Оптимизация условий масштабируемого культивирования туляремийного микроба в технологиях получения протективных антигенов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Шепелев, Иван Анатольевич

• Шепелев, Иван Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шепелев, Иван Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Биотехнологические аспекты культивирования и получения биологически активных компонентов патогенных бактерий

1.2.Питательные среды и условия культивирования возбудителя туляремии

1.3.0сновные антигенные компоненты туляремийного микроба

ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ОПРЕ

ДЕЛЕНИЕ АДЕКВАТНЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ ДЛЯ МАКСИМАЛЬНОГО ВЫХОДА БИОМАССЫ И АНТИГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА

3.1. Подбор и конструирование питательных сред для максимального выхода биомассы туляремийного микроба

3.2. Оптимизация условий культивирования туляремийного микроба для максимального выхода «С»-комплекса.

ГЛАВА 4.

БИОКИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КУЛЬТУР ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА В ПРОЦЕССЕ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕТОК

4.1. Характеристика биомассы туляремийного микроба, 62 полученной в условиях глубинного культивирования по биологическим и иммунохимическим показателям.

4.2. Разработка способов выделения и очистки антигенных компонентов туляремийного микроба.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОСТИ, ИММУНО- И БИО

ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ «С»-КОМПЛЕКСА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА.

5.1. Изучение биохимических и иммунохимических свойств «С»- комплекса туляремийного микроба.

5.2. Анализ иммуногенности «С»-комплекса туляремийного микроба

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация условий масштабируемого культивирования туляремийного микроба в технологиях получения протективных антигенов»

Актуальность проблемы профилактики туляремии определяется наличием природных очагов этой инфекции на всей территории Российской Федерации, эпизоотическая активность которых ежегодно подтверждается обнаружением значительного числа положительных на туляремию проб из объектов внешней среды. С 1996 по 1998 г было выделено более 200 штаммов возбудителя туляремии от носителей и переносчиков инфекции и из внешней среды [Приказ Минздрава России № 125 от 14. 04. 99].

Природные очаги туляремия существуют в большинстве Европейских стран. В некоторых регионах, например в Скандинавии, вспышки, включающие сотни случаев отмечаются, по крайней мере, один раз в десятилетие. В других странах, эпидемии такой величины случаются довольно редко, за исключением периода военных конфликтов [Berdai В. P., Grunov R., et al., 2000; Reintjes R., Dedushaj I., Grunow R., et al., 2002]. В межэпизоотический период, естественный резервуар возбудителя -Francisella tularensis, неизвестен. Возможно, микроорганизм переживает неблагоприятные условия внутриклеточно в простейших или в виде персистирующей формы внутри макроорганизма. Установлена приуроченность туляремии к ландшафтам с естественными водоёмами [Tarnvik A., et al., 2004].

В Европе и Азии распространены штаммы голарктической расы, тогда как неарктическая раса характерна для Северной Америки, где некоторые штаммы туляремии могут вызвать скоротечное заболевание с летальным исходом, особенно при аэрозольном заражении. Это свойство возбудителя было использовано при разработке биологического оружия [Ales N.C, Katial R.K., 2004], и в настоящее время туляремия считается потенциальным средством биотерроризма [Gallagher-Smith М., et al., 2004; Conlan J.W., 2004]. Согласно классификации биологических агентов туляремия отнесена к категории А вместе с такими инфекциями как чума, сибирская язва и оспа [Алексеев В. В. и др., 2003].

В России ежегодно регистрируется от 100 до 400 случаев заболеваний туляремией, при этом около 70,5 % из них приходится на Северный, Центральный и Западно-Сибирский районы. В 1993-1998 г вспышки туляремии трансмиссивного характера зарегистрированы среди населения в Ростовской области и в Башкирии, водного в Смоленской области, промыслового в Оренбургской области, пищевого (молочного) -в Москве. В 1999 г. заболевания туляремией встречались на 20 административных территориях [Карцев А. Д., 2002]. В 2003 г. число заболеваний туляремией возросло -27 случаев в 12 субъектах федерации против 23 заболеваний в 2002 г. [Резолюция межведомственного совещания по проблемам санитарно-эпидемиологической охраны территории Российской Федерации, 2003]. В Краснодарском крае с 1988 по 2004 г. зарегистрировано 20 заболеваний туляремией: 12 человек из села; 8 — из города; в осенне-зимний период во время эпизоотии среди мелких млекопитающих. В 55% случаев наблюдался сельскохозяйственный и охотничье-промысловый тип заражения. Из всех заболевших двое были привиты: первый за 2 года, второй - за 3 [Антонов А.В., 2004]. За последние 15 лет на территории Ульяновской области зарегистрировано 72% больных туляремией от общего числа случаев заболеваемости особо опасными инфекциями [Нафеев А. А. 2003]. В Саратовской области из 38 районов 25 являются неблагополучными по туляремии. Особенностью заболеваемости туляремией в настоящее время является то, что среди заболевших более 70% составляют не привитые против этой инфекции городские жители [Онищенко Г. Г., 2001]. По данным ЦГСЭН Саратовской области за 2003 г. положительные ответы в реакциях термопреципитации отмечены у 10 из 15 (66,6%) обследованных [Данилов А. Н. и др., 2004]. Спорадический характер заболевания свидетельствует об активности природных очагов и об уменьшении иммунной прослойки среди населения, проживающего в пределах природного очага, возможно за счёт неучтенной миграции населения [Антонов А.В., 2004]. В связи с этим немаловажное значение приобретают данные об активности природных очагов в приграничных регионах.

В течение 1992-2001 в Казахстане было отмечено 31 случай туляремии. Эпидемиологический анализ показал, что инфекция передавалась различными путями, включая укусы зараженных насекомых, поглощение зараженной пищи и воды и прямым контактом при снятии кожи животных [Meka-Mechenko Т., et al, 2003]. Болезнь была представлена главным образом ангинозно-бубонной (62,5%), бубонной (25,0%) или легочной (12,5%) формами.

На сегодняшний день в России для профилактики туляремии используют живую вакцину на основе штамма F. tularensis 15 линии НИИЭГ, которая является одной из немногих бактериальных вакцин, создающих стойкий и длительный (более 5 лет) иммунитет. За рубежом для вакцинации используют штамм F. tularensis LVS, являющийся стабильной недиссоциирующей субкультурой в RS форме полученной из штамма F. tularensis 15 в начале 60-х годов [Eigelsbach Н.Т., Downs С. М., 1961]. В СССР иммунизацию населения живой туляремийной вакциной по показаниям и плановую проводят с 1946 года [Олсуфьев Н.Г., 1975]. Несмотря на отмечаемые побочные реакции на введение живой туляремийной вакцины (лихорадочные реакции, головная боль, лимфадениты и т. д.) и соответствующие противопоказания (аллергические и инфекционные заболевания, беременность, болезни кровообращения), более эффективного средства специфической профилактики на сегодняшний день не существует [Олсуфьев Н. Г., Руднева Г. П., 1960; Sjostedt А., 2003].

Вакцины, используемые до настоящего времени в большинстве стран мира содержат практически полный набор антигенов свойственных данному возбудителю при культивировании на питательных средах. Причем, наряду с веществами, определяющими протективный эффект, вакцины содержат также компоненты, обуславливающие реактогенность препарата или являющиеся балластом, и их вклад в развитие иммунной реакции может тормозить ответ макроорганизма на введение протектив-ных антигенов [Станиславский Е. С., 1976; Маянский А. Н., 1977]. Всех этих недостатков в какой-то степени лишены химические вакцины, при получении которых возможно создавать в готовых препаратах рациональные композиции протективных антигенов [Дальвадянц С. М. 1991; Дальвадянц С. М. и др., 1997]. Развитие живых вакцин нового поколения (генноинженерных) затруднено, поскольку существуют в настоящее время очень жесткие стандарты для таких препаратов. Кроме того, нет доступных лицензированных живых вакцин во многих странах. Таким образом, более перспективным является создание и развитие субъединичных вакцин [Магазов Р. Ш.

