова Т.П., Ефремова Н.В. Мембранные свойства конъюгатов белков с блок—сополимерами окиси этилена и окиси пропилена. // Биохимия. 19946. Т. 59. С. 16—19.

48. Топчиева И.Н., Осипова C.B., Иванова В.П., Ефремова Н.В., Сычева Т.И., Голубев В.Б., Елецкая C.B., Быстрицкий Г.И. Продукты автоокисления блок—сополимеров окиси этилена и окиси пропилена. // Высокомол. соед. 19896. Т. 31, С. 725-729.

49. Топчиева И.Н., Снитко Я.Э., Ефремова Н.В., Сорокина Е.М. Нековалентные поликомплексы между а—химотрипсином и блок—сополимером оксидов этилена и пропилена. // Биохимия. 19956. Т. 60. С. 131—137.

50. Топчиева И.Н., Сорокина Е.М., Ефремова Н.В., Ксенофонтов А.Л. Комплексы полиэтиленгликоля с белками. //Биохимия. 1998в. Т. 63. № 11. С. 87—94.

- 13851. Уверский В.Н., Птицын О.Б. Трехстадийное равновесное разворачивание небольших глобулярных белков сильными денатурантами. // Молек. биология. 1996. Т. 30. № 5. С. 1124-1143.

52. Фурукава Дж., Саегуса Т. Полимеризация альдегидов и окисей. / пер. с анг. М. 1965. 434 с.

53. Хмельницкий Ю.Л., Левашов А.В., Клячко Н.Л., Черняк В.Я., Мартинек К. Ферменты, включенные в обращенные мицеллы поверхностно—активных веществ в органических растворителях. Исследование системы белок-Н20-октан методом седиментационного анализа. // Биохимия. 1982. Т. 47. С. 86—99.

54. Шишков А.В., Филатов Э.С., Симонов У.В., Унукович М.С., Гольданский В.И., Несмеянов Н.Н. Получение меченых тритием биологически активных соединений. //Докл. АН СССР. 1976. Т. 228. № 6. С. 1237-1239.

55. Яворский Б.М., Селезнев Ю.А. Справочное руководство по физике./ М. Изд—во "Наука". 1989. С. 30-52.

56. Abuchowski A., McCoy I.R., Palczuk N.C., Davis F.F. Alternation of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of poly (ethylene glycol). // J. Biol. Chem. 1977a. Vol. 252. P. 3582-3586.

57. Abuchowski A., Van Es Т., Palczuk N.C., Davis F.F. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. // J. Biol. Chem. 1977b. Vol. 252. P. 3578-3581.

58. Affleck R., Xu Z.-F., Suzawa V., Focht K., Clark D.S., Dordick J.S. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water enviroments. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. Vol. 89. P. 1100-1104.

59. Arakawa T. The mechanism of increased elution volume of proteins by polyetylene glycol. //Anal. Biochem. 1985. Vol. 144. P. 267-268.

60. Arakawa T., Timasheff S.N. Mechanism of poly(ethylene glycol) interaction with proteins. //Biochemistry. 1985. Vol. 24. P. 6756—6762.

61. AshiharaY., Kono T., Yamazaki S., InadaY. Modification of E.coli./—asparaginase with poly(ethylene glycol): disappearanse of binding ability to anti—asparaginase serum. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. V. 83. P. 385-391.

62. Benovic J.L., Stine W., Caron M.J., Lefkovitz R.J. Inhibition of the b—adrenergic receptor kinase by polyanions. // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 6707—6710.

63. Birkroft G.G., Blow D.M. Structure of crystalline a—chymotrypsin. // J. Mol, Biol. 1972. Vol. 68. P. 187-240.

64. Blinlcovsky A.M., Khmelnitsky Yu.L., Dodrick J.S. Organosoluble enzyme—polymer complexes: a novel type of biocatalyst for nonaqueous media. // Biotechnol. Techniques. 1994. Vol. 8. P. 33-38.

65. Blume G., Cevc G. Liposomes for the sustained drug release in vivo. // Biochim. et Biophys. Acta. 1990. Vol. 1029. P. 91-97.

