Применение экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus в экспериментальных моделях гиперплазии и опухолей предстательной и молочной желез тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ермакова Елена Дмитриевна

• Ермакова Елена Дмитриевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Ермакова Елена Дмитриевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование изофлавонов и фукоиданов у человека

1.2. Изофлавоны

1.2.1. Химическая природа

1.2.2. Получение: источники и способы выделения и очистки

1.2.3. Методы очищения и разделения изофлавонов из растительного сырья

1.2.4. Биологическая активность

1.3. Фукоиданы

1.3.1. Химическая природа

1.3.2. Получение: источники и способы выделения и очистки

1.3.3. Биологическая активность

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

2.2. Получение и количественная оценка содержания изофлавонов в экстрактах Pueraria lobata и фукоиданов в экстракте Fucus vesiculosus

2.3. Животные

2.4. Модели опухолевого роста

2.5. Параметры оценки

2.6. Рандомизация животных в экспериментальные группы, схемы введения экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus

2.7. Методы лабораторной диагностики

2.7.1. Клинический анализ крови

2.7.2. Биохимический анализ

2.7.3. Оценка антиоксидантной активности

2.8. Патоморфологические методы исследования

2.8.1. Определение массовых коэффициентов внутренних органов

2.8.2. Иммуногистохимические исследования

2.9. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Скрининг in silico потенциальных молекулярных мишеней биологически активных веществ изучаемых экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus

3.2. Оценка экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus как потенциальных средств сопроводительной терапии в отношении перевиваемой солидной опухоли Эрлиха у мышей на фоне химиотерапии 5-фторурацилом

3.2.1. Показатели продолжительности жизни и выживаемости экспериментальных животных с перевиваемыми опухолями Эрлиха

3.2.2. Динамика роста опухолевых узлов экспериментальных животных

3.2.3. Динамика массы тела экспериментальных животных

3.2.4. Масса внутренних органов экспериментальных животных

3.2.5. Клинические показатели периферической крови экспериментальных животных

3.2.6. Гистологическая оценка внутренних органов и развившейся опухоли Эрлиха экспериментальных животных

3.2.7. Количество жизнеспособных крипт толстого кишечника у экспериментальных животных

3.3. Оценка профилактического действия экстракта Pueraria lobata в модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы у крыс

3.3.1. Динамика массы тела экспериментальных животных

3.3.2. Масса предстательной железы и ее долей

3.3.3. Клинические показатели периферической крови экспериментальных животных

3.3.4. Биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных животных

3.3.5. Оценка состояния минерального обмена и работы антиоксидантной системы в сыворотке крови экспериментальных животных

3.3.6. Гистологическая оценка степени выраженности доброкачественной гиперплазии предстательной железы у экспериментальных животных

3.3.7. Иммуногистохимическое окрашивание тканей вентральных долей предстательной железы экспериментальных животных

3.4. Оценка профилактического действия экстрактов цветков кудзу (Pueraria lobata) и Fucus vesiculosus на модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы у крыс

3.4.1. Динамика массы тела экспериментальных животных

3.4.2. Масса предстательной железы экспериментальных животных

3.4.3. Клинические показатели периферической крови экспериментальных животных

3.4.4. Биохимические показатели в сыворотке крови экспериментальных животных

3.4.5. Оценка состояния минерального обмена и работы антиоксидантной системы в сыворотке крови экспериментальных животных

3.4.6. Гистологическая оценка степени выраженности доброкачественной гиперплазии предстательной железы у экспериментальных животных

3.4.7. Иммуногистохимическое окрашивание тканей вентральных долей предстательной железы экспериментальных животных

3.5. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus в модели доброкачественной гиперплазии молочной железы (мастопатии) у крыс

3.5.1. Динамика массы тела экспериментальных животных

3.5.2. Масса внутренних органов экспериментальных животных

3.5.3. Клинические показатели периферической крови экспериментальных животных

3.5.4. Площадь сосков экспериментальных животных

3.5.5. Гистологическая оценка степени выраженности морфологических изменений в тканях молочной железы экспериментальных животных

3.6. Оценка профилактического действия экстракта корней кудзу (P. lobata) на модели индуцированного рака предстательной железы у крыс

3.6.1. Показатели выживаемости экспериментальных животных

3.6.2. Динамика масса тела экспериментальных животных

3.6.3. Масса внутренних органов экспериментальных животных

3.6.4. Масса предстательной железы экспериментальных животных

3.6.5. Клинические показатели периферической крови экспериментальных животных

3.6.6. Биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных животных

3.6.7. Состояние минерального обмена и работы антиоксидантной системы в сыворотке крови экспериментальных животных

3.6.8. Состояние минерального обмена и работы антиоксидантной системы в ткани предстательной железы экспериментальных животных

3.6.9. Нарушения работы мочевыделительной системы экспериментальных животных

3.6.10. Гистологическое описание тканей предстательной железы экспериментальных животных

3.6.11. Частота возникновения новообразований предстательной железы у экспериментальных животных

3.6.12. Иммуногистохимическое окрашивание тканей вентральных долей предстательной железы экспериментальных животных

3.7. Оценка профилактического эффекта экстракта Fucus vesiculosus в модели индуцированного рака предстательной железы у крыс

3.7.1. Показатели выживаемости экспериментальных животных

3.7.2. Динамика массы тела экспериментальных животных

3.7.3. Масса внутренних органов экспериментальных животных

3.7.4. Масса предстательной железы экспериментальных животных

3.7.5. Клинические показатели периферической крови экспериментальных животных

3.7.6. Состояние минерального обмена и работы антиоксидантной системы в сыворотке крови экспериментальных животных

3.7.7. Состояние минерального обмена и работы антиоксидантной системы в ткани предстательной железы экспериментальных животных

3.7.8. Нарушения работы мочевыделительной системы

3.7.9. Частота возникновения новообразований предстательной железы у экспериментальных животных

3.7.10. Гистологическое исследование тканей предстательной железы

экспериментальных животных

3.8. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели спонтанного рака молочной железы у мышей FVB/N, трансгенных по HER-2/neu

3.8.1. Показатели продолжительности жизни и выживаемости экспериментальных животных

3.8.2. Динамика роста опухолей молочных желез у экспериментальных животных

3.8.3. Оценка динамики массы тела экспериментальных животных

3.8.4. Биохимические показателей в сыворотке крови экспериментальных животных

3.8.5. Гистологическое описание опухолей молочной железы у

экспериментальных животных

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Скрининг in silico потенциальных молекулярных мишеней биологически активных веществ изучаемых экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus

4.2. Оценка экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus как потенциальных средств сопроводительной терапии в отношении перевиваемой солидной опухоли Эрлиха у мышей на фоне химиотерапии 5-фторурацилом

4.3. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы у крыс

4.4. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели доброкачественной гиперплазии молочной железы у крыс

4.5. Оценка профилактического эффекта экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели индуцированного рака предстательной железы у крыс

4.6. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели спонтанного рака молочной железы у мышей FVB/N,

трансгенных по HER-2/neu

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ШИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение А. Акт внедрения результатов диссертационного исследования

175

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus в экспериментальных моделях гиперплазии и опухолей предстательной и молочной желез»

Актуальность проблемы

В настоящее время остро стоит проблема профилактики и лечения онкологических заболеваний. В структуре общей смертности населения опухолевые заболевания занимают второе место в мире, уступая лишь сердечнососудистым заболеваниям [63]. Во всем мире в 2022 году зарегистрировано 20 млн. новых случаев злокачественных новообразований (ЗНО) и почти 10,0 млн. смертей от них) [37]. В России в 2022 г. выявлено 624 тыс. случаев ЗНО (в том числе 283 тыс. у женщин и 341 тыс. у мужчин) [141].

Одной из актуальных проблем современной медицинской биотехнологии и экспериментальной медицины в целом является поиск новых химиопрофилактических препаратов как в отношении доброкачественных, так и злокачественных новообразований. Большинство из имеющихся на рынке противоопухолевых препаратов предназначены не для профилактики, а для лечения опухолевых заболеваний и имеют серьезные побочные эффекты, среди которых основными являются различные виды токсического действия: желудочно-кишечная токсичность, гепатотоксичность, нефротоксичность, токсическое повреждение кроветворной системы, кардиотоксичность и нейротоксичность, рвота, тромбообразование, алопеция [181], поэтому существует масса ограничений их применения. В связи с этим в схему лечения вводят сопроводительные препараты, снижающие побочные эффекты (противорвотные, антитромботические, антитоксические и др.), а также с осторожностью выбирают продолжительность лечения.

Биологически активные вещества (БАВ) растительного происхождения, как правило, мало- или нетоксичны, а также обладают плейотропным действием, среди которого часто отмечают антипролиферативные свойства. Несколько исследований показали [18; 98], что БАВ, выделенные из растений, снижают побочное действие химиотерапевтических препаратов и повышают эффективность

химиотерапии [147]. Кроме того, доказано, что БАВ могут использоваться в качестве самостоятельных химиопрофилактических средств в отношении различных патологий, в том числе предопухолевых и опухолевых заболеваний [29; 30; 91; 93; 120].

Наиболее хорошо описаны в литературе свойства изофлавонов -полифенольных соединений, содержащихся в большом количестве в растениях вида Fabaceae [176], и фукоиданов - полисахаридов, выделяемых преимущественно из бурых морских водорослей [83]. Так, известно, что изофлавоны могут выступать в качестве противовоспалительных агентов: они снижают сигнальную трансдукцию, вызванную цитокинами [27]. Антиоксидантный потенциал изофлавонов высок, поскольку они имеют в своей структуре гидроксильные группы, поэтому могут переносить атом водорода на свободные радикалы, в частности активные формы кислорода (АФК), и таким образом их деактивировать [69] То же справедливо и для фукоиданов. Фукоиданы могут значительно ингибировать высвобождение N0, уровень которого в организме увеличивается во время воспалительной реакции. Фукоидан также является лигандом для макрофагального рецептора А, который может быть поглощен макрофагами и также ингибирует выработку N0. Ингибирование миграции лейкоцитов в воспалительные ткани - еще одно проявление противовоспалительной активности фукоидана. Антиоксидантная активность фукоидана обусловлена его способностью снижать накопление амилоида-в и АФК [163].

Кроме вышеперечисленных эффектов, как изофлавоны, так и фукоиданы проявляют также антикоагулянтное, антитромботическое, иммунорегуляторное, антивирусное и противовоспалительное действие [105; 142]. Таким образом, эти классы соединений имеют схожий профиль биологической активности.

Способность подавлять окислительный стресс и смягчать воспаление - два основных процесса, ассоциированных с развитием новообразований [66], позволяет считать БАВ, среди которых изофлавоны и фукоиданы, перспективными

потенциальными средствами профилактики гиперплазий и злокачественных опухолей различной локализации.

Поскольку среди наиболее часто диагностируемых онкологических заболеваний по всему миру в 2022 г. выделяли рак груди (2,3 млн. новых случаев, 665 тыс. - летальных) и рак предстательной железы (1,5 млн. новых случаев, 396 тыс. - летальных) [37], актуальной задачей является доклиническая разработка новых эффективных биологически активных препаратов изофлавонов и фукоиданов для их профилактики.

