Р-селектин и микровезикулы тромбоцитарного происхождения в лабораторной оценке функциональной активности тромбоцитов у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ермаков Алексей Игоревич

• Ермаков Алексей Игоревич
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Ермаков Алексей Игоревич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ С ОБЛИТЕРИРУЮЩИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ АРТЕРИЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ

1.1. Облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей

1.2. Антиагрегантная терапия при облитерирующих заболеваниях артерий нижних конечностей

1.3. Современная модель сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза

1.4. Внеклеточные везикулы, как новый биологический объект в оценке функциональной активности тромбоцитов

1.5. Лабораторная диагностика функциональной активности тромбоцитов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика обследованных больных и референтной (контрольной) группы

2.2. Методы оценки функциональной активности тромбоцитов

2.2.1. Стандартная оптическая агрегатометрия

2.2.2. Оптическая трансмиссионная агрегатометрия

2.2.3. Проточная цитометрия

2.2.4. Клинический анализ крови с определением количества тромбоцитов

2.3. Статистические методы обработки полученных данных

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнительное исследование относительного количества микрочастиц тромбоцитарного происхождения, как функциональных молекулы, характеризующих активность тромбоцитов у здоровых лиц

3.2. Исследование относительного количества Р-селектина, микрочастиц тромбоцитарного происхождения и параметров агрегации тромбоцитов у здоровых лиц и пациентов с ОЗАНК на фоне приема ДААТ

3.3. Оптимизация преаналитического и аналитического этапов определения относительного количества Р-селектина на поверхности тромбоцитов методом проточной цитометрии

3.4. Определение референтных интервалов для относительного количества Р-селектина на поверхности тромбоцитов, измеренного методом проточной цитометрии

3.5. Сравнительный анализ остаточной реактивности тромбоцитов и определение критериев эффективности двойной антиагрегантной терапии у пациентов с ОЗАНК при использовании двух лабораторных методов: проточной цитометрии и оптической агрегатометрии

3.6. Клинико-экономический анализ использования метода проточной цитометрии и оптической агрегатометрии в оценке остаточной реактивности тромбоцитов у пациентов с ОЗАНК на фоне приема двойной антиагрегантной терапии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Р-селектин и микровезикулы тромбоцитарного происхождения в лабораторной оценке функциональной активности тромбоцитов у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей»

Актуальность темы исследования

В России сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) - одна из главных причин смерти, уносящая жизни 56,4% населения. Ежегодные затраты на борьбу с ССЗ составляют 1 триллион рублей, что эквивалентно 3% ВВП. Несмотря на огромные социальные и экономические потери, система профилактики ССЗ в России недостаточно эффективна. Эксперты считают, что необходимо уделить больше внимания изучению и коррекции факторов риска, совершенствовать методы лечения и улучшить контроль за эффективностью проводимой терапии [1].

Ключевой особенностью патогенеза большинства заболеваний сердечнососудистой системы является атеротромбоз, клиническая картина которого существенно зависит от глубины окклюзионно-стенотического процесса в артериях и пораженных органах, что проявляется в виде серьезных осложнений ишемиче-ской болезни сердца (инфаркт миокарда, острый коронарный синдром), острого нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу (инсульт) и критической ишемии нижних конечностей [43].

Летальность пациентов с облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей (ОЗАНК) повышена в 2-4 раза, чем в соответствующей популяции по возрасту и полу, и достигает 60% за 5-10 лет в течение медицинского сопровождения. Число ампутаций нижних конечностей по жизненным показаниям в Российской Федерации составляет 78,5% у больных ОЗАНК старше 75 лет, а летальность пациентов с ОЗАНК через год после радикальной ампутации составляет 48,3% [21].

Наиболее эффективным подходом в тактике ведения пациентов с атеро-склеротическими изменениями является превентивное воздействие на развитие атеротромботических осложнений.

Тромбоциты выступают в качестве основного участника активации артериального тромбоза, а также выполняют роль ключевого агента в его поддержании. В связи с этим антиагрегантные лекарственные препараты, подавляющие функцию тромбоцитов, выступают в качестве ведущего агента в патогенетиче-

4

ской терапии сердечно-сосудистых заболеваний, включая атеросклеротические поражения периферических артерий. Монотерапия с использованием ацетилсалициловой кислоты (АСК) в настоящее время представляет собой основу обеспечения антиагрегантной протекции при симптоматических поражениях артерий нижних конечностей или ранее проведенной процедуры реваскуляризации.

В случае высоких рисков атеротромбоза при неблагоприятном течении заболевания может быть использован ингибитор P2Y12 рецепторов тромбоцитов -клопидогрел, а после проведенного стентирования - двойная антиагрегантная терапия (ДААТ), включающая сочетание ацетилсалициловой кислоты и одного из широко используемых ингибиторов Р2Y12, блокирующих рецепторы тромбоцитов, например, клопидогрела [56, 100, 73, 41, 140].

По некоторым литературным данным от 25% до 50% пациентов, получающих клопидогрел, имеют недостаточный фармакологический ответ, который проявляется в виде высокой остаточной реактивности тромбоцитов (ВОРТ). Как следствие, такие пациенты имеют высокий риск развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий тромботического характера или тромбоза стента [143, 136, 80, 145].

Преодоление высокой остаточной реактивности тромбоцитов подразумевает замену ацетилсалициловой кислоты на другой антиагрегантный препарат или добавление к АСК любого блокатора Р2У12-тромбоцитарных рецепторов. Повышение антиагрегантного эффекта может послужить возникновению кровотечений. Поэтому для достижения наилучшего терапевтического эффекта и безопасности применяемого лечения была предложена концепция «терапевтического окна», которая оценивается по данным тестирования функциональной активности тромбоцитов при использовании различных лабораторных методов [42, 48, 135].

Согласно клиническим исследованиям, проводимым в соответствии с национальными и международными стандартами оказания медицинской помощи, а также клиническим рекомендациям, существует перечень показаний для нормализации функциональной активности тромбоцитов - это риск развития тромбоза стента, риск развития кровотечения, подозрение на резистентность к одному из

препаратов, приверженность пациента к проводимой терапии, перед подготовкой к операции, а также при назначении аналогов оригинального препарата [33, 151, 71, 98, 81].

Сложность реализации таких рекомендаций и определения нахождения пациента в «терапевтическом окне» определяется особенностями лабораторных методов оценки функции тромбоцитов, среди которых наибольшее распространение получили следующие: оптическая агрегатометрия, световая трансмиссионная агрегатометрия, импедансная агрегатометрия. Однако основными факторами, лимитирующими широкое применение данных методов в повседневной клинической практике, является сложность стандартизации, их недостаточная аналитическая точность, определенные требования к количеству тромбоцитов в образце, отсутствие четких и единых подходов в интерпретации конечного результата по полученным данным, а также высокая стоимость некоторых из них [68].

Альтернативой вышеуказанным методам может выступать цитометриче-ский анализ функциональной активности тромбоцитов в цельной крови. Этот метод позволяет анализировать две специфические, зависимые от активации, модификации мембраны тромбоцитов - количество рецепторов GP ПЬ-Ша и экспрессию Р-селектина на клеточной мембране, что соответствует степени активации тромбоцитов и «реакциям выброса» собственных гранул хранения, соответственно [111, 93, 132].

Клинические и фундаментальные биохимические исследования последних лет открыли роль внеклеточных микрочастиц (синоним - везикулы, микровезикулы). Во многих физиологических реакциях и, в том числе, процессах свертывания крови участвуют все без исключения внеклеточные везикулы. Изучается роль везикул различного клеточного происхождения, но считается, что наиболее высокой прокоагулянтной активностью обладают именно везикулы тромбоцитарного происхождения, которые одновременно являются и самыми многочисленными в плазме крови [18, 14, 55]. Уникальные характеристики, постоянство и доступность тромбоцитарных внеклеточных микрочастиц делают их перспективными биомаркерами для применения в клинических лабораторных исследованиях. Ко-

личественное исследование содержания тромбоцитарных микрочастиц может выступать в качестве новой биоаналитической методологии, пригодной, как для разработки лабораторных тестов, позволяющих оценивать активацию системы гемостаза, так и для установления терапевтической эффективности антиагрегантных лекарственных препаратов у больных с атеросклеротическими поражениями сосудов нижних конечностей.

Таким образом, в настоящее время недостаточно изученной и актуальной областью биохимии коагуляционных реакций является характеристика микровезикул тромбоцитов, их клиническое значение, лабораторная идентификация и прикладное использование для оценки эффекта антиагрегантных препаратов. Изучение Р-селектина и микровезикул тромбоцитарного происхождения в лабораторной оценке функциональной активности тромбоцитов у пациентов с облите-рирующим заболеванием артерий нижних конечностей открывает новые возможности контроля антиагрегантной терапии с помощью быстрого, воспроизводимого и высокочувствительного лабораторного теста [118].

Степень разработанности темы

На сегодняшний день в крупных медицинских учреждениях при наличии централизованной лаборатории стала активно применяться технология проточной цитометрии для фенотипической характеристики клеток крови. Цитометрический анализ позволяет исследовать микровезикулы тромбоцитов, их агрегаты как между собой, так и с другими клетками крови, экспрессию различных тромбоцитар-ных рецепторов - это в совокупности лабораторные показатели, которые могут характеризовать агрегационный потенциал тромбоцитов и напрямую оценивают терапевтический эффект от антиагрегантов.

Также, проточная цитометрия в течение короткого времени измеряет специфические характеристики большого количества (например, 5000 или 10000) отдельных тромбоцитов, поэтому может использоваться у пациентов с тромбоцито-пенией [74, 95]. Поскольку для анализа требуются только минимальные объемы (5-10 мкл) цельной крови, данный метод подходит для исследований педиатриче-

ских образцов [38]. Кроме того, тромбоциты анализируются в их физиологической среде - цельной крови с полным клеточным составом, без какой-либо предварительной обработки. Это позволяет оценивать работу тромбоцитов совместно с их естественным окружением - эритроцитами и лейкоцитами, измерять как базовое состояние циркулирующих тромбоцитов, так и их реактивность в ответ на различные агонисты без влияния артефактной активации «in vitro» вследствие предварительной обработки крови [101].

Особое значение приобретает технология выделения и собственно детектирование внеклеточных везикул, которые балансируют между количеством выделенных микрочастиц и их специфичностью. Одним из методов анализа внеклеточных везикул с их возможным количественным определением также является проточная цитометрия. При всей привлекательности проточной цитометрии, в связи с ее высокой производительностью и специфичностью, остаются нерешенными вопросы влияния преаналитических и аналитических факторов на процесс измерения и результат анализа. Отсутствуют референтные интервалы для оценки функциональной активности тромбоцитов, а также значение уровня «cut-off» для оценки эффективности двойной антиагрегантной терапии у пациентов с облите-рирующим атеросклеротическим поражением сосудов нижних конечностей.

Цель исследования

Определить клинико-лабораторное значение измерения количества Р-селектина и микровезикул тромбоцитарного происхождения методом проточной цитометрии в оценке функциональной активности тромбоцитов на фоне приема двойной антиагрегантной терапии у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей.

