Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Воробьев, Павел Евгеньевич

  • Воробьев, Павел Евгеньевич
  • кандидат химических науккандидат химических наук
  • 2005, Новосибирск
  • Специальность ВАК РФ02.00.10
  • Количество страниц 104
Воробьев, Павел Евгеньевич. Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами: дис. кандидат химических наук: 02.00.10 - Биоорганическая химия. Новосибирск. 2005. 104 с.

Оглавление диссертации кандидат химических наук Воробьев, Павел Евгеньевич

Список сокращений.

1. Введение.

2. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами (обзор литературы).

2.1. Общая характеристика блеомицинов.

2.2. Структура блеомицинов.

2.3. Активация комплексов блеомицина с ионами железа.

2.4. Связывание блеомицина с нуклеиновыми кислотами.

2.5. Специфичность расщепления нуклеиновых кислот блеомицином.

2.6. Эффективность расщепления РНК блеомицином.

2.6.1. Сравнение эффективности расщепления различных РНК.

2.6.2. Зависимость эффективности расщепления от концентрации ионов магния.

2.7. Продукты расщепления нуклеиновых кислот блеомицином.

2.8. Свойства конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами.

2.8.1. Синтез конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами.

2.8.2. Стабилизация комплементарных комплексов конъюгат-мишень остатком блеомицина.

2.8.3. Сайт-специфическое расщепление одноцепочечных ДНК.

2.8.4. Каталитическое расщепление одноцепочечной ДНК олигонуклеотидным конъюгатом блеомицина.

2.8.5. Расщепление двуцепочечной ДНК в составе триплекса.

3. Расщепление нуклеиновых кислот блеомициновыми производными олигонуклеотидов (Результаты и обсуждение).

3.1. Синтез блеомициновых производных олигонуклеотидов.

3.1.1. Синтез стандартных конъюгатов.

3.1.2. Синтез линкерсодержащих конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами.

3.2. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами

3.2.1. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с протяженной олигонуклеотидной частью.;.

3.2.2. Расщепление ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в присутствии олигонуклеотидных эффекторов.

3.2.2.1. Факторы, определяющие эффективность расщепления одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов.

3.2.3. Влияние гидрофобных и гетероциклических группировок в составе конъюгата и эффекторов на эффективность расщепления одноцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов.

3.3. Субстратные свойства гибридных дуплексов, образованных с участием тандемов производных коротких олигонуклеотидов по отношению к рибонуклеазе Н Е. coli.

3.3.1. Гидролиз РНК рибонуклеазой Н Е. coli в составе гибридного дуплекса, образованного с участием немодифицированного тандема коротких олигодезоксирибонуклеотидов

3.3.2. Субстратные свойства тандемных гибридных дуплексов, содержащих конъюгаты блеомицина с короткими олигонуклеотидами, по отношению к рибонуклеазе Н Е. coli.

3.4. Расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами.

3.5. Расщепление двуцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с триплекс-формирующими олигонуклеотидами (ТФО).

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами»

Реакционноспособные производные олигонуклеотидов (РПО) широко применяются в исследовательской практике для изучения структуры и функций важнейших биополимеров - белков и нуклеиновых кислот. Направленная модификация нуклеиновых кислот при помощи РПО является одним из основных подходов к решению целого ряда задач. В их числе - исследование нуклеиново-белковых взаимодействий, манипулирование генетическим материалом, регуляция экспрессии гена, генная конверсия. К настоящему времени создан широкий спектр РПО, включающий олигонуклеотиды, несущие различные алкилирующие группы, фотоактивные остатки, металлокомплексы. Среди последних наибольший интерес представляют металлокомплексы, принимающие участие в циклических процессах окисления -восстановления. К числу таких группировок принадлежит остаток гликопептидного антибиотика блеомицина, обладающий рядом уникальных свойств. Наиболее важными из них являются:

- способность вызывать прямое (наблюдаемое без дополнительных обработок) расщепление ДНК и РНК;

- высокая селективность окисления дезоксирибозы и рибозы (гетероциклические основания практически не модифицируются);

- относительно низкая токсичность, позволяющая применять антибиотик как противоопухолевое средство в терапевтической практике.

В ЛХНК НИБХ СО РАН впервые были созданы блеомициновые производные олигонуклеотидов. Был разработан способ конъюгирования блеомицина А5 и олигонуклеотидов с сохранением способности олигонуклеотидов образовывать комплементарные комплексы, а остатка блеомицина - осуществлять селективное расщепление ДНК. Первые исследования показали, что конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами обладают рядом уникальных свойств. Они могут эффективно расщеплять одноцепочечные ДНК в составе комплементарных дуплексов. В зависимости от условий одна молекула конъюгата может повреждать до трех молекул ДНК или наносить несколько повреждений одной молекуле мишени. Кроме того, было выявлено, что остаток блеомицина в составе олиготимидилата способен осуществлять прямые разрывы двуцепочечных ДНК в триплексах. До сих пор неизвестны другие конъюгаты олигонуклеотидов, обладающие столь уникальными свойствами. Полученные результаты безусловно свидетельствовали о том, что конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами являются одними из наиболее перспективных реакционноспособных производных олигонуклеотидов. Такие конъюгаты могут найти применение в антисенс- и антигенном подходах к регуляции экспрессии гена, для генной конверсии, а также могут быть использованы в молекулярно-биологических исследованиях в качестве эффективных искусственных нуклеаз с уникальной специфичностью. Низкая токсичность блеомицина позволяет также надеяться на возможность использования его конъюгатов с олигонуклеотидами в качестве терапевтических средств.