66. Blundel T.L., Sibanda B.L., Sternberg M.J.E., Thornton G.M. Knowlege-based prediction of protein structures and the design of novel molecules. // Nature. 1987. Vol. 326. P. 347-352.

67. Bromberg L.E., Klibanov A.M. Detergent—enabled transport of proteins and nucleic acids through hydrophobic solvents. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P.

143-147.

68. Bromberg L.E.., Klibanov A.M. Transport of proteins dissolvent in organic solvents across biomimetic membranes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 1262-1266.

69. Bross J., Engbersen J.F.J., Sakodinskaya I.K., Verboom W., Reinhoudt D.N. Activity and enantioselectivity of serine proteases in transesterification reactions in organic media. //J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1995. P. 2899-2905.

70. Cleland J.L., Hedgepeth C., Wang D.I.C. Mechanism of polyethylene glycol interaction with molten globule folding intermediate of bovine carbonic anhydrase b. // J. Biol. Chem. 1992a. Vol. 267. P. 13327-13334.

71. Cleland J.L., Randolph T. W. Polyethylene glycol enhanced refolding of bovine carbonic anhydrase b. //J. Biol. Chem. 1992b. Vol. 267. P. 3147-3153.

72. Cross M., Jaenicke R. Proteins under pressure. The influence of high hydrostatic pressure on structure, function and assembly of proteins and protein complex. // Eur. J. Biochem.

1994. Vol. 235-296. P. 617-630.

73. Dabulus K., Klibanov A.M. Dramatic enhancement of enzymatic activity in organic solvents by lyoprotectants. // Biotechnol. Bioeng. 1993. Vol. 41. N 5. P. 566—571.

74. Douzou P., Balny C. Cryoenzymology in mixed solvents without cosolvent effects on enzyme specific activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. P. 2297-2300.

75. Francis G.E., Delgado C., Fisher D., Malik F., Adrawal A.K. Polyethylene glycol modification: applications in tumour targeting and cytokine therapy.// J. Drug Targeting.

1995. V.3. P. 321-340.

76. Franke R. Theoretical Drug Design Methods. / Amsterdam: Elsevier. 1984. 432 p.

77. Gaertner H.F., Puigserver A.J. Kinetics and specifity of serine proteases in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 181. N 1. P. 207-213.

78. Ghatorae A.S., Bell G., and Hailing P.J. Inactivation of enzymes by organic solvents: new technique with well—defined interfacial area. // Biotechnol. Bioeng. 1994. Vol. 43". P. 331-336.

79. Gibson T.D.,Hulbert J.N., Woodward J.R. Preservation of shelf life of enzyme based analytical systems using a combination of sugars, sugar alcohols and cationic polymer or zinc ions. //Anal. Chem. Acta. 1993. Vol. 279. P. 185-188.

80. Gladilin A.K., Kudryashova E.V., Vakurov A.V., Izumrudov V.A., Mozhaev V.V., Levashov A.V. Effect of polyanions on the unfolding of acidic fibroblast growth factor. // Biotechnol. Lett. 1995. Vol. 17. P. 1329-1334.

81. Glass J.D., Silver L., Sondheimer J. Procedure of polymer coupling with SH-groups of proteins. // Biopolymers. 1979. V. 18. P. 383-392.

82. Golander C.G., Herron J., Lim K., Claesson P., Stenius P., Andrade J. / In Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications. Ed. Harris J.M. N.Y.: Plenum Press. 1992. P. 221.

83. Greenwald R.B., Martinez A. Non—antigenic branched polymer conjugates. // Patent US PCT/US 94/12237 // PCT. 1995 WO 95/11924. P. 34.

84. Gupta M.N. Enzyme function in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 203. P 25-32.

85. Hansch C., Leo A.J. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. / N. Y.. Wiley-Interscience. 1979. 271 p.

86. Harada A., Li G., Kamachi M. Double stranded inclusion complexes of cyclodextrin throaded on polyethylene glycol). // Nature. 1992. Vol. 356. P. 325—327.

87. Harris J.M. Poly(Ethylene Glycol). Chemistry. Biotechnical and biomedical application. / Plenum Press: New York—London. 1992. P. 1—14, 127—138.

