Разработка экспресс-метода анализа опухолевых тканей на основе масс-спектрометрии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бормотов Денис Сергеевич

• Бормотов Денис Сергеевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Бормотов Денис Сергеевич

1.4.2 Регрессионный анализ

2 Ионный источник для быстрого анализа образцов тканей

2.1 Соединение одноразового эмиттера с картриджем

2.2 Методы

2.2.1 Экстракция и ионный источник

2.2.2 Образцы тканей

2.2.3 Расходные материалы

2.2.4 Измерения масс-спектров

2.3 Результаты

2.3.1 Практика применения картриджа с одноразовым эмиттером для анализа тканей

2.3.2 Сравнение с другими методами прямой ионизации

2.3.3 Анализ влияния использования одноразового эмиттера на

молекулярные профили

3 Сравнение ионизации при помощи одноразового эмиттера с ионизацией при помощи многоразового ионного источника электрораспыления

3.1 Методы

3.2 Результаты и обсуждение

4 Анализ клинических образцов и определение доли опухолевых клеток

4.1 Методы

4.2 Результаты и обсуждение

5 Анализ изменений липидного состава в глиомах IV степени злокачественности

5.1 Методы

5.1.1 Экстракция липидов и масс-спектрометрический анализ

5.1.2 Отбор ионов, характерных для глиомы IV степени злокачественности

5.2 Результаты

Заключение

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка экспресс-метода анализа опухолевых тканей на основе масс-спектрометрии»

Введение

В настоящее время, наиболее распространённым подходом к лечению злокачественных опухолей является их удаление. Перед хирургом стоит задача наиболее полного иссечения опухоли, но также минимизации негативных последствий для пациента, связанных с удалением прилегающих к опухоли тканей. Последнее особенно существенно в области нейрохирургии, где расстояние между опухолью и жизненно важными участками головного мозга может составлять 1 сантиметр. Задача усложняется врастанием наиболее злокачественных опухолей в прилежащую ткань, сложностью или невозможностью визуального определения границы опухоли, и фактом механической деформации тканей при удалении близких к ним участков.

В помощь хирургу разработан ряд различных методов определения положения и границ опухоли. В первую очередь, следует говорить о магнитно-резонансной томографии (МРТ). Как правило, МРТ применяется до операции, и потому не может учитывать эффекты механического смещения во время иссечения; интраоперационные варианты МРТ существуют, но всё ещё требуют остановки операции на существенное время (что, в частности, увеличивает риски, связанные с анестезией). Флуоресцентные методы, задействуя косвенные и не обязательно специфичные для опухоли признаки (такие, как накопление протопорфирина IX), применимы в некотором наборе частных случаев, как и ультразвуковое исследование, полагающееся на различия в плотности тканей. «Золотым стандартом» для определения границы опухоли является гистологический анализ замороженных срезов, однако, он занимает порядка 30 минут

и требует работы квалифицированного врача-гистолога, что ограничивает возможности его применения единичными образцами на каждую операцию. Ней-ронавигация в целом является активно развивающейся областью исследований.

Масс-спектрометрия позволяет решать задачи, связанные с анализом сложных смесей веществ, таких, как биологические образцы. Именно масс-спектрометрические методы используются при анализе сразу широкого класса молекул, т. е. в протеомике, липидомике и др. Однако, наиболее устоявшиеся методики для таких исследований включают не только непосредственно измерение масс-спектров, но и пробоподготовку, как правило, занимающую несколько часов. Лишь начиная с середины 2000-х годов активно и целенаправленно разрабатываются методы «прямой масс-спектрометрии» - то есть методы, исключающие пробоподготовку или по крайней мере наиболее времязатратные её шаги.

Применение методов прямой масс-спектрометрии для анализа образцов тканей, полученных при помощи биопсии (или даже in vivo), в ходе решения клинических задач, имеющих ограничения по времени, представляется, таким образом, логичной идеей. Существующие работы в данной области большей частью основаны на методах быстрой масс-спектрометрии с ионизацией при испарении (Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry, REIMS) и десорбции/ионизации в электроспрее (Desorbtion/Electrospray Ionization, DESI), а также устройств MassSpec Pen и SpiderMass. Их применение, впрочем, связано либо с всё ещё относительно сложной пробоподготовкой (варианты DESI, в которых используются срезы тканей), либо с плохой воспроизводимостью условий десорбции и ионизации.

В данном исследовании совместно применяется гистологический и масс-спектрометрический анализ образцов рутинной клинической биопсии, и по их результатам строится регрессионная модель, предназначенная для определения доли опухолевых клеток образца ткани головного мозга непосредственно по его масс-спектрам, исключая, таким образом, длительную пробоподготов-

ку. В силу деструктивности обоих методов анализа (гистологического и масс-спектрометрического), невозможно анализировать ими один и тот же фрагмент ткани и получить напрямую сопоставленные ДОК и масс-спектры. Поэтому, в работе предлагается и применяется оценка ДОК фрагмента ткани, полученная путём гистологического анализа соседних фрагментов. Такой подход, вместе с предложенными в работе существенными модификациями метода проточной экстракции в картридже, позволил добиться определения доли опухолевых клеток в образце по его молекулярным профилям, получение которых занимает менее 3 минут и не требует участия квалифицированного гистолога - в отличие от применяемых в клинической практике методов экспресс-гистологии, занимающих приблизительно 20-30 минут. В работе рассмотрены не только затраты времени, но и стабильность и воспроизводимость получаемых молекулярных профилей, в том числе в сравнении с другими методами прямой масс-спектрометрии, а также связь наблюдаемых различий в молекулярных профилях с метаболическими изменениями в глиомах по сравнению с неопухолевой тканью головного мозга.

Целью настоящей работы являлась разработка масс-спектрометрического метода определения доли опухолевых клеток в образце иссекаемой патологической ткани головного мозга, который может быть применён непосредственно в процессе нейрохирургического вмешательства по резекции опухоли. Реализация поставленной цели основывалась на последовательном решении следующих задач:

1. Разработка ионного источника на базе микроэкстракции и последующего электрораспыления, и создание на его основе экспрессного метода получения молекулярных профилей образцов опухолевых тканей.

2. Оценка воспроизводимости молекулярных профилей, получаемых с использованием разработанного метода, и влияния случайных факторов, связанных с особенностями реализации метода, на получаемые данные.

3. Разработка автоматизированного метода оценки доли опухолевых клеток на основе молекулярных профилей образцов патологических тканей головного мозга.

4. Выявление биохимических особенностей глиальных опухолей, отвечающих за наблюдаемые различия в молекулярных профилях.

Научная новизна работы определяется тем, что в ней впервые:

1. Предложен подход к встраиванию одноразовых эмиттеров электрораспыления в микроэкстракционный картридж путем заплавления кварцевого капилляра PEEK-пластиком, что позволило исключить кросс-контаминацию и ускорить каждый единичный цикл анализа биологического образца;

2. При помощи косинусной метрики подобия и анализа главных компонент продемонстрирована однородность молекулярных профилей, получены количественные характеристики стабильности и воспроизводимости сигнала в методе проточной экстракции в картридже с использованием одноразовых эмиттеров и с использованием рутинного ионного источника электрораспыления;

3. Предложен подход к получению оценки доли опухолевых клеток по молекулярным профилям, полученным методом проточной экстракции в картридже;

4. Продемонстрировано выделение набора молекулярных маркеров, определяемых при помощи метода проточной экстракции в картридже, которые являются наиболее статистически значимыми для построения классификатора по молекулярным профилям образцов.

Теоретическая и практическая значимость

Разработанные подходы для изготовления и применения одноразовых эмиттеров электрораспыления, обеспечивающие стабильность и воспроизводимость сигнала не хуже, чем рутинные многоразовые ионные источники, расширяют возможности применения ионизации электрораспылением в условиях, когда необходимо исключить кросс-контаминацию спектров образцов.

Разработанный метод построения регрессионной модели для определения доли опухолевых клеток в образце ткани, включая предложенный в работе способ оценки доли опухолевых клеток в целях обучения и проверки регрессора, позволяют, при условии использования большего количества образцов, определять долю опухолевых клеток без привлечения высококвалифицированного специалиста, что отличает метод от гистологического анализа замороженных срезов, применяемых для этой цели сейчас. В частности, так может производиться предварительная проверка пригодности образцов для иммуногистохи-мических исследований, при применении которых к образцам с недостаточной долей опухолевых клеток получаются ложноотрицательные результаты.

Выявленный набор молекулярных маркеров, наиболее статистически значимо различающихся в образцах глиальных опухолей высшей степени злокачественности и образцах неопухолевых патологий, позволил сопоставить молекулярные профили, получаемые методом проточной экстракции в картридже, с имеющейся теорией изменения метаболизма при злокачественной трансформации в глиальных опухолях.

Материалы диссертации были представлены на следующих международных и всероссийских конференциях:

1. 24th International Mass Spectrometry Conference (Маастрихт, Нидерланды,

2022),

2. 4th Sechenov International Biomedical Summit (Москва, 2020),

3. 16th International Symposium on Bioinformatics Research and Applications (Москва, 2020)

По материалам диссертации опубликованы 5 печатных работ, из которых 1 статья в научном журнале из Q1, 1 статья в научном журнале из Q2, 2 статьи в научных журналах из Q4, и 1 тезисы докладов.

Публикации в журналах, индексируемых в WoS и Scopus:

1. Bormotov, D. S., Eliferov, V. A., Peregudova, O. V., Zavorotnyuk, D. S., Bocharov, K. V., Pekov, S. I., Sorokin, A. A., Nikolaev, E. N., Popov, I. A. Incorporation of a Disposable ESI Emitter into Inline Cartridge Extraction Mass Spectrometry Improves Throughput and Spectra Stability // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. — 2023. — V. 34, N. 1. — P. 119-122. — PMID: 36535019.

2. Pekov, S. I., Bormotov, D. S., Nikitin, P. V., Sorokin, A. A., Shurkhay, V. A., Eliferov, V. A., Zavorotnyuk, D. S., Potapov, A. A., Nikolaev, E. N., Popov, I. A. Rapid estimation of tumor cell percentage in brain tissue biopsy samples using inline cartridge extraction mass spectrometry // Analytical and Bioanalytical Chemistry. — 2021. — V. 413, N. 11. — P. 2913-2922.

3. Pekov, S. I., Sorokin, A. A., Kuzin, A. A., Bocharov, K. V., Bormotov, D. S., Shivalin, A. S., Shurkhay, V. A., Potapov, A. A., Nikolaev, E. N., Popov, I. A. Analysis of Phosphatidylcholines Alterations in Human Glioblastomas Ex Vivo // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. — 2021. — V. 15, N. 3. — P. 241-247.

4. Ivanov, D. G., Pekov, S. I., Bocharov, K. V., Bormotov, D. S., Spasskiy, A. I., Zhvansky, E. S., Sorokin, A. A., Eliferov, V. A., Zavorotnyuk, D. S., Tkachenko, S. I., Khaliullin, I. G., Kuksin, A. Y., Shurkhay, V. A., Kononikhin, A. S., Nikolaev, E. N., Popov, I. A. Novel Mass Spectrometric Utilities for

Assisting in Oncological Surgery // Russian Journal of Physical Chemistry B.

— 2020. — V. 14, N. 3. — P. 483-487

Публикации в сборниках материалов и тезисов конференций:

1. Bormotov D.S., Pekov S.I., Zhvansky E.S., Nikitin P.V., Sorokin A.A.,

Shurkhay V.A., Eliferov V.A., Zavorotnyuk D.S., Potapov A.A., Popov I.A.

A method for Rapid Evaluation of Tumor Cell Percentage in Biopsy Samples.

- Abstracts Book Sechenov International Biomedical Summit 2020, 17.11 -

18.11.2020, Moscow, Russia. М.: Publishing house of Sechenov University,

2020, p. 52. ISBN 978-5-6045848-4-2

Автор участвовал в постановке задачи под руководством научного руководителя. Использование одноразовых эмиттеров, способ их соединения с картриджем, а также способ оценки доли опухолевых клеток путём разделения образца на фрагменты, предложены автором. Экспериментальные данные были получены автором вместе с соавторами опубликованных работ. Автор участвовал в обработке и анализе данных. Подготовка результатов и текстов статей осуществлялась совместно с соавторами. Представление результатов в виде устных докладов на двух конференциях было выполнено лично автором.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, 5-и глав, заключения, и библиографии. Общий объем диссертации составляет 119 страниц, включая 16 рисунков и 3 таблицы. Библиография включает 142 наименования.

Глава 1

Литературный обзор

В условиях современной нейрохирургии, существует и рутинно применяется ряд высокотехнологичных методов диагностики как до, так и непосредственно во время операции, в том числе магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ), флуоресцентное мечение и ультразвуковое исследование, наряду с гистопатологическим анализом иссечённых при биопсии образцов. Несмотря на это, принятые решения во время операции всё ещё сильно зависят от опыта и субъективной оценки хирурга. Сложность решений связана с двойственностью цели хирурга - необходимо добиться полного иссечения опухоли, но при этом сохранить важные зоны головного мозга, разрушение которых может привести к параличу, когнитивным нарушениям и смерти пациента [1, 2]. Совершенствование процесса принятия таких решений является целью исследований в области нейронавигации [1, 3, 4], в которых рассматриваются задачи учёта смещения мозга, предотвращения вреда для жизненно важных зон головного мозга, и оптимизации доступа к опухоли, так, чтобы минимально повредить волокна белого вещества [4]. Пространственная точность имеющихся систем нейронавигации составляет, обычно, 2-3 мм [3]. Следует отметить, что применение существующих навигационных систем может существенно влиять на длительность операции, и не всегда применимо для определённых видов опухоли [2].

Постановка точного диагноза с учётом молекулярно-генетических характеристик ткани в каждом индивидуальном случае крайне важна для выработки плана лечения после операции, однако, за время операции получить его невозможно. Сама операция является, в том числе, шагом, необходимым для постановки диагноза - вырезанные во время операции фрагменты ткани далее анализируются гистологически, в том числе с изготовлением постоянных срезов при помощи окрашивания гематоксилином и эозином (permanent section; "золотой стандарт", диагноз по которому принимается за истину при сравнении методов [5]) и методами иммуногистохимии (информация о мутациях и экспрессии генов). К сожалению, исследование этими методами занимает несколько дней, при этом требуется предварительная оценка пригодности образцов. В частности, на чувствительность иммуногистохимических методов сильно влияет доля опухолевых клеток (ДОК) в образце ткани, поскольку при низкой ДОК могут быть получены ложноотрицательные результаты [6-8].