В данной работе исследовано взаимодействие блеомициновых производных олигонуклеотидов в составе тандемных комплексов с одноцепочечной ДНК, в составе триплексов с двуцепочечной ДНК и впервые показана возможность расщепления РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами. Также в работе показано, что остаток блеомицина не препятствует гидролизу РНК РНКазой Н Е.соИ в составе гибридных дуплексов.

Научная новизна и практическая ценность

В настоящей работе впервые исследовано расщепление фрагментов ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами в тандемных комплексах с олигонуклеотидными эффекторами. Показано, что в тандемных комплексах одна молекула конъюгата блеомицина с тетрануклеотидом может расщепить свыше 6 молекул ДНК-мишени. Обнаружено, что максимальную эффективность проявляют конъюгаты с коротким олигонуклеотидным адресом (4-5 нуклеотидов), повреждающие ДНК-мишень в сайте связывания конъюгата.

Впервые показана возможность расщепления РНК (30-звенного фрагмента) конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами.

Разработан метод синтеза новых конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами, содержащих линкеры на основе гексаэтиленгликольфосфата. Показано, что такие конъюгаты более эффективно расщепляют двуцепочечные ДНК в составе триплексов. Также показано, что использование линкерсодержащих конъюгатов позволяет существенно повысить эффективность направленного расщепления РНК за счет формирования в цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина, и его доставки к таким сайтам при помощи линкера оптимальной длины.

Выявлено, что субстратные свойства блеомициновых производных коротких олигонуклеотидов в составе тандемных гибридных дуплексов по отношению к рибонуклеазе Н Е.соИ близки к таковым для протяженных олигонуклеотидов. Результаты этого исследования позволяют рассчитывать на успешное применение разработанных конъюгатов в качестве искусственных нуклеаз, а также эффективных ген-направленных соединений.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Похожие диссертационные работы по специальности «Биоорганическая химия», 02.00.10 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Воробьев, Павел Евгеньевич

5. Выводы:

1. Созданы и исследованы тандемные системы, содержащие конъюгаты коротких олигонуклеотидов с блеомицином As и олигонуклеотидные эффекторы.

Показано, что независимо от длины и последовательности олигонуклеотидного адреса, все исследованные конъюгаты в составе тандемных комплексов сайт-специфически взаимодействуют с комплементарными ДНК-мишенями, многократно вызывая расщепление мишени в области связывания конъюгата. Наибольшую эффективность (деструкция более 6 молекул ДНК-мишени одной молекулой конъюгата в составе тандема) проявляют конъюгаты блеомицина с тетрануклеотидами, расщепляющие ДНК-мишень в собственном сайте связывания. Установлено, что ключевыми факторами, определяющими эффективность таких конъюгатов в составе тандемов являются, с одной стороны, высокая степень ассоциации комплекса конъюгагДНК-мишень, обеспечиваемая эффекторами, и, с другой стороны, быстрая диссоциация реагента из комплекса с поврежденной ДНК мишенью.

2. Синтезированы конъюгаты нового типа, в которых остаток блеомицина As присоединен к олигонуклеотиду через линкер, состоящий из остатков гексаэтиленгликольфосфата (от одного до четырех остатков). Показано, что линкерсодержащие конъюгаты блеомицина с гексадекатимидилатом более эффективно расщепляют обе цепи ДНК в составе триплекса по сравнению со стандартными конъюгатами.

3. Впервые продемонстрировано, что конъюгаты блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами способны вызывать сайт-специфическое расщепление фрагмента РНК.

Показано, что эффективность расщепления РНК линкерсодержащими конъюгатами может быть существенно (до 3 раз) повышена за счет формирования олигонуклеотидной частью конъюгата в цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина.

4. Исследовано расщепление РНК рибонуклеазой Н Е. coli в непрерывных и тандемных гибридных дуплексах с олигонуклеотидами, несущими на 5'-концевой фосфатной группе остаток блеомицина. Показано, что наличие остатка блеомицина не препятствует гидролизу РНК мишени рибонуклеазой Н в тандемных комплексах, и снижает его скорость в 3-4 раза в случае непрерывных комплексов.

3.6. Заключение

Результаты данного исследования позволяют заключить, что конъюгаты блеомицина с олигопуклеотидами способны эффективно расщеплять ДНК (как а дуплексах так и в триплексах) и РНК в гибридных дуплексах. Таким образом, конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами могут быть использованы в качестве искусственных нуклеаз РНК и ДНК, а также могут рассматриваться в качестве потенциальных антисенс-агентов для подавления экспрессии патогенных ДНК и в качестве индукторов гомологичной рекомбинации для конверсии мутантных генов.