Задачи исследования

1. Исследовать относительное количество микрочастиц тромбоцитарного происхождения, как функциональных молекул, характеризующих активность тромбоцитов у здоровых лиц.

2. Провести сравнительное исследование относительного количества Р-селектина, микрочастиц тромбоцитарного происхождения и параметров агрегации тромбоцитов у здоровых лиц и пациентов с ОЗАНК на фоне приема ДААТ.

3. Оптимизировать преаналитический и аналитический этапы определения количества поверхностного Р-селектина тромбоцитов с использованием метода проточной цитометрии.

4. Определить референтные интервалы содержания поверхностного Р-селектина тромбоцитов, измеренного с использованием проточной цитометрии.

5. Проанализировать результаты измерения остаточной реактивности тромбоцитов и определить критерии эффективности двойной антиагрегантной терапии у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей с использованием двух методов: оптической агрегатометрии и проточной цитометрии.

6. Выполнить клинико-экономический анализ использования метода проточной цитометрии и оптической агрегатометрии в оценке остаточной реактивности тромбоцитов у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей, которым назначена двойная антиагрегантная терапия.

Научная новизна

Впервые стандартизованы преаналитический и аналитический этапы для оценки функциональной активности тромбоцитов с использованием проточной цитометрии. Установлены референтные интервалы для оценки функциональной активности тромбоцитов по уровню экспрессии поверхностного Р-селектина методом проточной цитометрии в соответствии с Руководством CLSI C28-A3: «Определение, утверждение и проверка референтных интервалов в клинической лаборатории».

Впервые определена клиническая информативность для исследования экспрессии Р-селектина на тромбоцитах методом проточной цитометрии (чувствительность, специфичность, точность, уровень «cut-off»).

Впервые проведена комплексная лабораторная оценка функциональной активности тромбоцитов у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей, принимающих ДААТ.

Впервые проведен клинико-экономический анализ 2-х технологий по оценке функции тромбоцитов методом проточной цитометрии и агрегатометрии у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей, принимающих ДААТ.

Впервые методом проточной цитометрии исследованы тромбоцитарные микровезикулы у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей, принимающих ДААТ.

Теоретическая и практическая значимость работы

Анализ изменения уровня экспрессии Р-селектина на поверхности активированных тромбоцитов и оценка микровезикул плазмы крови позволит дополнить знания о патогенетических механизмах активации тромбоцитов, а также о процессах микровезикуляции, которые сопровождают активацию клеток крови.

Оценка функциональной активности тромбоцитов методом проточной ци-тометрии позволяет индивидуально подойти к принятию решения об эффективности терапии или необходимости смены ДААТ у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей.

Определение Р-селектина методом проточной цитометрии может быть включено в перечень исследований по функциональной активности тромбоцитов в клинико-диагностических лабораториях.

Разработанные критерии эффективности ДААТ могут быть использованы и при оценке эффективности терапии заболеваний, связанных с атеросклерозом артерий других бассейнов.

Результаты диссертационной работы внедрены в лечебную практику отделения сердечно-сосудистой хирургии больницы Петра Великого ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова и ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России.

Методология и методы исследования

Диссертационная работа основана на обследовании 65 пациентов с облите-рирующим заболеванием артерий нижних конечностей, принимающих различные схемы ДААТ; контрольной группы, состоящей из 120 условно здоровых добровольцев; группы сравнения - 15 человек с COVID-19. Для реализации цели исследования были использованы методы проточной цитометрии, оптической и трансмиссионной агрегатометрии, проведен статистический анализ результатов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Функциональная молекула Р-селектин на поверхности тромбоцитов и количество надмолекулярных комплексов - микровезикул тромбоцитарного происхождения - отражают функциональное состояние тромбоцитов у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей.

2) Оптимизация технологии лабораторного определения Р-селектина и валидация референтных интервалов его относительного количества на поверхности тромбоцитов позволяет повысить клиническую информативность метода и определить значение уровня «cut-off» для оценки эффективности антиагрегантной терапии.

3) Количественное содержание Р-селектина и тромбоцитарных микровезикул, измеренные методом проточной цитометрии, выступают в качестве не менее информативными, более стандартизованными и сопоставимыми по экономическим затратам показателями оценки остаточной реактивности тромбоцитов у пациентов с облитерирующим заболеванием артерий нижних конечностей, принимающих двойную антиагрегантную терапию, по сравнению с оптической агрега-тометрией.

Степень достоверности и апробации результатов

Достоверность полученных результатов подтверждается достаточным объемом материала, использованием высокотехнологического оборудования, совре-

менных методов исследования и статистической обработки полученных результатов.

Материалы диссертационного исследования представлены на 3-м Всемирном конгрессе "Controversies in Thrombosis and Haemostasis (COiTH) совместно с 8-й Всероссийской конференцией по клинической гемостазиологии и гемореоло-гии (Москва, 2016 г.), VIV Всероссийской конференции с международным участием «Противоречия современной кардиологии: спорные и нерешенные вопросы» (Самара, 2020 г.), международном конгрессе International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH2020 Virtual Congress, 2020 г.), международном симпозиуме XXXIV International Symposium on Technical Innovations in Laboratory Hematology (ISLH2021 Virtual Meeting, 2021 г.), Форуме антитромботической терапии с международным участием (Москва, 2021 г.), на III объединенном научном форуме физиологов, биохимиков и молекулярных биологов (Сочи, 2021 г.).

Работа поддержана грантом РФФИ №16-04-01142А «Функциональная активность тромбоцитов и передача сигналов межклеточного взаимодействия - роль микрочастиц, содержащих микроРНК» (рук. Сироткина О.В.).

Разработанный метод «Исследование функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии» внедрен в практику работы Центральной клинико-диагностической лаборатории ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова», а также в образовательную программу кафедры лабораторной медицины с клиникой ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России.

По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, 3 из которых в изданиях, определенных ВАК для опубликования основных научных результатов диссертации. Издано 1 учебное пособие.

Личный вклад автора

Автор лично сформулировал цель и задачи исследования, самостоятельно собрал данные литературы, составил дизайн исследования. Автор самостоятельно выполнил исследование функциональной активности тромбоцитов различными

аналитическими методами, включая проточную цитометрию и стандартную агре-гатометрию. Экспериментальные данные, приведенные в диссертации, получены, статистически обработаны, обобщены и проанализированы лично автором.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Тема работы, использованные материалы и методы, полученные результаты, их обсуждение, выводы и практические рекомендации соответствуют паспорту специальности 3.3.8. Клиническая лабораторная диагностика (пункты 1, 2, 3) и 1.5.4. Биохимия (пункты 1, 10).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 122 страницах, содержит 19 таблиц и 29 рисунков. Диссертация включает введение, обзор литературы, главу материалы и методы исследования, главу собственных результатов и их обсуждения, заключение с выводами, практическими рекомендациями и списка цитированной литературы. Список литературы включает 157 источников (30 отечественных и 127 зарубежных).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ С ОБЛИТЕРИРУЮЩИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ АРТЕРИЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ

1.1. Облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей

В России сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) - одна из главных причин смерти, уносящая жизни 56,4% населения. Ежегодные затраты на борьбу с ССЗ составляют 1 триллион рублей, что эквивалентно 3% ВВП. Несмотря на огромные социальные и экономические потери, система профилактики ССЗ в России недостаточно эффективна. Эксперты считают, что необходимо уделить больше внимания изучению и коррекции факторов риска, совершенствовать методы лечения и улучшить контроль за эффективностью проводимой терапии [1].

Атеротромбоз лежит в основе патогенеза целого ряда сердечно-сосудистых заболеваний, и его клиническая картина зависит от глубины окклюзионно-стенотического процесса в артерии пораженного органа, которое проявляется в виде жизнеугрожающих осложнений ишемической болезни сердца (инфаркт миокарда, острый коронарный синдром), острого нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу (инсульт) и критической ишемии нижних конечностей [43].

У больных с ОЗАНК, как правило, выявляется группа факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и высокий риск развития инфаркта миокарда и инсульта. Авторы работы [26] показали, что в течение 4 лет частота симптомов ишемической болезни сердца увеличивается с 44 до 72%, а ишемических нарушений мозгового кровообращения — с 13 до 26%.

За приведенный период наблюдения тромботические осложнения развиваются у 26% пациентов с ОЗАНК, половина из которых заканчиваются смертью [12]. Число ампутированных нижних конечностей по жизненным показаниям в Российской Федерации составляет 78,5% у больных с ОЗАНК старше 75 лет, а летальность пациентов с ОЗАНК через год после радикальной ампутации составляет 48,3% [21]. Тотальная летальность пациентов с ОЗАНК в 2-4 раза выше, чем в со-

ответствующих возрастной и гендерной группах и составляет 60% за 5-10 лет наблюдения за пациентами. Таким образом, в общей структуре смертности пациентов ОЗАНК более 75% составляют атеротромботические осложнения [59].

1.2. Антиагрегантная терапия при облитерирующих заболеваниях артерий нижних конечностей

Одним из основных компонентов лечения пациентов с атеросклеротиче-ским поражением является профилактика главным образом атеротромботических осложнений. Тромбоциты играют значительную роль в индукции и развитии артериального тромбоза. Таким образом антиагреганты являются важнейшим компонентом патогенетической терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Антиаг-регантные препараты проявляют терапевтическую эффективность в отношении ишемических событий в миокарде, как в остром периоде, так и при вторичной профилактике атеротромботических эпизодов.

Также, антиагрегантные препараты широко применяются у пациентов с атеросклеротическим поражением периферических артерий, как для лечения, так и для профилактики развития сердечно-сосудистых осложнений. Монотерапия в настоящее время остается основой антиагрегантной терапии в случаях симптоматического заболевания артерий нижних конечностей или ранее проведенной рева-скуляризации (рис. 1). Однако у некоторых пациентов с заболеванием артерий нижних конечностей (ОЗАНК) комбинированная (двойная) антиагрегантная терапия (ДААТ) имеет некоторое преимущество в течение определенного периода времени [56, 100, 73, 41].

Рисунок 1. Антиагрегантная терапия у пациентов с заболеваниями артерий нижних конечностей [Национальные рекомендации по диагностике и лечению заболеваний артерий нижних конечностей, 2019]. АСК - ацетилсалициловая кислота; ДААТ - двойная антиагрегантная терапия; а - например, сопутствующая фибрилляция предсердий или механические протезы клапанов сердца; б - антиагре-гантная монотерапия, рассматриваемая при наличии сопутствующих проявлений атеросклероза, например, ишемическая болезнь сердца; в - ДААТ можно рассматривать у пациентов с недавним ОКС и/или коронарным стентированием, проведенным менее 12 месяцев назад, стентированием последней коронарной артерии, при множественных поражениях коронарных артерий у пациентов с сахарным диабетом и неполной реваскуляризацией; г - недостаточно доказательств, риски кровотечений в два раза выше по сравнению с монотерапией.

На сегодняшний день известно три класса антиагрегантных препаратов с доказанной клинической эффективностью у пациентов с инфарктом миокарда (рис. 2). К ним относятся ацетилсалициловая кислота (АСК), ингибиторы P2Y12 рецепторов тромбоцитов и блокаторы рецепторов гликопротеина ПЬ/Ша.