Степень разработанности темы

Разработка и оценка БАВ, выделяемых из растительного сырья, является перспективным направлением в биотехнологии, особенно в контексте применения для профилактики онкологических заболеваний. Вместе с тем многие аспекты применения in vivo таких БАВ, как изофлавоны и фукоиданы, включая их эффективность и безопасность, зависят от способа получения, что требует дальнейших исследований. Модификации способов извлечения этих БАВ направлены на увеличение выхода целевых продуктов, а также на снижение нагрузки на экологию. В этом контексте природные глубокие эвтектические растворители (ПГЭР) привлекают внимание благодаря их способности повышать растворимость трудно- или нерастворимых в воде и спиртах классов соединений флавоноидов, к которым относятся изофлавоны, и стабильность полисахаридов, к которым относится фукоидан, что подтверждается работами Dai и соавт. И Choi и соавт [44, 47]. Большинство исследований изофлавонов и фукоиданов проведены in vitro, а данные in vivo, особенно с использованием ПГЭР-экстрактов, ограничены. В связи с этим, актуальным является проведение доклинической оценки изофлавонов и фукоиданов, экстрагированных из растительного сырья с помощью ПГЭР, in vivo.

Цель исследования

Оценить эффективность ПГЭР-экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus в отношении гиперплазии и опухолей предстательной и молочной желез на in vivo моделях.

Задачи исследования

1. Провести in silico скрининг потенциальных мишеней биомолекул, идентифицированных в экстрактах, полученных из P. lobata и F. vesiculosus, с использованием природных глубоких эвтектических растворителей.

2. В пилотном опыте in vivo на модели перевиваемой солидной опухоли Эрлиха оценить эффективность изофлавонов P. lobata и фукоиданов F. vesiculosus как средств сопроводительной терапии на фоне лечения 5-фторурацилом (5-ФУ).

3. Исследовать эффективность изофлавонов P. lobata и фукоиданов F. vesiculosus в краткосрочном опыте на модели доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) in vivo.

4. Оценить эффективность изофлавонов P. lobata и фукоиданов F. vesiculosus в краткосрочном опыте на модели доброкачественной гиперплазии молочной железы (мастопатии, ДГМЖ) in vivo.

5. Изучить эффективность изофлавонов P. lobata и фукоиданов F. vesiculosus в долгосрочном опыте на модели индуцируемого рака предстательной железы in vivo.

6. Оценить эффективность изофлавонов P. lobata и фукоиданов F. vesiculosus в долгосрочном опыте на модели спонтанного рака молочной железы in vivo.

Научная новизна

Впервые проведена доклиническая оценка изофлавонов и фукоиданов, полученных по технологии экстракции c применением ПГЭР из P. lobata и F. vesiculosus. Впервые изучена эффективность смеси изофлавонов (пуэрарин, дайдзеин, генистеин, формононентин, биоханин А) из корней или цветков кудзу (P. lobata) и фукоиданов морских водорослей F. vesiculosus, на различных in vivo моделях, а именно перевиваемой солидной карциноме Эрлиха у мышей линии BALB/c; тестостерон-индуцированной гиперплазии предстательной железы у крыс линии Wistar; индуцированной эстрогеном и прогестероном доброкачественной гиперплазии молочной железы (мастопатии) у крыс линии Wistar; индуцированном N-метил-Ы-нитрозомочевиной раке предстательной железы у крыс линии Wistar; спонтанном канцерогенезе молочной железы у мышей линии FVB/N, трансгенных по гену HER-2/neu.

Теоретическая и практическая значимость

Установлено, что изофлавоны из корней кудзу (Р. lobata) способствуют снижению тяжести мукозита у мышей, развивающегося на фоне терапии 5-ФУ, не снижают эффективность химиотерапии перевиваемой опухоли Эрлиха и эффективны при применении в качестве самостоятельного химиопрофилактического средства в модели ДГПЖ у крыс. Также изофлавоны из корней кудзу (Р. lobata) могут быть рекомендованы к дальнейшей разработке для применения у пациентов с ДГПЖ. Показана безопасность пожизненного применения изофлавонов корней кудзу (Р. lobata) у крыс в опыте с индуцированным РП. Выявлена токсичность пожизненного применения фукоиданов F. vesiculosus. Доказано, что применение изофлавонов корней кудзу (Р. lobata) в случае гормонозависимой доброкачественной гиперплазии молочной железы у крыс усугубляет тяжесть этой патологии, а в отношении злокачественных опухолей молочной железы не оказывает ингибирующего эффекта.

Полученные в ходе in vivo исследований результаты внедрены в научную деятельность научной лаборатории канцерогенеза и старения ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (Акт внедрения от 14.04.2025, Приложение А).

Методология и методы исследования

В каждый эксперимент было включено достаточное для получения статистически значимых результатов число животных; сформированы необходимые для обоснования наблюдаемых эффектов контрольные группы. На каждой экспериментальной модели проводили гистологическую оценку формировавшихся новообразований, проводили расчет их частоты и, в модели с HER-2/пеи-позитивным раком молочной железы у мышей - их множественности. Проводили биохимический анализ сыворотки крови. Антиоксидантную активность исследуемых экстрактов оценивали по степени ингибирования супероксиддисмутазы, а также по изменению концентрации малонового диальдегида в образцах сыворотки крови. Механизмы действия оценивали с помощью иммуногистохимических исследований. Вывод об эффективности исследуемых экстрактов в отношении моделируемых патологий делали на основании совокупности полученных в результате лабораторных и патоморфологических исследований результатов. Использовали приемлемые методы математической статистики и подходящие критерии для обработки результатов эксперимента. Экспериментальные данные обобщены, проанализированы и сопоставлены с результатами, описанными в мировой литературе.

Положения, выносимые на защиту

1. Механизмы биологической активности изофлавонов P. lobata и фукоиданов F. vesiculosus реализуются через взаимодействие со следующими молекулярными мишенями: рецепторами воспаления (глюкокортикоидными рецепторами, циклооксигеназой-2 и т.д.), рецепторами гормонов (андрогеновыми,

рецепторами эстрогена, прогестерона), аденозиновыми рецепторами А1, А2а, эндотелиновым рецептором ЕТ-А; через ингибирование сквален-синтазы.

2. Изофлавоны из корней Р. lobata в эксперименте на мышах с перевитой солидной опухолью Эрлиха и монотерапией 5-ФУ уменьшают тяжесть проявления одного из распространенных побочных эффектов химиотерапии - мукозита, без снижения эффекта использованного цитостатика. Таким образом, изофлавоны из корней Р. lobata можно рассматривать в качестве перспективного средства сопроводительной терапии у онкологических больных.

3. Изофлавоны из корней кудзу (Р. lobata) и фукоиданы F. vesiculosus оказывают выраженное ингибирующее действие на развитие индуцированной доброкачественной гиперплазии предстательной железы у крыс. Пожизненное применение изофлавонов корней Р. lobata у крыс с индуцированным раком предстательной железы является нетоксичным: у животных увеличивается выживаемость, при этом тяжесть патологии снижается. Фукоиданы F. vesiculosus не обладают профилактическим эффектом в данной модели, кроме того, проявляют токсический эффект.

4. Изофлавоны Р. lobata усиливают тяжесть эстроген-индуцированной мастопатии у крыс, что, вероятно, обусловлено фитоэстрогенной активностью изофлавонов. Фукоиданы F. vesiculosus не влияют на развитие доброкачественной гиперплазии молочной железы. Изофлавоны Р. lobata и фукоиданы F. vesiculosus не оказывают профилактического действия в отношении спонтанного рака молочной железы у мышей FVB/N, трансгенных по HER-2/neu.

Степень достоверности результатов

Результаты диссертационного исследования являются достоверными и обоснованными ввиду использования достаточного количества экспериментального материала (опыты выполнены на 614 животных), формирования контрольных групп (интактный, негативный, позитивный контроли). Потенциальную профилактическую активность БАВ оценивали в

нескольких in vivo моделях и использовали адекватные задачам работы методы исследования. Для обработки полученных результатов применяли современные методы статистической обработки и релевантные статистические критерии.

Апробация работы

Результаты диссертационного исследования представлены на Всероссийской конференции «Биотехнологии и безопасность в техносфере» (Санкт-Петербург 2021); Алмазовском молодежном медицинском форуме (Санкт-Петербург, 2021); VII, VIII, IX Петербургском международном онкологическом форуме (Санкт-Петербург 2021-2023 гг.); Международной научно-практической конференции «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (Екатеринбург, 2021).

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда в рамках гранта № 20-65-47025.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из которых 4 статьи в научных журналах, входящих в реферативные базы ISI Web of Science и Scopus, и 7 публикаций, включенных в РИНЦ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста и включает в себя введение, 4 главы, заключение и список литературы, содержащий 186 источников. Работа проиллюстрирована 57 таблицами, 36 рисунками, 2 формулами и содержит 1 Приложение.

Личный вклад автора

Автором работы лично был проведен поиск и анализ отечественных и зарубежных литературных источников, составлен дизайн и спланированы все основные этапы экспериментальной части работы. Манипуляции с лабораторными животными, отбор проб для проведения клинического и биохимического анализов крови, а также сами анализы, статистическая обработка и интерпретация результатов исследования выполнялись автором самостоятельно. Автор принимал активное участие в подготовке публикаций.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Представленная диссертация соответствует паспорту специальности 1.5.6. Биотехнология (отрасль наук - биологические): п.9. «Медицинские биотехнологии. Создание ... биологически активных препаратов».

Благодарно сти

Автор выражает благодарность заведующему научной лабораторией канцерогенеза и старения НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова, к.с.-х.н., Федорос Елене Ивановне за консультативную поддержку. Автор также благодарит сотрудников лаборатории биотрансформационных технологий и пищевой химии УрФУ за предоставленные сведения и материалы, используемые при постановке экспериментальных исследований.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование изофлавонов и фукоиданов у человека

Содержание изофлавонов в сое как в растении, содержащем наибольшее количество изофлавонов, установлено в 1931 г., генистеин выделен в 1941 г. Впервые биологическое действие изофлавонов выявлено в 1946 г., когда H. W. Bennett с соавт. обнаружили, что бесплодие, выкидыши у выпасавшихся овец связаны с присутствием в красном клевере формононетина биоханина А. [2]. Начавшиеся после исследования других биологически активных изофлавонов: дайдзеина, дайдзина и генистеина показали, что они характеризуются низкой биодоступностью при пероральном приеме вследствие ограниченной водной растворимости и низкой проницаемости через биологические мембраны [143; 172]. Низкая биодоступность изофлавонов при пероральном введении обусловлена совокупностью факторов, связанных с их абсорбцией и метаболизмом. Гликозиды изофлавонов, являющиеся основной формой этих соединений в растениях, характеризуются низкой скоростью пассивной диффузии через эпителий кишечника, что обусловлено их гидрофильностью и большими молекулярными размерами. Агликоны, образующиеся в результате гидролиза гликозидов, хотя и обладают большей липофильностью, подвергаются интенсивному метаболизму первой фазы с образованием реактивных метаболитов, которые затем конъюгируются с глюкуроновой кислотой и сульфатом. Образовавшиеся конъюгаты активно экскретируются из энтероцитов обратно в просвет кишечника с помощью эффлюксных транспортных систем MRP2 и P-gp, что дополнительно снижает системную биодоступность изофлавонов [185].