4. Экспериментальная часть.

4.1. Исходные материалы.

В работе были использованы следующие реактивы и растворители: трифенилфосфин, 2,2'-дипиридилдисульфид, Ы,Ы,Ы\Ы'-этилендиаминтетрауксусная кислота, цетилтриметиламмония бромид, ^^К'^'-тетраметилэтилендиамин, гидразин-гидрат (Fluka AG, Швейцария), 2-меркаптоэтанол, трис(оксиметил)аминометан (Merck), аденозин-5'-трифосфат, акриламид, ^М-метиленбисакриламид, Stains-all (Acros Organics, США), карбамид, аммония персульфат, 4-Ы,М-диметиламинопиридин-1-оксид (Frinton Laboratories, США), железа(П)-аммония сульфата гексагидрат (х.ч.), ацетон (о.с.ч.), ацетонитрил (о.с.ч.), полинуклеотидкиназа фага Т4 (КФ 2.7.1.78) (Сибэнзим, Россия), рибонуклеаза Н Е. coli (КФ 3.1.26.4) (Promega, США).

Олигодезоксирибонуклеотиды (в т.ч. и линкерсодержащие) были синтезированы твердофазным фосфитамидным методом на автоматических синтезаторах Виктория 8М (Россия) и ASM700 (Биоссет, Россия) и любезно предоставлены А.С. Левиной, Д.В. Пышным и И.А. Пышной (ИХБФМ СО РАН). Эстрон- и холестеринсодержащие тетрануклеотиды а также дифеназиниевые производные октануклеотидов были синтезированы модифицированным триэфирным методом [130] и любезно предоставлены И.А. Пышной (ИХБФМ СО РАН). Эйкозарибонуклеотид UGCCUGGAGCUGCUUGAUGC синтезирован по методу [131] и любезно предоставлен А.Г.Веньяминовой и М.Н.Репковой (ИХБФМ СО РАН).

Гидрохлорид блеомицина А5 (95% основного вещества) производства опытного завода Института органического синтеза (Латвия).

4.2. Основные методы работы

Выделение нуклеотидного материала из водных растворов проводили при помощи осаждения 10-кратным объемным избытком 2% раствора L1CIO4 в ацетоне. Осадок отделяли центрифугированием на микроцентрифугах D 5414 или Minispin Plus (Eppendorf, ФРГ) при 14 ООО об/мин. После удаления супернатанта осадок промывали ацетоном, ацетон удаляли высушиванием в вакуум-эксикаторе при остаточном давлении 15-20 мм. рт. ст.

Для концентрирования водных растворов использовали ротационные испарители RE-120 и R-200 (Biichi, Швейцария) а также концентратор 5301 (Eppendorf, ФРГ). Концентрирование проводили при температуре не выше 45 °С.

4.2.1. Хроматографические методы

Обращенно-фазовая ВЭЖХ проводилась на хроматографе Waters 600Е на колонках 4x250мм.

Синтезированные олигонуклеотиды, содержащие диметокситритильную защитную группу, после удаления прочих защитных групп и полимерного носителя выделяли обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5-20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0-30% в 0.05 М LiC104. Диметокситритильную защитную группу удаляли обработкой 80% уксусной кислотой в течение 5 мин.

Олигонуклеотиды, содержащие концевую фосфатную группу, после деблокирования выделяли ионообменной хроматографией на сорбенте Полисил СА [132] в градиенте КН2РО4 0-0.3 М в 30% ацетонитриле.

Олигонуклеотиды после удаления диметокситритильной группы либо после ионообменной хроматографии дополнительно очищали обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5-20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0-20% в 0.05 М L1CIO4.

Медьсодержащий комплекс блеомицина выделяли обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5-20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0-40% в 0.05 М LiC104.

Конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами выделяли ионообменной хроматографией на колонке Resource Q, 1 ml (Amersham Pharmacia Biotech AB, Швеция) в градиенте LiC104 0-0.5 M в 0.01 М LiOH, затем обращенно-фазовой хроматографией на сорбенте PRP-1 (10 мкм) (Hamilton, США) в градиенте ацетонитрила 0-30% в 0.05 М LiC104.

4.2.2. Электрофорез

Все электрофоретические разделения проводили в 20%-ном денатурирующем полиакриламидном геле в присутствии 8М мочевины, 0.89 М Трис-НзВОз рН 8.3, 0.001 М о

ЭДТА при напряженности электрического поля 40-60 В/см и температуре 30-40 С.

Для анализа гомогенности олигонуклеотидов и конъюгатов использовали гель толщиной 0.4 мм. По окончании разделения гели окрашивали 0.1 % раствором Stains-all в 50% водном формамиде.