Рисунок 2. Механизмы действия антиагрегантных препаратов [по Meadows Т., Bhatt D.L., 2007 с модификациями]. АК - арахидоновая кислота; PAR-1 - рецептор, активируемый протеазами 1 типа; ТР - рецептор к тромбоксану; P2Y12 - рецептор к АДФ (аденозиндифосфату); IIb/IIIa - гликопротеиновые рецепторы

IIb/IIIa.

Следует отметить новый класс антиагрегантных средств, который пока не нашел широкого применения в клинической практике: ингибиторы РАК-рецепторов тромбоцитов. Эти препараты действуют путем ингибирования активации тромбоцитов, вызванной тромбином. В настоящее время реальная клиническая значимость ингибиторов РАК-рецепторов остается не полностью изученной [57, 72]. Двойная антиагрегантная терапия (ДААТ) представляет собой комбинацию ацетилсалициловой кислоты и одного из ингибиторов P2Y12-рецепторов тромбоцитов (клопидогрел, прасугрел или тикагрелор). Данная комбинация препаратов часто используется после стентирования коронарных артерий у пациентов с инфарктом [103, 97]. Клопидогрел, среди других препаратов, имеет ряд преимуществ и часто применяется в сочетании с ацетилсалициловой кислотой. Исследования показали, что фармакологический эффект клопидогрела значительно отличается у разных людей. Это может приводить к его неэффективности и, как следствие, возникновению тромботических осложнений или кровотечений, различной степени выраженности [83, 109]. На сегодня осложнения, связанные с по-

17

вторными ишемическими событиями на фоне антиагрегантной терапии, трактуются как высокая остаточная реактивность тромбоцитов (ВОРТ), определяемая с помощью лабораторных методов для оценки функциональной активности тромбоцитов. По данным литературы доля пациентов, которые принимают клопидог-рел и имеют недостаточный фармакологический ответ составляет 25- 50%. Как следствие, все эти пациенты имеют недостаточную защиту от неблагоприятных сердечно-сосудистых событий или тромбозов стента [143, 136, 80, 145].

Корреляция между функциональной активностью тромбоцитов и вероятностью неблагоприятных исходов остается в центре внимания большого числа клинических исследований (GRAVITAS [78], ARCTIC [49]) и регистров. Так, в исследовании ADAPT-DES [139, 152] было показано, что пациенты с ВОРТ имеют четырехкратное увеличение риска тромбоза стента. Аналогичные результаты были подтверждены рядом проведенных метаанализов, которые дополнительно указывают на повышенный риск смерти и инфаркта миокарда среди пациентов с ВОРТ (Таблица 1).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ермаков Алексей Игоревич, 2026 год

- / / /

«Cut-off» < 59

/

-

- /

■ / / /

■ /

AUC = 0,945 P < 0,001

Тромбоциты, экспрессирующие Р-селектин (20 мкМ АДФ)% 100

80 60 40 20

0

0 20 40 60 80 100

100-специфичность

Рисунок 25. Графическое изображение ROC-кривой для проточной цитометрии,

используемый индуктор - 20 мкМ АДФ Однако, для более точного и объективного представления об информативности исследуемого теста, а также для его сравнения и выбора наиболее оптимального, следует определить площадь (AUC) под ROC-кривыми для каждого из них. С определенными допущениями можно предположить, что чем ближе значение площадь к 1.0, тем лучше предсказательная сила диагностического теста. В литературе [69, 70] иногда приводится следующая экспертная шкала значений AUC, которую можно использовать для оценки качества модели: 0.9-1.0 — отлично, 0.8-0.9 — очень хорошо, 0.7-0.8 — хорошо, 0.6-0.7 — средне, 0.5-0.6 — неудовлетворительно. Рассчитанные показатели ROC-анализа для каждого теста представлены в Таблице 16.

Таблица 1 6

Показатели ROC-анализа лабораторных тестов для определения функциональной активности тромбоцитов у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечно-

стей принимающих ДААТ

Название лабораторного теста (метод, индуктор) Значение «Cut-off» Площадь под кривой (AUC) Индекс Youden р-уровень

Оценка количества тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин (проточная цитомет-рия, 20 мкМ АДФ), % 12,0 0.996 1,00 <0,001

Оценка степени агрегации тромбоцитов (оптическая агре-гатометрия, 20 мкМ АДФ), % 59,1 0.945 0,84 <0,001

!■—1 1 1

«Cut-o ff» <12

- /

- /

■ /

■ /

AUC = 0,996 P < 0,001

Для оценки функциональной активности тромбоцитов методом оптической агрегатометрии референтный интервал степени агрегации тромбоцитов принимают в интервале от 60 до 90%. При приеме двойной антиагрегантной терапии подавление на высоких концентрациях АДФ вторичной волны агрегации, а также снижение степени агрегации тромбоцитов менее 60% расценивается, как снижение их функциональной активности [134]. Аналогичные результаты были получены и в нашем исследовании при проведении ROC-анализа и расчета точки «Cutoff». Однако параметры стандартной агрегатометрии не всегда адекватно отражают функциональную активность тромбоцитов у больных, принимающих анти-агреганты, что связанно с особенностями преаналитического этапа, проблемами стандартизации метода и сложной интерпретацией полученных результатов, что обуславливает более низкое значение площади под ROC-кривой для данного метода.

Таким образом, при определении функциональной активности тромбоцитов метод проточной цитометрии показал наилучшие характеристики клинической информативности: чувствительность метода составила 97,8%, специфичность - 95,0%, точность 96,9%. При этом показателем эффективности двойной ан-тиагрегантной терапии будет снижение относительного количества тромбоцитов, позитивных по Р-селектину, менее 12,0%.

3.6. Клинико-экономический анализ использования метода проточной цито-метрии и оптической агрегатометрии в оценке остаточной реактивности тромбоцитов у пациентов с ОЗАНК на фоне приема двойной антиагрегант-ной терапии

При создании и внедрении нового метода важно оценивать его экономическую обоснованность в сравнении с широко используемым старым методом. В связи с этим, мы выполнили клинико-экономический анализ, чтобы проверить обоснованность применения метода проточной цитометрии для оценки активности тромбоцитов у пациентов с ОЗАНК, которые проходят лечение на ДААТ.

С практической точки зрения в здравоохранении клинико-экономический анализ проводится для определения финансовых расходов, требуемых для достижения запланированной эффективности, а также для сопоставления этих расходов с доступными ресурсами.

В ходе клинико-экономического анализа первостепенно требуется определить критерий эффективности медицинской технологии, который необходимо оценивать, учитывая его влияние на продолжительность и качество жизни. В роли критерия эффективности медицинского вмешательства из прямых клинических эффектов допустимо использование изменений в физиологических и биохимических показателях, таких как биомаркеры.

После определения критерия эффективности, следующим важным компонентом клинико-экономического анализа становится детальный учет и оценка затрат. В рамках анализа требуется стремиться учитывать всевозможные расходы: прямые, косвенные и неуловимые.

Заключительный этап клинико-экономического анализа включает в себя вычисление и изучение клинико-экономических индикаторов. В настоящее время в мировой практике применяются четыре основных метода такого анализа:

1. Анализ «минимизации затрат»

2. Анализ «затраты - эффективность»

3. Анализ «затраты - полезность»

4. Анализ «затраты - выгода»

Наиболее популярным является метод «затраты-эффективность», который даёт возможность соотнести финансовые затраты с клинической результативностью медицинских вмешательств:

CER - коэффициент «затраты-эффективность»;

Cost - затраты на медицинскую технологию, руб.;

Ef - показатель эффективности медицинской технологии.

Чем ниже значение показателя «затраты-эффективность», тем меньше расходов требуется для достижения желаемого результата, и тем более оправданным становится применение данной медицинской технологии. Если одна методика оказывается более эффективной, но при этом более затратной, следует дополнительно рассчитать коэффициент прироста эффективности затрат.

Коэффициент «приращенной эффективности затрат» (ICER) отражает соотношение между дополнительными затратами и их дополнительным эффектом при применении более дорогой, но эффективной технологии в сравнении с более дешевой и менее действенной. Для вычисления данного показателя используется следующая формула [29]:

ICER = (С1-С2)/(ЕА-Е£2), где: ICER - показатель приращения затрат, условная единица, показывает стоимость достижения 1-ой дополнительной единицы эффективности при использовании более эффективной технологии;

С1-С2 - затраты на применение исследуемых методов ЕП-ЕО - эффективность применения исследуемых методов Для сопоставления различных методов определения одного показателя при обследовании одной популяции больных используется такое понятие, как диагностическая эффективность лабораторного теста, который численно выражается через аналитическую точность - соотношение числа истинных результатов теста к числу всех результатов обследования. Клинические наблюдения и оценка результатов исследования функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии показали, что аналитическая точность данного лабораторного теста составила 96,9% (сумма истинно-положительных и истинно-отрицательных результатов по отношению ко всем обследованным). Аналогичный показатель для метода оптической агрегатометрии оказался равным 83,1%. Этот показатель был принят нами за критерий эффективности медицинской технологии при расчете клинико-экономических показателей.

Себестоимость анализа показывает, в какую сумму обходится медицинской организации оказание лабораторной услуги, но отражает лишь текущие расходы только на приобретение реактивов и расходных материалов для выполнения данного исследования (Таблица 17).

Таблица 17

Расчет себестоимости лабораторной услуги «Исследование функциональной ак-

п/п Наименование Ед. изм. Цена упаковки, р. Кол-во в упаковке Цена за ед. изм., р. Потребность на 1 услугу Итог:

1 Разводящий раствор CellPack мл 5 080,00р. 20000 0,25р. 30,00 7,62р.

2 Лизирующий раствор Stromatolyser-WH мл 12 820,00р. 1500 8,55р. 1,00 8,55р.

3 Чистящий раствор CellClean мл 5 660,00р. 50 113,20р. 0,05 5,66р.

4 Моноклональные антитела для CD61/41-FITC мл 10 438,00р. 1 10 438,00р. 0,01 104,38р.

5 Моноклональные антитела для CD62P-PE мл 27 612,00р. 1 27 612,00р. 0,02 552,24р.

6 Пробирки Sample Tubes for FC500 12x75 мм шт 2 511,89р. 250 10,05р. 2 20,10р.

7 Чистящее средство Coulter Clenz мл 6 423,24р. 5000 1,28р. 6 7,71р.

8 Изотонический раствор Coulter Isiton II Diluent мл 4 383,91р. 20000 0,22р. 60 13,15р.

ИТОГО: 719,40р.

Таким образом, расчетная себестоимость исследования функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии составила 719,40 руб., а оптической агрегатометрии - 450,00 руб. Общий размер себестоимости лабораторного исследования (прямые затраты) включал расходы на материальные затраты (реактивы и другой расходный материал), оплату труда персоналу лаборатории, а также амортизационные отчисления и эксплуатационные расходы на содержание оборудования.

Приказом Минздрава РФ №1631н, изданным 29 декабря 2012 года, медицинским учреждениям предоставляется право самостоятельно устанавливать стоимость медицинских услуг. Стоимость услуги основывается на размере расчетных и расчетно-нормативных затрат, что приводит к созданию актуального прейскуранта цен, который подлежит ежегодному пересмотру и обновлению. В 2019 году, согласно действующему прейскуранту СЗГМУ им. И.И. Мечникова,

стоимость исследования функциональной активности тромбоцитов с использованием метода проточной цитометрии составила 1 540,00 руб., а для оптической аг-регатометрии - 900,00 руб.