Бурые водоросли также имеют длительную историю применения в традиционной китайской медицине для лечения различных патологических состояний [103]. Современные фармакологические исследования подтвердили терапевтический потенциал этих морских организмов. Экспериментальные данные

свидетельствуют о наличии у биоактивных соединений, в том числе фукоиданов, выделенных из Sargassum spp., широкого спектра фармакологических эффектов, включая противоопухолевый, противовоспалительный, антимикробный, антивирусный и нейропротекторный [103]. Впервые фукоидан был выделен в 1913 году из бурых водорослей Laminaria digitata, Ascophyllum nodosum и Fucus vesiculosus [125]. Фукоидан использовался в качестве противоопухолевого препарата в традиционной китайской медицине [184]. Механизмы его действия активно изучаются in vitro и in vivo.

Считается, что биодоступность фукоидана при пероральном приеме низкая [60]. Однако в рамках текущих клинических исследований изучается фармакокинетический профиль и безопасность фукоидана у человека. Исследование с использованием меченных технецием соединений фукоидана (QinicalTrials.gov, идентификатор: NCT03422055) позволяет отслеживать его распределение в организме здоровых добровольцев. Параллельно идет набор в рандомизированное двойное слепое исследование эффективности и безопасности фукоидана у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи (QinicalTrials.gov, идентификатор: NCT04597476). Полученные данные позволят получить данные об ADME (с англ. Absorption (Всасывание), Distribution (Распределение), Metabolism (Метаболизм), Excretion (Выведение) фукоидана и разработать оптимальные схемы его применения [105].

1.2. Изофлавоны 1.2.1. Химическая природа

Изофлавоны — подкласс изофлавоноидов, природных полифенольных соединений с фенилпропановым С6-С3-С6-углеродным скелетом. Изофлавоны отличаются от других классов флавоноидов наличием трехуглеродного фрагмента

у третьего атома углерода в цепи, а не у С2 кольца А. Дополнительный гетероцикл замыкается через атом кислорода и атомы С2 и С3 (Рисунок 1) [2].

Рисунок 1 - Типичная структурная формула изофлавона [69] Изофлавоны являются вторичными метаболитами растений. Эти фитохимические соединения в основном содержатся в семенах, цветках и корнях растений семейства бобовых [50]. В бобовых изофлавоны наиболее часто представлены гликозидами (Р-глюкозидами, ацетилглюкозидами и малонилглюкозидами, преимущественно в-глюкозидами), в частности, формононентином и биоханином А и агликонами: генистеином, пуэрарином, дайдзеином. В Таблица 1 представлена информация об основных изофлавонах, встречающиеся в культивируемых растениях семейства бобовых. В агликоновой форме присутствуют только 2-5% [8] .

По своей молекулярной структуре изофлавоны сходны с эстрогенными гормонами животных и человека, в частности эстрадиолом (17-в-эстрадиолом), поэтому их называют также фитоэстрогенами [46].

Таблица 1 - Основные изофлавоны растений семейства бобовые (Fabaceae)

Название

Химическая структура

Наименование по ИЮПАК

Молярная

масса,

г/моль

Пуэрарин

8-ф-0-

глюкопиранозил)-4',7-дигидроксиизофлавон

416,38

Дайдзеин

4',7-

дигидроксиизофлавон

254,23

Генистеин

4',5,7-

тригидроксиизофлавон

270,24

Продолжение табл. 1

Формонентин 7-Гидрокси-4'-метоксиизофлавон 268,26

Биоханин А 5,7-Дигидрокси-4'-метоксиизофлавон 284,27

1.2.2. Получение: источники и способы выделения и очистки

Ряд опубликованных обзоров литературы рассматривает экспериментальные данные, направленные на исследования их биосинтеза, профиля их биологической активности и распространенности в растительном сырье. Iwashina в своем обзоре обобщает данные о наличии флаваноидов, в том числе изофлавонов, в растениях [79]. Также есть обзоры, в которых рассматриваются методы выделения и идентификации новых (в период 1994-2004 гг. и 2004-2005 гг., соответственно) соединений [108; 129].

Наиболее актуальные данные представлены в обзоре Sohn и соавт. [146]. Авторы предоставляют не только общую информацию об изофлавонах как о подклассе биологически активных соединений в растениях рода бобовых, но и подробно описывают ряд структурных и регуляторных генов, участвующих в биосинтезе изофлавонов в растениях. В обзоре приводятся экспериментальные данные о введении выделенных генов в различные культурные растения для увеличения выработки изофлавонов.

Изофлавоноиды в больших количествах встречаются в растениях, принадлежащих к семействам Fabaceae и Iridaceae. Они считаются полуспецифическим хемотаксономическим маркером Fabaceae и Iridaceae, но также встречаются у представителей семейств Cupressaceae, Liliaceae, Gramineae, Polygonaceae, Ranunculaceae, Lamiaceae, Rosaceae и Apiaceae.

В большом количестве изофлавоны содержатся в сое (Glycine max L. ), красном клевере (Trifolium pratense L.), конских бобах (Vicia faba L.), пуэрарии волосянистой или иначе - кудзу (P. lobata), а также в люцерне (Medicago L.) и мятлике луговом (Poapratensis L.) и в кофейных зернах [8].

Для выделения изофлавонов из растительных источников применяются различные методы экстракции. Экстракция изофлавонов проводится по тем же принципам, что и для других полифенолов. В качестве экстрагентов традиционно используются метанол, этанол, ацетонитрил, ацетон или их смеси с водой [34].

Процесс переработки растительного сырья изменяет начальный состав изофлавонов. Несколько исследований показали, что выделение при высоких температурах приводит к изменению состава изофлавонов из-за разложения гликозидов [45; 115; 132]. Наиболее распространенными превращениями гликозидов, происходящими в процессе экстракции, являются декарбоксилирование малонилглюкозидов до ацетилглюкозидов и сложноэфирный гидролиз малонил- и ацетилглюкозидов до недоватированных глюкозидов. Поэтому метод экстракции изофлавонов должен быть тщательно продуман.

Традиционные методы простой экстракции растворителем без дополнительного источника энергии: настаивание, перколяция и мацерация все еще часто используются в фитохимических лабораториях. Перечисленные методы, а также экстракция при кипячении и экстракция в аппарате Сокслета хоть и применяются до сих пор, однако считаются устаревшими. При этом метод Сокслета до сих пор является наиболее часто используемым методом экстракции. Целевые продукты экстрагируются в растворитель из сухой смеси во время непрерывного цикла кипячения и конденсации экстрагента. В дополнение можно проводить экстракцию несколькими органическими растворителями, например, в порядке гексан, дихлорметан, этилацетат и метанол [126].

Несмотря на распространенность традиционных методов экстракции, они не решают всех проблем в области экстракции. Проведение экстракции традиционными методами требует много времени, использования большого количества токсичных органических растворителей и большого количества исходного материала. Кроме того, традиционные методы экстракции трудно автоматизировать. Они также производят значительное количество отходов, а также есть риск деградации термолабильных соединений. Современные методы экстракции лишены подобных ограничений. Для выделения изофлавонов из растительного сырья используют микроволновую экстракцию [122], ультразвуковую экстракцию [41], жидкостную экстракцию под давлением [178], сверхкритическую экстракцию [132], матричное твердофазное диспергирование [72].

Преимуществами микроволновой экстракции являются уменьшение требуемого времени для экстрагирования целевых продуктов, пониженный расхода растворителя наряду с повышенным выходом извлекаемых изофлавонов. Так, данный метод применяли Du и соавт. для одновременного извлечения сразу нескольких изофлавонов из корней P. montana var. lobata и P. thomsonii [53]. Авторами было установлено, что выход целевых соединений, экстрагированных методом микроволновой экстракции 65%-ным этанолом при 100 °С, был выше, чем

у соединений, полученных с использованием других методов (рефлюкс-экстракцией и экстракцией с обработкой ультразвуком).

Посредством ультразвуковой экстракции также можно добиться сокращения общего времени экстрагирования, но главным достоинством данного метода является отсутствие необходимости в высоких температурах. При этом полнота извлечения целевых продуктов остается высокой. Экстракция с использованием ультразвука применяется для извлечения изофлавонов из таких растительных источников, как василька синего (C. cyanus L.) [9], черемухи (P. avium Mill.) [3], гречихи посевной (F. sagittatum Gilib.) [1], вишни (Prunus cerasus L.) [15], бобов мунг (V. radiata) [127].

Жидкостная экстракция под давлением используется для извлечения изофлавонов из лекарственных растений, например корней и листьев женьшеня обыкновенного (Panax ginseng) [128].

В основе метода сверкритической флюидной экстракции лежит использование веществ в сверхкритическом состоянии в качестве экстрагентов. В среде такого флюида интенсифицируется массоперенос, поэтому экстрагент легко проникает в сырье, и эффективность выхода целевых продуктов увеличивается [113]. Этот метод применяли для экстракции изофлавоно из гинко билоба (G. biloba L.) [100], корней кудзу (P. montana var. L.) [161], листьев мяты (M. spicataL.) [32].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ермакова Елена Дмитриевна, 2025 год

. - - 1

\ ' I ' Г»

щ ШШ

В

Рисунок 24 — Репрезентативные микрофотографии отделов предстательной железы интактных самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта корней кудзу (Р. 1оЬаХа) в модели рака предстательной железы

Окрашивание гематоксилином и эозином, увеличение 200х. А — дорсолатеральный отдел предстательной железы; Б — вентральные доли предстательной железы; В — передние доли предстательной железы

В опытных группах у всех животных в предстательной железе развилась гиперплазия, которая была выявлена во всех отделах. Изменения включали нарушение структуры ацинусов (ацинусы неправильной формы с папиллярными выростами и крибриформными разрастаниями ткани в просветах), разрастание стромы, атипию и гипертрофию эпителиальных клеток, потерю полярности клетками (многочисленные участки с многорядным и многослойным эпителием), повышение митотической активности. Для передних отделов предстательной

железы были характерны крибриформные разрастания эпителия, практически полностью занимающие просвет ацинуса (Рисунок 25).

Рисунок 25 — Репрезентативные микрофотографии отделов предстательной железы самцов крыс Wistar с выраженной гиперплазией в исследовании эффективности экстракта корней кудзу (Р. 1оЬаХа) в модели рака предстательной

железы

Окрашивание гематоксилином и эозином, увеличение 200х. А — дорсолатеральный отдел предстательной железы; Б — вентральные доли предстательной железы; В — передние доли предстательной железы

Злокачественные изменения в тканях отделов предстательной железы экспериментальных животных приведены на рисунке (Рисунок 26). Опухоли были представлены преимущественно аденокарциномами умеренной или высокой степени дифференцировки и характеризовались выраженной ядерной атипией, высокой митотической активностью и инвазивным ростом.

