Разработка биокаталитической технологии производства 7-аминоцефалоспорановой кислоты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат технических наук Яхкинд, Михаил Ильич

• Яхкинд, Михаил Ильич
• кандидат технических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат технических наук Яхкинд, Михаил Ильич

Введение

Глава 1. Анализ существующих технологий получения 7-А ЦТС

1.1. Химические способы получения 7-АЦК

1.1.1. Гидролиз и подобные процессы

1.1.2. Реакция с нитрозилхлоридом

1.1.3. Реакция с тетрафторборатом триэтилоксония

1.1.4. Реакция с пятихлористым фосфором

1.1.4.1. При защищенной боковой аминогруппе и обеих карбоксигруп- 20 пах

1.1.4.2. При силильной защите реакционноспособных групп

1.1.4.3. При защите карбоксигрупп смешанными ангидридами

1.1.5. Через 7-тиоацилпроизводные цефалоспорина С

1.1.6. Сопоставление химических способов получения 7-АЦК

1.2. Энзиматические способы получения 7-АЦК

1.2.1. Одностадийное энзиматическое дезацилирование цефалоспорина 33 С

1.2.1.1. Поиск ферментов, способных дезацилировать цефалоспорин С

1.2.1.2. Цефалоспорин С-ацилаза Pseudomonas sp. SE-83 и ее мутанты

1.2.1.3. Цефалоспорин С-ацилаза Pseudomonas sp. N176 и ее мутанты

1.2.1.4. Природные цефалоспорин С-ацилазы других микроорганизмов

1.2.1.5. Условия проведения одностадийного энзиматического дезаци- 40 лирования цефалоспорина С и общая оценка цефалоспорин С-ацилаз

1.2.1.6. Лучшие мутантные цефалоспорин С-ацилазы

1.2.2, Окислительное дезаминирование цефалоспорина С — первая ста- 43 дия двухстадийного энзиматического дезацилирования

1.2.2.1. Действие оксидаз D-аминокислот на цефалоспорин С

1.2.2.2. Оксидаза D-аминокислот Trigonopsis variabilis

1.2.2.3. Получение оксидазы D-аминокислот Т. variabilis при помощи 50 рекомбинантных микроорганизмов

1.2.2.4. Оксидаза D-аминокислот Rhodotorula gracilis

1.2.2.5. Необычные гибридные оксидазы D-аминокислот

1.2.2.6. Оксидазы D-аминокислот из других источников

1.2.2.7. Химический способ дезаминирования цефалоспорина С

1.2.2.8. Определение активности оксидаз D-аминокислот

1.2.2.9. Условия проведения окислительного дезаминирования цефа- 59 лоспорина С

1.2.3. Энзиматическое дезацилирование глутарил-7-АЦК — вторая ста- 64 дия двухстадийного энзиматического дезацилирования

1.2.3.1. Назначение глутарилацилаз

1.2.3.2. Глутарилацилазы Pseudomonas sp. SY-77-1 и GK

1.2.3.3. ГлутарилацилазаPsewdomo^as' sp.

1.2.3.4. Глутарилацилаза Pseudomonas dim inuta KAC

1.2.3.5. Глутарилацилазы других псевдомонад

1.2.3.6. Глутарилацилазы других микроорганизмов

1.2.3.7. Классификация цефалоспоринацилаз

1.2.3.8. Определение активности цефалоспоринацилаз

1.2.3.9. Условия проведения энзиматического дезацилирования глута- 79 рил-7-АЦК

1.2.4. Проведение обеих стадий трансформации цефалоспорина С в 82 7-АЦК

1.2.4.1. Проведение окислительного дезаминирования цефалоспорина С 82 и дезацилирования глутарил-7-АЦК в двух аппаратах

1.2.4.2. Проведение окислительного дезаминирования цефалоспорина С 84 и дезацилирования глутарил-7-АЦК в одном аппарате

1.2.5. Сопоставление энзиматических способов получения 7-АЦК

1.3. Сопоставление химического и энзиматического способов получе- 88 ния 7-АЦК

1.4. Выводы по главе

1.5. Постановка задач исследования

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Исследуемые материалы

2.2. Контрольно-аналитические методы 93 2.3 Химическая схема процесса

2.4. Условия проведения экспериментов

2.4.1. Методика лабораторного эксперимента

2.4.2. Методика опытно-промышленного эксперимента

2.4.3. Методика испытаний на пилотной установке

2.5. Кинетические расчеты

2.6. Выводы по главе

Глава 3. Результаты экспериментов и их обсуждение 118 3.1 Результаты экспериментов