Такая предварительная оценка пригодности образца обычно выполняется при помощи экспресс-методов, таких, как гистологический анализ замороженных срезов (frozen section) [5], которые предоставляют оценочную информацию о доле опухолевых клеток и основных гистологических свойствах. Этот метод занимает примерно 25 минут [9], однако, полученные результаты могут быть субъективными [10]. Например, в работе [7] было показано, что оценки ДОК для одного и того же среза, сделанные разными гистопатологами, различаются со стандартным отклонением 20%. Поэтому, существует потребность в воспроизводимом и надёжном методе определения ДОК в образце ткани. Автоматизированные подходы [10-12] частично компенсируют проблему, однако, для них всё ещё необходима существенная пробоподготовка. Кроме того, поскольку ДОК сама по себе является характеристикой ткани, которую хирург иссекает, получение быстрого (в пределах нескольких минут) результата, если такой метод будет разработан, может быть использовано непосредственно при принятии решений хирургом.

По сравнению с нормальными клетками, раковые отличаются как клеточной структурой, так и, что важнее для данной работы, молекулярным составом. Это связано со специфичными для опухолей изменениями метаболизма [13], которые приводят к заметному накоплению некоторых метаболитов [14, 15], и в липидном составе злокачественных клеток по сравнению с нормальными [1618]. Недавно разработанные подходы на основе масс-спектрометрии продемонстрировали возможность классификации различных типов опухоли, а также дифференцировки опухолей от неопухолевых образцов, на основе их молекулярных профилей [19-22]. Эти подходы можно разделить на две широких категории: масс-спектрометрическая визуализация (MS imaging) и прямые масс-спектрометрические методы.

Масс-спектрометрическая визуализация позволяет напрямую сравнить срезы, подготовленные для гистологического анализа, с пространственным распределением тех или иных соединений, определённым при помощи мас-спектрометрии (включая не только нативно присутствующие в ткани, но и, например, контрастирующий агент для МРТ, накапливающийся в опухолях [23]). Более того, иногда возможно выполнить масс-спектрометрическую визуализацию непосредственно на срезах для гистологического анализа [24]. Для исследования образцов головного мозга могут использоваться различные методы масс-спектрометрической визуализации, в том числе основанные на лазерной десорбции/ионизации с использованием матрицы (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) [25], десорбции/ионизации электрораспылением (desorption/electrospray ionization, DESI) [21, 26, 27], и масс-спектрометрии вторичных ионов (secondary ion mass spectrometry, SIMS) [28]. Более того, десорбция/ионизация электрораспылением применялась и для определения ДОК в образцах ткани головного мозга [12]. К сожалению, каким бы методом и какие бы срезы ни исследовались, процедура визуализации неизбежно занимает значительное время, поскольку множество пикселей изображения анализируется последовательно.

С другой стороны, методы прямой масс-спектрометрии предназначены для быстрого получения информации о ткани, что может быть ценно непосредственно во время операции. Десорбция/ионизация электрораспылением может быть применена и интраоперационно [29] для различения глиомы и нормальной ткани головного мозга в образцах биопсии. Метод MALDI также может быть адаптирован для интраоперационного применения, если в качестве матрицы использовать молекулы воды: этот вариант был успешно реализован в системе SpiderMass [30-32]. Метод ионизации быстрым испарением (rapid evaporative ionization mass spectrometry, REIMS) [22, 33, 34] обеспечивает получение молекулярных профилей рассекаемой ткани в реальном времени, хотя и требует применения дополнительных действий и модифицированных инструментов непосредственно хирургом. Методы, реализующие быструю экстракцию и ионизацию молекул, такие, как проточная экстракция в картридже (inline cartridge extraction, ICE) [20] и прямой спрей с ткани (spray-from-tissue) [35], не требуют конкретных хирургических инструментов и их модификаций, что делает их менее дорогими по сравнению с REIMS и SpiderMass, и менее времязатратными по сравнению с DESI.

Дополнительной практической сложностью в нейрохирургии является то, что определение границ опухоли, а точнее границ ткани, вырезать которую было бы оптимально - это не только задача классификации опухолевой и неопухолевой ткани. Существуют различные паттерны роста опухоли, а также врастания (инфильтрации) опухолевых клеток в здоровую ткань [11, 36-39]. Поэтому, создание метода, который бы позволил быстро определить в образце именно долю опухолевых клеток, существенно поможет в рутинной клинической практике хирургического удаления опухолей, снижая необходимость дорогих и времяза-тратных методов интраоперативных МРТ и КТ, и потенциально делая молекулярное профилирование ценным методом в арсенале хирурга для оптимизации удаления ткани.

Следует отметить, что в связи с пересмотром ВОЗ классификации опу-

холей в 2016 году (см., например, [40]), направленной на лучшее отражение генетических характеристик опухолей, некоторые опухоли головного мозга IV степени злокачественности, классифицированные ранее как глиобластомы, (а именно, все IDHl/2-мутантные опухоли без коделеции 1p19q) с точки зрения новой классификации являются астроцитомами. Термин "глиомы IV степени злокачественности" включает как глиобластомы, так и указанные астроцито-мы согласно новой классификации.

1.1 Особенности метаболизма злокачественных опухолей головного мозга

Глиобластома является наиболее злокачественной (IV степень злокачественности) формой глиальных опухолей. Являясь наиболее распространённой и наиболее летальной опухолью головного мозга, глиобластомы имеют не только разные генетические подтипы, но также некоторые морфологические и молекулярные различия [41, 42]. Это связано с тем, что, хотя большинство гли-областом - первичные опухоли, от 5 до 10% из них вторичные, происходящие от глиальных опухолей II или III степени злокачественности [43]. Для первичных глиобластом характерно наличие области некроза, а вторичные глиобла-стомы могут содержать области, гистологически схожие с опухолями более низких степеней злокачественности - олигодендроглиомами и астроцитомами [42]. Первичные и вторичные глиобластомы также отличаются частотой, с которой встречаются некоторые мутации. В частности, мутация фермента изоцитратде-гидрогеназы (IDH) характерна для более, чем 80% вторичных глиобластом, но не встречается в первичных [43-45].

Фермент IDH катализирует реакцию окислительного декарбоксилиро-вания с образованием альфа-кетоглутарата (aKG). Однако, мутация R132H в IDH-1, имеющаяся в большинстве вторичных глиобластом (и большинстве

астроцитом), а также более редкие мутации R140Q и R172K в изоформе IDH-2 влияют на их каталитическую активность: aKG превращается в 2-гидроксиглутарат (2HG), который накапливается в опухолевых клетках в большом количестве [46, 13]. в нормальных физиологических условиях, 2HG не выполняет никакой известной функции в организме, однако с увеличением его концентрации в клетке, он ингибирует aKG-зависимые ферменты, в том числе деметилирующие молекулы ДНК и гистоны, меняя таким образом эпигенетическое состояние клетки [46]. Следовательно, мутации в генах IDH приводят к гиперметилированию ДНК, что препятствует дифференциации клеток, играя роль в росте и развитии опухоли [47]. Другая важная для опухолевых процессов функция IDH связана с превращением глутамата в цитрат, который используется для синтеза жирных кислот de novo [48]. Существенные изменения в метаболизме злокачественных клеток (эффект Варбурга) также приводят к формированию значительного количества цитрата за счёт аэробного гликолиза [49]. Полученный излишек NADH используется как в превращении aKG в 2HG, так и для de novo синтеза жирных кислот [13]. Также, в процессе анаэробного гликолиза формируются прекурсоры для синтеза аминокислот и нуклеоти-дов. Злокачественные клетки способны, таким образом, наращивать биомассу и энергию для роста и пролиферации опухоли [13].

Клетки человека не способны синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты, и получают их только с пищей. Активный синтез жирных кислот de novo и недостаточное кровоснабжение в условиях опухоли приводят к соответствующему изменению липидного состава клеток. Дополнительным источником энергии в клетках опухоли является бета-окисление, не характерное для здоровых клеток головного мозга. Хотя митохондриальное бета-окисление в основном задействует триацилглицериды, накопленные в липидных каплях внутри клетки, оно существенно влияет на общий состав жирных кислот (и, следовательно, липидов) в клетке [13, 50]. Изменения в липидном составе сопровождаются изменениями физических свойств клетки, в частности, текучести клеточной

мембраны. Однако, независимо от происхождения опухоли (первичная или вторичная), а также наличия или отсутствия мутаций IDH, ядро опухоли (помимо областей некроза и областей более низкой злокачественности) формируется одинаковыми клетками, и дальнейшее уточнение диагноза требует определения наличия/отсутствия мутаций и учёта анамнеза [41, 45]. Таким образом, можно предположить, что основные структурные липиды клеток глиобластомы, независимо от её подтипов, сходны по составу жирных кислот, и определение отклонений в этом составе поможет развить понимание механизмов канцерогенеза и подойти к более эффективным методам лечения глиобластом.

1.2 Ионизация электрораспылением

Метод ионизации электрораспылением при атмосферном давлении (Electrospray ionization, ESI; также ЭРИАД) [51, 52] (см. Рисунок 1.1) основан на характерном поведении жидкости в сильном электрическом поле, описанном Дж. Тейлором [53]: поверхность (проводящей) жидкости принимает форму конуса (называемого конусом Тейлора) и, если электростатическое отталкивание участка поверхности на образующемся острие превышает силу поверхностного натяжения, образуется цилиндрический поток, распадающийся на отдельные капли, несущие заряд (подробнее см., например, [54, 55])). Под действием электростатических сил капли летят в направлении входного интерфейса масс-спектрометра. В это время с поверхности капель происходит испарение растворителя, за счёт чего их радиус уменьшается и баланс сил, действующий на участок поверхности капли, смещается в сторону электростатического отталкивания - когда оно снова превышает силу поверхностного натяжения, с поверхности капли происходит электрораспыление, в результате которого образуются капли существенно меньшего радиуса. С другой стороны, ионы, находящиеся на поверхности, также испаряются, уменьшая заряд капли и приводя к обратному эффекту; что важнее, эти ионы теперь находятся в газовой фазе и могут быть

>

Рисунок 1.1: ESI

далее проанализированы. Механизмы электрораспыления и ионизации подробно рассмотрены, например, в работах [56, 57].

Существует следующее приблизительное соотношение для радиуса капилляра, через который подаётся раствор (образец), и напряжения между капилляром и входным интерфейсом масс-спектрометра, полученное в работе [58] (см. также [57]):

Здесь Von ~ минимальное напряжение между капилляром и входным интерфейсом (моделируемым плоской поверхностью), необходимое для электрораспыления раствора, гс - радиус капилляра, 7 - поверхностное натяжение раствора, в - половинный угол конуса Тейлора, £о - диэлектрическая проницаемость вакуума, d - расстояние между капилляром и входным интерфейсом.

При превышении этого напряжения, происходит электрораспыления в режиме стабильного, одиночного конуса (cone-jet mode в англоязычной литературе). При дальнейшем увеличении напряжения, наблюдается переход в режим множественных конусов Тейлора с нестабильной геометрией, и/или зажигание коронного разряда, существенно влияющего на наблюдаемый масс-спектр в свя-

(1.1)

зи с дополнительными процессами ионизации. Режим одиночного конуса представляет основной интерес в контексте масс-спектрометрии, поскольку капли, полученные при таком режиме, малы и имеют относительно узкое распределение размера, отсутствуют низкочастотные и случайные изменения направления электрораспыления. Таким образом, имеет место "остров стабильности" ионизации [59-61], который может быть определён экспериментально для различных геометрий ионного источника. Зависимость его нижней границы (по напряжению) от радиуса эмиттера электрораспыления может быть оценена по уравнению 1.1. Условия, определяющие верхнюю границу, могут быть оценены численно - например, при рассмотрении сходимости модели [62] на основе уравнений Навье-Стокса, в которую заложена осевая симметрия поверхности жидкости -поскольку образование множественных конусов Тейлора эту симметрию нарушает. Однако, такое рассмотрение ограничено эмиттерами с ровными срезами, симметричными относительно их центральной оси.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бормотов Денис Сергеевич, 2023 год

источника спрея

Включение записи 5 5

масс-спектров

Получение масс-спектров 595 595

Внесение данных об образце 20 20

и запуск классификации**

Автоматизированная классификация** 60 60

От образца до результата 1840 1210

Цикл с учётом параллелизации 1280 650

действованы и оператор, и прибор, после чего - 595 секунд действий прибора (сокращается до 30) и 20 секунд действий оператора (а также автоматизированная классификация, результаты которой будут показаны непосредственно хирургу). При непрерывном потоке образцов, можно производить разрезание следующего образца и т.д., пока измеряются спектры предыдущего, то есть при единственной точке синхронизации - можно просто взять максимальное время из времени работы оператора и прибора. Итого, возможно добиться производительности 140 секунд на образец, или 25 образцов в час - разумеется, при расположении масс-спектрометра непосредственно в операционной, отлаженном взаимодействии оператора и хирурга, и других идеализациях. Отметим, что в этом сценарии время работы прибора близко ко времени работы оператора, поэтому дополнительная оптимизация будет иметь смысл в первую очередь в процессах, которые требуют и того, и другого - то есть установке картриджа в линию и позиционировании источника.

Ещё одна важная характеристика, которую следует обсудить в рамках клинического анализа - это время от получения образца оператором до получения результата анализа хирургом. Здесь необходимо учесть и точку синхронизации, и время на автоматизированную классификацию. Согласно предыдущим рассуждениям, время анализа одного конкретного образца составит приблизительно 200 секунд. Для сравнения, время анализа методом экспресс-гистологии (frozen section histopathology) составляет приблизительно 30 минут, то есть приблизительно на порядок дольше.

Глава 3

Сравнение ионизации при помощи одноразового эмиттера с ионизацией при помощи многоразового ионного источника электрораспыления

Рассмотрим теперь вопрос, как использование одноразовых эмиттеров влияет на получаемые данные - воспроизводимость спектров в рамках одного измерения, и сходство спектров между измерениями с одноразовыми эмиттерами и измерениями с коммерческим ионным источником [123].