ЖЖ ••• • • Л н ьйигг** мл А1'1'/!. " -ч р ' • ■ ■ > Ь нГ к;: , . й . ' :: ШЩ '■'' - . V .." . V 3"."* 7« » *' : •' йЩ^'Ъ/■ ?:.; И» у.. У'-: К . ,<; Л" - " : :

А Б в

Рисунок 26 — Репрезентативные микрофотографии отделов предстательной железы самцов крыс Wistar с карциномами в исследовании эффективности экстракта корней кудзу (Р. lobata) в модели рака предстательной железы

Окрашивание гематоксилином и эозином, увеличение 200х. А — умеренно дифференцированная аденокарцинома дорсолатерального отдела; Б — умеренно дифференцированная аденокарцинома вентральных долей; В — низкодифференцированная аденокарцинома дорсолатерального отдела

3.6.11.

Частота возникновения новообразований предстательной железы у экспериментальных животных

В группе 1ИК не было обнаружено случаев опухолей предстательной железы. У животных в группах с индуцированной патологией частота возникновения новообразований была значимо выше и достигла 37% в обеих группах: негативном контроле и с применением экстракта корней кудзу (Р. 1оЬаХа) (Таблица 41). В дорсолатеральном отделе предстательной железы новообразования возникали в 30% у крыс группы 2РП, в 33% у животных в группе 3ИЗФ-КК. Опухоли предстательной железы обнаруживались с меньшей частотой в вентральных долях, без значимых различий между группами с индуцированным РП. В передних долях предстательной железы опухоли не были обнаружены ни в одной группе.

Таблица 41 — Частота возникновения новообразований предстательной железы и ее долей у самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта корней кудзу (Р. 1оЬаХа) в модели рака предстательной железы, п (%)

Группа ДП ВП ПП Вся ПЖ

Кол-во животных с новообразованиями % животных с новообразованиями Кол-во животных с новообразованиями % животных с новообразованиями Кол-во животных с новообразованиями % животных с новообразованиями Кол-во животных с новообразованиями % животных с новообразованиями

1ИК, П = 31 0 0 0 0 0 0 0 0

2РП, П = 30 9 30 5 17 0 0 11 37

3ИЗФ-КК, п = 27 9 33 4 15 0 0 10 37

Примечания: ДП — дорсолатеральный отдел предстательной железы ВП — вентральные доли предстательной железы ПП — передние доли предстательной железы ПЖ — предстательная железа Курсив — различия с 1ИК статистически значимы ф < 0,05, точный критерий Фишера)

3.6.12. Иммуногистохимическое окрашивание тканей вентральных долей предстательной железы экспериментальных животных

Выявлено интенсивное окрашивание антителами к андрогеновому рецептору (AR) ядер эпителиальных и стромальных клеток (Рисунок 27).

ч

ч ч.

,ч

В Г

Рисунок 27 — Результаты окрашивания ткани предстательной железы самцов крыс Wistar к андрогеновому рецептору и фактору про лиферации в исследовании эффективности экстракта корней кудзу (Р. 1оЬаХа) в модели рака предстательной

железы антителами

А - доля ядер, позитивно окрашенных антителами к андрогеновому рецептору АК; Б - доля ядер, позитивно окрашенных антителами к фактору пролиферации H3Ser10; В - Репрезентативная микрофотография предстательной железы крыс-самцов в исследовании эффективности экстракта корней кудзу (Р. lobata) на модели рака предстательной железы, иммуногистохимическое окрашивание антителами к АК х200; Г - Репрезентативная микрофотография предстательной железы крыс-самцов в исследовании эффективности экстракта на раке предстательной железы, иммуногистохимическое окрашивание антителами к H3Ser10, х200; стрелками обозначены позитивно окрашенные ядра

Статистически значимых различий в соотношении AR-положительного окрашивания во всех группах обнаружено не было. Количество клеток, положительных по маркеру пролиферации H3Ser10, увеличивалось при индукции РП. Применение экстракта корней кудзу (P. lobata) нормализовало этот показатель, но вследствие высокой вариабельности различия не достигли порога достоверности.

3.7. Оценка профилактического эффекта экстракта Fucus vesiculosus в модели индуцированного рака предстательной железы у крыс

3.7.1. Показатели выживаемости экспериментальных животных

Эксперимент завершили по достижении 50%-ной гибели животных в группе 4Fuc.v. Всего опыт продлился 49 недель. Первая опухоль, подтвержденная гистологическим исследованием, была обнаружена в группе 3Fuc.v на 159 день эксперимента. Кривые динамики выживаемости животных представлены на рисунке (Рисунок 28).

Как и ожидалось, развитие индуцируемой патологии сопровождалось статистически значимым снижением выживаемости по сравнению с животными интактного контроля (p < 0,05, логранговый критерий). Использование исследуемого экстракта также не приводило к изменению общей выживаемости: она была статистически значимо ниже в сравнении с контрольным значением и не отличалась от значения в негативном контроле. Гибель более 50% животных была достигнута только в группе животных, получавших экстракт F. vesiculosus., на 354-й день после начала опыта и составила 50,0%, что статистически значимо отличалось от показателя для 1ИК (5,0%, p < 0,001, точный тест Фишера). Доля не доживших до окончания эксперимента животных в группе негативного контроля статистически значимо не отличалась от таковой у интактных животных и составляла: 30,77% (p = 0,0572, точный тест Фишера).

=

н

о 100-

<Я

м

S 75-

£

л

м

н

= 50-

я

о

Л

в 25-

1ИК 2РП 3Fuc.v.

—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i 0 50 100 150 200 250 300 350 400

Продолжительность опыта, сутки

Рисунок 28 - Кривые выживаемости самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Очевидно, что пусть различия формально и не достигали статистической значимости, имелась явная тенденция более частой гибели. Статистически значимых различий по показателю доли погибших животных между группой 2РП и группой, в которых животные получали исследуемый экстракт, не было.

3.7.2. Динамика массы тела экспериментальных животных

Результаты мониторинга массы тела животных в течение 49 недель эксперимента подтверждают сделанный ранее вывод о том, что использованные экспериментальные процедуры (хирургическая кастрация, введение нагрузочной дозы тестостерона; инъекция канцерогена - Ы-нитрозо-Ы-метилмочевины — и далее поддерживающие еженедельные инъекции тестостерона) приводили к существенному замедлению набора массы тела животных. Так, начиная с первой недели опыта и по 49-ю неделю наблюдали статистически значимое снижение массы тела экспериментальных животных во всех группах по сравнению с интактным контролем (Таблица 42, Рисунок 29).

Таблица 42 - Масса тела самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы, г

Неделя Группа

опыта 1ИК 2РП 3Fuc. V.

-1* 347±6 322±4 323±5

1 370±6 341±5 343±5

3 385±7 342±5 349±5

5 402±7 350±6 357±6

9 408±7 347±6 359±6

11 420±7 350±6 367±7

14 427±8 358±6 365±7

17 441±9 368±7 374±8

19 459±11 381±7 383±8

22 480±12 385±7 384±7

27 498±14 393±7 395±9

36 520±16 406±8 410±8

39 519±17 408±9 412±9

44 519±19 409±8 424±9

49 537±10 412±9 383±11

Примечание: * —14 дней до введения канцерогена Данные представлены в виде M±SEM Курсив — различия с 1ИК статистически значимы (р < 0,05, двухфакторный ANOVA с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету)

Продолжительность опыта, недели

Рисунок 29 - Динамика массы тела самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы, г

(M±SEM)

3.7.3. Масса внутренних органов экспериментальных животных

Установлено, что индукция рака предстательной железы влияла на абсолютные массы печени и почек (Таблица 43). Так, масса печени в группе интактного контроля составляла 14883,83±809,58 мг, в то время как у животных с индуцированной патологией она была статистически значимо снижена. В частности - в группе негативного контроля в 1,27 раз (до 11675±448,27 мг, р < 0,01), в группе, получавшей экстракт и из F. vesiculosus. - в 1,18 раз (до 12519,85±469,43 мг, р < 0,05). Масса почек в опытных группах, напротив, была статистически значимо выше по сравнению с контрольным значением. Различий по массе сердца и селезенки между контрольной и опытными, а также внутри опытных групп не обнаружено.

Таблица 43 - Абсолютная масса органов самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы, мг

Группа Печень Почки Сердце Селезенка

1ИК 14883,83±809,58 2620,67±92,89 1461,33±67,05 1264,67±73,70

2РП 11675±448,27 2900,11±78,51 1355,28±28,61 1359,5±94,83

3Fuc.v. 12519,85±469,43 3304,08±186,70 1429,77±86,43 1626,38±183,53

Примечания: Данные представлены в виде M±SEM Курсив - различия с 1ИК статистически значимы (р < 0,05, непараметрический аналог однофакторного ANOVA - тест Краскела-Уоллиса с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Данну)

При анализе массовых коэффициентов внутренних органов обнаружено, что различия между таковыми по печени пропали у контрольной группы и групп с патологией вследствие разнящихся масс тела перед эвтаназией. При этом массовые индексы почек животных с индуцированным РП статистически значимо превышали контрольное значение (0,49±0,02, р < 0,01). Статистически значимое повышение в сравнении с группой 1ИК зафиксировано также в массовых коэффициентах сердца и печени у животных всех опытных групп. Усредненные результаты для животных всех групп приведены в таблице (Таблица 44).

Таблица 44 - Массовые коэффициенты органов самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы, %

Группа Масса в день эвтаназии, г Печень Почки Сердце Селезенка

1ИК 537,7±11,9 2,77±0,15 0,49±0,02 0,27±0,01 0,24±0,01

2РП 412,1±9,0 2,82±0,06 0,7±0,01 0,33±0,01 0,33±0,02

3Fuc.v. 422,2±13,6 2,98±0,12 0,8±0,06 0,34±0,02 0,39±0,04

Примечания: Данные представлены в виде M±SEM Курсив - различия с 1ИК статистически значимы Полужирный — различия с 2РП статистически значимы

3.7.4. Масса предстательной железы экспериментальных животных

Массы ПЖ и ее долей: дорсолатерального отдела, вентральных долей и передних долей были статистически значимо выше в группах животных с индуцированным РП в сравнении с интактными животными (Таблица 45). Так, у животных негативного контроля масса цельной ПЖ была больше, чем в интактном контроле, в 3 раза и составила 3216,17±124,97 мг ^ 1064,83±140,54 мг в 1ИК, р < 0,001). Для животных, получавших исследуемый экстракт, не наблюдали значимого снижения этого показателя относительно 2РП. Напротив, применение экстракта из F. vesiculosus приводило к увеличению массы органа до 3585,5±209,86 мг.

При анализе значений масс ДП установлено, что применение экстракта F. vesiculosus приводило к увеличению этого показателя даже относительно негативного контроля. Такая картина обусловливается наличием макроскопически выраженных новообразований у животных, получавших исследуемые препараты, в данном отделе органа.