Препаративную очистку олигонуклеотидов и конъюгатов проводили при толщине геля 1-1.5 мм. По окончании разделения для визуализации гель помещали под ультрахемископ. В качестве фона использовали пластину с флуорофором для тонкослойной хроматографии Kieselgel 60 F254 (Merck, ФРГ). Полосы геля, содержащие олигонуклеотиды, вырезали и трижды элюировали 1М раствором LÍCIO4. Фракции, полученные после элюции объединяли и очищали от солей флэш-хроматографией на сорбенте RP-18 (Waters, США). Олигонуклеотиды с сорбента элюировали 50% ацетонитрилом.

Разделение продуктов деструкции радиоактивно меченых олигонуклеотидов-мишеней проводили в 20 %-ном денатурирующем полиакриламидном геле толщиной 0.4 мм. По окончании реакции нуклеотидный материал осаждали, прибавляли 50 мкл 0.1 М раствора 1-бутиламина и инкубировали при 90 °С в течение 8 мин. По окончании обработки нуклеотидный материал вновь осаждали, используя в качестве носителя полиуридиловую кислоту (1мкл раствора, содержащего 0.1 мг в 1мл). Полученный осадок растворяли в 2-5 мкл 8 М раствора мочевины, содержащего 0.02% бромфенолового синего и ксиленцанола FF, и наносили на полиакриламидный гель. По окончании разделения гели высушивали на установке FB GD 45 (Fisher Biotech, США).

Гели радиоавтографировали на пленку CP-BU NIF 100 (AGFA, Бельгия). Интенсивность сигналов на радиоавтографах оценивали с помощью программного пакета GelPro (Media Cybernetics, США) после предварительной калибровки по жидкостному сцинтилляционному счетчику Rackbeta (Wallac LKB, Finland) в воде по Черенкову. Относительная погрешность определения во всех опытах не превышала 20%. За степень расщепления принимали отношение интенсивности определяемой полосы к суммарной интенсивности всех полос в дорожке.

4.2.3. Спектрофотометрия

Электронные спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра UV-2100 (Shimadzu, Япония) в буферном растворе 0.2 LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5 при комнатной температуре.

Концентрации олигонуклеотидов и их производных определяли спектрофотометрически в буферном растворе 0.2 LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5 при комнатной температуре с использованием УФ-детектора жидкостного хроматографа «Милихром» (Россия). Молярные коэффициенты поглощения при длине волны 260 нм (в2бо) для олигонуклеотидов были рассчитаны по методу [133].

Молярные коэффициенты поглощения для блеомициновых производных олигонуклеотидов полагали равными сумме в2бо соответствующего олигонуклеотида и остатка антибиотика. Коэффициент экстинкции медьсодержащего остатка антибиотика считали равным 16000 М^см'1 [39].

Эксперименты по термической денатурации были выполнены Д.В.Пышным (ИХБФМ СО РАН). Термическую денатурацию ДНК-дуплексов исследовали в растворе, содержащем 0.1 М ЫаС1, 0.01 М какодилат натрия рН 7.4, при концентрации каждого олигонуклеотидного компонента 1.3'10"5М. Термическую денатурацию гибридных дуплексов исследовали в растворе, содержащем 0.05 М КС1, 0.01 М какодилат натрия рН 7.4, 0.01 М М§СЬ, при концентрации каждого олигонуклеотидного компонента 1.3-10"5 М. Перед плавлением буферные растворы, содержащие комплементарные олигонуклеотиды в эквимолярных количествах, нагревали до 80-90 °С и медленно охлаждали до 4-5 °С. Кривые оптического плавления регистрировались на установке с терморегулируемой оптической кюветой на базе УФ-детектора жидкостного хроматографа "Милихром" (Россия) с одновременной детекцией на длинах волн 260, 270, 280, 300, и 320 нм. Скорость нагрева образцов не превышала 0.7-1 °С/мин. Кривые нагревания всех исследованных образцов совпадали с кривыми охлаждения.

4.3. Методики эксперимента.

Получение медьсодержащего комплекса блеомицина А5 (Си(П)В1ш).

15.5 мг (10 мкмоль) гидрохлорида блеомицина А5 растворяли в 1 мл бидистиллированной воды и добавляли 150 мкл 0.1 М раствора Си504 (15 мкмоль). Образование медьсодержащего комплекса блеомицина А5 сопровождается появлением интенсивной синей окраски раствора. Полученный комплекс выделяли обращено-фазовой ВЭЖХ, концентрировали и осаждали 10-кратным объемным избытком ацетона. Выход 14.5 мг(90%).

Получение цетилтриметиламмонийных солей олигонуклеотидов.

0.1 мкмоль олигонуклеотида растворяли в 40 мкл бидистиллированной воды и добавляли по 2 мкл 8% раствора цетилтриметиламмоний бромида до прекращения выпадения осадка (-10 мкл раствора). Осадок отделяли центрифугированием, супернатант отбирали, осадок промывали диэтиловым эфиром и сушили в вакуум-эксикаторе при остаточном давлении 5 мм. рт. ст. в течение 1 ч.