3.1 Методы

При помощи метода проточной экстракции в картридже, описанного в главе 2, были проведены эксперименты с образцами глиальных опухолей IV степени злокачественности (поскольку при этой патологии не наблюдается резких переходов между опухолевой и неопухолевой тканью). Для каждого из клинических образцов от трёх пациентов, были взяты по 3 участка ткани для масс-спектрометрии для каждой из двух моделей картриджа (т.е. всего было задействовано 18 картриджей).

Для выбранных конфигураций источников методы характеризовались при помощи рассмотрения отдельных сканов* для каждого измерения. Данные для каждого скана подвергались биннированию с шириной бина 0,1 Да, для построения матрицы признаков. Для каждого режима, были построены и проанализированы главные компоненты (principal component analysis, PCA). Результаты приведены на Рисунке 3.1-3.4 в виде проекций векторов каждого скана на первые две главные компоненты. Также, была посчитана косинусная метрика подобия (см. формулу 1.3) попарно между сканами каждого режима (для всех картриджей и технических повторов), и посчитаны статистические значения внутри групп и между группами сканов (см. раздел 2.3).

3.2 Результаты и обсуждение

Полученные значения косинусной метрики подобия между сканами (их приблизительно 107) использованы для построения Таблицы 3.1, содержащей статистические характеристики матрицы подобия. Данный результат опубликован в работе [123]; см. также работу [112], в которой обсуждается применение

"слово "скан" здесь используется для обозначения единичного спектра, записываемого в файл данных, которому присваивается одно значение времени - в отличие от "молекулярных профилей", под которыми понимается усреднение сканов по всему времени измерения в конкретном режиме. В данной работе, настройки прибора подобраны так, что один скан соответствует приблизительно 0,5 секунды (в зависимости от режима), один молекулярный профиль измеряется в течение 30 секунд, и, соответственно, молекулярный профиль -это усреднение по 50-70 сканам.

косинусной метрики и её связь с коэффициентами Пирсона. Обозначения в Таблице 3.1:

с - косинус угла между векторами, соответствующими двум конкретным сканам;

с - значение с, усреднённое по участку матрицы, соответствующему сравнению между двумя молекулярными профилями (наборами сканов, полученных в одном режиме в течение 30 секунд);

а(с) - стандартное отклонение с, полученное для такого же участка матрицы;

с (с) - усреднение а (с) по одной категории (см. ниже); а (с) - стандартное отклонение с, полученное для одной категории; avg = avg (с) - среднее значение с по категории.

Все участки матрицы разделены на категории, согласно тому, какие молекулярные профили сравниваются между собой:

self-old: сравниваются сканы внутри одного и того же молекулярного профиля, относящегося к картриджу с коммерческим ионным источником; self-new: сравниваются сканы внутри одного и того же молекулярного профиля, относящегося к картриджу с одноразовым эмиттером; tech-old: сравниваются сканы молекулярных профилей технических по-второв^, относящихся к одному картриджу с коммерческим ионным источником;

tech-new: сравниваются сканы молекулярных профилей технических повторов, относящихся к одному картриджу с одноразовым эмиттером; cart-old: сравниваются сканы молекулярных профилей разных картриджей с коммерческим ионным источником от одного пациента; cart-new: сравниваются сканы молекулярных профилей разных картриджей с одноразовым эмиттером от одного пациента;

tизмерения в одинаковом режиме, проведённые с разницей в 5 минут - см. Таблицу 2.1.

Таблица 3.1: Средние значения и стандартные отклонения косинусов угла между сканами в разных моделях картриджей [123]. См. текст для разъяснения обозначений.

L-w L-n H-w H-n L+w L+n H+w H+n

avg self-old "(c) "(c) 0.9332 0.9699 0.9820 0.9922 0.9743 0.9869 0.9953 0.9983 0.0217 0.0168 0.0185 0.0051 0.0044 0.0032 0.0038 0.0008 0.0196 0.0142 0.0084 0.0052 0.0094 0.0053 0.0022 0.0006

avg self-new "(c) "(c) 0.9481 0.9806 0.9787 0.9878 0.9674 0.9839 0.9913 0.9961 0.0132 0.0068 0.0213 0.0087 0.0071 0.0065 0.0071 0.0039 0.0110 0.0042 0.0152 0.0169 0.0107 0.0054 0.0046 0.0020

avg tech-old "(c) "(c) 0.8957 0.9237 0.9309 0.9667 0.9335 0.9397 0.9392 0.9488 0.0264 0.0247 0.0247 0.0094 0.0059 0.0080 0.0092 0.0061 0.0366 0.0425 0.0346 0.0163 0.0596 0.0475 0.0622 0.0476

avg tech-new "(c) "(c ) 0.8979 0.9631 0.9127 0.9609 0.9490 0.9665 0.9702 0.9768 0.0236 0.0104 0.0325 0.0172 0.0093 0.0102 0.0104 0.0081 0.0352 0.0116 0.0614 0.0283 0.0251 0.0230 0.0268 0.0206

avg cart-old "(c) "(c) 0.8017 0.8499 0.7753 0.8852 0.9144 0.9134 0.9014 0.9077 0.0354 0.0267 0.0327 0.0135 0.0058 0.0076 0.0087 0.0053 0.0943 0.1274 0.1136 0.0855 0.0481 0.0656 0.0826 0.0772

avg cart-new "(c) "(c) 0.8719 0.9172 0.8369 0.8720 0.9011 0.9391 0.9014 0.9032 0.0191 0.0109 0.0310 0.0199 0.0116 0.0106 0.0123 0.0096 0.0522 0.0628 0.1102 0.1115 0.0718 0.0419 0.1145 0.1241

avg cart-vs "(c) "(c ) 0.8215 0.8629 0.8055 0.8823 0.9026 0.9202 0.8984 0.9064 0.0357 0.0277 0.0329 0.0187 0.0099 0.0108 0.0114 0.0086 0.0742 0.0949 0.1138 0.0999 0.0679 0.0649 0.1029 0.1008

avg pat-old "(c) "(c) 0.7526 0.7769 0.6794 0.7855 0.8249 0.8243 0.7982 0.7882 0.0411 0.0367 0.0360 0.0198 0.0080 0.0092 0.0110 0.0077 0.0796 0.1069 0.1119 0.0908 0.1198 0.1333 0.1531 0.1534

avg pat-new "(c) "(c) 0.8277 0.8772 0.6744 0.7604 0.8676 0.8970 0.8691 0.8708 0.0203 0.0136 0.0398 0.0290 0.0154 0.0157 0.0168 0.0132 0.0434 0.0507 0.1129 0.1141 0.0612 0.0456 0.0785 0.0830

avg pat-vs "(c) "(c ) 0.7772 0.8079 0.6685 0.7600 0.8475 0.8590 0.8340 0.8284 0.0357 0.0299 0.0386 0.0252 0.0117 0.0125 0.0137 0.0103 0.0787 0.1007 0.1312 0.1195 0.0951 0.1130 0.1296 0.1364

cart-vs: сравниваются сканы молекулярных профилей картриджей разных моделей от одного пациента;

pat-old: сравниваются сканы молекулярных профилей картриджей с коммерческим ионным источником от разных пациентов; pat-new: сравниваются сканы молекулярных профилей картриджей с одноразовым эмиттером от разных пациентов;

pat-vs: сравниваются сканы молекулярных профилей картриджей разных моделей источником от разных пациентов;

Обозначения режимов, как и ранее:

H/L - высокое/низкое разрешение (измерения в масс-анализаторе LTQ или Orbitrap);

+/- - положительные/отрицательные ионы;

w/n - широкий/узкий диапазон масс (100-2000 Да и 500-1000 Да, соответственно).

Значения avg отражают, насколько сканы похожи друг на друга. Как следствие, более высокие значения в категории self-* (где * обозначает все возможные варианты с моделями картриджей) означают более высокую стабильность сигнала, а в категориях cart-* и pat-* - более высокую воспроизводимость сигнала между картриджами, относящимися к одному клиническому образцу, и картриджами от разных пациентов, соответственно. Используя таблицу, можно таким образом напрямую сравнить стабильность и воспроизводимость для картриджей различных моделей. Различия между значениями avg для категорий self-* и соответствующих им категорий tech-* можно связать с "истощением образца" - поскольку анализируемые молекулы экстрагируются из него в течение дополнительных 5 минут (между стартом первого и стартом второго технического повтора).

Значения с(с) в категории self-*, являясь (усреднёнными по картриджам) значениями сходства между отдельными сканами и их средним в рамках одно-

го измерения, могут быть интерпретированы как мера стабильности процесса ионизации в данном ионном источнике, в данном режиме измерения. Более высокие значения могут быть связаны с изменениями режима спрея в ходе одного измерения: например, переходе от одиночного конуса Тейлора к нескольким более мелким конусам и потокам капель, который наблюдается при излишне высоком напряжении, или зажигании коронного разряда.

Значения а(с), с другой стороны, отражают влияние различий в геометрии ионного источника и других условиях между измерениями. Более низкие значения соответствуют большей воспроизводимости условий, что в данном случае важно для качественной оценки срезов одноразовых эмиттеров (достаточно ли одинаковые) и работы системы позиционирования картриджей. Для категорий cart-* и pat-*, в которых сравниваются различные картриджи, гетерогенность образцов и различия в обтекании образца растворителем внутри картриджа также могут повлиять на это значение.

Для оценки значимости разностей косинусной метрики подобия между различными категориями был применён анализ PERMANOVA [125]. Данным методом проверяется гипотеза, что среднее значение (в данном случае косинусной метрики подобия) является одинаковым между группами; по сравнению со стандарными ANOVA/MANOVA, устраняется предположение о нормальности и равенстве дисперсий (гомоскедастичности) распределений в группах. В результате, все факторы - принадлежность образцов к пациенту, модель картриджа и номер технического повтора - показали себя значимыми на уровне 10-3. Анализ двух моделей картриджа отдельно показал, что и пациент, и номер технического повтора остаются значимыми во всех восьми режимах измерения. Кроме того, для всех режимов измерения отрицательных ионов (L-w, H-w, L-n, H-n) взаимодействие между этими двумя факторами незначительно на уровне 0,1 для картриджей с коммерческим ионным источником; для картриджей с одноразовым эмиттером, это же взаимодействие так же незначительно в режиме H+n. Для оставшихся трёх режимов, все три характеристики значительны

для обеих моделей картриджа.

Стабильность сигнала, которая оценивается по среднему от стандартных отклонений сходства между сканами внутри одного измерения, для обеих моделей картриджа имеет близкие значения. Это означает (если рассматривать вместе с анализом главных компонент, см. ниже), что одноразовый эмиттер электроспрея, предлагаемый в данной работе, допустимо использовать для масс-спектрометрического анализа опухолевых тканей. Следует отметить, что картриджи с коммерческим ионным источником показали выдающуюся стабильность в режиме H+n (Orbitrap, положительные ионы, m/z = 500-1000).

Средние стандартные отклонения косинусов для одних и тех же измерений (с(с) для same-*) сравнимы со стандартным отклонением средних (а(с)). Это указывает, что дальнейшее улучшение стабильности сигнала внутри измерения само по себе не приведёт к принципиальному изменению качества данных (и, следовательно, качества классификации и др.), поскольку воспроизводимость условий между картриджами станет лимитирующим фактором. То же самое справедливо и в обратную сторону. Только усовершенствования в обоих факторах вместе может существенно улучшить метод - снизить влияние случайных факторов, не связанных напрямую с образцом.

Метод анализа главных компонент дополняет анализ при помощи косинусной метрики подобия: рассматриваются одни и те же вектора в многомерном пространстве, при этом косинусная метрика подобия связана с углами между векторами, а анализ главных компонент - с их проекциями (на главные компоненты). Рисунки 3.1-3.4 согласуются с результатами, полученными при помощи косинусной метрики подобия - в частности, размеры эллипсов 95% вероятности существенно меньше общих размеров графика и, как правило, расстояний между эллипсами, т.е. проекции на главные компоненты сканов одного измерения различаются существенно меньше, чем проекции сканов различных измерений. Следует также отметить отсутствие видимых отклонений распределений от "эллиптических" для каждого измерения, поскольку в случае их наличия интер-

претация значений косинусной метрики подобия была бы существенно сложнее. Заслуживает внимания высокая доля двух первых главных компонент (40-80%) в описании различий между всеми сканами.

Отметим, что подобная схема сравнения может быть применена и к другим комбинациям методов, но это выходит за рамки данной работы.

с эмиттером

Компонента 1 (30.8%)

# без эмиттера + ХО+ХО Пациент 1 фО< фО< Пациент2 ОН* ОН* Пациент 3 с эмиттером—^

Компонента 1 (36.7%)

* без эмиттера + ХО+ХО Пациент 1

фО<] фО<] Пациент 2

ОН* ОН*| Пациент 3 з эмиттером—^

△

Компонента 1 (48.8

о

ж

ж

V

V

* без эмиттера + X О X О Пациент 1

фО< фО< Пациент 2 ОН* Пациент 3

с эмиттером—I

О

Компонента 1 (55.7%)

Рисунок 3.1: График анализа главных компонент для первого технического повтора в режиме положительных ионов. Режимы измерения: (а) Ь+ш, (б) Ь+п, (в) Н+ш, (г) Н+п. Красным обозначены картриджи с одноразовым эмиттером, синим - картриджи без одноразового эмиттера. Эллипсоиды для каждого измерения указывают область, в которой с вероятностью 95% находятся значения отдельных сканов данного измерения.

я

к

(б)

Рисунок 3.2: График анализа главных компонент для первого технического повтора в режиме отрицательных ионов. Режимы измерения: (а) Ь-ш, (б) Ь-п, (в) Н-ш, (г) Н-п. Красным обозначены картриджи с одноразовым эмиттером, синим - картриджи без одноразового эмиттера. Эллипсоиды для каждого измерения указывают область, в которой с вероятностью 95% находятся значения отдельных сканов данного измерения.