Таблица 45 - Абсолютная масса цельной предстательной железы и ее долей у самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы, мг

Группа ДП ВП ПП Вся ПЖ

1ИК 550,17±57,06 381,33±67,22 133,33±23,79 1064,83±140,54

2РП 1689,33±81,29 1182,44±107,53 344,39±27,88 3216,17±124,97

3Fuc.v. 1755,8±206,72 1373,18±85,8 413,18±75,05 3585,5±209,86

Примечания: ДП — дорсолатеральная доля предстательной железы; ВП — вентральные доли предстательной железы; 1111 — передние доли предстательной железы; ПЖ — предстательная железа Данные представлены в виде M±SEM Курсив - различия с 1ИК статистически значимы; (р < 0,05, непараметрический аналог однофакторного ANOVA - тест Краскела-Уоллиса с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Данну)

Выявлено значимое повышение массовых индексов всех отделов предстательной железы, а также цельного органа в опытных группах относительно интактных животных (Таблица 46). При этом исследуемый экстракт не проявил профилактического эффекта: в группах с терапией не было обнаружено статистически значимых различий с негативным контролем, и массовые индексы были даже выше. Все вышеописанное указывает на достоверность индукции патологии.

Таблица 46 - Массовые коэффициенты предстательной железы и ее долей у самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы, % (М±т)

Группа Масса в день эвтаназии, г ДП ВП ПП Вся ПЖ

1ИК 537,7±11,9 0,1±0,01 0,07±0,01 0,02±0 0,2±0,03

2РП 412,1±9,0 0,41±0,02 0,29±0,03 0,08±0,01 0,79±0,03

3Fuc.v. 422,2±13,6 0,4±0,03 0,31±0,02 0,09±0,02 0,82±0,03

Примечания: ДП — дорсолатеральная доля предстательной железы ВП — вентральные доли предстательной железы ПП — передние доли предстательной железы ПЖ — предстательная железа Данные представлены в виде M±SEM Курсив - различия с 1ИК статистически значимы (р < 0,05, непараметрический аналог однофакторного ANOVA - тест Краскела-Уоллиса с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Данну)

3.7.5. Клинические показатели периферической крови экспериментальных животных

На четвертый месяц проведения эксперимента не было выявлено статистически значимых различий в крови животных контрольных и опытных групп. Усредненные результаты представлены в таблице (Таблица 47).

Таблица 47 - Показатели клинического анализа крови самцов крыс Wistar через 4 месяца после введения канцерогена в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Группа Лейкоциты, 109кл/л Лимфоциты, 109кл/л Моноциты, 109кл/л Гранулоциты, 109кл/л Эритроциты, 1012кл/л Гемоглобин, г/л Гематокрит, % Тромбоциты, 109кл/л МСНС, г/л

1 ИК 14,3±1,9 9,5±1,3 0,5±0,1 4,3±0,6 10,1±0,2 180±2 53,0±0,8 812±55 339±2

2 РП 13,8±0,7 7,5±0,4 0,5±0,01 5,8±0,5 9,5±0,2 171±3 50,4±0,8 669±35 339±3

3Fuc.v. 13,1±2,1 7,9±1,6 0,4±0,07 4,8±0,6 9,2±0,3 168±4 48,9±1,0 719±75 343±3

Примечание: Данные представлены в виде М±SEM

На 8 месяц эксперимента при гематологическом анализе (Таблица 48) у экспериментальных животных выявлены признаки развития воспаления, а именно - повышение уровня содержания лейкоцитов, преимущественно за счет гранулоцитарной фракции. У крыс наблюдали значимое повышение: в группе негативного контроля до 7,93±1,04, (р < 0,01), в группе, получавшей экстракт F. vesiculosus. - до 6,83±1,22 (р < 0,05).

Также обнаружено статистически значимое снижение средней концентрации гемоглобина в эритроците (МСНС) в крови крыс всех групп с патологией в сравнении с интактными животными. Так, у крыс из группы 1ИК МСНС составляла

342±4 г/л, а в группе негативного контроля данный показатель снижался до 328±2 г/л (р < 0,01). У животных, которым вводили фукоиданы из F. vesiculosus., данный показатель снижался до 315±4 г/л (р < 0,0001), и это было наибольшим падением концентрации МСНС в сравнении с контрольным значением.

Таблица 48 - Показатели клинического анализа крови самцов крыс Wistar через 8 месяцев после введения канцерогена в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosusна модели рака предстательной железы

Группа Лейкоциты, 109кл/л Лимфоциты, 109кл/л Моноциты, 109кл/л Гранулоциты, 109кл/л Эритроциты, 1012кл/л Гемоглобин, г/л Гематокрит, % Тромбоциты, 109кл/л МСНС, г/л

1 ИК 12,8±1,3 8,2±0,8 0,4±0,1 4,1±0,5 9,4±0,2 171±2 49,9±0,5 826±101 342±4

2 РП 15,4±1,3 6,9±0,4 0,6±0,1 7,9±1,0 9,2±0,1 163±2 49,55±0,7 645±42 328±2

3Fuc.v. 16,8±1,7 9,3±1,5 0,9±0,1 6,8±1,2 8,9±0,3 156±5 49,6±1,3 672±65 315±4

Примечания: Данные представлены в виде M±SEM Курсив — различия с 1ИК статистически значимы (р < 0,05, непараметрический аналог однофакторного ANOVA - тест Краскела-Уоллиса с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Данну)

Гематологический анализ крови (Таблица 49) крыс в конце эксперимента (343 день) выявил тромбоцитопению во всех группах с индуцируемой патологией наблюдали, что согласуется с результатами, полученными в первой серии опытов с индукцией РП, и позволяет сделать вывод о том, что модель достоверна. При этом, равно как и в сравнении с первой серией, статистической значимости различия по показателю концентрации тромбоцитов в крови экспериментальных животных, не достигали. Так в сравнении с интактным контролем, у которого концентрация тромбоцитов была 786±141 кл 109/л, в группе негативного контроля она понижалась до 590±108 кл/109/л, что было наибольшим проявлением тромбоцитопении. У животных, получавших исследуемый экстракт, уровень тромбоцитов был несколько выше, чем у крыс без терапии. Различий по другим исследуемым параметрам крови у животных не выявлено.

Таблица 49 - Показатели клинического анализа крови самцов крыс Wistar через 12 месяцев после введения канцерогена в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Группа Лейкоциты, 109кл/л Лимфоциты, 109кл/л Моноциты, 109кл/л Гранулоциты, 109кл/л Эритроциты, 1012кл/л Гемоглобин, г/л Гематокрит, % Тромбоциты, 109кл/л МСНС, г/л

1 ИК 9,4±0,9 5,5±0,5 0,3±0,04 3,6±0,6 8,7±0,3 153±5 45,4±1,5 786±141 338±2

2 РП 10,8±1,6 5,5±0,9 0,4±0,07 4,9±0,7 8,9±0,2 157±5 46,9±1,4 590±108 334±6

3Fuc.v. 12,7±2,3 5,3±0,7 0,4±0,06 6,9±1,8 8,6±0,3 148±6 43,5±1,9 650±116 341±1

Примечания: Данные представлены в виде M±SEM (p > 0,05, непараметрический аналог однофакторного ANOVA - тест Краскела-Уоллиса с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Данну)

3.7.6. Состояние минерального обмена и работы антиоксидантной системы в сыворотке крови экспериментальных

животных

Индукция РП вызывала снижение активности СОД (в 1,75 раза) и повышение уровня МДА (в 1,55 раза) по сравнению с интактным контролем до 57±2,4 % и 27,92±1,20 мкмоль/1*1012 эритроцитов, соответственно. Применение экстракта F. vesiculosus, оказывало прооксидантное воздействие: концентрации СОД статистически значимо снижалась до 79,0±2,6 относительных единиц активности, концентрации МДА - повышалась до 33,96±2,19 мкмоль/1*1012 эритроцитов как в сравнении с 1ИК, так и в сравнении с 2РП (p < 0,05, однофакторный ANOVA). Также отмечено заметное снижение уровня кальция в сыворотке крови, и, как следствие, снижение соотношения Ca/Mg, в том числе на фоне применения экстракта F. vesiculosus. (Таблица 50).

Таблица 50 — Показатели активности антиоксидантной системы и содержания макроэлементов в сыворотке крови самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Группа Железо, мкмоль/л Кальций, ммоль/л Магний, ммоль/л Кальций/ Магний Фосфор, ммоль/л СОД, отн. акт., % МДА, мкмоль/ 1*1012 эритроцитов

1 ИК 22,10±1,22 2,45±0,17 0,73±0,02 3,32±0,05 1,64±0,06 100,0±0,3 21,88±0,69

2 РП 28,14±1,40 1,98±0,30 0,78±0,05 2,49±0,32 1,20±0,26 57,0±2,4 27,92±1,20

3Fuc.v. 23,84±1,04 1,85±0,12 0,78±0,04 2,41±0,07 1,61±0,08 79,0±2,6 33,96±2,19

Примечания: Данные представлены в виде M±SEM Курсив — различия с 1ИК статистически значимы Полужирный — различия с 2РП статистически значимы (р < 0,05, однофакторный ANOVA с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету)

3.7.7. Состояние минерального обмена и работы антиоксидантной системы в ткани предстательной железы экспериментальных животных

Развитие РП приводило к значимому снижению активности СОД в среднем на 24,1%, повышению содержания кальция в среднем в 2,18 раз. Соотношение содержания кальция к магнию в ткани предстательной железы в экспериментальных группах по сравнению с группой 1ИК было статистически значимо повышенным. Содержание магния не отличалось значимо между группами (Таблица 51).

Таблица 51 — Показатели относительной активности супероксиддисмутазы и содержания макроэлементов в ткани предстательной железы самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Группа СОД, отн. акт., % Кальций, мкмоль/г белка Магний, мкмоль/г белка Кальций/Ма гний

1 ИК 100,6±2,3 5,64±0,27 18,76±2,03 0,32±0,04

2 РП 74,6±4,5 11,96±0,5 18,78±1,85 0,67±0,08

3Fuc.v. 77,2±2,2 12,68±0,28 17,26±1,60 0,76±0,08

Примечания: СОД — супероксиддисмутаза Данные представлены в виде M±SEM Курсив — различия с 1ИК статистически значимы (p < 0,05, однофакторный ANOVA с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету)

3.7.8. Нарушения работы мочевыделительной системы

В группе интактного контроля не было обнаружено животных с задержкой мочи отмечено (Таблица 52).

Из 24 животных с индуцированным раком предстательной железы задержка мочи была отмечена у шести особей (23,03%), что статистически отличалось от контрольного значения ф = 0,0287, точный критерий Фишера). В группе с применением экстракта водорослей F. vesiculosus. задержка мочи была у 7,69%

животных (р = 0,4976, точный критерий Фишера). Различий между группами с индуцированным раком предстательной железы не обнаружено.

Таблица 52 - Частота развития задержки мочи у самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Группа Кол-во эффективных животных % животных с задержкой мочи

Суммарное С задержкой мочи

1 ИК 20 0 0

2 РП 26 6 23,07

3Fuc.v. 26 2 7,69

Примечания: Курсив — различия с 1ИК статистически значимы ф < 0,05, точный критерий Фишера)

3.7.9. Частота возникновения новообразований предстательной железы у

экспериментальных животных

В группе 1ИК не было обнаружено случаев опухолей предстательной железы. У животных в группах с индуцированной патологией частота возникновения новообразований была значимо выше и достигла 37% и 32% для новообразований всех отделов предстательной железы суммарно в группах 2РП, и 3Fuc.v., соответственно (Таблица 53). В дорсолатеральном отделе предстательной железы новообразования возникали в 33% у крыс группы 2РП и 29% у крыс в группе 3Fuc.v. В вентральной и передней долях предстательной железы опухоли возникали гораздо реже - не более 4% для каждой локализации. Значимых различий между группами с индуцированным РП обнаружено не было.