3.1.1. Результаты лабораторных экспериментов

3.1.2. Результаты опытно-промышленных экспериментов

3.1.3. Результаты экспериментов на пилотной установке

3.2. Обсуждение результатов

3.2.1. Влияние начальной концентрации цефалоспорина С на протека- 120 ние процессов

3.2.2. Влияние рН на протекание процессов

3.2.3. Влияние температуры на протекание процессов

3.2.4. Влияние абсолютного давления кислорода на стадии окисления 125 на протекание процессов

3.3. Изучение кинетики энзиматических процессов

3.3.1. Кинетика процесса окисления

3.3.2. Кинетика процесса дезацилирования

3.4. Выбор условий осаждения 7-АЦК

3.5. Выводы по главе

Глава 4. Сравнительный анализ химической и энзиматической техноло- 143 гий получения 7-АЦК, в том числе по воздействию на окружающую среду

4.1. Сравнительный анализ химической и энзиматической технологий 143 получения 7-АЦК

4.2. Сопоставление техногенной нагрузки на атмосферу, гидросферу и 155 литосферу

4.3. Выводы по главе 4 159 Основные результаты и выводы 160 Литература 163 Приложение. Акт апробации технологии

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биокаталитической технологии производства 7-аминоцефалоспорановой кислоты»

Актуальность работы. В ближайшие годы в мире ожидается рост производства продуктов биотехнологии. По оценке известной международной консалтинговой компании McKinsey & Company [1, 2] мировой объем продаж химических продуктов, полученных с использованием биотехнологических процессов, в 2000 г. составлял 53 млрд. евро (5 % всех химических продуктов), в 2005 г. - 77 млрд. евро (7 %), в 2007 г. — 99 млрд. евро (6 %), прогноз на 2010 г. - 125 млрд. евро, на 2012 г. - 153 млрд. евро (9-10 %).

Примерами наиболее массовых производств, в которых биокаталитические процессы заменяют или заменили химические, является получение следующих веществ [3]:

- глюкоза, изоглюкоза, изомальтоза - моносахариды;

- акриламид - мономер для полиакриламидных полимеров;

- L-аспарагиновая кислота - аминокислота;

- аспартам - подслащивающее вещество;

- никотинамид — витамин РР;

- пантотеновая кислота - витамин В6;

- эфедрин - алкалоид;

- 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК) - исходный полупродукт для синтеза полусинтетических пенициллинов;

- 7-аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК) - исходный полупродукт для синтеза полусинтетических цефалоспоринов.

Изучение технологии получения 7-АЦК является предметом данного диссертационного исследования. Мировое производство 7-АЦК в 2003 г. оценивалось в 4000 тонн в год [3], в 2006 г. в 5000 тонн в год [4].

Цефалоспориновые антибиотики, исходным сырьем для которых является 7-АЦК, широко применяются при лечении тяжелых инфекционных заболеваний, имеют широкий спектр действия, малотоксичны, хорошо переносятся. В 32 Фармакопее США (2009 г.) [5] описано 27 цефалоспоринов. В Реестре зарегистрированных лекарственных средств Российской Федерации в январе 2009 г. присутствовало 29 цефалоспоринов, из них разрешена продажа 14, а для 15 истек срок действия регистрации [6]. Общее число цефалоспоринов в мире, разрешенных к применению или дошедших до последних стадий клинических испытаний, превышает 50 [7].

Объем продаж цефалоспоринов в 2005 г. оценивался в 9,7 млрд. долларов США (около 32 %) из около 30 млрд. долларов США мирового объема продаж антибиотиков [8], это первое место среди всех групп антибиотиков.

В России 7-АЦК не производят и поэтому закупают субстанции и готовые лекарственные формы цефалоспориновых антибиотиков за рубежом, что обуславливает их высокую стоимость и снижает лекарственную безопасность государства. В настоящее время производство цефалоспориновых антибиотиков в нашей стране признано приоритетным направлением. В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке оптимальной технологии получения 7-АЦК из цефалоспорина С с учетом новых, появившихся в последние годы знаний и достижений.