Синтез коньюгатов блеомицина с олигонуклеотидами (в т. ч. эстронсодержащих и линкерсодержащих)

0.1 мкмоль цетилтриметиламмонийной соли олигонуклеотида растворяли в 40 мкл абсолютного ДМСО, добавляли 3,5 мг (13.5 мкмоль) трифенилфосфина, 3 мг (13.5 мкмоль) дипиридилдисульфида и 5 мкл 0.1 М раствора DMAPO в абсолютном ДМСО. После 20 мин инкубации промежуточное цвиттер-ионное производное олигонуклеотида отделяли от остальной реакционной смеси осаждением. К высушенному осадку добавляли 1.5 мг (1 мкмоль) медьсодержащего комплекса блеомицина As в 40 мкл 0.2 М раствора NaHC03 рН 8.5. Реакционную смесь инкубировали в течение 6 часов. Продукт выделяли ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход 55-70 %.

Полученные стандартные конъюгаты (в т.ч. эстронсодержащие) идентифицировали по хроматографической и электрофоретической подвижности а также по соотношению интенсивностей полос с >.Мах=260 и 310 нм в УФ-спектрах конъюгатов.

Линкерсодержащие конъюгаты идентифицировали методом MALDI масс-спектрометрии. Экспериментально полученные значения массы практически совпадают с расчетными: для Ni6(pL)2pBlm - 6982.6/6985.8, для Ni6(pL)3pBlm - 7330.7/7330.1 и для N,6(pL)4pBlin - 7688.0/7674.4.

Введение радиоактивной метки в РНК- и ДНК-мишени проводили с использованием полинуклеотидкиназы фага Т4 (5 ед.акт.), 0.1 mCi [у-32Р] АТР в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl (рН 7.6), ЮмМ MgCb, 0.1 мМ спермидин, 0.1 мМ EDTA, 5мМ дитиотреит (общий объем 15 мкл). Меченую РНК-мишень выделяли при помощи электрофореза в 20%-ном ПААГ, элюировали из геля буферным раствором, содержащим 0.25 М CH3COONH4, 0.5 мМ EDTA, 0.1% додецилсульфата натрия. Окончательно продукт выделяли при помощи флэш-хроматографии на сорбенте Preparative С18 125А (55-105 мкм) (Waters, США).

Расщепление одноцепочечных ДНК- и РНК-мишеней коньюгатами блеомицина с протяженными олигонуклеотидами.

Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 5'-32Р-меченую мишень и конъюгат блеомицина с олигонуклеотидом (концентрации мишени и конъюгата указаны в каждом конкретном случае), 0.2 М LiCI, 0.01 М трис-HCl рН 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением 1 мкл 0.5 М 2-меркаптоэтанола и 1 мкл раствора М0"3М Fe(NH4)2(S04)2, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде.

Реакционные смеси инкубировали при температуре 20 °С в течение 4 ч (при эквивалентном соотношении концентраций конъюгата и мишени и при избытке конъюгата) либо в течение 16 ч (при избытке мишени по отношению к конъюгату).

Расщепление одноцепочечных ДНК-мишеней конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в присутствии эффекторов

Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 5'-32Р-меченую мишень, конъюгат блеомицина с олигонуклеотидом а также олигонуклеотиды - эффекторы (концентрации мишени, конъюгата и эффекторов указаны в каждом конкретном случае). Реакцию проводили в буферном растворе 0.2 М LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением раствора 2-меркаптоэтанола до концентрации 0.05 М и раствора Fe(NH4)2(SC>4)2 до концентрации МО"4 М, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде. Реакционные смеси инкубировали при температуре 20 - 45 °С в течение 2-18 ч. в зависимости от температуры проведения реакции и соотношения концентраций конъюгата и мишени.

Расщепление двуцепочечной ДНК-мишени конъюгатами блеомицина с триплекс-формирукнцими олигонуклеотидами

Триплексы преформировали при 4 °С в течение 18 часов в 30 мкл раствора 1 М LiCl, 0.1 М трис-HCI pH 7.5, 10 мМ MgCb. Концентрация каждой из цепей ДНК-мишени составляла ЗМО^М, конъюгатов 1.5'10"5М. Реакцию инициировали одновременным добавлением 1 мкл 0.5 М 2-меркаптоэтанола и 1 мкл раствора Н03М Fe(NH4)2(S04)2, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде. Реакционные смеси инкубировали при 20 °С в течение 4 ч.

Гидролиз рибонуклеазой Н Е. coli проводили в растворе, содержащем 20 мМ HEPES (pH 8.0), 50 мМ KCl, ЮмМ MgCl2 и 1 мМ дитиотреит. Концентрация РНК-мишени во всех экспериментах составляла 1-10'7М, олигодезоксирибонуклеотидов -2'10"бМ. Реакционные смеси (10 мкл) инкубировали при 20 °С в течение 15 мин, затем добавляли 0.15 ед.акт. рибонуклеазы Н. Через необходимое время добавляли 1 мкл раствора полиуридиловой кислоты (0.1 мг/мл) и осаждали олигонуклеотиды 2% раствором перхлората лития в ацетоне.