Таблица 53 - Частота возникновения новообразований предстательной железы у самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Локализация Группа

1ИК 2РП 3Fuc. V.

ДЛП 0 (0%) 10 (33%) 8 (29%)

ВП 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

ПП 0 (0%) 1 (3%) 1 (4%)

Всего 0 (0%) 11 (37%) 9 (32%)

Примечание: ДЛП - дорсолатеральный отдел предстательной железы ВП - вентральные доли предстательной железы ПП - передние доли предстательной железы Курсив — различия с 1ИК статистически значимы (р < 0,05, точный тест Фишера)

3.7.10. Гистологическое исследование тканей предстательной железы

экспериментальных животных

У животных из группы интактного контроля в дорсолатеральном и вентральном отделе наблюдали ацинусы в основном правильной формы, с небольшими выростами в просвет. Эпителий состоял почти во всех ацинусах из одного слоя поляризованных клеток цилиндрического, кубического или плоского типа. Как и в первой серии опыта, обнаруживались участки с диспластическими и гиперпластическими изменениями эпителия, соответствующие нормальным возрастным изменениям в предстательной железе.

Передние доли отличались более крупными ацинусами с многочисленными разветвленными папиллярными выростами в просвет. Эпителий (преимущественно цилиндрический, местами многослойный) состоял из крупных клеток с обильной цитоплазмой, что указывало на высокую секреторную активность (Рисунок 30).

им

щ /

Л

39Г ^

'РУ* _ мйшЯ

Ж*Е £ Л.**

А

Б

В

Рисунок 30 - Репрезентативные микрофотографии отделов предстательной железы интактных самцов крыс Wistar в исследовании эффективности экстракта Р. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 200х; А — дорсолатеральный отдел предстательной железы; Б — вентральные доли предстательной железы; В — передние доли предстательной железы

У всех животных после индукции РП во всех отделах обнаруживались гиперпластические изменения, характерные для этой модели: изменение формы ацинусов (неправильной формы, с папиллярными выростами и крибриформными разрастаниями ткани), изменение числа слоев эпителия с атипией и гипертрофией клеток, утолщение стромы, повышение митотической активности. Передние доли характеризовались разрастаниями эпителия. Картина изменений соответствовала тому, что наблюдали в опыте по оценке профилактического действия экстракта корней кудзу (Р. 1оЬаХа) на индуцированный РП (Рисунок 31).

• • <ь М. ¿У * • -УА" ч

л|

%

. • ' - • А Л Ж : ' У:

Л

Б

Рисунок 31 - Репрезентативные микрофотографии отделов предстательной железы самцов крыс Wistar с выраженной гиперплазией в исследовании эффективности экстракта ¥. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 200х; А — дорсолатеральный отдел предстательной железы; Б — вентральные доли предстательной железы; В — передние доли предстательной железы

Злокачественные изменения выявлены преимущественно в дорсолатеральном и вентральном отделах предстательной железы и представляли собой практически во всех случаях аденокарциномы (низкой, умеренной или высокой степени дифференцировки). Репрезентативные микрофотографии представлены на рисунке (Рисунок 32). Опухолевые клетки характеризовались выраженной ядерной атипией, высокой митотической активностью и инвазивным ростом.

&ЖШ9Ж

■ -

№

- ■ - ; • .;. . :

t.- W. , A V ' 7 ^r . - ' ___N®

■ * ' S-*-

5S

4 S® «mv IШШ „

д ' &«• ■ ¡4 • i .. ••

л ■ ■■

А Б В

Рисунок 32 - Репрезентативные микрофотографии отделов предстательной железы самцов крыс Wistar с карциномами в исследовании эффективности экстракта F. vesiculosus в модели рака предстательной железы

Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 200х; А — высокодифференцированная аденокарцинома вентрального отдела; Б — умеренно дифференцированная аденокарцинома дорсолатерального отдела; В —низкодифференцированная аденокарцинома дорсолатерального отдела

3.8. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели спонтанного рака молочной железы у мышей

FVB/N, трансгенных по HER-2/neu

3.8.1. Показатели продолжительности жизни и выживаемости экспериментальных животных

Средняя продолжительность жизни (СПЖ) и медиана выживаемости животных в группах с терапией исследуемыми экстрактами статистически значимо не отличалась от контрольного значения (Таблица 54). Опытные группы не

отличались статистически значимо по показателю выживаемости от контрольной (Рисунок 33).

Таблица 54 - Параметры продолжительности жизни самок мышей FVB/N, трансгенных по гену HER/2-neu, в исследовании эффективности экстракта корней Р. lobata и экстракта F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы

Группа СПЖ, сут Медиана, сут

1ИК 278,62±5,2 283

2ИЗФ-КК 279,8±6,0 280

3Fuc.v. 270,6±4,1 265

Продолжительность опыта, недели

Рисунок 33 - Кривые выживаемости самок мышей FVB/N, трансгенных по гену HER/2-neu, в исследовании эффективности экстракта корней Р. lobata и экстракта F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы

3.8.2. Динамика роста опухолей молочных желез у экспериментальных

животных

Первые пальпируемые узлы на молочных железах были обнаружены на 134140 день жизни животных. К 199-200 дню по крайней мере у одного животного из каждой группы развились опухолевые узлы объемами от 40 мм3 до 1666 мм3.

Массовый выход множественных спонтанных опухолей молочной железы начался на 6 месяц жизни (Таблица 55).

Таблица 55 - Параметры развития опухолей молочной железы у самок мышей FVB/N, трансгенных по гену HER/2-neu, в исследовании эффективности экстракта корней Р. lobata и экстракта F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы

Группа Срок обнаружения 1 -й ОМЖ, сутки Средний диаметр опухоли*, мм3 Средний объём опухоли*, мм3

1ИК 186,5±4,8 15,7±0,4 1613,0±152,1

2ИЗФ-КК 200,0±4,0 16,8±0,6 1663,0±146,8

3Fuc.v. 199,0±2,9 15,6±0,6 1491,0±110,5

Примечание: Данные представлены в виде (M±SEM) ** значения на 23-й неделе наблюдения

При сравнении результатов замеров опухолей на 23-й неделе наблюдения за животными, когда был зафиксирован выход массовых опухолей у всех животных в каждой группе, установлено, что статистически значимых различий ни по показателю среднего диаметра опухолей, ни по показателю среднего объема опухолей нет (однофакторный ANOVA, р > 0,05).

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии модифицирующего влияния исследуемых экстрактов на финальные линейные размеры и объемы спонтанных опухолей молочной железы.

По результатам оценки кумулятивной частоты развития ОМЖ (Рисунок 34) можно сделать заключение о наличии некоторого положительного эффекта у используемых экстрактов, которые в среднем на 13-14 дней задерживали появление новообразований; однако, наблюдаемые различия не достигали уровня статистической значимости с контрольным значением (логранговый критерий, р > 0,05 по сравнению с 1ИК).

Рисунок 34 - Кумулятивная частота развития ОМЖ у самок мышей FVB/N, трансгенных по гену HER/2-neu, в исследовании эффективности экстракта корней Р. lobata и экстракта F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы

3.8.3. Оценка динамики массы тела экспериментальных животных

49

«

п

н «

и и

Мониторинг массы тела экспериментальных животных проводился в течение недель опыта. (Таблица 56,

40-1

35-

30-

25-

20-

1.ИК

2. ИЗФ-ЦК

3. Бис.у.

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

-1 12356789 101213141516171820222327323538434649

Продолжительность опыта, недели

Рисунок 35). В течение первых трех недель опыта не обнаруживалось статистически значимых различий в показателях массе тела между группами. На

пятой неделе наблюдения у животных, получавших экстракт F. vesiculosus, масса тела статистически значимо уменьшалась до 24,5±1,1 г ^ 27,7±1,5 г в 1ИК, р < 0,05), а у животных, которым вводили экстракт корней кудзу (Р. lobata) — до 24,9±0,8 г (р < 0,05). Далее масса тела животных выровнялась и вновь не различалась между группами существенно до 23 недели. После 23 недели наблюдали рост массы тела мышей во всех группах, что связано с одновременным активным приростом объема опухолей.

Таблица 56 - Масса тела самок мышей FVB/N, трансгенных по гену HER/2-neu, в исследовании эффективности экстракта корней Р. lobata и экстракта F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы, г

Неделя опыта 1ИК 2ИЗФ-КК 3Fuc.v.

1 23,8±1,) 23,1±0,4 23,2±0,4

2 22,1±0,7 22±0,2 22,3±0,3

3 23,5±0,5 22,2±0,4 22,4±0,4

5 27,7±1,5 24,9±0,8 24,5±1,1

6 25,9±0,5 24,4±0,4 24,3±0,4

7 25,6±0,5 24,4±0,4 24,1±0,4

8 26±0,5 24,5±0,5 24,1±0,4

9 25,5±0,5 24±0,4 23,9±0,4

10 25,7±0,5 24,7±0,4 24,4±0,4

12 26,3±0,4 25,5±0,5 25,4±0,4

13 26,3±0,5 25,5±0,4 25,2±0,4

14 26,5±0,4 25,6±0,4 25,5±0,5

15 26,8±0,5 26,5±0,5 26±0,5,0

16 25,3±0,9 25,5±0,5 25,8±0,4

17 27±0,5 26±0,5 26,2±0,5

18 27,9±0,6 26,3±0,7 26,8±0,5

20 25,9±0,8 25,5±0,9 25,7±0,9

22 28,1±1,0 27,1±1,0 26,9±0,9

23 29,4±1,3 26,4±1,5 27,4±0,9

27 32,2±2,0 30,1±2,0 29,3±1,1

32 30,9±2,2 29,6±2,6 32,4±1,9

35 30,5±1,6 28,2±2,0 27,1±1,3

38 31,6±1,6 28±1,8 28,2±2,1

43 33,2±2,0 28,8±1,2 28,5±1,1

Продолжение табл. 56

Неделя опыта 1ИК 2ИЗФ-КК 3Fuc.v.

46 35,8±2,1 31,3±0,8 31,8±1,4

49 37,7±2,0 34,6±1,0 34,9±1,8

Примечание: Данные представлены в виде M±SEM; Курсив - различия с 1ИК статистически значимы (р < 0,05, двухфакторный ANOVA с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету))

«

п «

н «

и и

40п

35-

30-

25-

20-

1.ИК

2. ИЗФ-ЦК

3. Бис.у.

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

-1 12356789 101213141516171820222327323538434649

Продолжительность опыта, недели

Рисунок 35 - Динамика массы тела самок мышей FVB/N, трансгенных по гену HER/2-neu, в исследовании эффективности экстракта корней Р. lobata и экстракта F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы, г (M±SEM)

Начиная с 32 недели опыта, динамика массы тела определялась соотношением выбывания из эксперимента животных с крупными опухолями и ростом опухолей у оставшихся. В целом результаты показывают, что исследуемые экстракты не оказали статистически значимого эффекта на изменение массы животных.