В специализированных научных учреждениях - Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков (ВНИИА), позже Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА), и его Пензенском филиале (ПФ ВНИИА, ПФ ГНЦА), позже Пензенском научно-исследовательском и технологическом институте антибиотиков (ПНИТИА), начиная с 1981 г. по госзаказам № 103, 42-0263-02 и 140-187-БМ проводились исследования и разработка вначале химической, а затем энзиматической технологии промышленного получения 7-АЦК. После ликвидации ПНИТИА научно-исследовательская работа продолжена в Пензенской государственной технологической академии при поддержке РФФИ, гранты № 07-08-00557, 09-08-07049.

Актуальность указанной проблемы определила выбор направления исследования и основное содержание работы.

Цели и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлась разработка биокаталитической технологии производства 7-АЦК для промышленного освоения на российских предприятиях.

Для реализации поставленной цели автором сформулированы и решены следующие задачи:

- проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК и выбраны наиболее перспективные;

- на основе выбранных вариантов разработаны опытно-промышленные технологии получения 7-АЦК с учетом особенностей отечественного производства;

- проведен сравнительный анализ воздействия этих опытно-промышленных технологий на окружающую среду;

- предложена безопасная ресурсосберегающая биокаталитическая технология производства 7-АЦК для отечественных предприятий.

Научная новизна.

- в соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматиче-ских стадий синтеза 7-АЦК выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: температура, рН и оптимальная начальная концентрация цефалоспорина С.

- установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзимати-ческого синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода глутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установлено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилиро-вания и осаждения.

- предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзима-тических стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости Кр зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования - модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы Fmax и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.

- установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости Кр как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления Рпр, при котором скорость реакции перестает зависеть от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы Vmax как характеристики массопередачи.

Практическая значимость работы.

- разработана опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезаци-лированием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно использовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухста-дийного энзиматического дезацилирования (ОПР 64-0263-55-2000); технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263-15-2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) на пилотной установке.

- проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньше; расход питьевой воды в 11 раз меньше; выбросы в атмосферу в 24 раза меньше; количество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзиматической технологии (79 %) больше, чем при химической (76 %).

- даны рекомендации для масштабирования разработанных процессов в промышленном оборудовании.

На защиту выносятся.

- технологические решения по условиям проведения процесса двухста-дийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С и осаждения целевого продукта;

- установленные зависимости протекания всех стадий энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного де-заминирования; кинетические модели для стадии окисления и стадии дезацилирования процесса синтеза 7-АЦК; предложения по масштабированию разработанных процессов в промышленном оборудовании; результаты сравнительного анализа воздействия на окружающую среду энзиматической и химической технологии получения 7-АЦК;

- опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК двухстадийным энзиматическим дезацилированием с использованием иммобилизованных ферментов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: Всесоюзной конференции «Биосинтез вторичных метаболитов» (Пу-щино, 1987); Всесоюзной конференции «Наука и производство в решении комплексной проблемы «Антибиотики» (Москва, 1989); IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Юрмала, 1991); V Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2006); III Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2006); IX Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2006); I Международном конгрессе «Экология и безопасность жизнедеятельности про-мышленно-транспортных комплексов» (Тольятти, 2007); IV Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2007); XXIII Международном симпозиуме «Новые технологии в образовании, науке и экономике» (Москва - Сидней, 2008); XXIV Международном симпозиуме «Новые технологии в образовании, науке и экономике» (Москва

- Сингапур, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, и две монографии.

Автор выражает признательность всем сотрудниками ПНИТИА и ОАО «Биосинтез» (г. Пенза), которые работали вместе с ним при воспроизведении технологий на опытной и пилотной установках.

1. Анализ существующих технологий получения 7-АЦК

История цефалоспоринов началась с того, что итальянский ученый Дж. Бротцу обнаружил, что несовершенный гриб вида Cephalosporium acremo-nium (в настоящее время именуемого Acremonium chrysogenum), выделенный им из проб, взятых в море около места сброса сточных вод г. Кальяри на о. Сардиния в 1945 г., выделяет вещество или вещества, которые подавляют рост ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий [9]. В своей работе он использовал фильтрат культуральной жидкости и концентрат, полученный из него после осаждения неактивных продуктов этанолом, выделить активные вещества ему не удалось из-за отсутствия возможностей и финансирования.

В связи с этим Дж. Бротцу в 1948 г. передал свой штамм С. acremonium британским ученым, которые начали его изучение. Основные исследования велись в Оксфордском университете под руководством известного ученого Э.П. Абрахама, который в годы II мировой войны принимал активное участие в работах по пенициллину [10]1.