2000], хотя эта работа в отношении туляремийной инфекции более сложная, чем разработка таких препаратов против чумы и сибирской язвы, поскольку для последних установлены и охарактеризованы протективные антигены. У F. tularensis к настоящему времени не определены иммунодоминантные антигены и специфические вирулентные детерминанты [Sjostedt А., 2003]. В качестве химической вакцины могут быть использованы поверхностные структуры F. tularensis, в частности белки внешней мембраны. Установлено, что препараты внешней мембраны обладают протектив-ной активностью для белых мышей и морских свинок [Хлебников В. С., Головлев И. Р., Чугунов А. М., 1994]. Было показано что антигенные компоненты внешней мембраны оказывают выраженный иммуномодулирующий эффект на разные формы функциональной активности макрофагов [Скатов Д. В., Хлебников В. С., 1993]. Наряду с попытками создания химической вакцины проводятся исследования по разработке более совершенной живой и субъединичной вакцин [Conlan J.W., 2004].

При детальном изучении механизмов повышенной устойчивости к инфекции после введения туляремийной вакцины был выявлен ее иммуномодулирующий эффект [Kartunen R., et al., 1991]. Эти данные на фоне многочисленных поисков общих антигенов, которые были найдены в последнее время практически у всех взятых на исследование грамотрицательных микроорганизмов, дают дополнительные объяснения появлению в печати разрозненных сообщений об эффективности туляремийной вакцины для повышения устойчивости к гетерологичным инфекциям, у которых клеточное звено играет существенную роль в специфическом иммунитете [Koskela Р., Herva Е., 1982; Илюхин В. И. и др., 2000]. Так, сотрудниками института «Микроб» в опытах на белых мышах было установлено формирование под влиянием иммунизации живой туляремийной вакциной перекрестного иммунитета против чумы [Васенин А. С., Вейнблат В. И., Самойлова JI. В., 1980].

В связи с вышеизложенным, представляется важной задачей выявление и разработка методов получения протективных компонентов туляремийного микроба, которые могут быть использованы при конструировании низкореактогенной химической туляремийной вакцины и, возможно, комплексной вакцины для сочетанной специфической профилактики нескольких особо опасных инфекций.

Накопленные данные о синтезе антигенных структур возбудителя туляремии свидетельствуют о существенной роли компонентного состава питательных сред и условий культивирования в формировании и количественном накоплении отдельных поверхностных структур клетки, обладающих протективной активностью. Прежде всего, к таким структурам относится гликопротеидный «С»-комплекс («С» от «слизистый») [Жемчугов В.Е. и др., 2004], содержащий в своем составе известные белковые компоненты туляремийного микроба и липополисахаридную часть. В связи с этим, изучение уровня синтеза и условий культивирования, способствующих максимальному накоплению «С»-комплекса, является актуальной научно-практической задачей. Не меньшее значение имеет разработка схемы и выбор современных методов биосепарации при получения «С»-комплекса в его наиболее очищенном и иммунологиче-ски активном состоянии.

Цель исследования. Создать оптимальную схему глубинного культивирования туляремийного микроба для получения протективного антигенного «С»-комплекса, разработать методы его выделения и очистки, изучить иммунологическую эффективность.

Задачи исследования:

1) Определить оптимальный состав питательных сред и физико-химических условий глубинного культивирования туляремийного микроба для получения максимального выхода биомассы и протективного «С»-комплекса.

2) Изучить биокинетические особенности культур туляремийного микроба в процессе глубинного культивирования на основе анализа биологических и физико-химических данных, а также расчёта формализованных показателей.

3) Разработать эффективный способ глубинного культивирования и оптимальный алгоритм проведения процесса выращивания вакцинного штамма туляремийного микроба для получения биомассы и протективного «С»-комплекса.

4) Разработать оптимальную биотехнологическую схему получения и очистки протективного «С»-комплекса туляремийного микроба из клеточной массы и культу-ральной жидкости, а также и методы его количественного определения.

5) Изучить антигенные, биохимические, физико-химические и электронномик-роскопические особенности препаратов «С»-комплекса. Провести сравнительный анализ препаратов, полученных из биомассы вакцинного и вирулентного штаммов туляремийного микроба. Оценить протективную активность «С»-комплекса в отношении высоковирулентных штаммов возбудителя туляремии голарктической и неарктической расы.

6) Провести сравнительный анализ влияния иммунизации «С»-комплексом и живой туляремийной вакциной на показатели клеточного звена иммунитета у лабораторных животных.

Научная новизна исследования.

Впервые изучены биокинетические свойства культур вакцинного штамма туляремийного микроба и особенности синтеза им протективного «С«-комплекса при глубинном выращивании в сложных многокомпонентных питательных средах, послужившие основой для разработки оптимального алгоритма проведения процессов культивирования. Впервые, на основании комбинации методов изоэлектрической преципитации и баромембранного разделения биологических молекул, разработан способ получения «С»-комплекса туляремийного микроба из клеточной массы и культуральной жидкости.

Впервые, с использованием иммунноэлектронной микроскопии с антителами к «С«-комплексу, мечеными коллоидным серебром показано, что данный антиген представляет собой надоболочечную структуру клеток возбудителя туляремии. Впервые показано, что «С«-комплекс интенсивно синтезируется культурами туляремийного микроба на сложных по составу питательных средах, обогащенных факторами роста и обеспечивающих высокую скорость размножения популяции возбудителя. Впервые проведен полный биохимический и иммунохимический анализ «С»-комштекса, показавший, что препарат содержит белковый, углеводный и липидный компоненты в соотношении частей, соответственно - 2:1:1. Впервые показана идентичность компонентного состава и иммунобиологических свойств препаратов «С»-комплексов, полученных из вакцинного и вирулентного штаммов возбудителя туляремии, что позволяет использовать в технологии его получения только культуры вакцинного штамма. На экспериментальных биологических моделях (белых мышах) показано, что «С»-комплекс туляремийного микроба защищает животных от заражения высоковирулентными штаммами возбудителя туляремии голарктической и неарктической расы в дозах соответственно по ЕД5о 630 и 280 мкг. Изучена динамика антителообразования у белых мышей в процессе развития гуморального иммунитета, выявлен положительный аллергический ответ у животных, иммунизированных «С»-комплексом. Показано, что антигенный комплекс инициирует активацию макрофагов белых мышей in vitro в НСТ-тесте, не индуцирует явление апоптоза у тимоцитов и спленоцитов белых мышей, что свидетельствует о его низкой реактогенности.

Практическая ценность.

Разработана технологическая схема глубинного культивирования туляремийного микроба в ферментере, включающая использование питательной среды сбалансированного компонентного состава - бульон FT, оптимизированные по длительности и количеству микробных клеток этапы подготовки посевного материала, алгоритм проведения процесса глубинного культивирования возбудителя. Показано, что наиболее эффективным методом глубинного культивирования туляремийного микроба является отъемно-доливной или метод «фазовой культуры», обеспечивающий наибольший выход клеточной массы и возможность проведения многочисленных последовательных циклов выращивания в одном ферментере без снижения конечной концентрации микробных клеток. Отработаны количественные и временные параметры реализации отьемно-доливного метода культивирования туляремийного микроба. Разработана схема получения протективного «С»-комплекса из клеточной массы и культуральной жидкости возбудителя туляремии с использованием методов изоэлек-трической преципитации и ультрафильтрационной очистки. Разработаны методы количественного определения «С»-комплекса в процессе глубинного культивирования, на этапах выделения и очистки препарата в реакциях ДОТ-ИФА, РДП, иммунолюми-несцентном анализе с использованием полученных гипериммунных кроличьих сывороток и моноклональных антител. Результаты иммунологических исследований по показателям протективной активности, реактогенности и безвредности позволяют рекомендовать «С»-комплекс в качестве компонента химической туляремийной вакцины.