Начальную скорость гидролиза Vo определяли по начальным участкам кинетических кривых (0-5 мин).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Воробьев, Павел Евгеньевич, 2005 год

1. Umezawa Н., Maeda К., Takeuchi Т., Okami Y. New antibiotics, bleomycin A and В.// J. Antibiot. (Tokyo). 1966. V. 19, № 5, P. 200-209.

2. Lazo J.S., Chabner B.A. Bleomycin.// Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice./ Eds. B.A. Chabner and D.L. Longo Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. P. 379.

3. Bennett J.M., Reich S.D. Bleomycin.// Ann. Intern. Med. 1979. V. 90, № 6, P. 945-948.

4. Carlson R.W., Sikic B.I., Turbow M.M., Ballon S.C. Combination cisplatin, vinblastine, and bleomycin chemotherapy (PVB) for malignant germ-cell tumors of the ovary.//J. Clin. Oncol. 1983. V. 1, № 10, P. 645-651.

5. Nagai K., Yamaki H., Suzuki H., Tanaka N., Umezawa H. The combined effects of bleomycin and sulfhydryl compounds on the thermal denaturation of DNA.// Biochim. Biophys. Acta. 1969. V. 179, № 1, P. 165-171.

6. Stubbe J., Kozarich J.W., Wu W., Vanderwall D.E. Bleomycins: A structural model for specificity, binding, and double strand cleavage.//Acc. С hem. Res. 1996. V. 29, №7, P. 322-330.

7. Petering D.H., Mao Q., Li W., DeRose E„ Antholine W.E. Metallobleomycin-DNA interactions: structures and reactions related to bleomycin-induced DNA damage.//Met. Ions. Biol. Syst. 1996. V. 33, №, P. 619-648.

8. Stubbe J., Kozarich J.W. Mechanisms of bleomycin-induced DNA degradation.// Chem. Rev. 1987. V. 87, № 5, P. 1107-1136.

9. D'Andrea A.D., Haseltine W.A. Sequence specific cleavage of DNA by the antitumor antibiotics neocarzinostatin and bleomycin.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1978. V. 75, № 8, P. 3608-3612.

10. Takeshita M., Grollman A.P., Ohtsubo E., Ohtsubo H. Interaction of bleomycin with DNA.// Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75, № 12, P. 5983-5987.

11. Mirabelli C.K., Huang C.H., Crooke S.T. Role of deoxyribonucleic acid topology in altering the site/sequence specificity of cleavage of deoxyribonucleic acid by bleomycin and talisomycin.// Biochemistry. 1983. V. 22, № 2, P. 300-306.

12. Barranco S.C., Humphrey R.M. The effects of bleomycin on survival and cell progression in Chinese hamster cells in vitro.// Cancer Res. 1971. V. 31, № 9, P. 1218-1223.

13. Hittelman W.N., Rao P.N. Bleomycin-induced damage in prematurely condensed chromosomes and its relationship to cell cycle progression in CHO cells.// Cancer Res. 1974. V. 34, № 12, P. 3433-3439.

14. Barlogie B., Drewinko B., Schumann J., Freireich E.J. Pulse cytophotometric analysis of cell cycle perturbation with bleomycin in vitro.// Cancer Res. 1976. V. 36, №3, P. 1182-1187.

15. Berry D.E., Chang L.H., Hecht S.M. DNA damage and growth inhibition in cultured human cells by bleomycin congeners.// Biochemistry. 1985. V. 24, № 13, P. 3207-3214.

16. Suzuki H., Nagai K., Yamaki H., Tanaka N., Umezawa H. Mechanism of action of bleomycin. Studies with the growing culture of bacterial and tumor cells.// J. Antibiot. (Tokyo). 1968. V. 21, № 6, P. 379-386.

17. Muller W.E., Yamazaki Z., Breter H.J., Zahn R.K. Action of bleomycin on DNA and RNA.// Eur. J. Biochem. 1972. V. 31, № 3, P. 518-525.

18. Haidle C.W., Bearden J., Jr. Effect of bleomycin on an RNA-DNA hybrid.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 65, № 3, P. 815-821.

19. Krishnamoorthy C.R., Vanderwall D.E., J.W. K. Degradation of DNA-RNA hybrids by bleomycin: Evidence for DNA strand specificity and for possible structural modulation of chemical mechanism.//J. Am. Chem. Soc. 1988. V. 110, № 6, P. 2008-2009.

20. Murray V., Martin R.F. The sequence specificity of bleomycin-induced DNA damage in intact cells.//J. Biol. Chem. 1985. V. 260, №19, P. 10389-10391.

21. Moore C.W. Bleomycin-induced mutation and recombination in Saccharomyces cerevisiae.//Mutat. Res. 1978. V. 58, № 1, P. 41-49.

22. Umezawa K., Haresaku M., Muramatsu M., Matsushima T. Mutagenicity of anthracycline glycosides and bleomycins in Salmonella assay system.// Biomed. Pharmacoter. 1987. V. 41, № 5, P. 214-218.