88. Harris J.M. Introduction to Biomedical and biotechnical application of polyethylene glycol. // Polymer Preprints .1997. Vol. 38. N 1. P. 520—521.

89. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding. // Nature. 1996. Vol. 381. N 6583. P. 571-580.

90. Horowitz P.M. In Protein folding in vivo and in vitro. / ED. Cleland J.L. A.M.C. Symp. Series 526. 1993. Washington: Amer. Chem. Soc. P. 156—163.

91. Inada Y., Takahashi K., Ishimoto P., Sjima A., Matsushoma F., Saito Y. Applycation of poly(ethylene glycol)—modified enzymes in biotechnological process : organic solvent-soluble enzymes. // Trends Biotechnol. 1986. V. 4. P. 190-194.

92. Ishikawa H., Noda K., Oka T. Kinetic properties of enzymes in AOT—isooctane reversed micelles. //J. Fermentation and Bioeng. 1990a. Vol. 70. P. 381-385.

93. Ishikawa H., Noda K., Oka T. Kinetic properties of enzymes in reversed micelles. // Annals of the New York Academy of Sciences. 1990b. Vol. 613. P. 529—533.

94. Israelachvili J. The different faces of polyethylene glycol. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 8378-8379.

95. Ito Y., Fujii H., Imanishi Y. Catalytic peptide synthesis by trypsin modified with polysterene in chloroform. // Biotechnol. Prog. 1993. Vol. 9. No. 2,- P. 128—130.

96. Jaenicke R., Gregori E., Laepple M. Conformational effects of coenzyme binding to porcine lactic dehydrogenase. // Biophys. Struct. Mech. 1979. Vol. 6. N 1. P. 57—65.

97. Jonson P., Waterley T.L. The effects of surface and macromolecular interactions on the kinetics of inactivation of trypsin and a—chymotrypsin. // Biochem. J. 1981. Vol. 193. N l.P. 285-294.

98. Karuppiach N., Sharma A. Cyclodextrins as protein folding aids. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 211. P. 60-66.

99. Khan S.A., Hailing P.J., Bosley J.A., and Clark A.H. Polyethylene glycol—modified subtilisin forms microparticulate suspensions in organic solvents. // Enzyme Microb. Technol. 1992. V. 14. No. 2. P. 96-100.

100.Khmelnitsky Yu.L., Levashov A.V., Klyachko N.L., Martinek K. Engineering biocatalytic systems in organic media low water content. // Enzyme Microbiol. Technol. 1988. Vol. 10. P. 710-723.

101.Khmelnitsky Yu.L., Belova A.B., Levashov A.V., Mozhaev V.V. Relationsip between surface hydrophilicity of a protein and its stability against denaturation by organic solvents. // FEBS Letters. 1991. Vol. 284. P. 267-269.

102.Knoll D.A., and Hermans J. Effect of poly(ethylene glycol) on protein denaturation and model compound pKa's. // Biopolymers. 1981. Vol. 20. P. 1747—1750.

103.Koide A., Suzuki S., Kobayashi S. Preparation of polyethylene glycol—modified streptokinase with disappearance of binding ability towards anti—serum an retention activity. // FEBS Letters. 1982. Vol. 143. N 2. P. 73-77.

104.Kurganov B.I., Topchieva I.N. and Efremova N.V..Protein conjugates with water—soluble poly(alkylene oxide)s entrapped in hydrated reversed micelles. // Bioconj. Chem. 1997. V. 8. P. 637-642.

105.Lalley T.P., Price G. Some observations on the colloidal behaviour of block copolymers. 11 Polymer. 1974. Vol. 15. No 5. P. 325-328.

106.Lawton J.B., Mekras Ch.I. Complexes of polyelectrolytes with the enzymes pepsin and a—chymotrypsin. // Macromol. Chem. 1985. Vol. 186. N 11. P. 2397—2405.

107.Leckband D.E. The surface force apparatus — a tool for probing molecular protein interactions. //Nature. 1995. Vol. 376. N 17. P. 617-618.

108.Lee W.T., Sehon A.N. Abrogation of reagenic antibodies with modified allergens. // Nature. 1977. Vol. 267. N 5612. P. 618-619.