По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Аппаратное культивирование туляремийного микроба». Методические рекомендации одобрены Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол №5 от 25.06.04 г.) и утверждены директором Кутыревым В.В. 28.06.04 г. Полученные в результате работы новые данные об особенностях культивирования туляремийного микроба и свойствах поверхностного «С»-комплекса используются на курсах специализации и усовершенствования врачей и биологов в институте «Микроб» при чтении лекций по общей микробиологии.

Апробация работы.

Материалы, изложенные в диссертации, были представлены и обсуждались на: ежегодных итоговых научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" «Итоги фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб», 20022004 гг; 4 Международной конференции по туляремии, Великобритания, г. Бас (Bath), 2003 г; IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине», г. Казань, 2004 г; Российской научной конференции «Медицинская микробиология - XXI век», г. Саратов, 2004 г.; Юбилейной научной конференции «Новые технологии в профилактике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Нижний Новгород, 2004 г.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1) Изучены биокинетические характеристики роста культур туляремийного микроба и динамика синтеза протективного «С»-комплекса при выращивании в уеловиях глубинного культивирования, послужившие основой для выбора оптимальных условий моссообмена в реакторе и наиболее эффективной питательной среде FT.

2) Разработана оптимальная схема культивирования вакцинного штамма туляремийного микроба для максимального получения биомассы и «С»-комплекса, основанная на использовании принципа глубинной отъемно-доливной или «фазовой» культуры.

3) Предложен комплекс методов биосепарации для выделения «С»-комплекса из клеток и культуральной жидкости в препаративных количествах и последующей очистки, основанный на комбинации способов изоэлектрической преципитации, мембранной и ультрафильтрации. Разработаны методы количественного определения «С»-комплекса на основе использования полученных специфических сывороток, в реакциях иммунофлюоресценции, диффузионной преципитации в геле, ДОТ-иммуноферментном анализе и электрофорезе в полиакриламидном геле с иммунобло-тингом.

4) Показано, что «С»-комплекс является надоболочечной структурой клетки туляремийного микроба, синтезируется в насыщенных факторами роста сложных средах, содержит белковый, углеводный и липидный компоненты, проявляет иммунохи-мическую активность.

5) «С»-комплекс, выделенный из вакцинных и вирулентных штаммов, защищает лабораторных животных от заражения высоковирулентными штаммами возбудителя туляремии голарктической и неарктической расы, инициирует активацию макрофагов белых мышей in vitro в НСТ-тесте, не индуцирует явление апоптоза у тимо-цитов и спленоцитов белых мышей.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников. Объём диссертации 133 страницы машинописного текста. Список литературы содержат 108 отечественных и 49 иностранных источников. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 16 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Шепелев, Иван Анатольевич

выводы

1. На основе биокинетического анализа роста отработаны условия глубинного культивирования туляремийного микроба в ферментере с использованием наиболее эффективной питательной среды FT со стимуляторами роста, оптимизированы этапы накопления биомассы для получения физиологически активного инокулята, разработан алгоритм ведения процесса выращивания с регуляцией массообмена кислорода скоростью подачи воздуха и интенсивностью перемешивания. В оптимизированных условиях синтез клеточной массы и протективного «С»-комплекса наиболее эффективны.

2. Разработана оптимальная технологическая схема получения биомассы туляремийного микроба при глубинном культивировании, основанная на реализации отъ-емно-доливного метода выращивания («фазовая культура») с удалением 50% биомассы при достижении культурой максимальной концентрации в данных условиях и добавлением 50% свежей питательной среды. Метод позволяет проводить множество циклов процесса и наиболее экономически эффективен при выращивании возбудителя туляремии для производственных целей.

3. Разработан комплекс методов выделения и очистки протективного «С»-комплекса туляремийного микроба, полученного из клеточной массы и культуральной жидкости методом изоэлектрической преципитации в с последующими дифференциальным центрифугированием, мембранной и ультрафильтрацией.

4. При проведении сравнительных биохимических и иммунохимических исследований установлено, что «С»-комплекс, полученный из клеток вирулентного штамма голарктической расы аналогичен «С»-комплексу, полученному из биомассы вакцинного штамма туляремийного микроба, что позволяет использовать в технологии получения протективного компонента только культуры авирулентного штамма.

5. Установлено, что «С»-комплекс содержит в своем составе белковый, углеводный и липидный компоненты в соотношении, соответственно - 2:1:1, гомогенен при гельхроматографии на сефакриле S-300. Предложен комплекс методов качественного и количественного определения антигена и антител к нему в реакциях иммунофлюоресценции, диффузионной преципитации в геле, ДОТ-иммуноферментном анализе и электрофорезе в полиакриламидном геле с иммуноблотингом.

6. С использованием трансмиссионной электронной микроскопии показано, что «С»-комплекс представляет собой надоболочечную структуру клетки, участвует в формировании слизистых образований у бактерий возбудителя туляремии при выращивании на жидких питательных средах с высокими ростовыми свойствами. Локализация антигенного комплекса на поверхности клеток подтверждена иммуноэлектрон-ной микроскопией с моноклональными антителами, меченными коллоидным серебром.

7. Препараты «С»-комплекса, полученные с поверхности клеток и из культуральной жидкости вакцинного штамма туляремийного микроба, индуцируют в организме лабораторных животных образование антител, выявляемых в реакции диффузионной преципитации в геле в титре 1:32. Антиген обладает протективной активностью, защищает от гибели белых мышей при их заражении сверхлетальными дозами вакцинного и вирулентных штаммов неарктической и голарктической расы (ED50 -277 и 630 мкг, соответственно), проявляет низкую реактогенность и токсичность. Полученная анти-«С»-сыворотка обладает выраженными привентивными свойствами.

8. Анализом влияния иммунизации белых мышей «С»-комплексом на показатели клеточного звена иммунитета установлено, что антиген увеличивает фагоцитарную активность макрофагов к 14 суткам иммуногенеза и пролиферативную активность спленоцитов к 21 суткам, что аналогично показателям для живой туляремийной вакцины. Значительная разница в значениях коэффициента лейкоцитолиза для «С»-комплекса по сравнению с живой вакциной, составляющая 1,8 раза, свидетельствует о формировании клеточного иммунитета у вакцинированных антигеном животных. Иммунизация «С»-комплексом не инициирует апоптотическую активность тимоцитов и спленоцитов белых мышей, что свидетельствует о низком повреждающем действии антигена на иммунокомпетентные клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа посвящена исследованиям, направленным на оптимизацию условий масштабируемого культивирования туляремийного микроба. Определение принципов культивирования патогенных микроорганизмов (возбудителей ООИ) с целью получения максимального выхода протективных антигенов остается актуальной задачей, поскольку перспективным в последнее время является создание химических или субъединичных вакцин, которые отличаются меньшей степенью реактогенности, кроме того, не несут чужеродного генетического материала в отличие от живых вакцин. Для туляремийной инфекции эта работа представляется наиболее сложной, чем разработка профилактических препаратов против чумы и сибирской язвы, поскольку у F.tularensis к настоящему времени, согласно литературным данным, не определены иммунодоминантные антигены и специфические вирулентные детерминанты [Sjostedt А., 2003]. Данные о синтезе антигенных структур возбудителя туляремии свидетельствуют о влиянии состава питательных сред и условий культивирования на синтез отдельных поверхностных структур клетки, обладающих протективной активностью. К таким структурам туляремийного микроба относится гликопротеидный «С»-комплекс, состоящий из белковой и липополисахаридной частей. В связи с этим, актуальной научно-практической задачей является изучение условий культивирования, способствующих максимальному накоплению «С»-комплекса, и разработка схемы биосепарации и выделения для получения препарата «С»-комплекса в его наиболее очищенном и иммунологически активном состоянии.