Компонента 1 (55.7%)

(а)

f без эмиттера + ХО +ХО Пациент 1

фО <] фО< Пациент 2 >Н* [>Н* Пациент 3

+

Компонента 1 (65.4%)

(в)

ж

Компонента 1 (67.8%) (б)

^ без эмиттера + X о +Х о Пациент 1 фО<] фО< Пациент 2

>Н* Пациент 3

с эмиттером—^

л

ж

11 / х ~ § %) СО с&

« с^ А

О 4 • \у О и не по ом

х^ К

V

н

х^

▽ о

Компонента 1 (71.4%)

(г)

Рисунок 3.3: График анализа главных компонент для второго технического повтора в режиме положительных ионов. Режимы измерения: (а) Ь+ш, (б) Ь+п, (в) Н+ш, (г) Н+п. Красным обозначены картриджи с одноразовым эмиттером, синим - картриджи без одноразового эмиттера. Эллипсоиды для каждого измерения указывают область, в которой с вероятностью 95% находятся значения отдельных сканов данного измерения.

о

Компонента 1 (31.3%)

Компонента 1 (45.6%)

К О

♦ без эмиттера -НхО+хО пациент 1 фО<] фО< Пациент2 > Н Пациент 3 с эмиттером—I

△

♦ без эмиттера + Х04-Х0 пациент 1

■фО< •фО< Пациент 2 О НПациент 3

с эмиттером —

Компонента 1 (43.0%)

О

V

V

X

О

Компонента 1 (54.8%)

Рисунок 3.4: График анализа главных компонент для второго технического повтора в режиме отрицательных ионов. Режимы измерения: (а) Ь+ш, (б) Ь+п, (в) Н+ш, (г) Н+п. Красным обозначены картриджи с одноразовым эмиттером, синим - картриджи без одноразового эмиттера. Эллипсоиды для каждого измерения указывают область, в которой с вероятностью 95% находятся значения отдельных сканов данного измерения.

Глава 4

Анализ клинических образцов и определение доли опухолевых клеток

Существенная сложность, связанная с эксплуатацией картриджей, заключается в "разрушительности" метода - в том смысле, что невозможно исследование того конкретного участка ткани, из которого производилась экстракция с последующим измерением масс-спектров, при помощи независимых методов, таких, как гистологическое исследование. Поставленный общий гистологический диагноз пациента может не соответствовать ткани конкретного участка, особенно учитывая тот факт, что основной практический интерес в работе представляют участки ткани на границе опухоли. Вместе с тем, для идентификации опухоли или неопухолевой ткани по масс-спектрам, необходимы референсные спектры, которые точно относятся к ткани определённой природы. В данной главе обсуждается формализация данной проблемы при помощи "доли опухолевых клеток" (ДОК; Tumor Cell Percentage, TCP) [126], а также протоколы [127], позволяющие учитывать её при построении дальнейших моделей.

4.1 Методы

Образцы тканей опухолевых патологий были получены при плановых операциях по иссечению опухлей, а образцы неопухолевых тканей - при хирургическом лечении лекарственно-устойчивой эпилепсии, в НМИЦ нейрохирургии им. ак. Н.Н.Бурденко (см. также Раздел 2.2.2). Образцы анализировались в соответствии с протоколом, одобренным этическим комитетом НМИЦ нейрохирургии им. ак. Н.Н.Бурденко в соответствии с Хельсинкской декларацией в редакции 2013 года. Образец представляет собой участок ткани размером от 3 мм до нескольких см, что зависит, в первую очередь, от размеров опухоли. Нижняя граница - это минимальный размер, которого требует рутинный гистологический анализ.

Размеры образца для масс-спектрометрического исследования составляют приблизительно 1 х 1 х 2 мм - они связаны с размерами линии подачи растворителя и, как следствие, картриджа (см. Главу 2 и конкретно Рисунок 2.3). Ввиду механических свойств тканей головного мозга и опухолей (мягкость, пластичность), точные размеры и форма образца не контролируются - однако он не должен перекрывать поток растворителя в картридже. При указанных размерах образец, размещённый в картридже, перекрывает сечение картриджа приблизительно наполовину.

В данном исследовании клинические образцы разрезались на фрагменты таким образом, чтобы измерить молекулярные профили (масс-спектры смеси молекул, полученной при экстракции в картридже) для нескольких из них, а остальные использовать для оценки ДОК при помощи экспресс-гистологии. Следует отметить, что выполнение обоих анализов для одного и того же фрагмента ткани невозможно, не только из-за требований к размерам, но и из-за деструктивности обоих методов.

Разрезание образцов производилось по трём предложенным схемам - см. Рисунок 4.1, - согласно визуальной оценке размеров образца. Далее, "длиной" и

"шириной" будут называться наибольшее и наименьшее возможное расстояние, соответственно, измеренное от края до края образца так, чтобы измеряемая линия проходила через его центр - обе величины являются приблизительными в силу произвольной формы образца ("размер образца" употребляется в том же смысле). Фрагменты для масс-спектрометрических измерений обозначаются римскими цифрами (поскольку их удобнее писать на картридже), а фрагменты для определения ДОК - арабскими.

В случае, если и длина, и ширина образца составляют 0,3 - 0,5 мм, и он визуально однородный, применяется схема, показанная на Рисунке 4.1а (далее -схема A). Фрагменты для масс-спектрометрии берутся из наиболее отдалённых друг от друга точек образца (в идеализированном случае круглого образца -вершин равностороннего треугольника). Оставшаяся часть более не разделяется и анализируется гистологически. В таком случае, с молекулярными профилями трёх фрагментов ассоциируется одинаковая ДОК, равная таковой для гистологического фрагмента (TCPi = TCPII = TCPIII = TCPHP).

В случае, если и длина, и ширина образца больше 0,5 мм, и образец визуально однородный, используется схема, показанная на Рисунке 4.1б (схема B). Образец разделяется на три приблизительно равные части разрезами, исходящими из центральной точки. Три фрагмента отбираются из участков, которые были границами клинического образца; четвёртый образец отбирается из области, соответствующей центральной точке. В данном случае, с молекулярными профилями фрагментов I — III ассоциируется ДОК от фрагментов 1 — 3, соответственно, а с профилем фрагмента IV - среднее арифметическое от них (TCPI = TCP3, TCPII = TCP2,TCPIII = TCP3,TCPIV = (TCPi + TCP2 + TCPs)/3).

В случае "продолговатого" образца, а также визуальных неоднородно-стей в образце, подходящем для схемы B, применяется схема на Рисунке 4.1в (схема C). Образец разделяется разрезами, перпендикулярными линии, по которой определяется длина образца; расстояние между разрезами соответству-

(а) Длина < 0,5 см

(б) Ширина > 0, 5 см

(в) Длина > 0, 5 см, 0, 3 < Ширина < 0, 5 см; или гетерогенность

Рисунок 4.1: Схемы Разрезания образцов. Римскими цифрами обозначены образцы, анализируемые при помощи масс-спектрометрии, арабскими - анализируемые гистологическими методами.

ет требованиям гистологического анализа. Фрагменты для получения молекулярных профилей отбираются из области, соответствующей середине разреза. ДОК, ассоциированная с молекулярными профилями, в этом случае определяется как среднее арифметическое от ДОК двух прилегающих фрагментов (TCPi = (TCP05 + TCP\5)/2 и т.п.). На рисунке приведён вариант схемы для трёх "масс-спектрометрических" фрагментов, однако их число может меняться в зависимости от размера образца; также, допустимо использование фрагментов, находящихся на той же прямой, но с краёв образца (с пометкой, что для них ДОК определяется по одному прилегающему фрагменту).

Образцы, не удовлетворяющие ни одному из вариантов указанных условий, из рассмотрения в этом исследовании исключались.

Фрагменты, использованные для определения ДОК, непосредственно после разрезания помещались в пробирку объёмом 1,5 мл (SSI, item nr. 1260-00), и фиксировались при помощи формалина. Впоследствие, ДОК в них была определена квалифицированным гистопатологом.

Фрагменты, используемые для получения молекулярных профилей, непосредственно после разрезания помещались в картриджи, описанные в Главе 2, и анализировались согласно приведённым там же методам, за исключением того, что данные были получены при помощи масс-спектрометра LTQ XL ETD (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA, USA)*, как следствие, получены только данные низкого разрешения. В исследовании использовались данные, полученные как при помощи картриджей с одноразовым эмиттером, так и при помощи картриджей со стандартным ионным источником: результаты, описанные в Главе 2 и работе [123], позволяют сделать вывод об однородности этих данных (т.е. различия масс-спектров, связанные с разными моделями картриджа, не превышают различия, связанные с исследованием разных фрагментов одного образца).

"масс-анализатор полностью аналогичен масс-анализатору низкого разрешения в приборе LTQ Orbitrap, использованном для получения данных для предыдущих глав

Диагноз пациента определялся согласно гистологическому и иммуноги-стохимическому исследованию, отдельному от указанного здесь определения ДОК и проводимому в клинических целях, независимо от данной работы.

В исследовании было задействовано 58 картриджей (фрагментов для масс-спектрометрии) от 20 клинических образцов. Из них, 29 картриджей были получены от 11 пациентов с диагностированной глиальной опухолью IV степени злокачественности, и 29 картриджей от 9 пациентов с неопухолевыми патологиями. Значения ДОК для образцов составляли от 0% до 100% - нулевое значение соответствует фокальной кортикальной дисплазии, реактивно изменённой ткани, или области врастания опухоли с единичными опухолевыми клетками. В данной работе, как правило, для одного клинического образца при помощи масс-спектрометрии анализировалось три его фрагмента.

Регрессионная модель была построена для режима положительных ионов, низкого разрешения и диапазона масс 500-1000 Да (Ь+п в обозначениях Главы 2). Для построения регрессионной модели, каждый масс-спектр нормировался на общий ионный ток, и преобразовывался в список пиков (вместе с их интенсивностями), из которого далее исключались пики с отношением сигнала к шуму менее 2. Все полученные списки пиков выравнивались и биннировались с шагом 2.0 * 10-4 Да, после чего из них составлялась матрица признаков; из матрицы признаков удалялись все пики, для которых ненулевая интенсивность наблюдалась менее, чем в 25% спектров. Полученная матрица содержала 90 признаков (пиков). Интенсивности были Парето-нормированы:

~ ^г ж г

ОС г --,

где аг - стандартное отклонение интенсивности ¿-го пика по всей матрице признаков.

Сканы в матрице признаков были поделены на наборы для обучения и для валидации в соотношении 3:1, таким образом, чтобы сканы от одного фрагмента

ткани находились только в одном из наборов. В набор для обучения вошли приблизительно 22000 сканов от 44 фрагментов ткани, а в набор для валидации - 7000 сканов от 14 фрагментов. Каждому скану была приписана ДОК при помощи описанной выше процедуры.

Регрессионные модели XGBoost были обучены при помощи трёхкратного повторения десятикратной кросс-валидации. Полученная регрессионная модель применялась ко всем строкам матрицы признаков (см. рисунок 4.2), но для расчёта приведённых в работе характеристик точности использовались только сканы из набора для валидации.

Преобразование масс-спектрометрических данных в матрицу признаков выполнялось при помощи пакета MALDIquant для R (версия 1.19.3) [128]. Для обучения регрессора применялся алгоритм xgbDART из пакета caret (версия R - 3.6.1 [129], версия caret 6.0-86 [130]). Конвейер для обработки данных был построен с помощью Drake, версия 7.12.4 [131].

4.2 Результаты и обсуждение

Измерить долю опухолевых клеток непосредственно во фрагменте ткани, который используется для масс-спектрометрического анализа, представляется трудно осуществимым, поскольку как прямая масс-спектрометрия, так и гистологический анализ включают необратимые изменения в образце, делающие применение второго метода невозможным. При сравнении масс-спектрометрических данных с результатами гистологического анализа, как правило, каждый образец делится на две части, каждая из которых исследуется только одним способом. В силу гетерогенности тканей злокачественных опухолей, вероятна ситуация, когда исследуемые фрагменты существенно различаются - в частности, по доле опухолевых клеток. Такая ошибка, заложенная в исходных данных, может приводить к снижению точности при попытке классификации образцов и, тем более, при построении регрессионной модели. Это

особенно важно в рамках применения какого-либо масс-спектрометрического метода, не включающего визуализацию, для исследования границ опухоли и областей врастания, где значительные изменения доли опухолевых клеток могут наблюдаться в пределах нескольких миллиметров. Поэтому, вполне возможно, например, что масс-спектры получены для образца, содержащего в основном неопухолевую ткань, а гистологический анализ соседнего образца показал содержание в основном опухолевой ткани. Любая регрессионная модель, построенная с использованием таких данных, не будет надёжна - и следует отметить, что такая ненадёжность связана не с методами масс-спектрометрического или гистологического анализа, но с самим образцом.

Наиболее прямым решением этой проблемы является применение масс-спектрометрической визуализации, в частности, методами на основе MALDI и DESI - при таком подходе масс-спектрометрические и гистологические данные могут быть сопоставлены при использовании близко расположенных срезов ткани. Однако, методы масс-спектрометрической визуализации требуют существенное время как на пробоподготовку, так и на сам анализ; фрагменты ткани, анализируемые двумя методами, при этом всё ещё различны. Выполнение масс-спектрометрической визуализации и гистологического анализа на одном и том же слайде [24] сопряжено с некоторыми трудностями, в частности, для визуализации предпочтительно использовать более тонкие срезы, гистологический анализ которых будет иметь сниженную точность определения ДОК. Всё это усложняет применение масс-спектрометрической визуализации в рассматриваемых клинических задачах, и означает, что деструктивные, но эффективные с точки зрения времени, методы прямой масс-спектрометрии - REIMS, DART, ICE и др. - предпочтительны для интраоперационного применения. Для улучшения точности алгоритмов машинного обучения, были предложены протоколы (см. раздел 4.1) для разделения клинических образцов на фрагменты с целью сопоставления значений ДОК, полученных путём гистологического анализа, молекулярным профилям тканей.

Три различные схемы разрезания были предложены в связи с тем, что форма, размеры и гетерогенность извлекаемого клинического образца диктуются, разумеется, в первую очередь необходимостью лечения пациента, а не условиями данного исследования. Применение всех трёх схем максимизирует количество образцов, которые могут быть задействованы в исследовании, и, как следствие, количество получаемых данных, что важно в связи с ограниченным количеством образцов вообще. В частности, наиболее маленькие из задействованных образцов не позволяют получить несколько фрагментов для гистологического анализа, однако фрагменты для масс-спектрометрического анализа достаточно малы, чтобы отделение нескольких таких фрагментов не влияло существенно на размеры гистологического фрагмента.