При анализе структуры распределения пациентов относительно трудоспособного возраста было установлено, что наибольший удельный вес среди госпитализированных пациентов приходился на лица старше трудоспособного возраста (Рис. 26), их доля составила 76%. Однако, практически 1/3 из них продолжали работать - доля работающих пенсионеров составила 27% (Рис. 27). Среди пациентов трудоспособного возраста, доля которых составила 24%, чуть более половины (54,8%) - это работающее население (Рис. 28).

Рисунок 26. Структура распределения пациентов по возрасту

Рисунок 27. Структура распределения пациентов старше трудоспособного возраста по социальному статусу

Рисунок 28. Структура распределения пациентов трудоспособного возраста по

социальному статусу

Таким образом, при анализе структуры распределения пациентов относительно трудоспособного возраста было установлено, что практически половина (45%) всех госпитализированных пациентов приходилось на работающее население.

Учитывая высокую долю пациентов трудоспособного возраста нами были определены непрямые затраты, к которым относятся выплаты по листам нетрудоспособности. Пособие по временной нетрудоспособности назначается и выплачивается работнику на основании предоставленного им листка нетрудоспособности. Для определения размера данного пособия необходимо в первую очередь рассчитать средний дневной заработок работника, предоставившего листок нетрудоспособности (часть 3 статьи 14 Федерального закона от 29.12.2006 № 255-ФЗ):

~Сумма заработка работника за расчетный период )

730 , где под

суммой дохода за расчетный период рассматриваются выплаты работнику, с которых начислены взносы на ВНиМ, за два календарных года, предшествовавших наступлению временной нетрудоспособности (ч. 1 ст. 14 Федерального закона от 29.12.2006 N 255-ФЗ).

То есть, расчетный период для оплаты листков нетрудоспособности в 2019 году включает выплаты, произведенные работнику в 2017-2018 годах. Важно

Средний дневной заработок

помнить о предельной сумме дохода, необходимой для расчета пособия в 2019 году:

-815 000 рублей (предельная база для взносов на 2018 год); -755 000 рублей (предельная база для взносов на 2017 год).

После определения среднего дневного заработка необходимо рассчитать размер суточного пособия, который зависит от стажа работы работника (часть 1 статьи 7 Федерального закона от 29.12.2006 N 255-ФЗ):

стажа до 5 лет учитывается при расчете оплаты по больничному листу 60% от среднего заработка, для стажа от 5 до 8 лет - 80% и для стажа более 8 лет - 100%.

После всех произведенных предварительных расчетов определение итоговой суммы пособия по временной нетрудоспособности осуществляется по формуле:

Таким образом, для работающего населения размер пособия по временной нетрудоспособности в 2019 году рассчитывался исходя из максимальной суммы среднего заработка со 100% оплатой, и составил 2 150,68 руб. в день ((755 000 руб. + 815 000 руб.) / 730 дн.). Средняя продолжительность пребывания пациентов в отделении сердечно-сосудистой хирургии №1 за 2019 год составила 16 койко-дней.

На сегодняшний день в России усиленно повышаются стандарты качества предоставляемой медицинской помощи и требования к обеспечению устойчивого эффекта от назначенной терапии [15]. Так, согласно Приказу Минздрава России от 10.05.2017 N 203н "Об утверждении критериев оценки качества медицинской помощи" (Зарегистрировано в Минюсте России 17.05.2017 N 46740) одним из критериев качества по оказанию медицинской помощи в стационарных условиях является оформление по результатам лечения выписного эпикриза с указанием

рекомендаций по дальнейшему лечению, обследованию и наблюдению.

92

При назначении двойной антиагрегантной терапии у пациентов с ОЗАНК важно оценить её эффективность на момент выписки, а также определить возможность развития нежелательных эффектов от длительного и регулярного приема лекарственных препаратов, что и определяет персонифицированный подход в лечении для конкретного пациента. Основной целью данного подхода является своевременная профилактика развития повторных тромботических событий и крупных кровотечений, которая отчасти будет зависеть от функционального состояния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

При исследовании функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии оценить положительный эффект от регулярного применения антиагрегантных препаратов возможно уже на 5 сутки, а при использовании метода оптической агрегатометрии не ранее 10 дня от начала терапии. Это позволит сократить продолжительность пребывания пациента на стационарном лечении и, как следствие, приведет к снижению непрямых затрат - выплат по листам нетрудоспособности.

Итоговые затраты на выполнение функциональной активности тромбоцитов методами проточной цитометрии и оптической агрегатометрии, а также их клинико-диагностическая эффективность представлены в Таблице 18.

Таблица 1 8

Показатели эффективности, прямых и непрямых затрат при выполнении функциональной активности тромбоцитов методами проточной цитометрии и оптиче-

ской агрегатометрии

Затраты и эффективность Проточная цитомет-рия Оптическая агрега-тометрия

Прямые затраты (стоимость одного исследования и трудозатрат персонала) 1 540,00 □ 900,00 □

Непрямые затраты (выплаты по листам нетрудоспособности) 45 164,28 □ (21 день х 2 150,68 □) 55 917,68 □ (26 день х 2 150,68 □)

ИТОГО: 46 704,28 □ 56 817,68 □

Эффективность (точность лабораторного метода), % 96,9 83,1

При анализе только прямых затрат разработанный метод оценки функциональной активности тромбоцитов на фоне приема ДААТ с использованием проточного цитометра оказался несколько дороже, чем метод оптической агрегато-метрии. Однако если провести полноценный клинико-экономический анализ и учесть в расчетах непрямые затраты, то данный метод окажется менее затратным и более эффективным.

Анализ эффективности затрат показал, что при включении прямых и косвенных расходов, стоимость обнаружения единицы эффективности с помощью метода проточной цитометрии практически в 1,5 раза ниже, чем при использовании традиционной оптической агрегатометрии. При оценке показателя, определяющего дополнительные затраты для достижения одного процента прироста эффективности или, иными словами, выявления большего процента людей с истинными результатами, мы выяснили, что такой рост эффективности требует всего 14,62 рублей (Таблица 19).

Таблица 1 9

Сравнительные клинико-экономические показатели методов оценки функцио-

нального ответа тромбоцитов на антиагрегантную терапию

Затраты и эффективность Проточная цито-метрия Оптическая агре-гатометрия

Соотношение «затраты-эффективность» (CER) 481,98 □ 683,73 □

Показатель «приращения эффективности затрат» (ICER) 14,62 □

Учитывая значительное расхождение в выплатах за больничные листы, такие затраты для обеспечения увеличения на один процент пациентов с достоверными результатами лабораторных исследований на уровне учреждения здравоохранения и страны существенно ниже предела экономической целесообразности. Использование таких обследований становится оправданным и целесообразным.

Кроме того, важно помнить, что недостаточное применение антиагрегант-ной терапии значительно увеличивает число повторных тромботических осложнений и эндоваскулярных операций на сосудах нижних конечностей. На диагностику и лечение одного пациента с острым тромбозом артерий нижних конечно-

94

стей тратится около 370 000 рублей. Предотвращение развития повторного тромбоза с последующей госпитализацией и лечением делают лабораторную оценку эффективности антиагрегантной терапии методом проточной цитометрии экономически еще более выгодной.

Таким образом, применение высокочувствительного метода проточной ци-тометрии для оценки функциональной активности тромбоцитов приводит к сокращению пребывания пациента в стационаре, профилактике повторных тромбо-тических событий и подбору адекватной антиагрегантной терапии, что уменьшает финансовые затраты не только для медицинского учреждения, но и для системы здравоохранения в целом за счет сокращения числа повторных госпитализаций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализируя полученные в диссертационной работе результаты и подводя итоги проведенного исследования, следует остановиться на положениях, послуживших основой для выбора темы исследования.

Выбор темы был обусловлен высокой частотой инвалидизации и смертности у пациентов с атеросклеротическим поражением сосудов нижних конечностей по причине атеротромботических осложнений [21, 59], развитием у части пациентов высокой остаточной реактивности тромбоцитов на фоне использования анти-агрегантной терапии [136, 145] с одной стороны, и неадекватность методов оценки функциональной активности тромбоцитов, с другой стороны.

Оценка функциональной активности тромбоцитов в контексте антиагре-гантной терапии возможна различными методами пригодными как для скринин-гового тестирования, так и более детального, углубленного изучения выявленных нарушений. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки, что сохраняет интерес к поиску и возможности оценки эффекта антиагрегантных препаратов достаточно быстрым, воспроизводимым и высокочувствительным тестом [118]. В связи с этим мы определили цель исследования - оценить функциональную активность тромбоцитов методом проточной цитометрии у пациентов с об-литерирующим заболеванием сосудов нижних конечностей на фоне приема ДА-АТ.

В ходе работы был произведен сравнительный анализ двух методов по оценке функциональной активности тромбоцитов на фоне приема антиагрегант-ной терапии - оптическая агрегатометрия и проточная цитометрия; определены аналитические характеристики метода проточной цитометрии, а также выявлены преаналитические факторы, влияющие на оценку полученного результата. При стандартизации протокола лабораторного исследования метод проточной цито-метрии показал наилучшие диагностические характеристики в исследовании функциональной активности тромбоцитов на фоне терапии антиагрегантами: чувствительность метода составила 97,8%, специфичность - 95,0%, точность - 96,9%.

На фоне применения различных схем антиагрегантной терапии в течение первых 5 дней от начала лечения, адекватный фармакологический эффект методом проточной цитометрии был выявлен у 42 (65%) больных, а методом оптической агрегатометрии - у 34 (52%) больных, что доказывает клиническое преимущество использования метода проточной цитометрии в оценке эффективности ан-тиагрегантной терапии. При этом показателем эффективности двойной антиагре-гантной терапии явилось снижение относительного количества тромбоцитов, экс-прессирующих Р-селектин, менее 12,0%.

Также, проведенное нами исследование на клеточном и молекулярном уровне с использованием анализа тромбоцитарных микрочастиц (экзосом) подтверждает терапевтический эффект от применения антиагрегантных препаратов у пациентов с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей и отражает согласованность результатов различных лабораторных тестов с применением одного метода при оценке функциональной активности тромбоцитов в разных клинических ситуациях.

Другим важным аспектом работы явилась возможность провести клинико-экономический анализ затрат на улучшение диагностики и повышение качества лечения за счет использования дорогостоящего высокотехнологичного лабораторного оборудования. В ходе исследования было выявлено, что применение относительно дорогого, но высокочувствительного метода проточной цитометрии для оценки функциональной активности тромбоцитов является экономически выгодным. Использование данного метода приводит к сокращению пребывания пациента в стационаре, профилактике повторных тромботических событий, подбору адекватной антиагрегантной терапии, что уменьшает финансовые затраты не только для медицинского учреждения, но и для системы здравоохранения в целом за счет сокращения количества дней пребывания в стационаре, а также числа повторных госпитализаций.