Наша работа проводилась с использованием вакцинного штамма F.tularensis 15 линии НИИЭГ. Выбор штамма обусловлен отсутствием достоверных данных о различии антигенного состава вирулентного и вакцинного штаммов туляремийного микроба. В результате были изучены биокинетические свойства культур вакцинного штамма и особенности синтеза им поверхностного антигенного «С»-комплекса при глубинном выращивании в сложных многокомпонентных питательных средах, послужившие основой для разработки оптимального алгоритма проведения процессов культивирования.

Проведенные эксперименты показывают, что среда FT на основе рыбного гид-ролизата обладает теми же ростовыми свойствами, что и более богатые экспериментальные среды Т и LB, на основе сердечно-мозгового экстракта и бактотриптона. Использование в качестве стимулирующих добавок к питательным средам крови и её производных (сывороток - нормальных и иммунных, сухих форменных элементов крови) не улучшало ростовых качеств жидких сред, но незначительно увеличивало выход антигена при глубинном культивировании. Добавление СФЭК, к плотной среде приводило к появлению более крупных единичных колоний, по сравнению с контролем. Исходя из того, что одним из обязательных компонентов среды для выращивания туляремийного микроба является глюкоза, мы попытались использовать её в качестве добавки к FT-бульону в процессе глубинного культивирования для увеличения выхода биомассы. Было установлено, что внесение добавки приводило к увеличению скорости роста во время экспоненциальной фазы по сравнению с культивированием без подкормки. Полученные данные о биокинетике синтеза «С»-комплекса свидетельствуют о колебании скорости его образования, в связи с чем критерием выбора питательной среды должны являться сведения о количестве антигена накопившегося в клетках и в культуральной жидкости на ранней стационарной фазе роста.

Разработана технологическая схема глубинного культивирования туляремийного микроба в ферментере на бульоне FT с использованием агаровой культуры в качестве посевного материала. Оптимальные режимы процесса культивирования вакцинного штамма отрабатывали в ферментёре «New Brunswik Ml9» (США) с рабочим объёмом 10 л. Объём питательной среды в ферментёре до 4 л, оптимальный объём подаваемого воздуха - 3,5 — 2 л/мин при скорости вращения мешалки 600 об./мин, оптимальная величина рН - 6,8-7,0. В ходе определения динамики роста биомассы F. tularensis 15 НИИЭГ было установлено, что лаг-фаза практически отсутствовала, что может быть связано с высокой активностью посевного материала. Было отмечено наличие двух экспоненциальных фаз роста (на 4-6 ч и 16-20 ч), причём во втором случае удельная скорость синтеза антигена снижалась. Однако при переходе к стационарной фазе скорость образования «С»-комплекса вновь возрастала, вероятно, по типу синтеза вторичных метаболитов в стрессовых условиях.

Показано, что наиболее эффективным методом глубинного культивирования туляремийного микроба является огьемно-доливной, обеспечивающий наибольший выход клеточной массы. Установлено, что при концентрации посевного материала 11,5 млрд/мл в ферментере, за 20-24 ч выращивания отьемно-доливным методом можно получить 14 л биомассы с концентрацией 12-14 млрд/мл. Отработаны количественные и временные параметры реализации отьемно-доливного метода культивирования туляремийного микроба. Эффективность данного способа культивирования была в 3 раза выше (по времени) по сравнению с обычным глубинным культивированием.

Определены особенности инактивирования и сепарации полученной биомассы для максимального сохранения естественной структуры биологически активных препаратов (антигенов и их комплексов) возбудителя туляремии. Для инактивирования биомассы был использован фенол (до конечной концентрации 1 %). Нами было установлено, что оптимальными режимами освобождения от клеточной массы является центрифугирование при 6000 g (или на сепараторе АСГ ЗМ при 9000 об/мин). Для концентрирования культуральной жидкости, полученной в ходе глубинного культивирования, был использован ультрафильтрационный волоконный аппарат марки УВА-ПС-17-1040 (предел исключения 17 кДа). Использование метода ультрафильтрации на полых волокнах позволяет за короткое время получать 10-кратный концентрат культуральной жидкости, что упрощает дальнейшее выделение антигенного препарата.

Следующим этапом была разработка способов получения «С»-комплекса из клеток и из культуральной жидкости. Клетки подвергали интенсивному гидродинамическому стрессу поверхности дистиллированной водой с помощью вихревого смесителя. Из клеточного смыва выделяли «С»-комплекс поэтапным осаждением при снижении рН. Основываясь на полученных данных о кинетике синтеза изучаемого антигена, прежде всего о его наличие в культуральной жидкости, разработана методика выделения «С»-комплекса в изоточке. Показано, что полученный в изоточке (рН 4,3) антигенный комплекс, как из клеток так и из культуральной жидкости, не отличается по основным физико-химическим и иммунохимическим свойствам от препарата «С»-комплекса, полученного методом ультрацентрифугирования в соответствии с технологией по патенту РФ 2221591 [Жемчугов В.Е., и др. 2003], и обладает большей иммуногенностью. Разработанная нами методика является, на наш взгляд, перспективным методическим подходом, который был использован при создании способа получения «С»-комплекса при масштабном культивировании. На основании полученных данных была составлена оптимальная биотехнологическая схема получения и очистки протективного «С»-комплекса туляремийного микроба из клеточной массы и культуральной жидкости, которая заключается в комбинации методов изоэлектриче-ской преципитации и баромембранного разделения биологических молекул. Применение данной схемы позволило отказаться от использования дорогостоящей ультразвуковой установки и ультрацентрифуги, и дало возможность работать с большими объёмами биомассы.

Учитывая поверхностное расположение «С»-комплекса, а также его высокую иммунохимическую активность, были разработаны методы качественного и количественного определения антигенного комплекса в процессе глубинного культивирования, на этапах выделения и очистки препарата в реакциях ДОТ-ИФА, РДП, люминесцентном анализе с использованием полученных гипериммунных кроличьих сывороток и моноклональных антител. В результате проведенной работы установлены необходимые дозы и способы введения «С»-комплекса лабораторным животным для максимальной выработки специфических антител в короткие сроки. Установлено, что полученная кроличья «С»-сыворотка обладала высокой чувствительностью и специфичностью. Анализ чувствительности в ДОТ-ИФА показал, что «С»-сыворотка почти не уступает моноклональным мышиным антителам гибридомы FB-1IX. Чувствительность МКАт при разведении 1/100 и 1/1000 составляет, соответственно, 1 мкг/мл и 2 мкг/мл, тогда как кроличья сыворотка к «С»-комплексу при тех же разведениях выявляла 1 мкг/мл и 4 мкг/мл антигена. ДОТ-ИФА был использован для определения динамики синтеза «С»-комплекса при культивировании штамма-продуцента и концентрации антигена на этапах выделения, очистки и концентрирования. Кроме того, при наблюдении за свойствами полученной «С»-сыворотки в течение 3-х лет (+4 °С) было показано, что активность жидкой, запаянной в ампулу сыворотки снизилась в 2 раза (титр в РДП снизился с 1/32 до 1/16), тогда как активность лиофильно высушенной сыворотки и иммуноглобулина (хранение при -20 ?С) не изменилась (титр в РДП 1/32).

С помощью изготовленной нами люминесцентной сыворотки на основе моноклональных антител FB-11X и специфической сыворотки к «С»-комплексу было отмечено специфическое свечение клеток вакцинного и вирулентного штаммов голарктической расы (на 3-4 «+»). Слизистые образования вокруг клеток, выращенных на жидкой среде, отмеченные ранее в мазках по Граму, также специфически светились, что свидетельствует о присутствии «С»-комплекса в слизистых «тяжах».