109. Lee L.L.—Y., Lee J.C. Termal stability of proteins in the presence of poly(ethylene glycols. // Biochemistry. 1987. Vol. 26. P. 7813-7819.

11 O.Liu F., Baudys M., Mix D., Hinds K., Kim S.W. Bioactive polyethylene glycol—insulin conjugates with enhanced stability. // Polymer Preprints. 1977. Vol. 38. N. 1. P. 595—596".

111.Ljunger G., Adlercreutz P., Mattiasson B. Reaction catalyzed by PEG—modified a—chymotrypsin in organic solvents. Influence of water content and degree of modification. // Biocatalysis. 1993. Vol. 7. P. 279-288.

112. Longman G.F. // The analysis of detergents and detergent products. N.Y., L.: J.Wiley. 1975. P. 275.

113.Lowenstein H. The use of ethylene maleic anhydride for the preparation of a water-soluble polyanionic derivative of pepsin, preparation and properties. // Acta Chem. Scand. 1974. Vol. B28. N 9. P. 1098-1100.

114. Martin J.C. Advances in the methodology of quantitave drug design. / In Drug Design (ed. E.J.Ariens), N. Y., Acad. Press. 1979. P. 1-72.

115. Matsushima A., Okada M., Inada Y. Chimotrypsun modified with polyethylene glycol catalyzes peptide synthesis reaction in benzene. // FEBS Lett. 1984 Vol. 178. N 2. P. 275-277.

1 l6.Melgren R.L. Interaction of human erytrocyte multicatalytic proteinase with polycations. // Biochim. et Biophys. Acta. 1990. Vol. 1040. N 1. P. 28-34.

117.Minato S., Hirai A. Characterization of ustilago ribonuclease U2. Effects of chemical modification of glutamic acid—61 and cystine—1 and of organic solvents on the enzymatic activity. //J. Biochem. 1979. Vol. 85. P. 327-334.

118.Mora M., Pato J. Effect of negative electric changes of polymers on the chymotripsin catalyzed hidrolysis on the side chains. // J. Controlled Relase. 1992. Vol. 18. P. 153—158.

119.Mozhaev V.V., Kudryashova E.V., Efremova N.V., Topchieva I.N. Stability of a—chymotrypsin conjugated with poly(ethylene glycols) and proxanols at hig temperature and in water—cosolvent mixtures. // Biotechnol. Techniques. 1996. Vol. 10. P. 849—854.

120.Mozhaev V.V., Martinek K. Structure — stability relationship in proteins: new approaches to stabilizing enzymes. // Enzyme and Microb. Technol. 1984. Vol. 6. P. 50—59.

121.Mozhaev V.V., Martinek K., Berezin I.V. Structure — stability relationship in proteins: fundamental task and strategy for the development od stabilized enzyme catalysts for biotechnology. // CRC Crit. Rev. Biochem. 1988. Vol. 23. P. 235-275.

122.Newkome G.R., Moorefield C.N., and Voltle F. Dendritic molecules. Concepts. Syntheses. Perspectives. / VCH Verlagsgesellschaft mbH. Weinheim. 1997.

123.Nozaki T., Masutami M., Akagawa T., Sugimura T., Esumi H. Non covalent interactions of poly(ADP—ribose) and cellular proteins: an application of a poly(ADP—ribose) —

western blotting method to detect poly(ADP—ribose) bining of protein—blotter filler. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol. 198. No 1. P. 45—51. 124,Otamiri M., Adlercreutz P., Mattiasson B. A differential scanning calorimetric study of chymotrypsin in the presence of added polymers. // Biotechnol. Bioengen. 1994. Vol. 44. P. 73-78.

125-Otamiri M., Adlercreutz P., Mattiasson B. Biocatalysis in non conventional media. / Td. J.Tramper. Amsterdam: Elsevier. 1992. P. 363—369.

126.Panzeter Ph.L., Realini C.A., Althaus F.R. Non covalent interactions of poly(adenosine diphosphate ribose) with histons. // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 1379—1385.

127. Pasta P., Riva S., Carrera G. Curcular dichroism and fluorescence of polyethylene glycol - subtilisin in organic solvents. // FEBS Lett. 1988. Vol. 236. N 2. P. 329—332.