Таким образом, результаты выполненного диссертационного исследования свидетельствуют о том, что для адекватной оценки функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии необходимо соблюдать условия

пре- и аналитического этапов, учитывать референтные интервалы в зависимости от гендерной принадлежности обследуемых лиц. Метод проточной цитометрии для определения функциональной активности тромбоцитов характеризуется высокой диагностической ценностью - точностью, специфичностью и чувствительностью. Применение данного метода у больных с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей, получающих антиагрегантную терапию, демонстрирует клиническую эффективность и экономические преимущества по сравнению с оптической агрегатометрией. Метод проточной цитометрии может быть использован для оценки функциональной активности тромбоцитов у больных с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей, получающих антиагрегантную терапию.

ВЫВОДЫ

1. У здоровых лиц относительное количество Р-селектина до активации индуктором составило 0,8% [0,5-1,7], после активации 36,1% [26,6-59,2]. При этом у пациентов с ОЗАНК до терапии относительное количество Р-селектина после индукции составило 48,3% [41,4-58,1], а через 5 дней ДААТ данный показатель оказался достоверно снижен по сравнению с исходным уровнем - 10,1% [9,111,5]. Снижение относительного количества тромбоцитов, позитивных по Р-селектину, после индукции до 12,0% и менее является показателем эффективности двойной антиагрегантной терапии.

2. Количество тромбоцитарных микровезикул у пациентов с ОЗАНК на фоне ДААТ, измеренное методом проточной цитометрии, составило 10,4% [4,514,3], что оказалось сопоставимо с количеством тромбоцитарных микровезикул у условно здоровых добровольцев - 10,1% [7,8-20,9], и достоверно меньше, чем у больных с активацией системы гемостаза вследствие тяжелого инфекционного заболевания - 41,7% [25,6-58,4] (р<0,05). Снижение количества тромбоцитарных микрочастиц у пациентов с ОЗАНК на фоне приема ДААТ подтверждает терапевтический эффект от применения антиагрегантных препаратов.

3. Разведение образца цельной крови в 50 раз наиболее оптимально для исследования Р-селектина на поверхности тромбоцитов методом проточной ци-тометрии. Стандартизация процедуры определения Р-селектина тромбоцитов методом проточной цитометрии позволяет использовать его для оценки функциональной активности тромбоцитов с приемлемой вариабельностью внутри анализа

- 25%.

4. Референтные интервалы для относительного количества Р-селектина на поверхности тромбоцитов, измеренного методом проточной цитометрии, составили: для женщин репродуктивного возраста - 0,10-6,64% и 13,88-78,30% до и после индукции АДФ, соответственно; для всех мужчин и женщин старше 55 лет

- 0,07-4,00% и 11,40-74,40% до и после индукции АДФ, соответственно.

5. Метод проточной цитометрии показал наилучшие аналитические характеристики (чувствительность - 97,8%, специфичность - 95,0%, точность -

96,9%) по сравнению со стандартной агрегатометрией (82,2%; 85,0%; 83,1% соответственно). У пациентов, принимающих антиагрегантные препараты, в течение 5 дней снижение функциональной активности тромбоцитов методом проточной ци-тометрии было выявлено у 65% больных, тогда как методом стандартной агрега-тометрии - у 52% больных.

6. Адекватно подобранная антиагрегантная терапия и лабораторный контроль эффективности антиагрегантной терапии с помощью проточной цито-метрии приводит к сокращению пребывания пациента на стационарном лечении в средней на 5 дней, а также профилактике повторных тромботических событий на 12,5%, что уменьшает финансовые затраты не только для медицинского учреждения, но и для системы здравоохранения в целом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Проведенное исследование и его результаты позволяют сформулировать ряд практических рекомендаций сосудистым хирургам и врачам клинической лабораторной диагностики:

1. С целью оценки эффективности антиагрегантной терапии у пациентов с атеросклерозом артерий нижних конечностей рекомендуется проводить исследование функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии на 5 сутки после начала терапии с оценкой экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов. Эффективность антиагрегантной терапии оценивать по показателям относительного количества тромбоцитов, позитивных по Р-селектину и расценивать, как эффективную, если данный показатель не превышает 12% после индукции 20 мкМ АДФ.

2. При исследовании функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии рекомендуется строго соблюдать правила пре- и аналитического этапов во избежание неверной трактовки результатов. Важными являются условия забора крови, хранения и транспортировки в лабораторию; разведение образца перед окрашиванием моноклональными антителами; отсутствие этапа фиксации нативного образца; проведение анализа на проточном цитометре в первые 20-30 минут после инкубации с моноклональными антителами.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Дальнейшее изучение оценки функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии является перспективным научным направлением. В данной связи также очевидна необходимость проведения клинической валида-ции представленных в настоящей работе результатов для пациентов, страдающих другими нозологическими формами поражения артерий нижних конечностей, а также артерий других анатомических локализаций с последующей оценкой эффективности терапии данных заболеваний.

Другим направлением дальнейшего научного поиска может явиться оценка стабильности тромбоцитарных микрочастиц, выделенных из венозной крови, при воздействии таких преаналитических факторов, как длительное хранение и транспортировка, что может быть востребовано в случае аутсорсинга биологического материала при назначении теста на функциональную активность тромбоцитов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CVg - коэффициент межиндивидуальной биологической вариации

CVi - коэффициент внутрииндивидуальной биологической вариации

ESCRT - эндосомальный сортировочный комплекс

FITC - флуоресцеин-изотиоционат

GPIIb-IIIa - тромбоцитарный рецептор фибриногена

MFI - средняя интенсивность флуоресценции

MPV - средний объем тромбоцитов

P2Y12 - тромбоцитарный рецептор аденозиндифосфата

PBS -фосфатно-солевой буфер

PCT - тромбокрит

PE - фикоэритрин

PLT - общее количество тромбоцитов PRU - единица реактивности тромбоцитов PTS - пневматическая почта Rab5 - рабанкирин-5 Rab7 - рабанкирин-7

RCV - уровень критической разницы двух лабораторных показателей

АДФ - аденозиндифосфорная кислота

АСК - ацетилсалициловая кислота

БТП - богатая тромбоцитами плазма

ВВП - валовой внутренний продукт

ВОРТ - высокая остаточная реактивность тромбоцитов

ДААТ - двойная антиагрегантная терапия

МНО - международное нормализованное отношение

НПВП - нестероидный противовоспалительные препараты

103

ОЗАНК - облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей

ОКС- острый коронарный синдром

ОТП - обедненная тромбоцитами плазма

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ФАТ - функциональная активность тромбоцитов

ФНО - фактор некроза опухоли

ЦОГ-1 - циклооскигеназа тип 1

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алекян, Б.Г. Роль тестирования функциональной активности тромбоцитов в профилактике сердечно-сосудистых осложнений у больных, получающих антитромбоцитарную терапию / Алекян Б.Г. [и др.] // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2014. - Т. 10, №6. - С. 679-687.

2. Балаховский, И. С. Количественная оценка воспроизводимости результатов клинических лабораторных анализов изо дня в день / Балаховский И.С. // Клин. лаб. диагностика. - 2003. - №3. - С. 50-54.

3. Берковский, А.Л. Пособие по изучению адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов / А.Л. Берковский. - Москва: НПО «Ренам», 2004. - 28 с.

4. Бернд, П. Гемостазиология. Рациональная диагностика и терапия / П. Бернд, К. Мадленер, Е. Сушко. - Москва: Здоровье, 2006. - 288 с.

5. Былов К. В. Место ангиопластики при лечении окклюзированных (длиной более 10 см) бедренных артерий / Былов К.В., Дроздов С.А., Дундуа Д.П., Ба-бунашвили А.М., Карташов Д.С., Кавтеладзе З.А. // Международный журнал интервенционной кардиоангиологии. - 2004. - №5. - С. 26-31.

6. Вавилова, Т.В. Молекулярные механизмы активации гемостаза при СОУГО-19 на госпитальном этапе / Вавилова Т.В., Сироткина О.В., Ермаков А.И. [и др.] // Лабораторная служба. - 2021. - Т. 10, №4. - С. 25-29.

7. Волкова, И.А. Влияние физиологических и аналитических погрешностей на интерпретацию количественных результатов лабораторных исследований / Волкова И.А. // Медицинский алфавит. - 2017. - №4. - С. 40-44.

8. Воронина, Е.Н. Мембранные рецепторы тромбоцитов: функции и полиморфизм / Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Сергеевичев Д.С., Пикалов И.В. // Вестник ВОГиС. - 2006. - Т.10, №3. - С. 553-564.

9. Григорьев, С.Г. Роль и место логистической регрессии и ROC-анализа в решении медицинских диагностических задач / Григорьев С.Г., Лобзин Ю.В., Скрипченко Н.В. // Журнал инфектологии. - 2016. - Т.8, № 4. - С. 36-45.

10. Зайко, Н.Н. Патологическая физиология: учебник / Н.Н. Зайко, Ю.В. Быця. - 3- е изд. - Москва: МЕДпресс-информ, 2006. - 640 с.

11. Ивойлов, О.О. Критерий RCV - перспективный способ оценки динамики количественных показателей в практике лаборатории / Ивойлов О. О., Кочетко-ва И.Н., Васильева Ю.Ю. [и др.] // Лаборатория. - 2017. - №S2. - С. 25.

12. Комаров, А. Л. Течение перемежающейся хромоты и прогноз больных атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей. Анализ результатов проспективного наблюдения / Комаров А. Л., Панченко Е.П., Деев А. Д. [и др.] //Ангиология и сосудистая хирургия. - 2000. - № 2. - С. 9-19.

13. Кореньков, Д.А. Роль микрочастиц в межклеточной коммуникации / Кореньков Д.А., Овчинникова О.М., Сельков С.А., Соколов Д.И. // Цитология. -2014. - №56 (7). - С. 480-488.

14. Кубатиев, А. А. Микрочастицы тромбоцитов: образование и свойства / Кубатиев А.А., Боровая Т.Г., Жуковицкая В.Г., Адреевская С.Г., Шевлягина Н.В. // Патогенез. - 2017. - №15(2). - С. 4-13.

15. Ломакин, Н.В. Индивидуальный подход к применению антитромбоци-тарной терапии. На что опереться в решении? / Ломакин Н.В., Сумароков А.Б., Доценко Ю.В., Учитель И.А., Бурячковская Л.И. // Атеротромбоз. - 2017. - №2. -С. 70-78.

16. Марцевич, С.Ю. Эффективность, безопасность и приверженность анти-тромбоцитарной терапии у пациентов с высоким риском тромботических осложнений / Марцевич С.Ю., Кутишенко Н.П., Гинзбург М.Л. [и др.] // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2014. - Т. 10, №6. С. - 679-687.

17. Мирзаев, К.Б. Значение фармакогенетического тестирования по СТР2С19 для персонализации применения антиагрегантов в кардиологической практике / Мирзаев К.Б., Сычев Д.А., Андреев Д.А., Прокофьев А.Б. // Рациональная Фармакотерапия в Кардиологии. - 2013. - №4 - С. 404-408.