Трансмиссионная электронная микроскопия негативно-окрашенных препаратов показала, что «С»-комплекс локализуется на поверхности клетки и в слизистом слое. Иммуноэлектронномикроскопический анализ, с использованием антител к «С»-комплексу, меченных коллоидным серебром, подтвердил наличие этого антигена на поверхности клеток. Метка была обнаружена как на самих клетках, так и на слизистых выростах клеток - «тяжах», что свидетельствует об участии «С»-комплекса в формировании данных слизистых образований. Препарат «С»-комплекса в водном растворе способен образовывать липосомоподобные структуры сходные по форме и размерам с клетками.

Биохимический анализ поверхностного комплекса туляремийного микроба показал, что в его состав входят белки - 52-77%, липиды - 16-32% и углеводы - 7-15%, при отсутствии нуклеиновых кислот. Молекулярная масса «С»-комплекса по данным гель-хроматографии составила около 280 кДа. SDS-электрофорезом в полиакрила-мидном геле показано наличие в препарате субъединиц с молекулярной массой около 17, 25, 65-67 кДа. Иммуноблотингом установлено, что независимо от источника выделения (клетки, культуральиая жидкость), эти субъединицы были иммунореактивны.

Показана идентичность компонентного состава и иммунобиологических свойств препаратов «С»-комплекса, полученных из вакцинного и вирулентного штаммов возбудителя туляремии, что позволяет использовать в технологии его получения только культуры вакцинного штамма.

В ходе анализа результатов гель-хроматографии на хроматографе Biologic LP фирмы «Bio-Rad» (США) с применением геля Sephacryl S-300 не было установлено существенных различий между профилем элюции препаратов полученных при глубинном культивировании в ферментёре и культивировании в малых объёмах.

Введение поверхностного антигенного «С»-комплекса белым мышам обеспечивало их защиту от последующей гибели после заражения голарктическими - F. tularensis 15 НИИЭГ (ED50- 33,11-56,23 мкг), F. tularensis 503(ED5 - 630 мкг), неарктическим - F. tularensis A'Cole (ED50MKr - 277,3 - 281,8 мкг) штаммами туляремийного микроба. При изучении динамики антителообразования у белых мышей в процессе развития гуморального иммунитета показано, что препараты «С»-комплекса вызывают формирование антительного ответа в ранние сроки, причём для препарата «С»-комплекса, полученного из культуральной жидкости, была характерна более высокая иммунологическая активность. Установлена превентивная активность сывороток содержащих антитела к «С»-комплексу, для белых мышей при заражении сверхлетальными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ. В опытах in vivo (на модели белых мышей и морских свинок) показано, что исследуемый антигенный комплекс не обладает токсичностью. Контроль пирогенности in vitro (LAL-тест) выявил минимальные концентрации эндотоксина в полученных сериях препарата (концентрация эндотоксина менее 0,5 ЕЭ/мл), что свидетельствует об отсутствии пирогенных свойств. Реакция лей-коцитолиза выявила иммунологическую перестройку у животных, иммунизированных препаратом «С»-комплекса, причём коэффициент лейкоцитолиза был в 1,8 раза меньше по сравнению с ЖТВ, что свидетельствует о формировании клеточного иммунитета у вакцинированных антигеном животных. Показано, что антигенный комплекс инициирует активацию макрофагов белых мышей in vitro в НСТ-тесте, причём более высокая фагоцитарная активность макрофагов отмечалась у животных, им.мунизированных препаратом «С»-комплекса полученным нз клеток. Исследование пролиферативной и апоптотической активности иммунокомпетентных клеток белых мышей, иммунизированных «С»-комплексом, показало, что процент апоптотических тимоцитов и спленоцитов соответствовал контрольному на всех этапах иммуногенеза, что свидетельствует о низкой реактогенности препарата. Результаты иммунологических исследований по показателям протективной активности, реактогенности и безвредности позволяют рекомендовать «С»-комплекс в качестве компонента профилактического препарата против туляремийной инфекции.

Полученные в работе данные представляют научный и практический интерес, поскольку впервые определена оптимальная схема глубинного культивирования туляремийного микроба, которая может быть использована для получения биомассы при производстве живых вакцин и выделения протективных антигенов при разработке химических и комбинированных вакцинных препаратов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шепелев, Иван Анатольевич, 2005 год

1. Александров Н. И., Гефен Н. Е. Поливакцины НИИСИ. (Препарат для одновременной иммунизации против холеры, брюшного тифа, паратифа, дизентерии). М.: 1957.

2. Алексеев В. В., Тихонов Н. Г., Липницкий А. В. и др. Аэрогенные инфекции в аспекте проблемы биотерроризма / Проблемы ООН: Сб. науч. тр. Под ред. проф. Кутырева В.В. Саратов: ОГУП «РНК» Полиграфия Поволжья», 2003. — Вып.85. -С. 20-27.

3. Анциферов М. И. Сравнительная оценка питательных сред в бактериологической диагностике туляремии / Изв. Иркутск, противочумного ин-та Сибири и Дальнего Востока. 1959.-Т. 21.-С. 148-177.

4. Аронова Н. В., Павлович Н. В. Использование препаратов ЛПС F. tularensis в точечном ИФА для обнаружения противотуляремийных антител// ЖМЭИ.- 2000.-№ 5.- С. 75-78.

5. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистичесике методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.- 180 с.

6. Баснакьян И. А. Оптимизация культивирования микроорганизмов в иммунобио-технологии // ЖМЭИ,- 1989.- № 5.- С. 90-96.

7. Баснакьян И. А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. -М.: Медицина. 1992.- 192 с.

8. Баснакьян И. А., Мирясова JI. В., Соколова Т. В. Оптимизация технологии культивирования вакцинных штаммов Shgella flexneri IIЖМЭИ,- 1993.- № 5.- С.6-10.

9. Васенин А. С., Вейнблат В. И., Самойлова JI. В.О перекрёстном иммунитете против чумы и туляремии // ЖМЭИ.- 1980. № 2,- С.49-52.

10. Глазунов А. В. Методы оценки физиологических параметров периодической и непрерывной культур микроорганизмов по кинетике потребления ими кислорода // Биотехнология. 2002. - № 5. - С. 23-31.

11. Дальвадянц С. М. Химическая вакцина: конструирование, экспериментальное и клиническое обоснование применения для ревакцинации людей: Автореф. дис. докг. мед. наук.- Саратов, 1991.-31 с.

12. Дальвадянц С. М., Белобородое Р. А., Сероглазое В. В. и др. Чумная химическая вакцина / Состояние и перспективы специфической профилактики чумы: Материалы науч.- практ. конф.- Саратов.- 1997.- Т. 1.- С. 201.

13. Дрожевкина М. С. Жидкая желточная среда для выращивания В. tularense / Тр. Рост.-на-Дону гос. научн.-исслед. Противочум. Ин-та. 1945. - Т. 4. — С. 51-64.

14. Дружинин О. Г., Баснакьян И. А., Алексахина Н. А. Поддержание уровня растворённого в среде кислорода с помощью ЭВМ в процессе управляемого глубинного культивирования Neisseria meningitides IIЖМЭИ.- 2000.- № 6.- С.65-67.

15. Дубинина Г. П. Управляемое культивирование патогенных микроорганизмов // ЖМЭИ.- 1982.-№ 12.- С.40-44.

16. Дрю С. Жидкая культура. Методы общей микробиологии. М.: Мир.- Т. 1.- 1983. - С. 374-437.

17. Емельянова О. С. Микробиология туляремии. — В кн.: Туляремия. М., - I960. -С.51-95.

18. Ерошенко Г. А., Кутырев В. В. Молекулярные аспекты изучения возбудителей особо опасных бактериальных инфекций / Проблемы ООИ: Сб. науч. тр. Под ред. проф. Кутырева В.В. Саратов: ОГУП «РИК» Полиграфия Поволжья», 2003. — Вып.86.-С. 54-67.