128.Patel S., Cudney B., McPherson A. Polymeric précipitants for the crystallization of macromolecules. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 207 (2). P. 819—828.

129.Privalov P.L., Potekhin S.A. Scanning microcalorimetry in studying temperature — induced changes in proteins. // Methods Enzymol. 1986. Vol. 131. P. 4—51.

130.Rapaport E., Zamechnik P. C., Baril E.F. Hela cell DNA polymerase a is tighly associated with tryptophanyl-tRNA synthetase and diadenosine—5', 5"—P', P''—tetraphosphate hinding activités. // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1981, Vol. 78. N 2. P. 838-842.

131.Rozema D., Gellman S.H. Artificial chaperones: protein refolding via sequentical use of detergent and cyclodextrin. // Biochem. 1996a. Vol. 35. N 8. P. 15760—15771.

132.Rozema D., Gellman S.H. Artificial chaperone — assisted refolding of carbonic anhydrase b. //J. Biol. Chem. 1996b. Vol. 271. P. 3478-3487.

133.Sakodinskaya I. K., Van Unen D.J., Engbersen J.F.G., Reinhoudt D.N. Effects of crown ethers on sol—gel entrapped enzymes in organic media. // Chimia. 1997. Vol. 41. N 7. P. 438.

134.Savoca K. V., Abuchowski A., Van Es. T. et al. Preparation of non—immunogenic arginase by covalent attachment of polyethylene glycol. // Biochim. et Biophys. Acta. 1979. V. 578. P. 47-53.

135.Sheth S.R., Leckband D.E. Measurements of attractive forces between proteins and end—grafted polyethylene glycol chains. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997a. Vol. 94. P. 8399-8404.

136.Sheth S.R., Leckband D.E. Investigating the molecular mechanism of protein interactions

with polyethylene glycol. // Polymer Preprints. 1997b. Vol. 38. N 1. P. 616—617. 137.Shiao D.F., Lumry R., Rajender S. Modification of protein properties by change in

charge. // Eur. J. Biochem. 1972. Vol. 29. P. 377-385. 138.Sundarm P.V., and Venkatesh R. Retardation of thermal and urea induced inactivation of alpha—chymotrypsin by modification with carbohydrate polymers. // Protein Eng. 1998. V. 11. No. 8. P. 699-705. 139.Szejtli I. // Cyclodextrins and their inclusion complexes. Budapest: Akad. Kiado, 1982. P. 32.

140.Takahashi A. Conformational states of polymers adsorbed on interfaces. // Polym. J. 1991.

Vol. 23. N 5. P. 715-724. 141 .Takahashi K., Ajima A., Yoshimoto T., Inada Y. Poly(ethylene glycol)—modified exibits unexpectedly high activity in benzene. // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1984. No. 125. P. 761-766.

142.Takahashi, K., Saito, V., Inada, Y. //J. Am. Oil Chem. Soc. 1988, V.65. P. 911-916.

143.Takahashi K., Nishimura H., Yoshimoto T. et al. A chemical modification to make horseradish peroxidase soluble and active in bensene. // Biochem. and Biophys. Res: Commun. 1984a. No. 121. P. 261-265.

144.Takahashi, K., Yoshimoto, T., Nishimura, H., Okada, M., Ajima, A. Polyethylene glycol—modified enzymes trap water on their surface and exert enzymatic activity in organic solvents. // Biotechnol. Lett. 1984b. V. 6. P. 765-770.

145.Tandon S., Horowitz P.M. The effects of lauryl maltoside on the reactivation of several enzymes after treament with guanidinum chlorid. // Biochem. Biophys. Acta. 1988. Vol. 955. P. 19-25.

146.Tazuke S., Nagahara H. Donor—acceptor interaction in polymeric systems. // Macromol. Chem. 1980. Vol. 181. No 10. P. 2217-2227.

147.Topchieva I.N., Efremova N.V. Conjugates of proteins with block copolymers of ethylene and propylene oxides. // Biotechnol. Genetic. Engineer. Rev. 1994. Vol. 12. P. 357—382.