В результате из фильтрата культуральной жидкости этого микроорганизма вначале, в 1952 г., был выделен цефалоспорин N (I) [11-13]. Было установлено, что он является пенициллином [14], почему позже его стали называть пенициллином N. Также было найдено, что цефалоспорин N идентичен синнематину В, антибиотику, выделенному ранее из культуральной жидкости грибка Cephalosporium salmosynnematum [15-17] (позже названного Emericellopsis salmosynnematum). А затем, в 1955 г., был выделен цефалоспорин С (И) [18-20]. Его структура [21, 22] оказалась близкой к структуре пени-циллинов.

Хотя цефалоспорин N и является пенициллином, грибки вида Penicil-lium chrysogenum и других видов Penicillium, которые продуцируют природ

1 В обзоре [10], соавтором которого является Э.П. Абрахам, в частности, описана история открытия цефа-лоспорина С. ные (биосинтетические) пенициллины, не образуют это вещество. Кроме С. acremonium и Е. salmosynnematum его продуцируют некоторые другие виды Cephalosporium и Emericellopsis, а также некоторые виды Streptomyces и Рае-cilomyces persicinus. Цефалоспорин С кроме С. acremonium продуцируют некоторые штаммы Emericellopsis terricola [10].

Когда были выяснены механизмы биосинтеза природных пеницилли-нов и цефалоспорина С [23], было установлено, что на начальных стадиях они одинаковы. При этом из L-a-аминоадипиновой кислоты (III), L-цистеина (IV) и L-валина (V) образуется трипептид а-аминоадипил-цистеинил-валин

VI), который циклизируется с образованием общего предшественника всех биосинтетических пенициллинов и цефалоспорина С — изопенициллина N

VII) (рис. I)2. Изопенициллин N и пенициллин N являются оптическими изомерами, 5 атом углерода в боковой цепи в изопенициллине N имеет исходную L-конфигурацию, а в пенициллине N - обращенную D-конфигура-цию.

При биосинтезе природных пенициллинов (кроме пенициллина N) далее идет замена ацильного радикала у аминогруппы в 6 положении изопенициллина N (VII)3 (реакция переацилирования) с образованием различных биосинтетических пенициллинов (например, бензилпенициллина (VIII).

При биосинтезе цефалоспорина С следующая стадия - изомеризация изопенициллина N (VII) в пенициллин N (I) (который, следовательно, является предшественником цефалоспорина С). Далее последовательно идут процессы расширения цикла (I) с образованием З'-дезацетоксицефалоспорина С (IX), окисления (IX) с образованием З'-дезацетилцефалоспорина С (X), и аце-тилирования (X) с образованием цефалоспорина С (II).

2 Все процессы идут под действием соответствующих ферментов.

3 Общепринятая нумерация атомов в ядре пенициллинов (пенам) [24] и ядре цефалоспоринов (цефам, при наличии двойной связи между 3 и 4 атомами - 3-цефем) [25]. Для цефалоспоринов атом 3' - атом углерода боковой группы, соседний с 3 атомом ядра. Nпенам

Цефам ноос. nh2

III ноос nh2

S. CH, ноос

0 / о' VIII

-СНз -<соон nh, ноос nh, он h2n l sh

СНз сн. л. су^он h2n" 'соон IV V sh fC сн3

СНз а

COOH

VI

S СНз У

VII

I.

СНз

СООН

0 У

СНз -СНз л<

СООН

НООС nh2

НООС nh2 У

IX t н

N„

СНз

СООН 0

НООС nh2

СООН X о

СНз

СООН

II

Рис. 1. Схема биосинтеза пенициллинов и цефалоспорина С

При этом в цефалоспорине С 5 атом углерода в боковой цепи имеет D-конфигурацию, как и в пенициллине N. Считают, что именно с этим связана невозможность переацилирования пенициллина N и цефалоспорина С, в отличие от изопенициллина N, и невозможность получения других био синтетических цефалоспоринов [23, с. 190].

Поскольку в молекулах цефалоспорина С и его полусинтетических производных, как и в молекулах всех пенициллинов, присутствует Р-лактам-ное ядро, цефалоспорины и пенициллины по современной классификации входят в группу |3-лактамных антибиотиков.