Отметим, что опухоли разной степени злокачественности имеют различные зоны врастания: более злокачественные, как правило, врастают более глубоко и более равномерно. В предлагаемой оценке ДОК заложено предположение о гладкости функции ДОК (в малом объёме) от координат внутри ткани, которое более вероятно выполняется для более злокачественных опухолей. С этим связан выбор глиом IV (наивысшей) степени злокачественности для данного исследования. Поскольку зоны врастания таких глиом обычно шириной 1 см или более [132], маловероятно, что соседние фрагменты ткани будут иметь сильно различающуюся ДОК в области их границы между собой.

Таким образом, наилучшая доступная оценка ДОК, которую можно сопоставить молекулярным профилям, для малых образцов - это просто ДОК соседнего фрагмента, согласно его гистологическому анализу. Для образцов большего размера, разделение их на несколько фрагментов для гистологического анализа позволяет учесть, в приближении равномерного градиента, гетерогенность образца.

К сожалению, невозможно исключить возможность того, что реальная ДОК фрагментов ткани, использованных для получения молекулярных профилей, существенно отличается от предложенной оценки согласно гистологическо-

му анализу. Однако, для рассматриваемых данных такие различия не должны оказать существенное влияние на точность результатов регрессии, в связи с тем, что большинство соседних фрагментов ткани имеют близкие значения ДОК. Среди 26 пар соседних образцов от пациентов с диагнозом "глиальная опухоль IV степени злокачественности", среднее значение разницы ДОК между двумя фрагментами составляло 5,5%. Из них, для 19 пар ДОК была одинаковой (во всех случаях либо 100%, либо 0%); ещё в 2 парах разница составила менее 10%, в 2 парах - между 10% и 20%, и в 3 парах - от 20% до 30%.

Дальнейшее улучшение предлагаемого метода определения ДОК требует расширения набора клинических образцов, а также независимой оценки ДОК фрагментов несколькими патологами, для снижения влияния человеческой ошибки. Следует отметить, во-первых, что регрессионные модели были построены с использованием 22000 отдельных сканов (строк в матрице признаков), многим из которых присвоены одинаковые значения ДОК. Это означает, что большое число различных сканов соответствует одинаковой ДОК, однако, увеличение числа пациентов важно для исследования с точки зрения учёта вариабельности между пациентами. Во-вторых, поскольку ДОК, определяемая при помощи гистологического анализа (и используемая как входные данные в данной работе), содержит ошибку в пределах 20% [7], следует ожидать, что полученная регрессионная модель не будет точнее, чем это значение. Это особенно важно в случаях, когда регрессионная модель предсказывает значение от 0 до 20% на основе масс-спектрометрических данных - в таких случаях, нужны дополнительные методы для определения опухолевого статуса данного образца. Такая классификационная модель, например, была построена в работе [20]. Пример такой ситуации, приведённый на Рисунке 4.2 - это фрагмент ткани 603 из набора для валидации: медианное значение предсказанной ДОК для него приблизительно 10%, в то время как ДОК соседнего образца согласно гистологическому анализу - 0% (см. также обсуждение ниже). Подтверждение наличия опухолевых клеток особенно важно, если рассматривать применение

метода для определения границ опухоли и зон врастания.

Регрессионные модели, использованные для предсказания ДОК фрагментов ткани по их молекулярным профилям, были обучены отдельно для измерений в режиме положительных ионов и для измерений в режиме отрицательных ионов. Точность предсказанных ДОК оценивалась при помощи кросс-валидации и составила приблизительно 90%, с коэффициентом детерминации Я2 — 0,97 в режиме положительных ионов. В режиме отрицательных ионов, точность оценки составила 70% в связи с более высокой вариабельностью между образцами (см. работы [133, 112]), поэтому далее в рамках данной главы данные, полученные в режиме отрицательных ионов, не рассматривались.

На Рисунке 4.2 показаны распределения ДОК, предсказанной регрессо-ром по отдельным сканам, для каждого проанализированного фрагмента ткани, включая как обучающий набор, так и набор для валидации. Межквартильные диапазоны (МКД), то есть диапазоны между 25 и 75 процентилью, заметно выше для образцов из набора для валидации по сравнению с набором для обучения; однако, расстояние между выбросами мало отличается между наборами. Кроме того, ДОК, оценённая при помощи гистологического анализа, выходит за пределы МКД только для трёх образцов - 471, 545, и 603.

Фрагменту ткани 471 присвоено значение ДОК 70% на основе гистологического анализа одного соседнего фрагмента. Согласно заключению гистолога, этот соседний фрагмент состоит на 70% из глиомы IV степени злокачественности и на 30% из зоны врастания опухоли. Кроме того, он находился между двумя фрагментами, представлявшими собой 100% глиомы IV степени злокачественности, что прямо указывает на некорректность предположения о линейном градиенте ДОК для данного клинического образца. Поэтому, разница между предсказанной ДОК и ДОК, определённой при помощи гистологического анализа, может быть связана в основном с несоответствием реальной ДОК во фрагменте, который использовался для получения молекулярного профиля, и оценки ДОК согласно гистологическому анализу.

576573493491 -477476475473472417416399398397553524523471 -526527525602546605604603-

Q 601— 600-лч 596 ■

CD 595-"q_594-593-F 592-

CÖ 591 " ГО 590-

UJ 586585584563545541 -540539538534518517516503502501 -500367363362878685-

-l-p- I-шш mumm at

• •• rfi

—1 ЕЪ - — • h

-г-

• •» •

Set

$ Validation 0 Train

40

80

120

Predicted TCP

Рисунок 4.2: Распределение предсказаний ДОК по отдельным сканам для каждого фрагмента ткани, исследованного при помощи масс-спектрометрии. Границы "ящика" соответствуют 25-й и 75-й процентили, линия между ними - медиане. "Усы" распространяются на 1,5 МКД (межквартильного диапазона) в обоих направлениях от "ящика". Выбросы, лежащие дальше "усов", обозначены отдельными точками. Набор для обучения обозначен оранжевым, набор для ва-лидации - бирюзовым.

Фрагмент ткани 545 был частью образца биопсии, который классифицирован как реактивно-изменённая мозговая ткань от пациента с диагностированным продолженным ростом глиомы IV степени злокачественности после химио-и радиотерапии. Этот фрагмент получен с края клинического образца, разрезанного по Схеме В. Остальные фрагменты этого образца, проанализированные гистологически, содержали меньше изменённой ткани. Это означает, что рассматриваемый фрагмент образца был, скорее всего, ближе других к непосредственно опухоли, и мог содержать существенное количество опухолевых клеток.

Фрагмент ткани 603 был получен от пациента с глиомой IV степени злокачественности и ему было присвоено значение ДОК по одному соседнему фрагменту, согласно схеме В. При этом, реактивно-модифицированная ткань содержалась во всех исследованных гистологически фрагментах данного образца, и наибольшая её доля наблюдалась во фрагментах, удалённых от фрагмента 603. Вероятно, в этом случае разница ДОК связана с ошибкой регрессионной модели. Отметим, впрочем, что ошибка составляет около 10%, что сравнимо как с оценкой ошибки регрессора по набору для валидации, так и с ошибками непосредственно в методе гистологического исследования [7].

Результаты предсказания ДОК фрагментов при помощи регрессионной модели представлены на Рисунке 4.3. Здесь, предсказание ДОК для отдельных сканов усреднялось по всем сканам фрагмента ткани и служило координатой точки на оси ординат, а оценка ДОК согласно гистологическому исследованию - на оси абсцисс. Графическое представление "ящик с усами" использовалось для значений ДОК, соответствующих набору для валидации. В целом, наблюдается хорошее согласие (Я2 близко к 1, линейная регрессия близка к у — х) между ДОК, предсказанной регрессором, и ДОК, полученной согласно гистологическим данным по предложенному в работе способу, во всех случаях, когда близкое значение ДОК было в обучающем наборе. Образец с переоценённым ДОК, наблюдаемый при значении 70% по оси абсцисс - это обсуждавшийся ра-

нее фрагмент 471; следует отметить, что значений, близких к 70%, не было в наборе для обучения.

В целом, полученная регрессионная модель имеет высокий коэффициент детерминации - Я2 — 0, 97 - даже несмотря на то, что входные данные (гистологическая оценка ДОК) субъективны, со стандартным отклонением результата, полученного разными гистологами для одного среза, до 20% [7]. Частично, это можно объяснить тем, что малый набор клинических образцов, состоящий из 58 образцов, позволил получить и использовать для построения регрессионной модели намного больший набор данных, состоящий из 29000 сканов. Относительно высокая вариабельность предсказаний ДОК для сканов одного фрагмента ткани, показанная на Рисунке 4.2, не приводит к высокой вариабельности значений, усреднённых для фрагмента ткани.

100

о.

о

ф о

■

"О

0

05 0

25 50 75

Аз81дпес! ТСР

Рисунок 4.3: Предсказанные регрессионной моделью и оценённые с помощью гистологии доли опухолевых клеток во фрагментах ткани. Синими точками обозначены значения ДОК фрагментов тканей из набора для обучения; "ящик с усами" соответствует значениям из набора для валидации

Глава 5

Анализ изменений липидного состава в глиомах IV степени злокачественности

В предыдущих главах масс-спектры рассматривались в парадигме "отпечатков пальцев" - как набор пар {m/z, интенсивность сигнала}, - при этом химическая и биологическая природа отвечающих за этот сигнал веществ оставалась за рамками работы. Однако, определение этой природы может быть реализовано при помощи масс-спектрометрии [134, 126], и открывает возможности для соотнесения данной работы с рядом других методов, "встраивания" её в более широкий научный контекст.

5.1 Методы

5.1.1 Экстракция липидов и масс-спектрометрический анализ

Клинические образцы глиом и неопухолевых патологий были исследованы методом проточной экстракции в картридже с одноразовым эмиттером, согласно описанию в Главе2.

Также, для этих образцов выполнялась экстракция липидов (совпадает с протоколом в разделе 2.2.4):

1. Отобрать 20-30 мг образца в пробирку объёмом 1,5 мл (Eppendorf);

2. Подготовить рабочий растворитель (см. раздел 2.2.3) в количестве 25 мкл на мг образца;

3. Добавить в пробирку с образцом 50-100 мкл растворителя, гомогенизировать образец при помощи пестика, добавить остальной растворитель;

4. Интенсивно перемешивать 5 мин при +4°C;

5. Сонифицировать с хладагентом 5 минут в ультразвуковой ванне;

6. Взбалтывать 5 мин при +4°C

7. Центрифугировать при 20000g 5-10 минут при +4°C;

8. Отобрать супернатант.

100 мкл полученного раствора немедленно исследовалось методом электрораспыления. Из оставшегося раствора, не менее 350 мкл раствора подвергалось удалению солей, и далее использовалось для экспериментов с высокоэффективной жидкостной хроматографией и масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС), и для электрораспыления с прямым вводом:

1. Добавить к раствору CH3Cl и H2O в объёмном соотношении 1:1:1;

2. Взболтать 15-30 секунд;

3. Центрифугировать 5 минут;

4. Отобрать верхнюю фракцию;

5. распределить отобранный раствор: 50 мкл в стеклянную пробирку для ВЭЖХ-МС, и не менее 250 мкл в пробирку eppendorf для электрораспыления с прямым вводом;

6. высушить образцы.

Для электрораспыления с прямым вводом, образец далее перерастворялся в растворителе (33% изопропанол, 0,1% уксусная кислота), объёмом 3/5 от объёма до высушивания.

Для ВЭЖХ-МС, образец перерастворялся в 25 мкл растворителя (8% бу-танол, 23% изопропанол, 69% - 5мМ раствор H3PO)

Все масс-спектрометрические измерения производились при помощи масс-спектрометра LTQ XL Orbitrap ETD (Thermo Fisher Scientific).

5.1.2 Отбор ионов, характерных для глиомы IV степени злокачественности

В работе были использованы образцы, полученные от 27 пациентов: 18 пациентов с диагностированной глиомой IV степени злокачественности (из них 16 с мутацией в гене IDH-1) и 9 пациентов с патологиями неопухолевой природы. Образцы анализировались при помощи метода ICE, описанного в Главе 2. На основе молекулярных профилей этих образцов был построен классификатор, различающий образцы глиомы IV степени злокачественности и неопухолевой ткани. Предварительно, из всех сканов удалялись пики с отношением сигнала к шуму ниже 2, оставшиеся пики были нормированы на общий ионный ток, и далее, путём биннинга, формировалась матрица признаков (feature matrix), в которую включались только пики, присутствующие не менее, чем в 25% сканов с соответствующим диагнозом (глиома или неопухолевая патология). Последнее, в частности, исключает пики, которые могут возникать в связи с особенностями отдельного пациента или измерения, т.к. для включения в матрицу пики

должны встретиться не менее, чем у 3 пациентов с неопухолевой патологией, и не менее, чем у 5 пациентов с глиомой (в каждом режиме количество сканов для пациентов одинаково с точностью не хуже 10%). Кроме того, учитывались только пики, интенсивность которых превышает медианную, для исключения пиков малой интенсивности, для которых возникнут трудности с идентификацией соответствующих им соединений.

Полученная матрица использовалась для определения наиболее важных признаков при помощи варианта линейного дискриминантного анализа, описанного в работе [135]. Значимость отдельного масс-спектрометрического пика для разделения классов оценивалась при помощи локальной вероятности ложного выявления (local false discovery rate, lfdr). Она определяется как вероятность того, что данный пик не повлияет на классификацию, если та будет построена по всем остальным пикам [136]. В результате, были выбраны наиболее значимые пики в молекулярных профилях в диапазоне m/z 500-1000 (к которому при анализе образцов тканей методом проточной микроэкстракции относятся в основном липиды). В режиме положительных ионов, наблюдались в основном ионы фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов. Для всех выбранных пиков, lfdr была менее 10%.

Идентификация липидов выполнялась при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) и программного обеспечения LipiDex [137], с дополнительной проверкой результатов вручную.