148.Topchieva I.N., Efremova N.V., Khvorov N.V., Magretova N.N. Synthesis and physico-chemical properties of protein conjugates with water—solubke poly(alkylene oxides). // Bioconjugate Chem. 1995. Vol. 6. P. 380-388.

149.Topchieva I.N., Mischnick P., Kühn G., Polyakov V.A., Elezkaya S.V., Bystryzkiy G.I., and Karezin K.I. Novel derivatives of cyclodextrins, modified with poly(ethylene oxide) and their complexation properties. // Bioconj. Chem. 1998. V. 9. P. 676—682.

150.Topchieva I.N., Polyakov V.A., ElezkayaS.V., Bystryzkiy G.I., and Karezin K.I. One—pot synthesis of cyclodextrins, modified with poly(ethylene oxide). // Polymer Bull., 1997. V. 38. P. 359-364.

151.Torchilin V.P. Immobilized Enzymes in Medicine. / Berlin: Springer Verlag. 1991. 206 p.

152.Triantaiyllow A.O., Wehtje E., Aldercreutz P., Mattiasson B. Calorimetric studies on solid a—chymotrypsin preparations in air and in organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1995. Vol. 1295. P. 110-118.

153.Vazquez—Duhalt R., Semple K.M., Westlake D.W.S., Fedorak Ph.M. Effect of water—miscible organic solvents on the catalytic activity of cytochrome c. // Enzyme Microb. Technol. 1993. Vol. 15. P. 936-943.

154.Veronese F.M., Caliceti P., Pastorino A., Schiavon O., Sartore L. Preparation, physico-chemical and pharmacokinetic characterization of monometoxypoly(ethylene glycol)—derivatized superoxide dismutase. // J. Controlled Release. 1989. V. 10. P. 145-154.

155.Veronese F.M., Largajolli R., Visco C., Ferruti P., Miuccii A. Surface modification of proteins by covalent bindig of acrilic polymers. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1985. Vol. 11. P. 269-277.

156.Villers G.R. New cyclic derivatives of starch. // C.R.Herbd. Seances Acad. Sci. 1891. Vol. 112. P. 536.

157.Volkin D.V., Staubly A., Langer R., Klibanov A.M. Enzyme thermoinactivation in anhydrous organic solvents. // Biotechnol. Bioeng. 1991. Vol. 37. P. 843—853.

158.Watson J., Crick H. Molecular structure of nucleic acids — a structure for deoxyribose nucleic acids. // Nature. 1953. Vol. 171. P. 737-742.

159.Weetall H.H. Enzymatic synthesis of gallic acid esters. // Appl. Biochim. Biotechnol. 1985. N 1, P. 25-28.

160.Wei J., Fasman G.D. A poly(ethylene glycol) water—soluble conjugate of porin: refolding to the native state. // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 6408—6414.

161. Wenz G. Threading cyclodextrin rings on polymer chains. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994. Vol. 33. N 4. P. 803-822.

162.Wieder K.J., Palczuk N.C., Van. Es. T., Davis F.F. Some properties of poly(ethylene glycol): phenilalanine ammonia lyase adducts. // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 12579-12587.

163.Woodle M., Lasic D. Sterically stabilized liposomes. // Biochim. et Biophys. Acta. 1992. Vol. 1113. P. 171-179.

164.Yamagata Y., Ichishima E. Modification of two amino groups with polyethylene glycol causes a unique activity change of an alkaline proteinase from alkalophilic Bacillus sp. // Current Microbiol. 1989. Vol. 19. P. 307-311.

165.Yee-Hsiyns S., Jang J.T., Martiner H.M. Determination of the secondary structures of proteins by circular dichroism and optical rotatory dispersion. // Biochemistry. 1972. Vol. 11. P. 4120-4132.

166.Zaks A., Klibanov A.M. The effect of water on enzyme action in organic media. // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 8017-8021.

167.Zardeneta G., Horowitz P.M. Micelle — assisted protein folding. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 5811-5816.

168.Zardeneta G., Horowitz P.M. Detergents, liposome, and micelle — assisted protein refolding. //Analyt. Biochem. 1994. Vol. 223. P. 1-6.