18. Пантелеев, М.А. Внеклеточные везикулы плазмы крови: состав, происхождение, свойства / Пантелеев М.А., Абаева А.А., Баландина А.Н., Беляев А.В., Нечипуренко Д.Ю., Обыденный С.И., Свешникова А.Н., Шибеко А.М., Атаулла-ханов Ф.И. // Биол. мембраны. - 2017. - №34(3). - С. 155-161.

19. Пантелеев, М.А. Пространственная динамика гемостаза и тромбоза: теория и практика / Пантелеев М.А., Баландина А.Н., Сошитова Н.П. [и др.] // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2010. - №4(44). - С. 48-60.

20. Петри, А. Наглядная медицинская статистика: учеб. пособие / Петри А., Сэбин К. [пер. с анг. под ред. В.П. Леонова]. - 3-е изд., перераб. и доп. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 216 с.

21. Поляков, П.И. Облитерирующий атеросклероз у лиц старческого возраста / Поляков П.И., Горелик С.Г., Железнова Е.А. // Вестник новых медицинских технологий нижних конечностей. - 2013. - Т.20, №1. - С. 98-101.

22. Самойлова, Е.М. Экзосомы: от биологии к клинике / Самойлова Е.М., Кальсин В.А., Беспалова В.А., Девиченский В.М., Баклаушев В.П. // Гены и клетки. - 2017; - №4: - С. 7-19.

23. Сироткина, О.В. Патент на изобретение № 2442167 «Способ оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1 как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y12 на тромбоцитарных мембранах, на состояние тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагре-гантные препараты указанной группы» / Гайковая Л.Б., Вавилова Т.В., Кухарчик Г.А., Шабров А.В. // - Заявка №2010130629 от 21 июля 2010 г., зарегистрирована в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 февраля 2012 г., бюллетень № 4.

24. Сироткина, О.В. Микрочастицы клеток крови у больных СОУГО-19 как маркер активации системы гемостаза / Сироткина О.В., Ермаков А.И., Гайковая Л.Б. [и др.] // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2020. - №4. - С. 35-40.

25. Скотников, А.С. Сравнение влияния на агрегацию тромбоцитов оригинального препарата (Плавикс) и его дженерика (Клапитакс): результаты наблюдательного исследования / Скотников А.С., Сизова Ж.М., Багликов А.Н., Рожнова О.Г., Новицкий Н.И. // РКЖ. - 2018. - №4. - С. 75-81.

26. Сумин, А.Н. Предикторы неблагоприятных исходов у пациентов с об-литерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей / Сумин А.Н., Мед-

ведева Ю.Д., Щеглова А.В., Барбараш Л.С. // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2020. - №13(1). - С. 41- 47.

27. Тамкович, С.Н. Экзосомы: механизмы возникновения, состав, транспорт, биологическая активность, использование в диагностике / Тамкович С.Н., Тутанов О.С., Лактионов П.П. // Биол. мембраны. - 2016. - №33(3). - С. 163-175.

28. Файнзильберг, Л.С. Гарантированная оценка эффективности диагностических тестов на основе усиленного ROC анализа / Файнзильберг Л.С. [и др.] // Управляющие системы и машины. - 2009. - № 5. - С. 3-13.

29. Федоренко, А. С. Оценка качества антибактериальной терапии хронических инфекционно-воспалительных заболеваний различной локализации в амбулаторных условиях / А.С. Федоренко, А.Т. Бурбелло, Л.Б. Гайковая // Актуальные вопросы экспериментальной, клинической и профилактической медицины -2012: Сборник научных трудов сотрудников Северо-Западного государственного медицинского университета им. И. И. Мечникова, - 2012. - С. 27.

30. Чевкина, Е.М. Экзосомы и передача (эпи)генетической информации опухолевыми клетками / Чевкина Е.М., Щербаков А.М., Журавская А.Ю., Семина С.Е., Комельков А.В., Красильников М.А. // Усп. молек. онкологии. - 2015. -№2(3). - С. 8-20.

31. Ahnadi, C.E. Comparison of two methods to assess variability of platelet response to anti-platelet therapies in patients with acute coronary syndrome undergoing angioplasty / Ahnadi C.E., Boughrassa F.F., Chapman-Montgomery E.S., et al. // Thromb. Haemost. - 2004. - №92. - Р. 1207-1213.

32. Anderson, H.C. Vesicles associated with calcification in the matrix of epiphyseal cartilage // J. Cell Biol. - 1969. - №41. - Р. 59-72.

33. Aradi, D. Expert position paper on the role of platelet function testing in patients undergoing percutaneous coronary intervention / Aradi D., Storey R.F., Komocsi A., et al. // Eur. Heart. J. - 2014. - №35. - Р. 209-215.

34. Baj-Krzyworzeka, M. Tumourderived microvesicles contain interleukin-8 and modulate production of chemokines by human monocytes / Baj-Krzyworzeka M, Weglarczyk K, Mytar B. et al. // Anticancer Res. - 2011. - №31. - Р. 1329-1335.

35. Banahan, B.F. Generic substitution of NTI drugs / Banahan B.F., Bonnarens J.K., Bentley J.P. // Formulary. - 1998. - №33. - P. 1082-1096.

36. Bard, M.P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2004. - №31(1). - P. 114121.

37. Baumgarth, N. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping / Baumgarth N., Roederer M. // J. Immunol. Methods. - 2000. -№243(1-2). - P. 77-97.

38. Bednarek, F.J. The platelet hyporeactivity of extremely low birth weight neonates is age-dependent / Bednarek F.J., Bean S., Barnard M.R., Frelinger A.L., Mi-chelson A.D. // Thromb. Res. - 2009. - №124(1). - P. 42-45.

39. Berda-Haddad, Y. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1 alpha / Berda-Haddad Y., Robert S., Salers P. et al. // PNAS USA - 2011. - №108. - P. 20684-20689.

40. Beringue, V. Facilitated Cross-Species Transmission of Prions in Extraneural Tissue / Beringue V., Herzog L., Jaumain E., Reine F., Sibille P., et. al. // Science. - 2012. - №335. - P. 472-475.

41. Bonaca, M.P. et al. Ticagrelor for Prevention of Ischemic Events After Myocardial Infarction in Patients With Peripheral Artery Disease // J. Am. Coll. Cardiol. -2016. - Vol.67, № 23. - P. 2719-2728.

42. Bonello, L. Relationship between post-treatment platelet reactivity and is-chemic and bleeding events at 1-year follow-up in patients receiving prasugrel / Bonello L., Mancini J., Pansieri M., et al. // J. Thromb. Haemost. - 2012. - №10. - P. 19992005.

43. Borissoff, J.I. The hemostatic system as a modulator of atherosclerosis / Borissoff J.I., Spronk H.M., ten Cate H. // N. Engl. J. Med. - 2011. - Vol.364,№18. - P. 1746-1760.

44. Born, G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. // Nature. - 1962. - №194. - P. 927-929.

45. Boulton, F. Beginner's luck--the first in vivo demonstration of functioning platelets; William Duke, 1910 // Transfus. Med. - 2012. - Vol.22,№2. - P. 80-83.

46. Breddin, H.K. Can platelet aggregometry be standardized? // Platelets. -2005. - №16(3-4). - P. 151-158.

47. Campo, G. Long-Term Clinical Outcome Based on Aspirin and Clopidogrel Responsiveness Status After Elective Percutaneous Coronary Intervention A 3T/2R (Tailoring Treatment With Tirofiban in Patients Showing Resistance to Aspirin and/or Resistance to Clopidogrel) Trial Substudy / Campo G., Fileti L., de Cesare N., et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2010. - №56. - P. 1447-1455.

48. Campo, G. Prospective evaluation of on-clopidogrel platelet reactivity over time in patients treated with percutaneous coronary intervention relationship with gene polymorphisms and clinical outcome / Campo G., Parrinello G., Ferraresi P., et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2011. - №57. - P. 2474-2483.

49. Cattaneo, M. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: a consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/IS TH / Cattaneo M., Cerletti C., Harrison P., et al. // J. Thromb. Haemost. - 2013. - №11. - P. 1183-1189.

50. Chargaff, E. The biological significance of the thromboplastic protein of blood / Chargaff E., West R. // J. Biol. Chem. - 1946. - №166. - P. 189-197.

51. Chen, T. Chemokine-containing exosomes are released from heat-stressed tumor cells via lipid raft-dependent pathway and act as efficient tumor vaccine / Chen T., Guo J., Yang M. et al. // J. Immunol. - 2011. - №186. - P. 2219-2228.

52. Collet, J.P. et al. Bedside Monitoring to Adjust Antiplatelet Therapy for Coronary Stenting // N. Engl. J. Med. - 2012. - Vol.367, № 22. - P. 2100-2109.

53. Collino, C.J. Statistical criteria to establish optimal antibody dilution in flow cytometry analysis / Collino C.J., Jaldin-Fincati J.R., Chiabrando G.A. // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2007. - №72(3). - P. 223-226.

54. Colombo, M. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles / Colombo M.,

Moita C., van Niel G., Kowal J., Vigneron J., Benaroch P., Manel N., Moita L.F., Thery C., Raposo G. // J. Cell. Sci. - 2013. - №126, Pt 24. - P. 5553-5565.

55. Curry, N. Levels of procoagulant microvesicles are elevated after traumatic injury and platelet microvesicles are negatively correlated with mortality / Curry N., Raja A., Beavis J., Stanworth S., Harrison P. // J. Extracell. Vesicles. - 2014. - №3. - P. 25625.

56. Dake, M.D. et al. Durable Clinical Effectiveness With Paclitaxel-Eluting Stents in the Femoropopliteal Artery clinical perspective // Circulation. - 2016. -Vol.133, №15. - P. 1472-1483.

57. Depta, J.P. New approaches to inhibiting platelets and coagulation / Depta J.P., Bhatt D.L. // Annual review of pharmacology and toxicology. - 2015. - №55. - P. 373-397.

58. Dong-Sic Choi. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes / Dong-Sic Choi, Dae-Kyum Kim, Yoon-Keun Kim, Yong Song Gho. // Proteomics. - 2013. - №13. - P. 1554-1571.

59. Dormandy, J. Fate of the patient with chronic leg ischemia / Dormandy J., Mahir H., Ascady G., et al. // J. Cardiovasc. Surg. - 1989. - №30. - P. 50-57.

60. Dragovic, R. A. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using nanoparti-cle tracking analysis / Dragovic R. A., Gardiner C., Brooks A. S., Tannetta D. S., Ferguson D. J., Hole P., Carr B., Redman C. W., Harris A. L., Dobson P. J., Harrison P., Sargent I. L. // Nanomedicine. - 2011. - №7. - P. 780-788.

61. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death // Toxicol Pathol. - 2007. - №35(4) - P. 495-516.

62. Enjeti, A.K. Detection and measurement of microparticles: an evolving research tool for vascular biology / Enjeti A.K., Lincz L.F., Seldon M. // Semin. Thromb. Hemost. - 2007. - Vol.33, №8. - P. 771-779.

63. Epaminondas, D. Principles of miRNA-Target Regulation in Metazoan Models. // IJMS. - 2013. - №14. - P. 16280-16302.

64. Erwig, L.P. Clearance of apoptotic cells by phagocytes / Erwig L.P., Henson P.M. // Cell Death Differ. - 2008. - №15(2). - P. 243-250.