5.2 Результаты

Наличие в тканях щелочных металлов в физиологических концентрациях приводит к тому, что при ионизации (в режиме положительных ионов) формируются не только протонированные квазимолекулярные ионы, но и и ионы-аддукты, содержащие эти щелочные металлы. Для оценки их вклада в общий

спектр, были проведены дополнительные эксперименты, в которых исследовались экстракты, полученные путём экстракции образца в пробирке с рабочим растворителем, с удалением солей и без него. На Рисунке 5.1 приведены репрезентативные масс-спектры этих экстрактов. Видно, что после обессоливания образца многие пики сдвинуты влево на 22 и 38 Да. Это соответствует уменьшению вклада ионов вида [M + Na] + и [M + K]+ соответственно в пользу образования протонированных ионов. При этом спектр обессоленных экстрактов был менее интенсивным по абсолютной величине отклика детектора, что можно объяснить меньшей эффективностью ионизации липидов в отсутствие катионов щелочных металлов. Наблюдаемая картина позволяет предположить, что большинство пиков, наблюдаемых в спектре как экстракта без удаления соли, так и ICE-MS, соответствуют катионам, в основном содержащим натрий, и в некоторых случаях калий. Таким образом, среди всех пиков, значимых для разделения МС на спектры тканей глиом IV степени злокачественности и тканей неопухолевой патологии, были выбраны 32 пика, обладающие достаточной интенсивностью для определения наличия катионов липидов в конкретном пике. В свою очередь, для большинства липидов в условиях МС-эксперимента, проведенного в присутствии ионов аммония в элюенте, образования катионов не наблюдалось. По этой причине для каждого катиона был выбран соответствующий протонированный аналог. В дальнейшем на основании данных МС-анализа (рисунок 5.1) с учетом выявленных аддуктов в спектрах ICE-MS 25 ионов были аннотированы как фосфатидилхолины (ФХ, phosphatidylcholines, PC) и фосфа-тидилэтаноламины (ФЭ, phosphatidylethanolamines, PE). Несмотря на то, что в некоторых случаях одному значению m/z в спектре ICE-MS можно сопоставить несколько липидов разных классов, для аннотации был выбран кандидат с наибольшей интенсивностью хроматографического пика, за исключением иона m/z 810,6, который соответствует как протонированному ФХ 38:4, так и катиониро-ванному натрием ФХ 36:1. В результате было идентифицировано 6 ФХ, один плазмалоген и один лизолецитин; увеличение их относительного содержания

90

hQ

Н

О

О 60

В

м

в

о В 30

н

X 0

в

а

в -30

hQ

Ч

н в -60

о

о

в -90

н

о

720

750 780 810

m/z, Да

840

870

Рисунок 5.1: Масс-спектры экстрагированных липидов с удалением солей (сверху) и без удаления (снизу). Чёрный - протонированные ионы, синий - натриевые аддукты, красный - калиевые аддукты. а - PC(32:0) в - PC(34:1) 7 - PC(36:1) 5 - PC(36:4) е - PC(38:4) Z - PC(40:6).

было связано со злокачественной трансформацией мозговой ткани в глиоме.

Используемый в данном исследовании метод выделения пиков, значимых для классификации глиальных опухолей IV степени злокачественности, методом линейного дискриминантного анализа (LDA), не позволяет делать количественные выводы об изменении концентрации тех или иных липидов в анализируемых тканях, в основном из-за малого объема изучаемой выборки. Рассчитанный в данной работе LDA CAT-критерий (correlation-adjusted t-score) является аналогом t-критерия Стьюдента, который используется для проверки гипотезы о равенстве средних значений двух групп измерений. Непосредственно t-критерий Стьюдента в нашем случае неприменим как из-за того, что распре-

деление интенсивности пиков отклоняется от нормы, так и из-за корреляции между интенсивностями пиков, малого объема выборки и высокой размерности сигнала. Тем не менее, CAT-критерий дает ту же информацию, что и критерий Стьюдента: большое положительное значение указывает на статистически значимую разницу между средними значениями в пользу неопухолевой ткани относительно измененной. Отрицательный CAT-критерий указывает на значительное превышение среднего значения в спектрах глиом IV степени злокачественности по сравнению с неопухолевыми образцами (рисунок 5.2). Кроме того, интенсивность пиков МС не всегда прямо пропорциональна концентрации молекул в образце. Однако, как правило, CAT-критерий отражает общие закономерности между повышенным уровнем одних молекул на фоне других.

Таким образом, исследование опухолей человека ex vivo в настоящее время является единственным эффективным инструментом для оценки изменений липидного обмена в клетках глиомы IV степени злокачественности, особенно в случае изучения молекул, выполняющих структурную функцию в клеточных мембранах, таких как ФХ. Высокая биологическая изменчивость клинического материала затрудняет его изучение классическими методами липидо-мики с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) из-за низкой доступности биоматериала. Извлечение липидов из ткани в количествах, достаточных для дальнейшего липидом-ного анализа, часто становится невозможным из-за малого объема иссекаемого материала. В то же время использование прямой масс-спектрометрии позволяет сравнительно быстро анализировать большое количество проб, в том числе небольшого объема, поскольку объем биоматериала, необходимого для анализа, не превышает 2 мм3.

Большинство пиков в МС прямой ионизацией опухолевых тканей глиом IV степени злокачественности в режиме положительных ионов соответствуют ФХ и ФЭ, но обнаруживаются и липиды других классов, включая фосфати-дилсерины, сфингомиелины и триглицериды. Однако наибольшее различие в

спектрах глиом IV степени злокачественности и неопухолевой ткани наблюдается в интенсивности пиков ФХ, что объясняется не только их высоким содержанием в клеточной мембране, но и высокой эффективностью ионизации при МС-анализе. Наиболее интенсивные пики в спектре, однако, не играют существенной роли в различении глиом IV степени злокачественности и неопухолевых тканей, так как внутригрупповая вариабельность их интенсивности в спектрах образцов с одним и тем же диагнозом сравнима с межгрупповой вариабельностью, что объясняется естественной биологической изменчивостью содержания липидов в образцах.

Полученные результаты (рисунок 5.2) показывают, что в глиомах IV степени злокачественности снижается уровень содержащих длинноцепочечные жирные кислоты и большое количество двойных связей ФХ, которые в первую очередь выполняют структурную функцию в клеточных мембранах. В то же время стандартный для нервной ткани уровень ПЭ снижается при злокачественной трансформации. Все фосфолипиды, характеризующие клеточную мембрану глиом IV степени злокачественности, содержат относительно корот-коцепочечные моно- и диненасыщенные остатки жирных кислот, что в целом хорошо согласуется с литературными данными по различным видам рака [138]. Увеличение содержания короткоцепочечных жирных кислот, состоящих из 12-16 атомов углерода, свидетельствует об общем снижении доступности длинноцепочечных жирных кислот, которые, по-видимому, подвергаются бета-окислению для поддержания метаболизма в раковой клетке и заменены жирными кислотами, синтезированными de novo. Снижение содержания полиненасыщенных липидов в пользу моно- и диненасыщенных липидов также связано с активацией синтеза жирных кислот de novo, что в основном приводит к образованию относительно насыщенных жирных кислот, характерных для многих видов рака, включая глиальные опухоли [138, 139]. Снижение уровня насыщенных фосфолипидов объясняется тем, что большая часть насыщенных жирных кислот в опухолевых клетках расходуется на синтез триглицеридов,

(РС 38:3 [М + N3]+) 834.57 (РС 32:3 [М + №]+) 750.55 (РС 40:3 [М + КГ) 836.58 (РС 40:7 [М +N3]+) 854.55 (РС 36:5 [М + N3]+) 802.58 (РС 32:0 [М + Н]+) 734.61 (РС 36:0 [М + N3]+) 812.62 (РС 40:6 [М +N3]+) 856.59 (РС 30:3 [М +N3]+) 723.51 (ЬукоРС 20:2 [М + К]+) 586.52 (РС 38:7 [М + N3]+) 826.58 (РЕ 38:7 [М + К]+) 800.57 (ЬуБоРЕ 22:1 [М + Н]+) 536.40 (ЬукоРС 20:1 [М + К1+) 588.54 (РС 36:1 [М + Н1+) 788.62 (Р1а$тепу1-РЕ 38:1 [М + Иа]+) 780.63 (РС 38:4 [М + Н]+ & РС 38:4 [М + Н]+) 810.60

750.60 (Р1а8тепу1-РЕ 36:2 [М + N3]+) 702.58 (РС 30:2 [М + Н1+)

560.51 (ЕукоРС 18:1 [М + К]+)

670.61 (РС 26:1 [М + Ыа]+) 752.58 (РС 32:2 [М +N3]+) 798.56 (РС 34:1 [М + К]+) 796.54 (РС 34:2 [М + К1+)

770.52 (РС 32:1 [М + К]+)

—I 80

-80

-60

-40 -20 0 20

САТ-показатель

40

60

Рисунок 5.2: Липиды, наиболее значимо различающиеся между глиомой IV степени злокачественности и неопухолевой тканью, согласно САТ-критерию. Оранжевый - относительная интенсивность выше для образцов глиомы, зелёный -для образцов неопухолевой ткани.

накапливаемых в качестве источника энергии в липидных каплях [13, 140]. Это является существенным отличием глиом от опухолей других органов. Слабая (по сравнению с фосфолипидами) ионизационная способность триглицеридов затрудняет их обнаружение методами прямой масс-спектрометрии; поэтому ни один из триглицеридов в нашем эксперименте не внес достаточно заметного вклада в классификацию образцов глиом IV степени злокачественности. Это хорошо согласуется с общей теорией интенсификации процессов, ведущих к быстрому синтезу биомассы для обеспечения ускоренной пролиферации клеток без необходимости сохранения их функциональности [13].

Ранее было показано [141], что ФХ 34:2 в основном характеризует не опухоль, а участки некрозов и кровоизлияний; это хорошо коррелирует с клиническими проявлениями первичной глиобластомы. В то же время его высокая значимость в классификации глиом IV степени злокачественности (включая вторичные опухоли, ГОН-мутантные опухоли) показывает, что в молекулярном отношении липиды первичных и вторичных глиом IV степени злокачественности гораздо более сходны, чем липиды вторичных глиом IV степени злокачественности и предшествующие ГОН-мутантные астроцитомы [142]. Это свидетельствует о конвергентном изменении метаболизма под влиянием кислорода и в условиях метаболического голодания внутри ядра опухоли. Кроме того, это также может свидетельствовать о процессах метаболического репрограмми-рования для поддержания жизнеспособности клеток в высокозлокачественных глиальных опухолях в условиях развития гипоксии внутри ядра опухоли.

Заключение

Разработан подход, позволяющий сократить время анализа образца методом проточной экстракции в картридже до приемлемого в клинической практике. Это достигается за счёт исключения промывки линии подачи аналита после измерений для каждого образца, путём использования одноразовых эмиттеров электрораспыления.

Показана однородность молекулярных профилей, полученных с использованием одноразового эмиттера электрораспыления и с использованием рутинного ионного источника электрораспыления. За счёт применения косинусной метрики подобия и анализа главных компонент, были получены количественные характеристики стабильности и воспроизводимости сигнала для обеих моделей картриджа, а также сходства молекулярных профилей для разных картриджей одной модели и разных моделей.

Разработан метод построения регрессионной модели, позволяющий определить долю опухолевых клеток в образце по его молекулярному профилю. Регрессионная модель построена с использованием алгоритмов ХСВооэ1 и данных, полученных методом проточной экстракции в картридже, дополненных результатами гистологической оценки доли опухолевых клеток. Валидация модели показала среднее абсолютное значение ошибки менее 10%.

Выявлен набор липидов, наиболее значимых для дифференциации образцов тканей глиальных опухолей высшей степени злокачественности и образцов тканей головного мозга, полученных от пациентов с неопухолевыми патологиями. Показано, что молекулярные профили глиальных опухолей отличаются

от профилей тканей неопухолевых патологий повышенной долей моно- и ди-ненасыщенных жирных кислот в фосфатидилхолинах, по отношению к доле насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, что согласуется с биологической теорией изменения метаболизма, сопровождающего злокачественную трансформацию глиальных клеток.

Список литературы

[1] Belsuzarri, TelmoAugusto Barba. Brain tumor surgery: supplemental intraoperative imaging techniques and future challenges / TelmoAugusto Barba Belsuzarri, RaphaelMartinelli Anson Sangenis, JoaoFlavio Mattos Arau-jo // Journal of Cancer Metastasis and Treatment. — 2015. — Vol. 0, no. 0.

— P. 0.

[2] Dammers, Ruben. Towards improving the safety and diagnostic yield of stereotactic biopsy in a single centre / Ruben Dammers, Joost W Schouten, Iain K Haitsma, Arnaud JPE Vincent, Johan M Kros, Clemens MF Dirven // Acta neurochirurgica. — 2010. — Vol. 152. — Pp. 1915-1921.

[3] Orringer, Daniel A. Neuronavigation in the surgical management of brain tumors: current and future trends / Daniel A Orringer, Alexandra Golby, Ferenc Jolesz // Expert review of medical devices. — 2012. — Vol. 9, no. 5. — Pp. 491-500.

[4] Gerard, Ian J. Brain shift in neuronavigation of brain tumors: A review / Ian J. Gerard, Marta Kersten-Oertel, Kevin Petrecca, Denis Sirhan, Jef-fery A. Hall, D. Louis Collins // Medical Image Analysis. — 2017. — Vol. 35.

— Pp. 403-420.

[5] Amraei, Razie. A Comparison between the Diagnostic Accuracy of Frozen Section and Permanent Section Analyses in Central Nervous System / Razie Amraei, Afshin Moradi, Hanieh Zham, Mahsa Ahadi, Maryam Baikpour,

Azadeh Rakhshan // Asian Pac J Cancer Prev. — 2017. — Vol. 18, no. 3. — Pp. 659-666.

[6] Dufraing, Kelly. Neoplastic cell percentage estimation in tissue samples for molecular oncology: recommendations from a modified Delphi study / Kelly Dufraing, J. Henricus van Krieken, Gert De Hertogh, Gerald Hoefler, Anca Oniscu, Tine P. Kuhlmann, Wilko Weichert, Caterina Marchio, Ari Ris-timaki, Ales Ryska, Jean Yves Scoazec, Elisabeth Dequeker // Histopathology.