Следует отметить, что биосинтетические пенициллины изначально имели высокую антибиотическую активность, но достаточно узкий спектр действия, в основном против грамположительных бактерий.

Цефалоспорин С, напротив, при широком спектре действия, в том числе против грамотрицательных бактерий, обладал относительно невысокой активностью. И, в отличие от пенициллинов, не удалось получить другие биосинтетические цефалоспорины. Поэтому сразу встал вопрос о получении полусинтетических цефалоспоринов с более высокой активностью. Подход при этом был такой же, как при получении полусинтетических пенициллинов.

Было найдено, что из природных пенициллинов отщеплением ацильно-го радикала у аминогруппы в 6 положении (реакция дезацилирования) можно получить 6-аминопенициллановую кислоту (6-АПК) (XI). Фермент, осуществляющий эту реакцию, пенициллинацилаза (пенициллинамидаза), впервые был обнаружен у P. chrysogenum [26].

6-АПК вначале была получена при биосинтезе в отсутствии предшественников боковой цепи [27, 28], но вскоре было обнаружено, что ее удобнее получать дезацилированием бензилпенициллина с использованием пеницил-линацилаз различного происхождения [29-32] (почти одновременные сообщения четырех исследовательских групп).

Н2М„ з СИ, У

СНз чсоон

XI

Ацилированием аминогруппы 6-АПК были получены многочисленные полусинтетические пенициллины.

Подобным образом из цефалоспорина С отщеплением ацильного радикала у аминогруппы в 7 положении можно получить 7-аминоцефалоспорано-вую кислоту (7-АЦК) (XII). Это вещество вначале было получено кислотным гидролизом цефалоспорина С [33, 34]. соон о

XII

7-АЦК стала исходным продуктом для синтеза большой группы полусинтетических цефалоспоринов. При этом у него больше возможностей для модификации, чем у 6-АПК, поскольку, помимо ацилирования аминогруппы в 7 положении, возможны также различные реакции замещения в 3 положении.

Как было отмечено выше, достаточно быстро был найден удобный эн-зиматический способ получения 6-АПК из пенициллинов. В связи с этим химические способы, специально предложенные для получения 6-АГЖ [35-37], практического применения не нашли.

Напротив, для 7-АЦК долго не удавалось найти энзиматический способ получения этого вещества из цефалоспорина С. В связи с этим вначале были разработаны химические методы, причем некоторые из них также можно использовать для получения 6-АПК из пенициллинов.

Обзор работ, посвященных химическим методам получения 7-АЦК из цефалоспорина С, приведен в [38]4. Известные химические методы можно подразделить на следующие группы:

- гидролиз и подобные процессы;

- реакция с нитрозилхлоридом;

- реакция с тетрафторборатом триэтилоксония;

- реакция с пятихлористым фосфором;

- через 7-тиоацилпроизводные цефалоспорина С.

Энзиматические методы получения 7-АЦК из цефалоспорина С можно подразделить на две группы:

- одностадийное энзиматическое дезацилирование;

- двухстадийное энзиматическое дезацилирование, включающее предварительное окислительное дезаминирование и последующее энзиматическое дезацилирование.

Обзор этих методов приведен ниже.

4 Этот обзор также охватывает и способы получения 6-АПК из пенициллинов.

15

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Яхкинд, Михаил Ильич

Основные результаты и выводы

1. Проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК из цефалоспорина С и выбран наиболее перспективный вариант — двухстадийное энзиматическое дезацилирование, включающее окислительное дезаминирование цефалоспорина С до глутарил-7-АЦК и дезацилирование последней до 7-АЦК.

2. Произведен поиск и выбор иммобилизованных ферментов, осуществляющих обе основные стадии двухстадийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С — оксидазы D-аминокислот Т. variabilis и глутарилацилазы Acinetobacter sp., рекомбинантной в Е. coli.

3. В соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматических стадий выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: для стадии окислительного дезаминирования: температура (20±1)°С, рН 7,2±0,1; для стадии дезацилирования: температура (20±1)°С, рН 8,1±0,1. Оптимальная начальная концентрация цефалоспорина С-кислоты - 30-33 г/л (72-79 ммоль/л).

4. Установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода глутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установлено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилирования и осаждения.

5. Предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзима-тических стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости КР зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования — модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы Ктах и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.

6. Установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости КР как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления Рпр, при котором скорость реакции перестает зависеть от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы Fmax как характеристики массопередачи.

7. Проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньше; расход питьевой воды в 11 раз меньше; выбросы в атмосферу в 24 раза меньше; количество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзиматической технологии (79 %) больше, чем при химической (76 %).

8. Разработана опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезацилированием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно использовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухстадийного энзиматического дезацилирования (ОПР 64-0263-55-2000); технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263-15-2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) на пилотной установке.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Яхкинд, Михаил Ильич, 2010 год

1. Perspective on Bio-based Chemicals and Biofuels. EuropaBio Open Day, Brussels, June 14, 2007. McKinsey & Company, June 2007.

2. Riese J. White Biotechnology. Press briefing. McKinsey & Company, February 2009.

3. White Biotechnology: Opportunities for Germany. Position Paper of DECHEMA e.V. November 2004.

4. Case study: Cephalosporin. // Consequences, Opportunities and Challenges of Modern Biotechnology for Europe (BI04EU) — Task 2. Report 3 / Deliverable 21. European Techno-Economic Policy Support Network (ETEPS network), September 2007. 57-73.

5. United States Pharmacopeia 32 National Formulary 27. The United States Pharmacopeial Convention, Inc., 2008.

6. Реестр зарегистрированных лекарственных средств (вер. 1.4.14.93). ФГУ НЦЭСМП. База данных: январь 2009 г.

7. Курочкина В. Б., Ныс П. С. Новые беталактамные структуры. Проблемы конструирования. // Антибиот. химиотер. 2002. 47, № 2: 29-37.

8. Injectable Generic Drugs: Prospects and Opportunities to 2010. Espicom Healthcare Intelligence, 2006.

9. G. Brotzu. Ricerche su di un nuovo antibiotico. Lavori delPIstituto di Igiene di Cagliari. Cagliari, 1948.

10. Abraham E. P., Loder P. B. Cephalosporin C. // Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and Biology. Flynn E., ed. Academic Press, New York, 1972. 1-26.

11. Патент 745208, Великобритания, 1956. Improvements relating to the production of an antibiotic substance by a Cephalosporium species.

12. Abraham E. P., Newton G. G. F., Crawford 1С., Burton H. S., Hale C. W. Cephalosporin N: a new type of penicillin. //Nature. 1953. 171: 343.

13. Abraham E. P., Newton G. G. F., Hale C. W. Purification and some properties of cephalosporin N, a new penicillin. // Biochem. J. 1954. 58: 94-102.

14. Newton G. G. F., Abraham E. P. Degradation, structure and some derivatives of cephalosporin N. // Biochem. J. 1954. 58: 103-111.

15. Патент 2658018, США, 1953. Synnematin and process of producing the same.

16. Olson В. H., Jennings J. C., Junek A. J. Separation of synnematin into components A and В by paper chromatography. // Science. 1953. 117: 76-78.

17. Abraham E. P., Newton G. G. F., Olson В. H., Schuurmans D. M., Schenck J. R., Hargie M. P., Fisher M. W., Fusari S. A. Identity of cephalosporin N and synnematin B. //Nature. 1955. 176: 551.

18. Патент 810196, Великобритания, 1959. Cephalosporin С.

19. Newton G. G. F., Abraham E. P. Cephalosporin C, a new antibiotic containing sulphur and D-a-aminoadipic acid. //Nature. 1955. 175: 548.

20. Newton G. G. F., Abraham E. P. Isolation of cephalosporin C, a penicillinlike antibiotic containing D-a-aminoadipic acid. // Biochem. J. 1956. 62: 651-658.

21. Abraham E. P., Newton G. G. F. The structure of cephalosporin C. // Biochem. J. 1961.79:377-393.

22. Hodgkin D. C., Maslen E. N. The X-ray analysis of the structure of cephalosporin C. //Biochem. J. 1961. 79: 393-402.

23. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. Пер. с англ. М.: Мир, 1985. 272 с.

24. Sheehan J. С., Henery-Logan К. R., Johnson D. A. The synthesis of substituted penicillins and simpler structural analogs. VII. The cyclization of a penicilloate derivative to methyl phthalimidopenicillanate. // J. Amer. Chem. Soc. 1953. 75: 3292-3293.

25. Morin R. В., Jackson B. G., Flynn E. H., Roeske R. W. Chemistry of cephalosporins antibiotics. I. 7-Aminocephalosporanic acid from cephalosporin C. // J. Amer. Chem. Soc. 1962. 84: 3400-3401.