19. Жемчугов В.Е., Дятлов И.А., Кутырев В.В., Волох О.А., Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Патент № 2221591 РФ, 27.01.03 г.f 121

20. Жемчугов В.Е. Как мы делали химические вакцины / Записки о современных охотниках за микробами. М.: «Наука» - 2004 - 349 с.щ 29. Илюхин В. И., Кисличкин Н. Н., Тихонов Н. Г., и др. Перспективы применения

21. Francisella tularensis 15 (LVS) для гетерологической иммунизации и создания поливалентных рекомбинантных вакцин / Сбор. Науч. Трудов «Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье», Волгоград. 2000. - С. 100-106.

22. Инструкция о порядке обеспечения безопасности при работе с патогенными биологическими агентами в секторе культивирования микроорганизмов. Рос-НИПЧИ «Микроб».- Саратов.- 2004.

23. Инструкция по технике безопасности при работе на реакторах № 36. РосНИПЧИ «Микроб».- Саратов.- 2004.

24. Карпухин Г. И., Шапиро Н. И., Андриевская Р. А. Химические вакцины для профилактики кишечных инфекций. Л.: Медицина. - 1979. - С. 66-74.

25. Карцев А. Д. Цикличность заболеваемости некоторыми природно-очаговыми инфекциями в Российской Федерации // ЖМЭИ.- 2002.- № 1.- С.23-27.

26. Кац Л. Н., Мещерякова И. С., Огиевецкая М. М. Электронномикроскопическое исследование локализации антигенов у Francisella tularensis с помощью антител меченных феррином //Журн. гиг., эпидемиол. (Прага). 1970. - Т. 14.-С. 430-435.

27. Клюжин В. А. Рост турбидостатной культуры дрожжей при высокой концентрации веществ в стационарном режиме в условиях осмотического шока // Микробиол.- 1998.-67, № 5.- С. 607-612.

28. Колядицкая JI. С., Шмурыгина А. А. Усовершенствование препарата сухой живой туляремийной вакцины // ЖМЭИ. 1957. - № 10. - С. 84-89.

29. Коннов Н. П. Демченко Т. А., Венгеров Ю. Ю. и др. Иммуноэлектронноскопи-ческое исследование антигенов чумного микроба // Микробиология и биохимия ООИ. Саратов. - 1988. С. 28 - 35.

30. Коннов Н. П. Атлас ультраструктуры возбудителя чумы и его переносчика блохи Xenopsylla cheopis. Саратов, 1989. — 134 с.

31. Кох А. Измерение роста. Методы общей микробиологии М.: Мир. Т. 1.- 1983. -С. 492 - 4 93

32. Кулевацкий Д.П. Липополисахаридобелковые комплексы внешней мембраны возбудителя туляремии. Автореф. дис. . канд. биол. наук // Любучаны. — 1994. - С.20.

33. Лапшенков Г. И., Зиновкина Т. В., Харитонова Л. Ю. Выбор режима культивирования аэробных микроорганизмов с учётом степени устойчивости процесса // Биотехнология.-2002.- № 6.- С. 70-76.

34. Магазов Р. Ш. О совместимости вакцин при комплексной и ассоциированной иммунизации //ЖМЭИ.- 2000.- № 5.- С. 108-112.

35. Майский В. Г., Шишов И. Н., Басилова Г. И. Питательные потребности F. tularensis // ЖМЭИ.-1984.-№6.-С. 20-23

36. Маслова Н. Н., Павлович Н. В. Иммуномодулирующие и антитоксические свойства препаратов липополисахарида представителей рода Francisella // ЖМЭИ. 1999.- № 4. - С. 50-53.

37. Матвеев В. Е., Плессер Jl. М. Расчёт необходимой эффективности процессов препятствующих проникновению посторонней микрофлоры на различных стадиях асептического производства // Биотехнология.-2001.- № 6.- С. 68-70.

38. Маянский А. Н. Иммунологическая характеристика внутриклеточных белков бактерий семейства кишечных// Журн. микробиол. 1977. - № 2. - С. 7-12.

39. Меджинов М. М. Справочник по микробиологическим питательным средам. -М.: Медицина, 2003. 205 с.

40. Мещерякова И. С. Антигенное строение штаммов туляремийного микроба различной степени вирулентности // Журн. гиг., эпидемиол. (Прага). 1970. - Т. 14.-С. 420-429.

41. Мельникова В. А. Ингибирование и стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов в процессах культивирования // ЖМЭИ. 1983.- №10. - С. 3 -7.

42. Мишанькин Б. Н., Павлович Н. В., Романова J1. В., и др. Туляремия //Лаб. диагностика возбудителей ООИ.- Саратов.-1998.- Т. 1.- С. 111-143.

43. Нафеев А. А. К проблеме совершенствования эпидемиологического надзора за инфекциями с природной очаговостью / Проблемы ООИ: Сб. науч. тр./ Под ред. проф. Кутырева В.В. Саратов: ОГУП «РИК» Полиграфия Поволжья», 2003. — Вып.85. - С.37-40.

44. Нижегородцев Н. А. Разработка новой технологии получения О-антигена холерного вибриона для производства профилактических препаратов.- Автореф. дне. канд. биол. наук// РосНИПЧИ «Микроб», Саратов.- 2003.- 22 с.

45. Олсуфьев Н. Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина, 1975.- 190 с.

46. Онищенко Г. Г. Об эпидемической ситуации и заболеваемости природноочаговы-ми инфекциями в Российской Федерации и мерах по их профилактике // ЖМЭИ.-2001.-№ 3.- С. 22-28.

47. Онищенко Г. Г., Монисов А. А., Гульченко JI. П. и др. Заболеваемость зооантро-понозными и природноочаговыми инфекциями и меры по их профилактике // ЖМЭИ.- 1999.- № 4.- С. 14-18.

48. Онищенко Г. Г., Сандахчиев JI. С., Нетесов С. В., Мартынюк Р. А. Биотерроризм: национальная и глобальная угроза //Вестник РАН.- 2003.- Т. 73, № 3.- С. 195-204

49. Оноприенко Н. Н., Павлович Н. В. Роль липополисахарида в токсичности бактерий рода Fracisella И Молекулярная генетика.-2003. №3.- С. 23-28.

50. Определение эндотоксина в тесте с лизатом амёбоцитов // МУК «Методы контроля медицинских и иммунобиологических препаратов, вводимых людям». 4.1/4.2 588-96.- М: Минздрав, 1998.- с. 53-54.

51. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2003 году: Государственный доклад.- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России , 2004.- С. 160-161.

52. Павлович Н. В., Мишанькин Б. Н. // Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. -Т. 32, №1. - С. 133 - 137.

53. Павлович Н. В., Цимбалистова М. А., Маслова Н. Н. Быстрый метод оценки вирулентности Francisella tularensis in vitro И ЖМЭИ.- 1997.- №2.- С. 17-20.

54. Павлович Н. В., Шиманюк Н. И., Мишанькин Б. Н. Нейромидазная активность у представителей рода Fracisella II ЖМЭИ. 1992, №9 - 10. - С. 8 - 12

55. Павловская Ж. И., Мороз И. В., Михайлова Р. В., и др. Влияние компонентов питательной среды на образование внеклеточной каталазы Penicillium piceum F -6481I Биотехнология.-2001.- № 3.- С. 18-24.

56. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. -1978.-331 с.

57. Покровский В. И. Инфекции наступают, но победить не должны // Эпидемиология и вакциропрофилактика.- 2001. № 1. - С. 3 - 5.

58. Получение суммарных антигенов бактерий паратифа А и изучение их свойств / Авт. Синяшин Н. И., Лобачёва Л. А., Абидов А. А., Ахмеджанова М. А. В кн.: Вакцины и сыворотки. Материалы по производству. М. —1974. - С. 12-16.