— 2019. — Vol. 75, no. 3. — Pp. 312-319.

[7] Smits, Alexander J.J. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate / Alexander J.J. Smits, J. Alain Kummer, Peter C. De Bruin, Mijke Bol, Jan G. Van Den Tweel, Kees A. Seldenrijk, Stefan M. Willems, G. Johan A. Offerhaus, Roel A. De Weger, Paul J. Van Diest, Aryan Vink // Modern Pathology. — 2014. — feb. — Vol. 27, no. 2. — Pp. 168-174.

[8] Lhermitte, Benoit. Adequately defining tumor cell proportion in tissue samples for molecular testing improves interobserver reproducibility of its assessment / Benoit Lhermitte, Caroline Egele, Noelle Weingertner, Damien Am-brosetti, Berengere Dadone, Valerie Kubiniek, Fanny Burel-Vandenbos, John Coyne, Jean-Francois Michiels, Marie-Pierre Chenard, Etienne Rouleau, Jean-Christophe Sabourin, Jean-Pierre Bellocq // Virchows Archiv. — 2017.

— jan. — Vol. 470, no. 1. — Pp. 21-27.

[9] St John, Edward R. Intraoperative tissue identification by mass spectrometric technologies / Edward R. St John, Merja Rossi, Pamela Pruski, Ara Darzi, Zoltan Takats // TrAC - Trends in Analytical Chemistry. — 2016. — Vol. 85.

— Pp. 2-9.

[10] Viray, Hollis. Automated objective determination of percentage of malignant nuclei for mutation testing / Hollis Viray, Madeline Coulter, Kevin Li,

Kristin Lane, Aruna Madan, Kisha Mitchell, Kurt Schalper, Clifford Hoyt, David L. Rimm // Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. — 2014. — Vol. 22, no. 5. — Pp. 363-371.

[11] Ji, Minbiao. Detection of human brain tumor infiltration with quantitative stimulated Raman scattering microscopy / Minbiao Ji, Spencer Lewis, Sandra Camelo-Piragua, Shakti H. Ramkissoon, Matija Snuderl, Sriram Ven-neti, Amanda Fisher-Hubbard, Mia Garrard, Dan Fu, Anthony C. Wang, Jason A. Heth, Cormac O. Maher, Nader Sanai, Timothy D. Johnson, Christian W. Freudiger, Oren Sagher, Xiaoliang Sunney Xie, Daniel A. Orringer // Science Translational Medicine. — 2015. — oct. — Vol. 7, no. 309. — Pp. 309ra163-309ra163.

[12] Pirro, V. Utility of neurological smears for intrasurgical brain cancer diagnostics and tumour cell percentage by DESI-MS / V. Pirro, A. K. Jarmusch, C. M. Alfaro, E. M. Hattab, A. A. Cohen-Gadol, R. Graham Cooks // Analyst. — 2017. — Vol. 142, no. 3. — Pp. 449-454.

[13] Sorokin, Anatoly. Untangling the Metabolic Reprogramming in Brain Cancer: Discovering Key Molecular Players Using Mass Spectrometry / Anatoly Sorokin, Vsevolod Shurkhay, Stanislav Pekov, Evgeny Zhvansky, Dani-il Ivanov, Eugene E. Kulikov, Igor Popov, Alexander Potapov, Eugene Niko-laev // Current Topics in Medicinal Chemistry. — 2019. — Vol. 19, no. 17. — Pp. 1521-1534.

[14] Dang, Lenny. Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate / Lenny Dang, David W. White, Stefan Gross, Bryson D. Bennett, Mark A. Bittinger, Edward M. Driggers, Valeria R. Fantin, Hyun Gyung Jang, Shengfang Jin, Marie C. Keenan, Kevin M. Marks, Robert M. Prins, Patrick S. Ward, Katharine E. Yen, Linda M. Liau, Joshua D. Rabinowitz, Lewis C. Cantley, Craig B. Thompson,

Matthew G. Vander Heiden, Shinsan M. Su // Nature. — 2009. — Vol. 462, no. 7274. — Pp. 739-744.

[15] Sciacovelli, Marco. Oncometabolites: Unconventional triggers of oncogenic signalling cascades / Marco Sciacovelli, Christian Frezza // Free Radical Biology and Medicine. — 2016. — Vol. 100. — Pp. 175-181.

[16] Luo, Xiangjian. Emerging roles of lipid metabolism in cancer metastasis / Xiangjian Luo, Can Cheng, Zheqiong Tan, Namei Li, Min Tang, Lifang Yang, Ya Cao // Molecular Cancer. — 2017. — dec. — Vol. 16, no. 1. — P. 76.

[17] Strain, Shinji K. Measurement of 2-hydroxyglutarate enantiomers in serum by chiral gas chromatography-tandem mass spectrometry and its application as a biomarker for IDH mutant gliomas / Shinji K. Strain, Morris D. Groves, Kelly L. Olino, Mark R. Emmett // Clinical Mass Spectrometry. — 2020. — jan. — Vol. 15. — Pp. 16-24.

[18] Long, Jia. Lipid metabolism and carcinogenesis, cancer development. / Jia Long, Chan-Juan Zhang, Neng Zhu, Ke Du, Yu-Fang Yin, Xi Tan, Duan-Fang Liao, Li Qin // American journal of cancer research. — 2018. — Vol. 8, no. 5. — Pp. 778-791.

[19] Ifa, Demian R. Ambient ionization mass spectrometry for cancer diagnosis and surgical margin evaluation / Demian R Ifa, Livia S Eberlin // Clinical chemistry. — 2016. — Vol. 62, no. 1. — Pp. 111-123.

[20] Pekov, Stanislav I. Inline cartridge extraction for rapid brain tumor tissue identification by molecular profiling / Stanislav I. Pekov, Vasily A. Elifer-ov, Anatoly A. Sorokin, Vsevolod A. Shurkhay, Evgeny S. Zhvansky, Alexander S. Vorobyev, Alexander A. Potapov, Eugene N. Nikolaev, Igor A. Popov // Scientific Reports. — 2019. — dec. — Vol. 9, no. 1. — P. 18960.

[21] Eberlin, Livia S. Classifying human brain tumors by lipid imaging with mass spectrometry / Livia S. Eberlin, Isaiah Norton, Allison L. Dill, Alexandra J. Golby, Keith L. Ligon, Sandro Santagata, R. Graham Cooks, Nathalie Y.R. Agar // Cancer Research. — 2012. — Vol. 72, no. 3. — Pp. 645654.

[22] Balog, Julia. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry / Julia Balog, Laszlo Sasi-Szabo, James Kinross, Matthew R. Lewis, Laura J. Muirhead, Kirill Veselkov, Reza Mirneza-mi, Balazs Dezso, Laszlo Damjanovich, Ara Darzi, Jeremy K. Nicholson, Zoltan Takats // Science Translational Medicine. — 2013. — Vol. 5, no. 194.

[23] Tata, Alessandra. Contrast Agent Mass Spectrometry Imaging Reveals Tumor Heterogeneity / Alessandra Tata, Jinzi Zheng, Howard J. Ginsberg, David A. Jaffray, Demian R. Ifa, Arash Zarrine-Afsar // Analytical Chemistry. — 2015. — Aug. — Vol. 87, no. 15. — Pp. 7683-7689.

[24] Chaurand, Pierre. Integrating Histology and Imaging Mass Spectrometry / Pierre Chaurand, Sarah A. Schwartz, Dean Billheimer, Baogang J. Xu, Anna Crecelius, Richard M. Caprioli // Analytical Chemistry. — 2004. — Vol. 76, no. 4. — Pp. 1145-1155.

[25] Veloso, Antonio. Distribution of lipids in human brain / Antonio Veloso, Roberto Fernandez, Egoitz Astigarraga, Gabriel Barreda-Gomez, Ivan Manuel, M. Teresa Giralt, Isidro Ferrer, Begona Ochoa, Rafael Rodriguez-Puertas, Jose A. Fernandez // Analytical and Bioanalytical Chemistry. — 2011. — jul. — Vol. 401, no. 1. — Pp. 89-101.

[26] Eberlin, Livia S. Pancreatic Cancer Surgical Resection Margins: Molecular Assessment by Mass Spectrometry Imaging / Livia S. Eberlin, Katherine Margulis, Ivette Planell-Mendez, Richard N. Zare, Robert Tibshirani, Teri A. Lon-

gacre, Moe Jalali, Jeffrey A. Norton, George A. Poultsides // PLOS Medicine. — 2016. — 08. — Vol. 13, no. 8. — Pp. 1-21.

[27] Porcari, Andreia M. Multicenter study using desorption-electrospray-ionization-mass-spectrometry imaging for breast-cancer diagnosis / An-dreia M Porcari, Jialing Zhang, Kyana Y Garza, Raquel M Rodrigues-Peres, John Q Lin, Jonathan H Young, Robert Tibshirani, Chandandeep Nagi, Geisi-lene R Paiva, Stacey A Carter et al. // Analytical chemistry. — 2018. — Vol. 90, no. 19. — Pp. 11324-11332.

[28] Touboul, David. Tissue Molecular Ion Imaging by Gold Cluster Ion Bombardment / David Touboul, Frederic Halgand, Alain Brunelle, Reinhard Kersting, Elke Tallarek, Birgit Hagenhoff, Olivier Laprevote // Analytical Chemistry. — 2004. — mar. — Vol. 76, no. 6. — Pp. 1550-1559.

[29] Pirro, Valentina. Intraoperative assessment of tumor margins during glioma resection by desorption electrospray ionization-mass spectrometry / Valentina Pirro, Clint M. Alfaro, Alan K. Jarmusch, Eyas M. Hattab, Aaron A. Cohen-Gadol, R. Graham Cooks // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2017. — Vol. 114, no. 26. — P. 201706459.

[30] Ogrinc, Nina. Water-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for minimally invasive in vivo and real-time surface analysis using SpiderMass / Nina Ogrinc, Philippe Saudemont, Julia Balog, Yves Marie Robin, Jean Pascal Gimeno, Quentin Pascal, Dominique Tierny, Zoltan Takats, Michel Salzet, Isabelle Fournier // Nature Protocols. — 2019. — Vol. 14, no. 11. — Pp. 31623182.

[31] Fatou, Benoit. Remote atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry (remote IR-MALDI MS) of proteins / Benoit Fatou, Michael Ziskind, Philippe Saudemont, Jusal Quanico, Cris-

tian Focsa, Michel Salzet, Isabelle Fournier // Molecular and Cellular Pro-teomics. — 2018. — Vol. 17, no. 8. — Pp. 1637-1649.

[32] Fournier, Isabelle. Mass spectrometry-based intraoperative tumor diagnostics: A letter in reply / Isabelle Fournier, Michel Salzet // Future Science OA. — 2019. — Vol. 5, no. 7. — Pp. 9-10.

[33] Kinross, James Macalister. Abstract 3977: iKnife: Rapid evaporative ionization mass spectrometry (REIMS) enables real-time chemical analysis of the mucosal lipidome for diagnostic and prognostic use in colorectal cancer / James Macalister Kinross, Laura Muirhead, James Alexander, Julia Balog, Cristina Guallar-Hoya, Abigail Speller, Ottmar Golff, Rob Goldin, Ara Darzi, Jeremy Nicholson, Zoltan Takats // Cancer Research. — 2016. — Vol. 76, no. 14 Supplement. — Pp. 3977-3977.

[34] Tzafetas, Menelaos. The intelligent knife (iKnife) and its intraoperative diagnostic advantage for the treatment of cervical disease / Menelaos Tzafetas, Anita Mitra, Maria Paraskevaidi, Zsolt Bodai, Ilkka Kalliala, Sarah Bowden, Konstantinos Lathouras, Francesca Rosini, Marcell Szasz, Adele Savage, Julia Balog, James McKenzie, Deirdre Lyons, Phillip Bennett, David MacIntyre, Sadaf Ghaem-Maghami, Zoltan Takats, Maria Kyrgiou // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2020. — Vol. 117, no. 13. — Pp. 7338-7346.

[35] Kononikhin, Alexey. A novel direct spray-from-tissue ionization method for mass spectrometric analysis of human brain tumors / Alexey Konon-ikhin, Evgeny Zhvansky, Vsevolod Shurkhay, Igor Popov, Denis Bormotov, Yury Kostyukevich, Sofiia Karchugina, Maria Indeykina, Anna Bugrova, Natalia Starodubtseva, Alexander Potapov, Eugene Nikolaev // Analytical and Bioanalytical Chemistry. — 2015. — Vol. 407, no. 25. — Pp. 7797-7805.

[36] Mikkelsen, Tom. Brain Tumor Invasion: Biological, Clinical and Therapeu-

tic Considerations / Tom Mikkelsen, Rolf Bjerkvig, Ole Didrik Laerum, Mark L. Rosenblum. — Wiley-Blackwell, 1998. — May.

[37] Price, S. J. Imaging biomarkers of brain tumour margin and tumour invasion / S. J. Price, J. H. Gillard // The British Journal of Radiology. — 2011. — dec. — Vol. 84, no. special issue 2. — Pp. S159-S167.

[38] Yamahara, Takahiro. Morphological and flow cytometric analysis of cell infiltration in glioblastoma: A comparison of autopsy brain and neuroimag-ing / Takahiro Yamahara, Yoshihiro Numa, Tetsuya Oishi, Takuya Kawaguchi, Toshitaka Seno, Akio Asai, Keiji Kawamoto // Brain Tumor Pathology. — 2010. — Vol. 27, no. 2. — Pp. 81-87.

[39] Nagashima, Goro. Graphic analysis of microscopic tumor cell infiltration proliferative potential, and vascular endothelial growth factor expression in an autopsy brain with glioblastoma / Goro Nagashima, Ryuta Suzuki, Hiro-mu Hokaku, Makoto Takahashi, Takayasu Miyo, Jun Ichiro Asai, Nobuhi-ro Nakagawa, Tsukasa Fujimoto // Surgical Neurology. — 1999. — Vol. 51, no. 3. — Pp. 292-299.