26. Sakaguchi K., Murao S. A preliminary report on a new enzyme, "penicillin-amidase". //J. Agr. Chem. Soc. Japan. 1950. 23: 411.

27. Патент 870396, Великобритания, 1961. Improvements in or relating to substances produced by penicillin-producing moulds.

28. Batchelor F. R., Doyle F. P., Nayler J. H. C., Rolinson G. N. Synthesis of penicillin: 6-aminopenicillanic acid in penicillin fermentations. // Nature.1959. 183: 257-258.

29. Rolinson G. N., Batchelor F. R., Butterworth D., Cameron-Wood J., Cole M., Eustace G. C., Hart M. V., Richards M., Chain E. B. Formation of 6-aminopenicillanic acid from penicillin by enzymatic hydrolysis. // Nature.1960. 187: 236-237.

30. Claridge C. A., Gourevitch A., Lein J. Bacterial penicillin amidase. // Nature. 1960. 187: 237-238.

31. Huang H. Т., English A. R., Seto T. A., Shull G. M., Sobin B. A. Enzymatic hydrolysis of the side chain of penicillins. // J. Amer. Chem. Soc. 1960. 82: 3790-3791.

32. Kaufmann W., Bauer K. Enzymatische Spaltung und Resynthese von Penicillin. //Naturwissenschaften. 1960. 47: 474-475.

33. Патент 953695, Великобритания, 1964. Derivatives of cephalosporin C.

34. Loder В., Newton G. G. F., Abraham E. P. The cephalosporin С nucleus (7-aminocephalosporanic acid) and some of its derivatives. // Biochem. J. 1961.79:408-416.

35. Патент 3107250, США, 1963. Process for the preparation of 6-aminopenicillanic acid and novel intermediates useful therein.

36. Патент 3271409, США, 1966. Chemical conversion of nitro-penicillins to 6-aminopenicillanic acid.

37. Johnson D. A., Panetta C. A., Smith R. R. Nonenzymatic conversion of penicillins to 6-aminopenicillanic acid. // J. Org. Chem. 1966. 31: 25602564.

38. Huber F. M., Chauvette R. R., Jackson B. G. Preparative methods for 7-aminocephalosporanic acid and 6-aminopenicillanic acid. // Cephalosporins and

39. Penicillins, Chemistry and Biology. Flynn E., ed. Academic Press, New York, 1972. 27-73.

40. Патент 3167549, США, 1965. Derivatives of 7-aminocephalosporanic acid.

41. Патент 3167550, США, 1965. Derivatives of 7-aminocephalosporanic acid.

42. Патент 3296258, США, 1967. 7-(Imidazolidinyl-butyryl)-aminocephalo-sporanic acids.

43. Патент 3454564, США, 1969. Therapeutically active derivatives of 7-ami-no-cephalosporanic acid and process for the manufacture of 7-amino-cepha-losporanic acid.

44. Патент 1027750, Великобритания, 1966. 7-Aminocephalosporanic acids and derivatives thereof.

45. Патент 3503964, США, 1970. Process for the manufacture of esters of 7-aminocephalosporanic acid.

46. Fechtig В., Peter H., Bikel H., Vischer E. Modifikationen von Antibiotika. 2 Mitteilung. Uber die Darstellung von 7-Amino-cephalosporansaure. // Helv. Chim. Acta. 1968.51: 1108-1119.

47. Патент 3188311, США, 1965. Process for the preparation of 7-aminocepha-losporanic acids.

48. Morin R. В., Jackson B. G., Flynn E. H., Roeske R. W., Andrews S. L. Chemistry of cephalosporin antibiotics. XIV. The reaction of cephalosporin С with nitrosyl chloride. // J. Amer. Chem. Soc. 1969. 91: 1396-1400.

49. Патент 1017534, Великобритания, 1966. Improvements in or relating to the production of 7-aminocephalosporanic acid.

50. Патент 3594370, США, 1971. Production of 7-aminocephalosporanic acid.

51. Патент 3507862, США, 1970. Cleavage of cephalosporin C.

52. Патент 3594371, США, 1971. Preparation of 7-aminocephalosporanic acid.

53. Barber M. S., Giesecke U., Reichert A., Minas W. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based P-lactams. // Adv. Biochem. Eng./Biotech-nol. 2004. 88: 179-215.53.