59. Приказ Минздрава РФ от 14 апреля 1999 г. N 125 "Об усилении мероприятий по профилактике туляремии".

60. Работнова И. Л., Позмошва И. Н. Питание микроорганизмов // ЖМЭИ.- 1993. -№5.-С. 112-116.

61. Родионова И. В., Захаренко В. И. Антигенный состав белков наружней мембраны туляремийного микроба // Мол. ген. микробиол. и вирусол. 1990. - № 11. - С. 16-18.

62. Родионова И. В., Константинова Н. Д., Бруханский Г. В. Наружные мембраны туляремийного микроба и их белковый состав // Молекулярная генетика.-1989. -№12.- С. 22-25.

63. Рокицкий П. Ф. Биологическая статистика. Минск: Высшая школа, 1973. - 320 с.

64. Романова Л. В., Водопьянов С. О., Саямов С. Р., Олейников И. П., Мишанькин Б. Н. Тепловой стресс и белок теплового стресса GroEL у возбудителя туляремии // Биотехнология.-2004.- № 5.- С. 33-38.

65. Рощина Е. К. Влияние условий культивирования на устойчивость Е. coli к стрессовым воздействиям / Доклад на 8 международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», С.-Петербург. 19-24 мая, 2000 // Рус.

66. Самыгин В. М., Пивень Н. Н., Гришкина Т. А. Условия культивирования как лимитирующие факторы в развитии патогенных бактерий (обзор) // Проблемы ООИ.- Саратов.- 2003.- Вып. 86.- С. 68-79.

67. Самыгин В. М., Владимцева И. В., Спиридонов В. А. и др. Биотехнологические аспекты культивирования Burholderia pseudomallei II Биотехнология.-2000.- № 3.-С. 53-58.

68. Самыгин В. М., Владимцева И. В., Спиридонов В. А. и др. Экспериментальная оценка роста и продукции экзопротеаз Burholderia mallei в условиях глубинного культивирования // Биотехнология.-2000.- № 3.- С. 59-62.

69. Самыгин В. М., Храпова Н. П., Спиридонов В. А. и др. // ЖМЭИ.- 2001.- № 4.-С. 50-52.

70. Сборник инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов. М. 1983. — С. 5253.

71. Скатов Д.В., Хлебников B.C., Василенко Н.Р. Влияние антигенных фракций внешней мембраны Francisella tularensis на функциональную активность макрофагов // ЖМЭИ. 1993.- №4.- С. 87-91.

72. Скоупс Р. Методы очистки белков. — М.: Мир, 1985. С. 337 - 350.

73. Смирнов С. Г. Информационные характеристики периодических культур энте-робактерий //ЖМЭИ.- 1981.- №1.- С. 34-39.

74. Смирнова Е. А., Комиссарова JI. В., Гаджиева Г. Р. и др. Питательная среда для индикации бактерий туляремии. Патент № 843466, 20. И. 1979.

75. Сорокин В. М., Павлович Н. В., Прозорова А. А. // Тез. докл. «Генетика и биохимия вирулентных возбудителей ООИ» Волгоград. - 1992. - С. 130.

76. СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами». Москва. 1999 г.

77. Станиславский Е. С. Бактериальные структуры и их антигенность. М., 1971.

78. Сухарь В. В. Изучение антигенного состава некоторых штаммов туляремийного микроба. Сообщение II. Сравнительный антигенный состав вирулентного и авирулентного микроба // Журн. микробиол. —1966, № 8.- С. 52-56.

79. Сухарь В. В. П-антиген туляремийного микроба // Журн. микробиол. 1974.-№7.-С. 104-107.

80. Туляремия. Под ред. проф. Олсуфьева Н. Г. и проф. Руднева Г. П. М.: Медгиз, 1960.-458 с.

81. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир. - 1975. - 324 с.

82. Фаддеева С. Е., Ясиновский В. Г. Влияние ряда условий культивирования на биосинтез L-аргинина мутантным штаммом Brevibacterium flavum II Биотехно-логия.-2002.- № 5.- С. 14-22

83. Фармакопейная статья: физико-химические, химические, физические, имму-нохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов (ФС 42-3874-99) / Минздрав. РФ. Фармокопейный государственный комитет. 3 февраля, 2000 г. С. .

84. Фармакопейная статья: вакцина туляремийная живая (ФСП 42-04333759-02) /. Минздрав. РФ. Фармокопейный государственный комитет., 2002 г. С.

85. Хлебников В. С., Головлев И. Р., Кулевацкий Д. П. и др. Изучение биохимических, антигенных и протективных свойств внешней мембраны возбудителя туляремии // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 1991. №7. - С. 15 - 20

86. Хлебников B.C., Головлев И.Р., Чугунов A.M. и др. Защитные свойства внешних мембран Francisella tularensis при экспериментальной инфекции морских свинок // ЖМЭИ. 1994, №1. - С.84-88.

87. Хлебников B.C., Коровина О. В., Кулевацкий Д.П., Жемчугов В. Е. / Тез. докл. «Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ». Волгоград. - 1992.-С. 142.

88. Хлебников B.C., Ветчинин С.С., Гречко Г.К., Аверина А.А., Головлев И.Р., Аверин С.Ф., Жемчугов В.Е. и др. Превентивная активность моноклональных антител, специфичных к липополисахариду Francisella tularensis И ЖМЭИ. -1992.-№9-10.-С. 67-70.

89. Хлебников B.C., Кулевацкий Д.П., Головлев И.Р., Аверин С.Ф., Жемчугов В.Е. и др. Исследование ЛПС-белкового комплекса из внешней мембраны Francisella tularensis И ЖМЭИ. 1992. - № 3. - С. 13-17.

90. Шапиро Н. И. Физико-химические условия среды при глубинном культивировании микроорганизмов, их контроль и регулирование // Прикл. биохим. и микробиол., 1965, в. 110, сер. биол., С. 26-31.

91. Шапиро Н. И., Карпухин Г. И. Тифо-паратифозные химические вакцины. — В кн.: Вакцины для профилактики и терапии кишечных бактериальных инфекций. М. -1976.-С. 20-30.

92. Шишкина Л. Н., Марков Е. Ю. Способ получения туляремийного антигена. А. с. № 1692580, 11.04.89 г. Опубл. 23.11.91 г. Бюл. №43 МКИ 5 А61К39/02. Информ. бюл.- 1993.-№3.

93. Юров С.В., Комаров А. М., Пчелинцев С. 10. и др. Особенности формирования иммунитета при вакцинации препаратом внешних мембран Francisella tularensis

94. Актуальные проблемы профил. туляремии / Тез. Всес. конф- Симферополь. -1991.-С. 208-209.

95. Яшечкин Ю. И., Куличенко А. Н., Ивашенцева Л. Н. и др. ПЦР-тест-система для детекции возбудителя туляремии / Проблемы ООИ: Сб. науч. тр. Под ред. проф. Кутырева В.В. Саратов: ОГУП «РИК» Полиграфия Поволжья», 2003. - Вып.86. -С. 159-163.

96. Aikimbayev А. М, Kunitza Т. N., Temiralieva G. A., et al. Tularemia in Kazakstan / Fourth International Conf. On Tularemia. City of Bath, United Kingdom. - 2003. - S 27.

97. Ales N. C, Katial R. K. Vaccines against biologic agents: uses and developments // Respir Care Clin N Am. 2004 Mar. - 10 (1). - P. 123-146.

98. Amenta J. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-bayer chromatography // J. Lipid Res. 1964. - Vol. 5. - P. 270-272.

99. Anderson Kevin R., Mendelson Neil H., Walkins Joseph C. A new mathematical approach predicts individual cell growth behavior using bacterial population information // J. Theor. Biol. 2000. - 202, № 1. - P. 87-94.