3.8.4. Биохимические показателей в сыворотке крови экспериментальных

животных

Биохимический анализ показателей обмена показал, что применение всех исследуемых экстрактов не оказало значимого влияния на содержание в сыворотке крови как глюкозы, так и триглицеридов и холестерина (Таблица 57).

Таблица 57 - Показатели биохимического анализа крови у самок мышей FVB/N, трансгенных по НЕЯ-2/пеи, в исследовании эффективности экстракта корней Р. lobata и экстракта F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы

Группа Триглицериды, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л Холестерин, ммоль/л

1ИК 1,10 ± 0,17 7,90 ± 0,55 2,90 ± 0,45

2ИЗФ-ЦК 1,04 ± 0,23 8,06 ± 0,43 3,29 ± 0,49

3Fuc.v. 0,90 ± 0,24 8,57 ± 0,38 3,28 ± 0,59

Примечание: Данные представлены в виде M±SEM

3.8.5. Гистологическое описание опухолей молочной железы у экспериментальных животных

Типичная микрофотография опухоли молочной железы, развившейся у мыши линии FVB/N, трансгеной по НЕЯ-2/пеи, представлена на рисунке (Рисунок 36). Традиционно спонтанные опухоли молочной железы у трансгенных по НЕЯ-2/пеи мышей фактически не имеют стадии «предрака». Опухоли множественные, развиваются с возраста 4-5 месяцев, к 10-12 месяцам приводят к гибели животных. Микроскопически опухоли являются солидными низкодифференцированными аденокарциномами с участками кистозного строения. Клетки характеризуются выраженной ядерной атипией и высоким уровнем митотической активности. Именно такую картину наблюдали на окрашенных срезах опухолей мышей всех групп, независимо от вводимого экстракта.

Рисунок 36 - Микрофотография опухоли молочной железы у мыши FVB/N, трансгенной по HER-2/neu, в исследовании эффективности экстракта корней P. lobata и экстракта F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы

Окрашивание гематоксилином-эозином, увеличение х400

149

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Скрининг in silico потенциальных молекулярных мишеней биологически активных веществ изучаемых экстрактов Pueraria lobata и

Fucus vesiculosus

Проведенный скрининг т sШco показал, что как изофлавоны, так и фукоиданы потенциально способны взаимодействовать со многими молекулярными мишенями, что указывает на их плейотропную активность. В частности, они могут взаимодействовать с мишенями, вовлеченными в процессы индукции/модулирования воспаления (глюкокортикоидные рецепторы, циклооксигеназа-2 и т.д.) [67]. Кроме того, изучаемые БАВ растительного происхождения способны связываться с рецепторами гормонов (андрогеновыми, рецепторами эстрогена, прогестерона). Также имеются сведения о том, что активация аденозиновых рецепторов А1, А2а [19, 33] полезна для снижения воспаления и болевого синдрома. По имеющимся сведениям [62], игибирование сквален-синтазы приводит к значительному снижению пролиферации раковых клеток, равно как и угнетение рецептора ЕТ-А [97].

Таким образом, воздействие на перечисленные молекулярные мишени может облегчить течение моделируемых в исследовании патологий за счет снижения системного воспаления.

4.2. Оценка экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus как потенциальных средств сопроводительной терапии в отношении перевиваемой солидной опухоли Эрлиха у мышей на фоне химиотерапии 5-

фторурацилом

Проведенное исследование продемонстрировало, что изофлавоны корней кудзу (генистеин, дайдзеин, формононетин, биоханин А) обладают значительным потенциалом в качестве средства сопроводительной терапии при лечении опухоли Эрлиха у мышей, получавших 5-фторурацил. Одним из ключевых результатов стало наблюдение, что в группе животных, получавших экстракт корней кудзу (P. lobata) на фоне введения 5-фторурацила, количество жизнеспособных крипт толстого кишечника статистически значимо не отличалось от такового в группе, не получавшей ни цитостатик, ни изофлавоны (контроль опухоли).

Известно, что 5-фторурацил, являясь одним из наиболее часто используемых цитостатиков, вызывает значительные повреждения быстро делящихся клеток, включая клетки слизистой оболочки кишечника. Это приводит к развитию мукозита, что существенно ухудшает качество жизни пациентов и может ограничивать дозировку и продолжительность химиотерапии [134]. Полученные в настоящем исследовании данные о защитном эффекте изофлавонов корней кудзу согласуются с результатами опубликованных исследований на грызунах, в которых было показано, что такие изофлавоны, как пуэрарин и дайдзеин проявляли защитный эффект в отношении индуцированного 5-фторурацилом мукозита у грызунов [24; 162]. Способность защищать клетки кишечника от токсического воздействия 5-фторурацила, вероятно, обусловлена антиоксидантными, противовоспалительными и антиапоптотическими свойствами изофлавонов.

4.3. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и экстракта Fucus vesiculosus на модели доброкачественной гиперплазии

предстательной железы у крыс

Известно, что развитие индуцированной у крыс доброкачественной гиперплазии предстательной железы сопровождается увеличением массы предстательной железы и повышенной пролиферацией эпителия ПЖ, особенно ее вентральных долей [56; 114]. В настоящем исследовании для экстракта корней кудзу (P. lobata) и экстракта водорослей F. vesiculosus зафиксирован сопоставимый с препаратом финастеридом, применяемым для лечения ДГПЖ у людей, тормозящий развитие патологии эффект. Это выражалось в статистически значимом снижении массы ПЖ и ее долей у животных, получавших указанные экстракты, относительно показателя для животных соответствующего негативного контроля. Кроме того, при оценке площади эпителия вентральных долей ПЖ отмечены те же закономерности.

Для экстракта корней кудзу (P. lobata) профилактический эффект может объясняться их способностью ингибировать 5а-редуктазу - фермент, преобразующий тестостерон в дегидротестостерон, сильнодействующий андроген. Подобный эффект описан для генистеина, биоханина А, эквола и 3',4',7-тригидроксиизофлавона, чья ингибирующая данный фермент активность была несколько выше, чем у дайдзеина, формононентина, глицитеина и др. [25]. Также в эксперименте Mohamad и соавт. было показано, что введение уже смеси изофлавонов: дайдзеина, диадзина, генистина, генистеина и пуэрарина, экстрагированной из Pueraria mirifica, уменьшало тяжесть ДГПЖ у крыс Sprague Dawley. Эффект был сопоставим с однократным введением очищенных дайдзеина или генистеина [114]. Ингибирование 5а-редуктазы после введения экстракта офлавонов из корня кудзу в комбинации с корицей было исследовано у мышей с ДГПЖ [171].

Выявленное в ходе настоящего исследования профилактическое действие экстракта корня кудзу (P. lobata) может быть связано с активностью содержащихся в нем генистеина, биоханина А, дайдзеина и формононетина [139].

Отдельных экспериментальных исследований ингибирующего действия фукоиданов в отношении ДГПЖ нет, однако обнаруженный выраженный антипролиферативный эффект экстракта F. vesiculosus в настоящей работе можно объяснить общими для полисахаридов свойствами: антиоксидантными и противовоспалительными. Так, в эксперименте Haijiang и соавт. было показано, что неочищенная фракция полисахаридов из Semen vaccaria снижала тяжесть индуцированной тестостероном ДГПЖ у мышей вида Кунминг, что выражалось в уменьшении абсолютной массы ПЖ, массово-органного коэффициента ПЖ, а также гистологической степени выраженности ДГПЖ [179]. В работе Liu и соавт. отмечено, что введение полисахаридов из Poria cocos также приводило к уменьшению массы ПЖ, а также к снижению концентраций МДА и СОД у крыс с индуцированным Х-каррагинаном хроническим небактериальным простатитом, и тем самым уменьшало общий уровень окислительного стресса и воспаления в ПЖ [102]. В нашем исследовании именно на фоне введения животным экстракта F. vesiculosus наблюдали те же закономерности.

Сообщается, что дисбаланс в соотношении кальция к магнию играет одну из ключевых ролей в развитии ДГПЖ у людей [22]. С возрастом наблюдается увеличение содержания кальция, и предполагается, что это вызывает патологический рост ПЖ [153]. Было установлено, что увеличение соотношения Ca/Mg связано с пролиферацией простатического эпителия. Следовые концентрации Ca и Mg были превышены в образцах ПЖ со патологическими изменениями в сравнении со здоровыми образцами [169]. С другой стороны, снижение соотношения Ca/Mg в основном связано с апоптозом [17]. В нашей работе не было выявлено различий между влиянием финастерида, экстракта корней кудзу (P. lobata) и экстракта F. vesiculosus на кальциево-магниевый баланс. Введение этих двух экстрактов снижало уровни Ca и Mg в сыворотке крови наряду

со снижением пролиферативной активности простатических эпителиальных клеток, отмеченным экспрессией H3Ser10 [139].

4.4. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели доброкачественной гиперплазии молочной

железы у крыс

На модели индуцированной эстрадиолом и прогестероном ДГМЖ у крыс установлено, что экстракты корней или цветков кудзу (P. lobata) усиливали тяжесть патологии, а экстракт F. vesiculosus не оказывал ни ингибирующего, ни стимулирующего на рост опухоли воздействия. В частности, было отмечено, что у животных в опытных группах наблюдалось статистически значимое увеличение высоты (p < 0,0001) и диаметра (p = 0,0042) сосков по сравнению с крысами из группы интактного контроля. Кроме того, массовые коэффициенты матки во всех опытных группах были статистически значимо выше в сравнении с контрольным значением.

Вопрос о пользе изофлавонов в качестве средств профилактики опухолевых заболеваний молочных желез остается дискуссионным. Существуют публикации, в которых оспаривается общее мнение о том, что изофлавоны обладают исключительно ингибирующим воздействием на канцерогенез молочной железы. Так, генистеин, проявляя эстрогеноподобные свойства, стимулировал пролиферацию гормонозависимых клеточных линий рака молочной железы и опухолей в мышиных моделях [92].

В эксперименте на свиньях, которых с предпубертатного возраста переводили на диету, содержащую гинестеин, отмечено, такая диета приводила к гиперплазии паренхиматозной ткани молочной железы [58].

Адекватная оценка влияния фитоэстрогенов на организм требует глубокого понимания не только их исходной структуры и количества, но и биохимических преобразований, происходящих in vivo. Микробиом кишечника играет ключевую роль в метаболизме изофлавонов, превращая их в биологически активные

метаболиты, часто обладающие свойствами, отличными от исходных соединений. Изучение превращения дайдзеина и формононетина в организме показало, что их метаболит, S(-)-эквиол, обладает более сильной эстрогенной активностью, что может повышать риск развития опухолей молочной железы [117].

Таким образом, экспериментально показано, что следует с осторожностью применять изофлавоны в случае гормонозависимой доброкачественной гиперплазии молочной железы.