65. Escola, J.M., et al. Selective enrichment of tetraspan proteins on the internal vesicles of multivesicular endosomes and on exosomes secreted by human B-lymphocytes. // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol.273, №32. - P. 20121-20127.

66. Fadok, V.A., et al. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptot-ic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. // J. Immunol. - 1992. - №148(7). - P. 2207-2216.

67. Falcone, G. Signaling by exosomal microRNAs in cancer / Falcone G., Felsani A., D'Agnano I. // J. Exp. Clin. Cancer Res. - 2015. - №34(1). - P. 32.

68. Favaloro, E.J. Platelet function testing: auditing local practice and broader implications / Favaloro E.J., Mohammed S. // Clin. Lab. Sci. - 2010. - №23. - P. 21-31.

69. Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. // Pattern Recognition Letters 27. - 2006. - P. 861-874.

70. Fawcett, T. ROC Graphs: Notes and Practical Considerations for Researchers. // Kluwer Acad. Publ. - 2004. - P. 38.

71. Ferraris, V.A. 2012 Update to The Society of Thoracic Surgeons Guideline on Use of Antiplatelet Drugs in Patients Having Cardiac and Noncardiac Operations / Ferraris V.A., Saha S.P., Oestreich J.H., et al. // Ann. Thorac. Surg. - 2012. - №94. - P. 1761-1781.

72. Franchi, F. Novel antiplatelet agents in acute coronary syndrome / Franchi F., Angiolillo D.J. // Nature Reviews Cardiology. - 2015. - №12(1). - P. 30-47.

73. Franzone, A. et al. Prolonged vs Short Duration of Dual Antiplatelet Therapy After Percutaneous Coronary Intervention in Patients With or Without Peripheral Arterial Disease. // JAMA Cardiol. - 2016. - Vol.1, №7. - P. 795.

74. Frelinger, A.Lr. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in ITP / Frelinger A.Lr., Grace R.F., Gerrits A.J., Berny-Lang M.A., Brown T., Carmichael S.L., et al. // Blood. - 2015. - №126(7). - P.873-879.

75. Friedl, P. The role of thrombospondin-1 in apoptosis / Friedl P., Vischer P., Freyberg M.A. // Cell Mol. Life Sci. - 2002. - №59(8). - P. 1347-1357.

76. Frydrychowicz, M. Exosomes structure, biogenesis and biological role in non-smallcell lung cancer / Frydrychowicz M., Kolecka-Bednarczyk A., Madejczyk M., Yasar S., Dworacki G. // Scand. J. Immunol. - 2015. - №81(1). - P. 2-10.

77. Gaither, C. Consumers' views on generic medications / Gaither C., Kirking D., Ascione F., Welage L. // J. Am. Pharm. Assoc. - 2001. - № 41. - P. 729-736.

78. Garabedian, T. High residual platelet reactivity on clopidogrel: its significance and therapeutic challenges overcoming clopidogrel resistance / Garabedian T, Alam S. // Cardiovasc. Diagn. Ther. - 2013. - Vol.3, №1. - P. 23-37.

79. Gary L. Horowitz. CLSI EP28 Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory. - 2020. - №28. - P. 1-76.

80. Giorgi, M.A. Nonresponders to clopidogrel: pharmacokinetics and interactions involved / Giorgi M.A., Di Girolamo G., González C.D. // Expert Opin. Pharmacother. - 2010. - №11(14). - P. 2391-403.

81. Gomez, Y. Analysis of purity in 19 drug product tablets containing clopidogrel: 18 copies versus the original brand / Gomez Y., Adams E., Hoogmartens J. // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2004. - № 34(2). - P. 341-348.

82. Greenhalgh, T. How to read a paper: the basics of evidence based medicine. 2th ed. London: BMJ Books; - 2001.

83. Gurbel, P.A. Clopidogrel for coronary stenting: response variability, drug resistance, and the effect of pretreatment platelet reactivity. / Gurbel P.A., Bliden K.P., Hiatt B.L., O'Connor C.M. // Circulation. - 2003. - №107(23). - P. 2908-2913.

84. Hadi, V. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells / Hadi Valadi, Karin Ekström, Apostolos Bossios, Margareta Sjöstrand, James J Lee, Jan O Lötvall. // Nat Cell Biol. - 2007. -№9. - P. 654-659.

85. Harrison, P. Screening tests of platelet function: update on their appropriate uses for diagnostic testing / Harrison P., Mumford A. // Semin. Thromb. Hemost. -2009. - №35. - P. 150-157.

86. Hristov, M., et al. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. // Blood. - 2004. - №104(9). - P. 2761-2766.

87. Huili, G. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels / Huili Guo, Nicholas T. Ingolia, Jonathan S. Weissman, David P. Bartel. // Nature. - 2010. - №466. - P. 835-840.

88. Ihara T, et al. The process of ultrastructural changes from nuclei to apoptotic body. // Virchows Arch. - 1998. - №433(5). - P. 443-447.

89. Jaeschke, R. Users' guides to the medical literature. III. How to use an article about a diagnostic test. A. Are the results of the study valid? Evidence-Based Medicine Working Group / Jaeschke R., Guyatt G., Sackett D.L. // JAMA. - 1994. - №271(5). -P. 389-391.

90. Jaeschke, R. Users' guides to the medical literature. III. How to use an article about a diagnostic test. B. What are the results and will they help me in caring for my patients? The Evidence-Based Medicine Working Group / Jaeschke R., Guyatt G.H., Sackett D.L. // JAMA. - 1994. - №271(9). - P. 703-707.

91. Johnstone, R.M. The Jeanne Manery-Fisher Memorial Lecture 1991. Maturation of reticulocytes: formation of exosomes as a mechanism for shedding membrane proteins. // Biochemistry and Cell Biology. - 1992. - №70(3-4). - P. 179-190.

92. Kandere-Grzybowska, K. IL-1 induces vesicular secretion of IL-6 without degranulation from human mast cells / Kandere-Grzybowska K., Letourneau R., Kempuraj D. et al. // J. Immunol. - 2003. - №171. - P. 4830-4836.

93. Kappelmayer, J. The emerging value of P-selectin as a disease marker / Kappelmayer J., Nagy B. Jr., Miszti-Blasius K., Hevessy Z., Setiadi H. // Clin. Chem. Lab. Med. - 2004. - №42(5). - P. 475-486.

94. Kerr, J.F. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics / Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. // Br. J. Cancer. -1972. - №26(4). - P. 239-57.

95. Kicken, C.H. Application of an optimized flow cytometry-based quantification of Platelet Activation (PACT): Monitoring platelet activation in platelet concen-

trates / Kicken C.H., Roest M., Henskens Y.M., de Laat B., Huskens D. // PLoS One. -2017. - №12(2). - P. e0172265.

96. Kim, H.K. Platelet microparticles induce angiogenesis in vitro / Kim H.K., Song K.S., Chung J.H. et al. // Br. J. Haematol. - 2004. - №124. - P. 376-384.

97. Kolh, P. 2014 ESC/EACTS Guidelines on myocardial revascularization: the Task Force on Myocardial Revascularization of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Association for Cardio-Thoracic Surgery (EACTS). Developed with the special contribution of the European Association of Percutaneous Cardiovascular Interventions (EAPCI) / Kolh P., Windecker S., Alfonso F., Collet J.P., Cremer J., Falk V. et al. // Eur J Cardiothorac Surg. - 2014. - №46(4). - P. 517-592.

98. Kristensen, S.D. 2014 ESC/ESA Guidelines on non-cardiac surgery: cardiovascular assessment and management. // Eur. Heart. J. - 2014. - №35(35). - P. 23832431.

99. Laine, M. Platelet reactivity evaluated with the VASP assay following ticagrelor loading dose in acute coronary syndrome patients undergoing percutaneous coronary intervention / Laine M., Toesca R., Berbis J., et al. // Thromb. Res. - 2013. -№132(1). - P. e15-18.

100. Laird, J.R. et al. Durability of Treatment Effect Using a Drug-Coated Balloon for Femoropopliteal Lesions. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2015. - Vol.66, №21. - P. 2329-2338.

101. LaRosa, C.A. Human neutrophil cathepsin G is a potent platelet activator / LaRosa C.A., Rohrer M.J., Benoit S.E., Rodino L.J., Barnard M.R., Michelson A.D. // J. Vasc. Surg. - 1994. - №19(2). - P. 306-318.

102. Larsen, S.B. Platelet Turnover in Stable Coronary Artery Disease Influence of Thrombopoietin and Low-Grade Inflammation / Larsen S.B., Grove E.L., Hvas A.M., Kristensen S.D. // PLoS One. - 2014. - №9(1). - P. e85566.

103. Levine, G.N. 2016 ACC/AHA Guideline Focused Update on Duration of Dual Antiplatelet Therapy in Patients With Coronary Artery Disease: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines: An Update of the 2011 ACCF/AHA/ /SCAI Guideline for Percuta-

neous Coronary Intervention, 2011 ACCF/AHA Guideline for Coronary Artery Bypass Graft Surgery, 2012 ACC/AHA/ACP/AATS/PCNA/ SCAI/STS Guideline for the Diagnosis and Management of Patients With Stable Ischemic Heart Disease, 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of ST-Elevation Myocardial Infarction, 2014 AHA/ACC Guideline for the Management of Patients With Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes, and 2014 ACC/AHA Guideline on Perioperative Cardiovascular Evaluation and Management of Patients Undergoing Noncardiac Surgery. / Levine G.N., Bates E.R., Bittl J.A., Brindis R.G., Fihn S.D., Fleisher L.A. et al.// Circulation. - 2016. - №134(10). - P. e123-e155.

104. Li, X. Platelet-derived microparticles and the potential of glycoprotein IIb/IIIa antagonists in treating acute coronary syndrome / Li X., Cong H. // Tex. Heart Inst. J. - 2009. - №36. - P. 134-139.

105. Lordkipanidze, M. Platelet Turnover in Atherothrombotic Disease. Current Pharmaceutical Design. - 2012. - №18(33). - P. 5328-5343.

106. Lotvall, J. Cell to cell signalling via exosomes through esRNA / Lotvall J., Valadi H. // Cell. Adh. Migr. - 2007. - №1(3). - P. 156-158.

107. Mahla, E. Platelet Function Measurement-Based Strategy to Reduce Bleeding and Waiting Time in Clopidogrel-Treated Patients Undergoing Coronary Artery Bypass Graft Surgery. The Timing Based on Platelet Function Strategy to Reduce Clopidogrel-Associated Bleeding Related to CABG (TARGET-CABG) Study. // Circ. Cardiovasc. Interv. - 2012. - №5. - P. 261-269.

108. Martin, S.J., et al. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J. Exp. Med. - 1995. - №182(5). - P. 1545-1556.

109. Matetzky, S. Clopidogrel resistance is associated with increased risk of recurrent athero-thrombotic events in patients with acute myocardial infarction / Matetzky S., Shenkman B., Guetta V., Shechter M., Beinart R., Goldenberg I. et al. // Circulation. - 2004. - №109(25). - P. 3171-3175.

110. McConnell, R.E., et al. The enterocyte microvillus is a vesicle-generating organelle. // The Journal of Cell Biology. - 2009. - №3. - Р. 185.