23. Povirk L.F., Goldberg I.H. A role of oxidative DNA sugar damage in mutagenesis by neocarzinostatin and bleomycin.// Biochimie. 1987. V. 69, № 8, P. 815-823.

24. Povirk L.F. DNA damage and mutagenesis by radiomimetic DNA-cleaving

25. V agents: bleomycin, neocarzinostatin and other enediynes.// Mutat. Res. 1996. V.355, № 1-2, P. 71-89.

26. Onishi T., Shimada K., Takagi Y. Effects of bleomycin on Escherichia coli strains with various sensitivities to radiations.// Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 312, № 2, P. 248-258.

27. Levin J.D., Demple B. In vitro detection of endonuclease IV-specific DNAdamage formed by bleomycin in vivo.// Nucleic Acids Res. 1996. V. 24, № 5, P.885.889.

28. Kikuchi H., Tetsuka T. On the mechanism of lipoxygenase-like action of bleomycin-iron complexes.//J. Antibiot. (Tokyo). 1992. V. 45, № 4, P. 548-555.

29. Lim S.T., Jue CX, Moore C.W., Lipke P.N. Oxidative cell wall damage mediated by bleomycin-Fe(ll) in Saccharomyces cerevisiae.//J. Bacteriol. 1995. V. 177, № 12, P. 3534-3539.

30. Magliozzo R.S., Peisach J., Ciriolo M.R. Transfer RNA is cleaved by activated bleomycin.//Mol. Pharmacol. 1989. V. 35, № 4, P. 428-432.

31. Carter B.J., Reddy K.S., Hecht S.M. Polynucleotide recognition and strand scission by Fe-bleomycin.// Tetrahedron. 1991. V. 47, № 14-15, P. 2463-2474.

32. Holmes C.E., Hecht S.M. Fe.bleomycin cleaves a transfer RNA precursor and its "transfer DNA" analog at the same major site.// J. Biol. Chem. 1993. V. 268, № 34, P. 25909-25913.

33. Holmes C.E., Carter B.J., Hecht S.M. Characterization of iron (ll)bleomycin-mediated RNA strand scission.// Biochemistry. 1993. V. 32, № 16, P. 4293-4307.

34. Abraham A.T., Lin J.J., Newton D.L., Rybak S„ Hecht S.M. RNA cleavage and inhibition of protein synthesis by bleomycin.// Chem. Biol. 2003. V. 10, № 1, P. 45-52.

35. Padbury G., Sligar S.S. Chemical reactivities of bleomycin.// J. Biol. Chem. 1985. V. 260, № 13, P. 7820-7823.

36. Murugesan N., Hecht S.M. Bleomycin as an oxene transferase. Catalytic oxygen transfer to olefins.// J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107, № 2, P. 493-500.

37. Takita T., Muraoka Y., Nakatani T., Fujii A., Umezawa Y., Naganawa H. Chemistry of bleomycin. XIX Revised structures of bleomycin and phleomycin.// J. Antibiot. (Tokyo). 1978. V. 31, № 8, P. 801-804.

38. Umezawa H. Structure and action of bleomycin.// Prog. Biochem. Pharmacol. 1976. V. 11, №, P. 18-27.

39. Sugiura Y., Ishizu K., Miyoshi K. Studies of metallobleomycins by electronic spectroscopy, electron spin resonance spectroscopy, and potentiometric titration.// J. Antibiot. (Tokyo). 1979. V. 32, № 5, P. 453-461.

40. Petering D.H., Byrnes R.W., Antholine W.E. The role of redox-active metals in the mechanism of action of bleomycin.// Chem. Biol. Interact. 1990. V. 73, № 2-3, P. 133-182.

41. Claussen C.A., Long E.C. Nucleic Acid recognition by metal complexes of bleomycin.//Chem. Rev. 1999. V. 99, № 9, P. 2797-2816.

42. Dabrowiak J.C., Greenaway F.T., Longo W.E., Van Husen M., Crooke S.T. A spectroscopic investigation of the metal binding site of bleomycin A2. The Cu(ll) and Zn(ll) derivatives.// Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 517, № 2, P. 517-526.

43. Rishel M.J., Thomas C.J., Tao Z.F., Vialas C., Leitheiser C.J., Hecht S.M. Conformationally constrained analogues of bleomycin A5.// J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125, № 34, P. 10194-10205.

44. Sausville E.A., Peisach J., Horwitz S.B. A role for ferrous ion and oxygen in the degradation of DNA by bleomycin.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 73, № 3, P. 814-822.

45. Sausville E.A., Stein R.W., Peisach J., Horwitz S.B. Properties and products of the degradation of DNA by bleomycin and iron(ll).// Biochemistry. 1978. V. 17, № 14, P. 2746-2754.

46. Ishida R., Takahashi T. Increased DNA chain breakage by combined action of bleomycin and superoxide radical.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 66, № 4, P. 1432-1438.

47. Lown J.W., Sim S.K. The mechanism of the bleomycin-induced cleavage of DNA.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 77, № 4, P. 1150-1157.