4.5. Оценка профилактического эффекта экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели индуцированного рака предстательной железы у

крыс

Использованная в настоящем исследовании схема индукции рака предстательной железы у крыс считается надежной моделью, позволяющей сымитировать течение болезни у человека [111]. Обнаруженные изменения массово-органного коэффициента ПЖ и ее долей согласуются с литературными данными [131]. Изученные экстракт корней кудзу (P. lobata) и экстракт^ vesiculosus не способствовали уменьшению массы ПЖ и массового коэффициента ПЖ, равно как и не влияли на общую заболеваемость. В группах с индуцированным РП без терапии частота заболеваемости РП составляла 37% в обоих опытах, в группе с введением экстракта корней кудзу (P. lobata) - те же 37%, а для экстракта F. vesiculosus 32%. Канцерогенный процесс сопровождался развитием доброкачественной гиперплазии предстательной железы, о чем свидетельствовали массовые коэффициенты ПЖ у животных без опухолей. Экстракт корней кудзу (P. lobata) и экстракт F. vesiculosus способны подавлять развитие ДГПЖ, но не РП.

Обнаруженный сниженный уровень кальция в сыворотке экспериментальных животных, которым индуцировали РП, согласуется с литературными данными, согласно которым гипокальциемия наблюдается у 30 % пациентов с распространенным раком простаты [35]. Гипокальциемия у пациентов

в основном связана с остеобластическими метастазами в костях. В используемой модели РП мы не оценивали повреждение костей у экспериментальных животных, однако было отмечено, что на фоне введения экстракта корней кудзу (P. lobata) уровень кальция нормализовался до контрольных значений. Экстракт F. vesiculosus, напротив, провоцировал еще большее снижение уровня кальция, чем в группе животных с РП без терапии.

Также важно отметить, что применение экстракта корней кудзу (P. lobata) приводило к изменению соотношения Ca/Mg у животных с РП. Конкретно, данный показатель снижался в сыворотке экспериментальных животных, но повышался в гомогенатах тканей ПЖ. Эта закономерность была отмечена и в эксперименте с ДГПЖ [139].

С другой стороны, в отличие от выраженной антиоксидантной активности, обнаруженной для экстракта корней кудзу (P. lobata) в модели ДГПЖ, у животных с индуцированным раком предстательной железы он иначе влиял на функционирование антиоксидантной системы. Так, активность СОД у крыс с РП была снижена в меньшей степени по сравнению с интактными животными, а экстракт корней кудзу (P. lobata) проявлял выраженное прооксидантное действие [140]. Схожим образом действовал и экстракт F. vesiculosus.

Многочисленные публикации сообщают об отсутствии токсичности фукоиданов при пероральном введении в различных дозировках и режимах введения [101; 137; 149]. Однако нами отмечено, вероятно, токсическое действие фукоиданов из F. vesiculosus при пожизненном применении у крыс с индуцированным РП, что выражалось в статистически значимом уменьшении медианы общей выживаемости в группе крыс, получавших этот препарат в сравнении с интактными животными.

Таким образом, несмотря на отсутствие выраженной химиопрофилактической активности в отношении индуцированного химическим канцерогеном рака предстательной железы у крыс в данном исследовании, наши результаты подтверждают положительные оздоровительные эффекты экстракта корней кудзу. К ним относятся: тенденция к увеличению выживаемости,

значительное снижение массово-органного коэффициента ПЖ и ее долей, уменьшение частоты случаев задержки мочи, снижение маркеров пролиферации в незлокачественных тканях простаты, нормализация уровней фосфора, кальция и кальций-магниевого соотношения в сыворотке крови [140].

4.6. Оценка профилактического действия экстрактов Pueraria lobata и Fucus vesiculosus на модели спонтанного рака молочной железы у мышей

FVB/N, трансгенных по HER-2/neu

В нашем исследовании использовали трансгенных по HER-2/neu мышей, у которых в 100% случаев вследствие гиперэкспрессии данного белка спонтанно возникают множественные ОМЖ. При оценке профилактического действия экстракта корней кудзу (P. lobata) и экстракта F. vesiculosus отмечено, что введение этих препаратов отсрочивало возникновение первого новообразования в среднем на 13-14 дней в сравнении с контрольными животными без терапии, но далее различия между группами нивелировались. Схожие результаты были получены Jin и соавт. у трансгенных мышей (онкогенный вирус мышиной молочной железы (MMTV)-neu/ErbB-2), у которых ОМЖ возникают спонтанно. На фоне введения животным изофлавонов (генистеина, дайдзеина или их смеси в дозе 250 мг/кг) увеличивался латентный период роста ОМЖ по сравнению с контролем. Однако после образования опухолей изофлавоны не уменьшали их количество и размер, поэтому в возрасте 34 недель различий в количестве опухолей между группами не было [86].

В литературе описаны эксперименты, направленные на оценку тормозящей развитие опухолей молочной железы активности как у изофлавонов, так и у фукоиданов. Множество публикаций посвящены в том числе синергетическим эффектам данных БАВ, когда они составляют комбинацию с применяемыми в клинике противоопухолевыми и цитостатическими препаратами. Такой интерес объясняется отсутствием эффекта традиционной терапии в случае, когда в ОМЖ отсутствуют рецепторы прогестерона и/или эстрогена, а рецепторы белка

HER2/neu. При этом в случае, когда наблюдается гиперэкспрессия HER2/neu, опухоли тоже часто не отвечают на химиотерапию.

Так, в исследовании Mai и соавт. направленном на оценку возможности генистеина повышать чувствительность эстроген-чувствительных клеток рака молочной железы с повышенной экспрессией HER2/neu к терапии тамоксифеном, было установлено, что совместное применение тамоксифена и генистеина оказывало синергитическое влияние на подавление роста клеток линии BT-474 in vitro. Поскольку имеются сведения о том, что в 40% случаев эстроген-положительных РМЖ наблюдается резистентность к лечению тамоксифеном, равно как и при гиперэкспрессии ОМЖ гена HER2/neu, полученные данные очень многообещающи [109].

Zhang и соавт. было установлено, что одновременная обработка клеток рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF-7 человека фукоиданом из водорослей Мозуку и химиотерапевтическими препаратами: тамоксифеном, цисплатином и паклитакселом, усиливала противораковую активность, такую как ингибирование роста клеток, апоптоз и остановка клеточного цикла [182].

Таким образом, учитывая отсутствие выраженного профилактического воздействия экстрактов Pueraria lobata и экстракта Fucus vesiculosus в модели спонтанного РМЖ в представленном исследовании, целесообразным кажется проведение дальнейших экспериментов по оценке их активности в качестве препаратов сопроводительной терапии.

По совокупности полученных в ходе исследования результатам установлено, что из двух экстрактов кудзу (P. lobata) наиболее перспективным потенциальным средством профилактики доброкачественной гиперплазии предстательной железы является таковой из корней кудзу. Он может также использоваться в качестве средства сопроводительной терапии при раке предстательной железы. Экстракт корней кудзу (P. lobata) обладает выраженной антиканцерогенной активностью, безопасен как при краткосрочном, так и при долгосрочном применении, и снижает выраженность побочных эффектов при химиотерапии. При этом оба экстракта

P. lobata следует с осторожностью использовать при гормонозависимой доброкачественной гиперплазии молочной железы, поскольку выявлено потенциальное усиливающее течение патологии у животных воздействие, которое может быть обусловлено фитоэстрогенной активностью содержащихся в этих экстрактах изофлавонов. Экстракт F. vesiculosus обладает профилактическим действием в отношении индуцированной доброкачественной гиперплазии предстательной железы у крыс, однако в модели индуцированного рака предстательной железы при долгосрочном применении является токсичным.

Выраженной профилактической активности ни у одного из изучаемых экстрактов в модели спонтанного рака молочной железы не обнаружено.

159

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Установлено, что изофлавоны и фукоиданы способны связываться с молекулярными мишенями, вовлеченным в процессы индукции/модулирования воспаления (глюкокортикоидные рецепторы, циклооксигеназа-2 и т.д.), рецепторами гормонов (андрогеновыми, рецепторами эстрогена, прогестерона). Также установлено, что как изофлавоны, так и фукоиданы могут активировать аденозиновые рецепторы A1, А2а и ингибировать сквален-синтазу и эндотелиновый рецептор ET-A.

2. Экстракт корней кудзу (P. lobata) показал защитное действие в отношении эпителия толстого кишечника, что выражалось в нормализации количества жизнеспособных крипт толстого кишечника (до 115,3±7,7 vs 119,9±20,1 в группе без 5-ФУ), то есть снижении тяжести вызванного 5-ФУ мукозита у мышей. При этом не наблюдали снижения эффекта цитостатика: при сочетанном применении этого экстракта и химиотерапии процент ТРО на 3 сутки после введения цитостатика был наиболее приближен к таковому в группе с монотерапией 5-ФУ (77,0%) и составил 70,1%.

3. Использование изофлавонов корней кудзу (P. lobata) и фукоиданов F. vesiculosus уменьшало массу предстательной железы у крыс с ДГПЖ на 15,83% и 11,08%, соответственно, по сравнению с негативным контролем (p < 0,05). Применение обоих экстрактов корректировало гипокальциемию, нормализовало соотношение Ca/Mg и восстанавливало функции антиоксидантной системы. Гистологическая оценка выявила статистически значимое снижение степени ДГПЖ (p < 0,05) относительно негативного контроля. Описанные закономерности сопоставимы с действием использованного препарата сравнения финастерид.

4. В модели доброкачественной гиперплазии молочной железы (мастопатии) зафиксировано потенциальное усиливающее тяжесть патологии действие обоих исследуемых экстрактов (и из корней, и из цветков) кудзу (P. lobata). Это выражалось в статистически значимом увеличении высоты и диаметра сосков по сравнению с крысами из группы интактного контроля. Доля

животных с гистологически подтвержденным диагнозом в опытных группах с введением и экстрактов Р. lobata, и экстракта F vesiculosus была статистически значимо повышена в среднем до 77,7% (р < 0,05)

5. Введение экстракта корней кудзу (Р. 1оЬаХа) снижало массу предстательной железы с 4376,31±287,80 мг у животных негативного контроля до 3952,79±172,02 мг; а массовый индекс предстательной железы - с 11,25±0,92 до 9,85±0,45 (р < 0,05). Также до 11,6% уменьшалась доля животных с задержкой мочи (в сравнении с 23% в негативном контроле). Кроме того, доля выживших к моменту плановой эвтаназии животных в группе с применением этого экстракта составляла 71,9%, что статистически не отличалось от такового в интактном контроле - 90,3% (р = 0,11). На фоне применения экстракта F. vesiculosus, напротив, статистически значимо снижалась медиана общей выживаемости животных: только в данной группе была достигнута гибель более 50% животных к концу наблюдения ^ 5,0% в интактном контроле, р < 0,001).

6. Не обнаружено выраженной профилактической активности у экстрактов Р. lobata и F. vesiculosus в модели спонтанного рака молочной железы у мышей FVB/N, трансгенных по HER-2/neu. Статистически значимых различий ни по показателю среднего диаметра опухолей, ни по показателю среднего объема опухолей, ни по показателю продолжительности жизни по сравнению с животными интактного контроля нет (р > 0,05).

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

АЛТ —аланинаминотрансфераза

АСТ —аспартатаминотрансфераза

АФК - активные формы кислорода

БАВ - биологически активные вещества

ВП — вентральные доли предстательной железы

ВЭЖХ-УФ - высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовой детекцией

ДГМЖ - доброкачественная гиперплазия молочной железы (мастопатия)