111. McEver, R.P. Selectins. // Curr. Opin. Immunol. - 1994. - №6(1). - Р. 7584.

112. Mega, J.L. Cytochrome P450 Genetic Polymorphisms and the Responseto Prasugrel Relationship Pharmacokinetic, Pharmacodynamic, and Clinical Outcomes / Mega J.L., Close S.L., Wiviott S.D., et al. // Circulation. - 2009. - №119. - Р. 25532560.

113. Merolla, M. Centrifugation speed affects light transmission aggregometry / Merolla M., Nardi M.A., Berger J.S. // Int. J. Lab. Hematol. - 2012. - №34(1). - Р. 8185.

114. Mirzaev, K. Cytochrome 2C19 Enzyme Polymorphism Frequency in Different Indigenous Ethnic Groups in Russian Federation: A Systematic Review / Mirzaev K., Sychev D. // J. Pharmacogenomics Pharmacoproteomics. - 2014. - №5. - Р. 3.

115. Morel, O. Impaired platelet P2Y12 inhibition by thienopyridines in chronic kidney disease: mechanisms, clinical relevance and pharmacological options / Morel O., Muller C., Jesel L., et al. // Nephrol Dial Transplant. - 2013. - №28(8). - Р. 1994-2002.

116. Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. // Curr Biol. - 2009. - №87.

117. Muralidharan-Chari, V, et al. Microvesicles: mediators of extracellular communication during cancer progression. // J. Cell Sci. - 2010. - №123.

118. Orme, R. Monitoring Antiplatelet Therapy / Orme R., Judge H.M., Storey R. // Semin. Thromb. Hemost. - 2017. - №43(3). - Р. 311-319.

119. Owens, M.A. Quality control of flow cytometer and reagents. In: Owens MA, Loken MR, editors. Flow cytometry: principles for clinical laboratory practice. Quality assurance for quantitative immunophenotyping / Owens M.A., Loken M.R. // New York: Wiley; - 1995. - pp 45.

120. Pan, B.T. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. // The Journal of Cell Biology. -1985. - №101. - Р. 942-948.

121. Pardee, AB. Multiple Molecular Levels of Cell Cycle Regulation. // J. Cell. Biochem. - 1994. - №54. - Р. 375-378.

122. Poletaev, A.V. Alterations in the parameters of classic, global, and innovative assays of hemostasis caused by sample transportation via pneumatic tube system / Poletaev A.V., Koltsova E.M., Ignatova A.A., Kuprash A.D., Gitelson P.G., Sepoyan A.M., Balandina A.N., Novichkova G.A., Panteleev M.A. // Thromb. Res. - 2018. -№170. - Р. 156-164.

123. Qu, Y. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages / Qu Y., Franchi L., Nunez G. et al. // J. Immunol. - 2007. - №179. - Р. 1913-1925.

124. Rajasekhar, D. Platelet hyporeactivity in very low birth weight neonates / Rajasekhar D., Barnard M.R., Bednarek F.J., Michelson A.D. // Thromb. Haemost. -1997. - №77(5). - Р. 1002-1007.

125. Ratajczak, J. Membrane-derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication / Ratajczak J., Wysoczynski M., Hayek F., Janowska-Wieczorek A., Ratajczak M.Z. // Leukemia. - 2006. - №20. - Р. 14871495.

126. Reid, M.C. Use of methodological standards in diagnostic test research. Getting better but still not good / Reid M.C., Lachs M.S., Feinstein A.R. // JAMA. -1995. - №274(8). - Р. 645-651.

127. Reilly, J.T. Use and evaluation of leukocyte monoclonal antibodies in the diagnostic laboratory: A review. // Clin. Lab. Haem. - 1996. - №18. - Р. 1.

128. Santos, M.T. Enhancement of platelet reactivity and modulation of eico-sanoid production by intact erythrocytes. A new approach to platelet activation and recruitment / Santos M.T., Valles J., Marcus A.J., Safier L.B., Broekman M.J., Islam N., et al. // J. Clin. Invest. - 1991. - №87(2). - Р. 571-580.

129. Sbrana, S. Relationships between optical aggregometry (type Born) and flow cytometry in evaluating ADP-induced platelet activation / Sbrana S., Della Pina F.,

Rizza A., Buffa M., De Filippis R., Gianetti J., Clerico A. // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2008. - №74(1). - Р. 30-39.

130. Schmitz, G. European Working Group on Clinical Cell Analysis: Consensus Protocol for the Flow Cytometric Characterisation of Platelet Function / Schmitz G., Rothe G., Rufl A., Bariage S., Tschope D., Clemetson K.J., et al. // Thromb. Haemost. -1998. - №79(5). - Р. 885-896.

131. Shantsila, E. The role of monocytes in thrombotic disorders. Insights from tissue factor, monocyte-platelet aggregates and novel mechanisms / Shantsila E, Lip GYH. // Thromb. Haemost. - 2009. - №102(05). - Р. 916-924.

132. Shattil, S.J. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb-IIIa complex during platelet activation / Shattil S.J., Hoxie J.A., Cunningham M., Brass L.F. // J. Biol. Chem. - 1985. - №260(20). - Р. 11107-1114.

133. Shrank, W. Patient perceptions of generic medications / Shrank W., Cox E., Fischer M.A., et al. / Health Aff. - 2009. - №28. - Р. 546-556.

134. Sibbing, D. Assessment of ADP-induced platelet aggregation with light transmission aggregometry and multiple electrode platelet aggregometry before and after clopidogrel treatment / Sibbing D, Braun S, Jawansky S, Vogt W, Mehilli J, Schömig A, Kastrati A, von Beckerath N. // Thromb. Haemost. - 2008. - №99(1). - Р. 121-126.

135. Sibbing, D. Platelet aggregation and its association with stent thrombosis and bleeding in clopidogrel-treated patients: initial evidence of a therapeutic window / Sibbing D, Steinhubl SR, Schulz S, et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2010. - №56. - Р. 317-318.

136. Siller-Matula, J.M. Response variability to P2Y12 receptor inhibitors: expectations and reality / Siller-Matula J.M., Trenk D., Schrör K., Gawaz M., Kristensen S.D., Storey R.F. et al. // JACC Cardiovasc Interv. - 2013. - №6(11). - Р. 1111-1128.

137. Simpson, R.J. Extracellular Microvesicles: The Need for Internationally Recognised Nomenclature and Stringent Purification Criteria / Simpson R.J., Mathivanan S. // J. Proteomics Bioinform. - 2012. - №5(ii-ii).

138. Snoep, J.D. Clopidogrel nonresponsiveness in patients undergoing percutaneous coronary intervention with stenting: a systematic review and meta-analysis / Snoep J.D., Hovens M.M., Eikenboom J.C., et al. // Am. Heart. J. - 2007. - №154(2). -P. 221-231.

139. Stone, G.W. Platelet reactivity and clinical outcomes after coronary artery implantation of drug-eluting stents (ADAPT-DES): a prospective multicentre registry study / Stone G.W., Witzenbichler B., Weisz G., et al. // Lancet. - 2013. - №382(9892).

- P. 614-623.

140. Storey, R. Inhibition of ADP-indused P-selectin expression and platelet-leukocyte conjugate formation by clopidogrel and the P2Y12 receptor antagonist AR-C69931MX but not aspirin / Storey R., Judge H., Wilcox R., Heptinstall S. // Thromb. Haemost. - 2002. - Vol.88,№3. - P. 488-494.

141. Strom, B.L. Generic drug substitution revisited. // N. Engl. J. Med. - 1987.

- №316(23). - P.1456-1462.

142. Takizawa, F. Enhancement of macrophage phagocytosis upon iC3b deposition on apoptotic cells / Takizawa F., Tsuji S., Nagasawa S. // FEBS Letters. - 1996. -№397. - P. 269-272.

143. Tantry, U.S. Consensus and update on the definition of on-treatment platelet reactivity to adenosine diphosphate associated with ischemia and bleeding / Tantry U.S., Bonello L., Aradi D., Price M.J., Jeong Y.H., Angiolillo D.J. et al. // J Am Coll Cardiol. - 2013. - №62(24). - P. 2261-2273.

144. Taylor, R.C. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level / Taylor R.C,. Cullen S.P., Martin S.J. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008. - №9(3). - P. 231241.

145. Trenk, D. A Randomised Trial of Prasugrel Versus Clopidogrel in Patients With High Platelet Reactivity on Clopidogrel After Elective Percutaneous Coronary Intervention With Implantation of Drug-Eluting Stents: Results of the TRIGGER-PCI (Testing Platelet Reactivity In Patients Undergoing Elective Stent Placement on Clopidogrel to Guide Alternative Therapy With Prasugrel) Study / Trenk D, Stone GW, Gawaz M, et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2012. - №59. - P. 2159-2164.

146. Vagdatli, E. Platelet distribution width: a simple, practical and specific marker of activation of coagulation / Vagdatli E., Gounari E., Lazaridou E. et al. // Hippokratia. - 2010. - №14. - P. 28-32.

147. Valadi, H. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells / Valadi H, Ekström K, Bossios A. et al. // Nature Cell Biology. - 2007. - №9(6). - P. 654-659.

148. Van Balkom, B.W.M. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells / Van Balkom B.W.M., de Jong O.G., Smits M., Brummelman J., den Ouden K., et. al. // Blood. - 2013. - №121. - P. 3997-4006.

149. Van der Pol, E. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles / Van der Pol E., Boing A.N., Harrison P., Sturk A., Nieuwland R. // Pharmacol. Rev. - 2012. - №64. - №676-705.

150. Vandivier, R.W., et al. Role of Surfactant Proteins A, D, and C1q in the Clearance of Apoptotic Cells In Vivo and In Vitro: Calreticulin and CD91 as a Common Collectin Receptor Complex. // The Journal of Immunology. - 2002. - №169(7). -P. 3978-3986.

151. Windecker, S. 2014 ESC/EACTS Guidelines on myocardial Revascularization / Windecker S., Kolh P., Alfonso F., et al. // Eur. Heart. J. - 2014. - №35(37). - P. 2541-2619.

152. Witzenbichler, B. Relationship between intravascular ultrasound guidance and clinical outcomes after drug-eluting stents: the assessment of dual antiplatelet therapy with drug-eluting stents (ADAPTDES) study. // Circulation. - 2014. - №129(4). -P. 463-470.

153. Wolf, P. The nature and significance of platelet products in human plasma. // Br. J. Haematol. - 1967. - №13. - P. 269-88.

154. Yanez-Mo, M. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions / Yanez-Mo M., Siljander P.R., Andreu Z. et al. // J. Extracell. Vesicles - 2015. - №4. - P. 27066.

155. Yee, D.L. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals / Yee D.L., Sun C.W., Bergeron A.L., Dong J.F., Bray P.F. // Blood. - 2005. -№106(8). - P. 2723-2729.

156. Zhang, H.G. A membrane form of TNF-alpha presented by exosomes delays T cell activation-induced cell death / Zhang H.G., Liu C., Su K. et al. // J. Immunol. - 2006. - №176. - P. 7385-7393.

157. Zwaal, R.F. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells / Zwaal R.F., Schroit A.J. // Blood. - 1997. - №89(4). - P. 1121-1132.