[40] Komori, Takashi. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System: The Major Points of Revision / Takashi Komori // Neurol Med Chir (Tokyo). — 2017. — Vol. 57, no. 7. — Pp. 301-311.

[41] Armento, Angela. Molecular Mechanisms of Glioma Cell Motility / Angela Ar-mento, Jakob Ehlers, Sonja Schötterl, Ulrike Naumann // Glioblastoma / Ed. by Steven De Vleeschouwer. — Brisbane (AU): Codon Publications, 2017.

[42] Huang, L Eric. Friend or foe—IDH1 mutations in glioma 10 years on / L Eric Huang // Carcinogenesis. — 2019. — 09. — Vol. 40, no. 11. — Pp. 1299-1307.

[43] Ohgaki, Hiroko. Genetic Pathways to Primary and Secondary Glioblastoma /

Hiroko Ohgaki, Paul Kleihues // The American Journal of Pathology. — 2007.

— Vol. 170, no. 5. — Pp. 1445-1453.

[44] Демяшкин, Г. А. IDH1- и ГОН2-мутации в глиальных опухолях головного мозга - новый антионкогенный механизм / Демяшкин, Г. А., Никитин, П. В. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. — 2018.

— Т. 118, № 4. — С. 134-139.

[45] Parsons, D Williams. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme / D Williams Parsons, Siän Jones, Xiaosong Zhang, Jimmy Cheng-Ho Lin, Rebecca J Leary, Philipp Angenendt, Parminder Mankoo, Hannah Carter, I-Mei Siu, Gary L Gallia, Alessandro Olivi, Roger McLen-don, B Ahmed Rasheed, Stephen Keir, Tatiana Nikolskaya, Yuri Nikol-sky, Dana A Busam, Hanna Tekleab, Luis A Diaz, Jr, James Harti-gan, Doug R Smith, Robert L Strausberg, Suely Kazue Nagahashi Marie, Sueli Mieko Oba Shinjo, Hai Yan, Gregory J Riggins, Darell D Bigner, Rachel Karchin, Nick Papadopoulos, Giovanni Parmigiani, Bert Vogelstein, Victor E Velculescu, Kenneth W Kinzler // Science. — 2008. — Vol. 321, no. 5897. — Pp. 1807-1812.

[46] Dang, L. IDH mutations in cancer and progress toward development of targeted therapeutics / L. Dang, K. Yen, E.C. Attar // Annals of Oncology. — 2016. — Vol. 27, no. 4. — Pp. 599-608.

[47] Lu, Chao. IDH mutation impairs histone demethylation and results in a block to cell differentiation / Chao Lu, Patrick S Ward, Gurpreet S Kapoor, Dan Rohle, Sevin Turcan, Omar Abdel-Wahab, Christopher R Edwards, Raya Khanin, Maria E Figueroa, Ari Melnick, Kathryn E Wellen, Donald M O'Rourke, Shelley L Berger, Timothy A Chan, Ross L Levine, Ingo K Mellinghoff, Craig B Thompson // Nature. — 2012. — Vol. 483, no. 7390. — Pp. 474-478.

[48] Reitman, Zachary J. Cancer-associated Isocitrate Dehydrogenase 1 (IDH1) R132H Mutation and d-2-Hydroxyglutarate Stimulate Glutamine Metabolism under Hypoxia * / Zachary J Reitman, Christopher G Duncan, Ethan Po-teet, Ali Winters, Liang-Jun Yan, David M Gooden, Ivan Spasojevic, Laszlo G Boros, Shao-Hua Yang, Hai Yan // Journal of Biological Chemistry. — 2014. — Vol. 289, no. 34. — Pp. 23318-23328.

[49] Lunt, Sophia Y. Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation / Sophia Y Lunt, Matthew G Vander Heiden // Annu Rev Cell Dev Biol. — 2011. — Vol. 27. — Pp. 441-464.

[50] Koizume, Shiro. Lipid Droplets: A Key Cellular Organelle Associated with Cancer Cell Survival under Normoxia and Hypoxia / Shiro Koizume, Yohei Miyagi // International Journal of Molecular Sciences. — 2016. — Vol. 17, no. 9.

[51] Александров, М.Л. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении - метод масс-спектрометрического анализа биоорганических веществ / Александров, М.Л., Галль, Л.Н., Краснов, Н.В., Николаев, В. И., Павленко, В.А., Шкуров, В.А. // ДАН СССР. — 1984. — Т. 277. — С. 379-383.

[52] Yamashita, Masamichi. Electrospray ion source. Another variation on the freejet theme / Masamichi Yamashita, John B. Fenn // The Journal of Physical Chemistry. — 1984. — Sep. — Vol. 88, no. 20. — Pp. 4451-4459.

[53] Taylor, Geoffrey Ingram. Electrically driven jets / Geoffrey Ingram Taylor // Proceedings of the Royal Society of London. A. Mathematical and Physical Sciences. — 1969. — Vol. 313, no. 1515. — Pp. 453-475.

[54] Wilm, Matthias S. Electrospray and Taylor-Cone theory, Dole's beam of macromolecules at last? / Matthias S. Wilm, Matthias Mann // International

Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. — 1994. — Vol. 136, no. 2.

— Pp. 167-180.

[55] Fernández de la Mora, Juan. The Fluid Dynamics of Taylor Cones / Juan Fernandez de la Mora // Annual Review of Fluid Mechanics. — 2007.

— Vol. 39, no. 1. — Pp. 217-243.

[56] Bruins, Andries P. Mechanistic aspects of electrospray ionization / An-dries P Bruins // Journal of Chromatography A. — 1998. — Vol. 794, no. 1.

— Pp. 345-357.

[57] Kebarle, Paul. On the Mechanism of Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESIMS) / Paul Kebarle, Udo H. Verkerk // Electrospray and MALDI Mass Spectrometry. — John Wiley & Sons, Ltd, 2010. — Pp. 1-48.

[58] Smith, David P. H. The Electrohydrodynamic Atomization of Liquids / David P. H. Smith // IEEE Transactions on Industry Applications. — 1986. — Vol. IA-22, no. 3. — Pp. 527-535.

[59] Marginean, loan. Electrospray Characteristic Curves: In Pursuit of Improved Performance in the Nanoflow Regime / Ioan Marginean, Ryan T. Kelly, Jason S. Page, Keqi Tang, Richard D. Smith // Analytical Chemistry. — 2007.

— Vol. 79, no. 21. — Pp. 8030-8036. — PMID: 17896826.

[60] Naderi, Pejman. Investigation on the onset voltage and stability island of electrospray in the cone-jet mode using curved counter electrode / Pejman Naderi, Mehrzad Shams, Hojat Ghassemi // Journal of Electrostatics. — 2019. — Vol. 98. — Pp. 1-10.

[61] Morad, M. R. A Very Stable High Throughput Taylor Cone-jet in Electrohy-drodynamics / M. R. Morad, A. Rajabi, M. Razavi, S. R. Pejman Sereshkeh // Scientific Reports. — 2016. — Dec. — Vol. 6, no. 1. — P. 38509.

[62] Hartman, R.P.A. ELECTROHYDRODYNAMIC ATOMIZATION IN THE CONE-JET MODE PHYSICAL MODELING OF THE LIQUID CONE AND JET / R.P.A. Hartman, D.J. Brunner, D.M.A. Camelot, J.C.M. Marijnissen, B. Scarlett // Journal of Aerosol Science. — 1999. — Vol. 30, no. 7. — Pp. 823-849.

[63] Rovelli, Grazia. A critical analysis of electrospray techniques for the determination of accelerated rates and mechanisms of chemical reactions in droplets / Grazia Rovelli, Michael I Jacobs, Megan D Willis, Rebecca J Rapf, Alexander M Prophet, Kevin R Wilson // Chemical science. — 2020. — Vol. 11, no. 48. — Pp. 13026-13043.

[64] Vandermarliere, Elien. Getting intimate with trypsin, the leading protease in proteomics / Elien Vandermarliere, Michael Mueller, Lennart Martens // Mass Spectrometry Reviews. — 2013. — Vol. 32, no. 6. — Pp. 453-465.

[65] Xia, Fangbo. Chemical derivatization strategy for mass spectrometry-based lipidomics / Fangbo Xia, Jian-Bo Wan // Mass Spectrometry Reviews. — 2021. — Vol. 42, no. 1. — P. e21729.

[66] Baker, Paul R S. Three-dimensional enhanced lipidomics analysis combining UPLC, differential ion mobility spectrometry, and mass spectrometric separation strategies / Paul R S Baker, Aaron M Armando, J Larry Campbell, Oswald Quehenberger, Edward A Dennis // Journal of Lipid Research. — 2014. — Vol. 55, no. 11. — Pp. 2432-2442.

[67] Cai, Jianyi. Capillary electrophoresis-mass spectrometry / Jianyi Cai, Jack Henion // Journal of Chromatography A. — 1995. — Vol. 703, no. 1. — Pp. 667-692.

[68] Karasek, Francis W. Basic gas chromatography-mass spectrometry: principles and techniques / Francis W Karasek, Ray E Clement. — Elsevier, 2012.

[69] Cody, Robert B. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions / Robert B. Cody, James A. Laramee, H. Dupont Durst // Analytical Chemistry. — 2005. — Vol. 77, no. 8. — Pp. 2297-2302.

[70] Van Berkel, Gary J. Established and emerging atmospheric pressure surface sampling/ionization techniques for mass spectrometry / Gary J. Van Berkel, Sofie P. Pasilis, Olga Ovchinnikova // Journal of Mass Spectrometry. — 2008. — sep. — Vol. 43, no. 9. — Pp. 1161-1180.

[71] Alberici, Rosana M. Ambient mass spectrometry: Bringing MS into the "real world" / Rosana M. Alberici, Rosineide C. Simas, Gustavo B. Sanvido, Wan-derson Romao, Priscila M. Lalli, Mario Benassi, Ildenize B.S. Cunha, Marcos N. Eberlin // Analytical and Bioanalytical Chemistry. — 2010. — Vol. 398, no. 1. — Pp. 265-294.

[72] Venter, Andre. Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry / Andre Venter, Paul E Sojka, R Graham Cooks // Anal. Chem. — 2006. — Vol. 78, no. 24. — Pp. 85498555.

[73] Takats, Zoltan. Ambient mass spectrometry using desorption electrospray ionization (DESI): instrumentation, mechanisms and applications in foren-sics, chemistry, and biology / Zoltan Takats, Justin M Wiseman, R Graham Cooks // J Mass Spectrom. — 2005. — Vol. 40, no. 10. — Pp. 1261-1275.

[74] Eberlin, Livia S. Discrimination of human astrocytoma subtypes by lipid analysis using desorption electrospray ionization imaging mass spectrometry / Livia S. Eberlin, Allison L. Dill, Alexandra J. Golby, Keith L. Ligon, Justin M. Wiseman, R. Graham Cooks, Nathalie Y.R. Agar // Angewandte Chemie - International Edition. — 2010. — Vol. 49, no. 34. — Pp. 5953-5956.

[75] Jarmusch, Alan K. Differential Lipid Profiles of Normal Human Brain Matter and Gliomas by Positive and Negative Mode Desorption Electrospray Ionization - Mass Spectrometry Imaging / Alan K. Jarmusch, Clint M. Alfaro, Valentina Pirro, Eyas M. Hattab, Aaron A. Cohen-Gadol, R. Graham Cooks // PLOS ONE. — 2016. — 09. — Vol. 11, no. 9. — Pp. 1-15.

[76] Kerian, K. S. Differentiation of prostate cancer from normal tissue in radical prostatectomy specimens by desorption electrospray ionization and touch spray ionization mass spectrometry / K. S. Kerian, A. K. Jarmusch, V. Pirro, M. O. Koch, T. A. Masterson, L. Cheng, R. G. Cooks // Analyst. — 2015. — Vol. 140. — Pp. 1090-1098.

[77] Banerjee, Shibdas. Diagnosis of prostate cancer by desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging of small metabolites and lipids / Shibdas Banerjee, Richard N. Zare, Robert J. Tibshirani, Christian A. Kunder, Rosalie Nolley, Richard Fan, James D. Brooks, Geoffrey A. Sonn // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2017. — Vol. 114, no. 13. — Pp. 3334-3339.

[78] D'Hue, Cedric. Feasibility of desorption electrospray ionization mass spectrometry for diagnosis of oral tongue squamous cell carcinoma / Cedric D'Hue, Michael Moore, Don-John Summerlin, Alan Jarmusch, Clint Alfaro, Avinash Mantravadi, Arnaud Bewley, D. Gregory Farwell, R. Graham Cooks // Rapid Communications in Mass Spectrometry. — 2018. — Vol. 32, no. 2. — Pp. 133-141.

[79] Schäfer, Karl-Christian. In Vivo, In Situ Tissue Analysis Using Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry / Karl-Christian Schafer, Julia Denes, Katalin Albrecht, Tamas Szaniszlo, Julia Balog, Reka Skoumal, Maria Katona, Miklos Toth, Lajos Balogh, Zoltan Takats // Angewandte Chemie International Edition. — 2009. — Vol. 48, no. 44. — Pp. 8240-8242.

[80] St John, Edward R. Rapid evaporative ionisation mass spectrometry of elec-trosurgical vapours for the identification of breast pathology: towards an intelligent knife for breast cancer surgery / Edward R. St John, Julia Balog, James S. McKenzie, Merja Rossi, April Covington, Laura Muirhead, Zsolt Bo-dai, Francesca Rosini, Abigail V. M. Speller, Sami Shousha, Rathi Ramakr-ishnan, Ara Darzi, Zoltan Takats, Daniel R. Leff // Breast Cancer Research.

— 2017. — May. — Vol. 19, no. 1. — P. 59.

[81] Alexander, James. A novel methodology for in vivo endoscopic pheno-typing of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife / James Alexander, Louise Gildea, Julia Balog, Abigail Speller, James McKenzie, Laura Muirhead, Alasdair Scott, Christos Kontovounisios, Shanawaz Rasheed, Julian Teare, Jonathan Hoare, Kirill Veselkov, Robert Goldin, Paris Tekkis, Ara Darzi, Jeremy Nicholson, James Kinross, Zoltan Takats // Surgical endoscopy. — 2017.

— Vol. 31. — Pp. 1361-1370.