100. Barloge В., Spidzer G., Hart G. S. et al. DNA histogram analysis of human hemopoetic cells // Blood. 1976. - Vol. 48, № 2. - P. 245 - 258.

101. Bevander L., Maeland J. A., Naess A. I. Agglutinius and antibodies to F. tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia // J. clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26. - P. 433-437.

102. Berdai B. P., Mehi R., Haaheim H., Grunov R., Burans J., Morgan C., Meyer H., Field finding F. tularensis II Scand. J. Infect. Diseases. 2000. - 32. - No.3. - P. 287-291.

103. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Extraction d un complex toxique et anti-genique a partir du tecilli dAertrycke / C. R. Soc. Biol. 1933. - Vol. 114, № 3. - P. 307-310.

104. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. -V. 72. - P. 248-254.

105. Conlan JW. Vaccines against Francisella tularensis past, present and future/ Expert Rev Vaccines. - 2004 Jun. - 3 (3). - P. 307-314.

106. Cowley S. C., Myltseva S. V., Nano F. E. Phasa variation in Francisella tularensis growth, lipopolisaccharide antigencity and nitric oxide production // Mol. Microbiol.-1996. Vol. 20, № 4. - P. 867-874.

107. De Oliveira M. A. C. G., Leite S. G. F., Robbs P. G. Features of the growing Spirulina maxima with differring temperature / IX Int. congress of Bacterid and App. Microbiol,16.20 aug. 1999. Sydney, 1999. - P. 66.

108. Difco manual of dehydrated culture media and reagents for microbial and clinical laboratory procedures / Difco Laboratories Inc. Detroit. Michigan. 1974

109. Eigelsbach H. Т., Downs С. M. Prophylactic effectiveness of live and killed tularemia vaccines. I. Production of vaccine and evaluation in the white mouse and guinea pig. // J. Immunol. 1961. - Vol.87. - P. 413- 425.

110. Ellis J., Petra C. F. Oyston, Green M., Titball R. Tularemia II J. clin. Microbiol. -2002. -Vol. 15.-P. 631-646.

111. Fomsgaard A. Antibodies to LPS: some diagnostic and protective aspects// AMPIS Suppl.- 1990. Vol. 18. - P. 1-38.

112. Fulop M., Leslie D., Titball R. A rapid highly sensitive method for the detection of F. tularensis in clinical // J. Trop. Med. Hyg. -1996. 54. - P. 364-366.

113. Fulop M., Manchee R.,Titball R. Role of two membrane antigens in inuction of different virulence II FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13. - P. 245-247.

114. Gallagher-Smith M, Kim J, Al-Bawardy R, Josko D. Francisella tularensis: possible agent in bioterrorism II Clin Lab Sci. 2004. - 17 (1). - P. 35-39.

115. Gil H., Thanassi D. G. Pilus-like surfase structures expressed by Francisella tularensis / Fourth International Conf. On Tularemia. City of Bath, United Kingdom. - 2003. - P 29.

116. Golovliov I.K., Kuoppa A., Sjostedt A. et al. Cytokine expression in the liver of mice infected with higly virabut strain of Francisella tularensis II FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - 13. - P. 239-244.

117. Hristova Т., Tzonkov S. Modelling and optimization of fed-batch fermentation process// Chem. and Biochem. Eng. Quart. 1998. - 12, № 4. - P. 213-215.

118. Hood A. M. Virulense factors of Francisella tularensis II J Hyg (Lond). 1977. - Vol 79. - P. 47-60.

119. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - 227: P. 680-685.

120. Lee В., Clemens D., Horwitz M. Identification of early culture filtrate Proteins of Francisella tularensis / Fourth International Conf. On Tularemia. City of Bath, United Kingdom. - 2003. - P 02.

121. Lowry О. H., Risebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent //J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265.

122. Meka-Mechenko Т., Aikimbayev A., Kunitza T. N., et al. Clinical and epidemiological characteristic of tularemia in Kazakhstan // Przegl Epidemiol. 2003. - 57 (4): P. 587591.

123. Nano F. E. Identification of a heat-modifiable protein of Francisella tularensis and molecular cloning of the encoding gene // Microb. Pathogen. 1988. - Vol. 5. - P. 109119.

124. Orergin-Ulgen K. et all. Carrying and seizure of the oxygen in culture in reactor of the periodic action // J. Chem. Technol. and Biotechnol. 1998. - Vol. 73, № 3. - P. 243250.

125. Ormsbee R. A., Larson C. L. Studies on Bacterium tularense antigens. II. Chemical and physical characteristics of protective antigen preparations // J. Immunol. 1955. - P. 359-370.

126. Prior J. L., Prior R. G., Hitchen P. G. Characterisation of the liopopolysaccharide of F tularensis subspecies tularensis / Fourth International Conf. On Tularemia. City of Bath, United Kingdom. - 2003. - S 27.

127. Rane L., Newhauser L. R. A method for the separation of protein fraction // Armed Forces med. J., 1954. V. 5, №3. - P. 368 - 370.

128. Reintjes R., Dedushaj I., Gjini A., Jorgensen T. R., et al. Tularemia Outbreak investigation in Kosovo: Case control and environmental studies // Emerg. Infect. Diseases. -2002. Vol. 8. - No. 1. - P. 69-73.

129. Ribi E., Shepard C. Morphology of Bacterium tularense during its growth cycle in liquid medium as revealed by the electron microscope / Exp. Cell. Res. — 1955. — Vol. 8. p. 474-487.

130. Sandstrom G., Sjostedt A., Johansson T. et al. Immunogenicity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS // FEMS Microbiol. Immunol. 1992.-5:-P. 201-210.

131. Sandstrom G., Tarnvik A., Wolf-Watz H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis II J. clin. Microbiol. 1987. -Vol. 25. -P. 641-644.

132. Shioga A., Morikawa M., Kajihara Y., et all. Optimization of the conditions mixing and aerations for maximum product virginimicin // Microbiol, and Biotechnol. 1999. — 51. №2.-P. 164-169.

133. Sjostedt A., Sandstrom G., Tarnvik A. Several membrane polypeptides of the live vaccine strain Francisella tularensis LVS stimulate T cells from naturally infected individuals//J. clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, №1. - P. 43-48.

134. Sjostedt A. Virulence determinants and protective antigens of Francisella tularensis II Curr. Opin. In Microbiol. 2003. - 6. - P. 66-71.

135. Staub A. M. The Role of Polysaccharide Moiety in Determing the Specificity and Immunologic Activity of the O-antigen Complex of Salmonellae // In. Bacterial. Endotoxin. Ed. by M. Lendy a. W. Brown. New Jersy. 1964. - P. 38-48.

136. Stulik J., Cerna J., Kovarova H., Macela A. Protein heterogeneity of Francisella tularensis: detection of proteins with antigenic determinants // Folia microbiol. (Praha). -1989. Vol. 34, № 4. - P. 316-323.

137. Surcel H. M., Sarvas M., Helander J. M., Herva E. Membrane proteins of Francisella tularensis LVS differ in ability to induce proliferation of lymphocytes from tularemia-vaccinated individuals // Microbiol. Patogen. 1989. - Vol. 7. - P. 411 - 419.

138. Tarnvik A., Priebe H. S., Grunow R. Tularaemia in Europe: an epidemiological overview// Scand J Infect Dis. 2004. - 36 (5). - P. 350-355.

139. Towbin H., Stacbelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poly-acrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - 76: P. 4350-4354.

140. Waag D.M., Sandstrom G., England M.J., Williams J. C. Immunogenecity of a new lot of F. tularensis LVS in human volonteers// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. -Vol. 13. - P. 205-209.

141. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolisaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Meth. Carbohydr. Chem. 1965. - Vol. 5. - P. 83-91.

142. Westphal O. Bacterial endotoxins. The second Karl Prausnits memorial lecture / Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1975. - Vol. 28, № 1-2. - P. 205-209.