48. Burger R.M., Horwitz S.B., Peisach J., Wittenberg J.B. Oxygenated iron bleomycin. A short-lived intermediate in the reaction of ferrous bleomycin with O2.// J. Biol. Chem. 1979. V. 254, № 24, P. 12999-12302.

49. Kuramochi H., Takahashi K., Takita T., Umezawa H. An active intermediate formed in the reaction of bleomycin-Fe(ll) complex with oxygen.// J. Antibiot. (Tokyo). 1981. V. 34, № 5, P. 576-582.

50. Burger R.M., Peisach J., Horwitz S.B. Activated bleomycin. A transient complex of drug, iron, and oxygen that degrades DNA.//J. Biol. Chem. 1981. V. 256,22, P. 11636-11644.

51. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A., Tosi L. Iron . bleomycin . DNA system evidence of a long-lived bleomycin . iron . oxygen intermediate.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 104, № 2, P. 557-563.

52. Burger R.M., Peisach J., Blumberg W.E., Horwitz S.B. Iron-bleomycin interactions with oxygen and oxygen analogues. Effects on spectra and drug activity.//J. Biol. Chem. 1979. V. 254, № 21, P. 10906-10912.

53. Burger R.M. Cleavage of Nucleic Acids by Bleomycin.// Chem. Rev. 1998. V. 98, №3, P. 1153-1170.

54. Sugiura Y., Suzuki T., Kuwahara J., Tanaka H. On the mechanism of hydrogen peroxide-, superoxide-, and ultraviolet light-induced DNA cleavages of inactive bleomycin-iron (III) complex.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 105, №4, P. 1511-1518.

55. Burger R.M., Peisach J., Horwitz S.B. Activated bleomycin. A transient complex of drug, iron, and oxygen that degrades DNA.//J. Biol. Chem. 1981. V. 256,22, P. 11636-11644.

56. Bukowski M.R., Zhu S., Koehntop K.D., Brennessel W.W., Que L., Jr. Characterization of an Fe lll-OOH species and its decomposition product in a bleomycin model system.//J. Biol. Inorg. Chem. 2004. V. 9, № 1, P. 39-48.

57. Povirk L.F., Hogan M., Dattagupta N. Binding of bleomycin to DNA: intercalation of the bithiazole rings.// Biochemistry. 1979. V. 18, № 1, P. 96-101.

58. Povirk L.F., Hogan M., Dattagupta N., Buechner M. Copper(ll).bleomycin, iron(lll).bleomycin, and copper(ll).phleomycin: comparative study of deoxyribonucleic acid binding.// Biochemistry. 1981. V. 20, № 3, P. 665-671.

59. Roy S.N., Orr G.A., Brewer C.F., Horwitz S.B. Chemical synthesis of radiolabeled Щ bleomycin A2 and its binding to DNA.//Cancer Res. 1981. V. 41, № 11, P. 44714477.

60. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A. Cobalt-bleomycin-deoxyribonucleic acid system. Evidence of deoxyribonucleic acid bound superoxo and mu-peroxo cobalt-bleomycin complexes.// Biochemistry. 1982. V. 21, № 26, P. 6777-6782.

61. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A. Iron-bleomycin-deoxyribonucleic acid system. Evidence of deoxyribonucleic acid interaction with the alpha-amino group of the beta-aminoalanine moiety.// Biochemistry. 1984. V. 23, № 1, P. 47-53.

62. Suzuki H., Nagai K., Akutsu E., Yamaki H., Tanaka N. On the mechanism of action of bleomycin. Strand scission of DNA caused by bleomycin and its bindingto DNA in vitro.// J. Antibiot. (Tokyo). 1970. V. 23, № 10, P. 473-480.

63. Chien M., Grollman A.P., Horwitz S.B. Bleomycin-DNA interactions: fluorescence and proton magnetic resonance studies.// Biochemistry. 1977. V. 16, № 16, P. 2641-2647.

64. Сергеев Д.С., Зарытова В.Ф. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами.// Успехи химии. 1996. V. 65, № 4, Р. 377-402.

65. Kemsley J.N., Zaleski K.L., Chow M.S., Decker A., Shishova E.Y., Wasinger E.C., Hedman В., Hodgson K.O., Solomon E.I. Spectroscopic studies of the interaction of ferrous bleomycin with DNA.//J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125, № 36, P. 10810-10821.

66. Li W., Antholine W.E., Petering D.H. Kinetics of reaction of DNA-bound Fe(lll)bleomycin with ascorbate: interplay of specific and non-specific binding.// J. Inorg. Biochem. 2002. V. 90, № 1-2, P. 8-17.

67. Nakamura M., Peisach J. Self-inactivation of Fe(ll)-bleomycin.// J. Antibiot. (Tokyo). 1988. V. 41, № 5, P. 638-647.

68. Morgan M.A, Hecht S.M. Iron(ll) bleomycin-mediated degradation of a DNA-RNA heteroduplex.// Biochemistry. 1994. V. 33, № 34, P. 10286-10293.V

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.